阅读说明：本技术 一种过氧化氢响应的偶氮鎓二醇盐类化合物及其用途 (Hydrogen peroxide responsive azonium diol salt compound and application thereof ) 是由 傅俊杰 尹健 孟婷婷 胡静 于 2019-09-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种过氧化氢响应的偶氮鎓二醇盐类化合物及其用途,属于药物化学领域。本发明化合物稳定性高,其α-酮酰胺结构可特异性响应H<Sub>2</Sub>O<Sub>2</Sub>释放NO,不同的结构可实现对不同种类肿瘤细胞的特异性抑制,且对正常细胞毒性小,可作为一类肿瘤细胞选择性高、毒副作用小的新型NO供体型药物,具有很好的市场前景。(The invention discloses a hydrogen peroxide-responsive azonium diol salt compound and application thereof, belonging to the field of pharmaceutical chemistry. The compound has high stability, and the alpha-ketoamide structure of the compound can specifically respond to H 2 O 2 the NO is released, different structures can realize specific inhibition on different types of tumor cells, the toxicity on normal cells is low, and the NO can be used as a novel NO donor type medicament with high tumor cell selectivity and low toxic and side effects, and has good market prospect.)

一种过氧化氢响应的偶氮鎓二醇盐类化合物及其用途

技术领域

本发明涉及一种过氧化氢响应的偶氮鎓二醇盐类化合物及其用途，属于药物化学领域。

背景技术

一氧化氮(NO)具有广泛的生理活性，在抗肿瘤领域也发挥着重要的作用。大量研究表明，NO对肿瘤细胞具有双重作用：低浓度NO能够诱导细胞凋亡相关基因(如p53)的突变、增加肿瘤细胞耐药性、促进肿瘤血管再生和转移，促进肿瘤细胞生长；高浓度NO能够上调抑癌基因p53的表达、促进抗凋亡蛋白酶体的降解、增加线粒体膜通透性、释放细胞色素C(Cyt-c)、诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞，发挥抗肿瘤活性。

NO供体是指在体内经过酶或非酶作用能够释放NO的化合物，它可以作为体内NO的运输形式和存储形式，延长NO的半衰期、实现NO的可控释放。目前已经报道的NO供体主要有硝酸酯类、偶氮鎓二醇盐类(Diazeniumdiolates，NONOates)、亚硝基硫醇类和呋喃氮氧化物类等。其中，偶氮鎓二醇盐类的O²位原子进行结构修饰后可形成稳定存在的前药，在特定的条件下活化并释放NO，实现NO的靶向性和可控性释放，因而引起人们广泛的关注，具体NO释放机制如下所示：

目前已报道的偶氮鎓二醇盐类NO供体前药：1)基于各种酶(如酯酶、糖苷酶、谷胱甘肽转移酶、β-内酰胺酶、P450酶等)活化的前药；2)光照(紫外光、近红外光、可见光等)活化的前药；3)活性氧簇(过氧化氢、过氧亚硝酸盐等)活化的前药。

过氧化氢(H₂O₂)是一类重要的活性氧簇，一些研究表明肿瘤细胞内的H₂O₂浓度高达5μM～1.0mM，远高于正常细胞(<1μM)。因此，H₂O₂活化的偶氮鎓二醇盐可实现NO在肿瘤细胞内的选择性释放。目前已报道的H₂O₂活化的偶氮鎓二醇盐都是基于H₂O₂响应的苯硼酸酯结构，存在结构单一、稳定性较差、H₂O₂特异性不足的问题，其抗肿瘤活性也缺乏较为详细的研究。本发明首次将H₂O₂响应的α-酮酰胺结构用于偶氮鎓二醇盐前药修饰，发展了一类全新的H₂O₂响应的偶氮鎓二醇盐前药，与已报道的结构相比，其稳定性和H₂O₂特异性大大提高。我们还对其NO释放、抗肿瘤活性、构效关系(不同的R₁、R₂对NO释放和抗肿瘤活性的影响)、抗肿瘤机制等进行了研究。

发明内容

本发明合成了一种全新的α-酮酰胺修饰的偶氮鎓二醇盐类前药。在无H₂O₂存在时其稳定性高；H₂O₂存在时，其α-酮酰胺结构能经H₂O₂亲核进攻、重排、水解(如图1所示)，生成CO₂、对硝基苯甲酸和苯胺，苯胺再经1,6-消除释放出NO。该类前药对H₂O₂的特异性很高，对活性氧族过氧亚硝酸盐几乎无响应。本发明还对该类前药的NO释放、抗肿瘤活性、构效关系(不同的R₁、R₂对NO释放和抗肿瘤活性的影响)、抗肿瘤机制等进行了研究。

本发明的第一个目的是提供一种含α-酮酰胺的偶氮鎓二醇盐类化合物，包括式I所示结构的化合物，所述化合物是H₂O₂响应的偶氮鎓二醇盐类前药：

X为氢、烷基、卤素、硝基、氰基、三氟烷基、氨基、羧基、烷氧基、酰氨基R_a-CONH-、烷氧酰基R_aOCO-，其中R_a选自烷基、卤代烷基、环烷基、卤代环烷基、链烯基、卤代链烯基、芳香基；

R₁和R₂为取代或未取代的C_1-12的直链烷基或烯基、取代或未取代的C_3-12的支链烷基或烯基、取代或未取代的C_1-4芳基烷基、取代或未取代的苄基、取代或未取代的芳杂基；或NR₁R₂为取代或未取代的吡咯烷基、哌嗪基、吗啉基、哌啶基、脯胺醇基。

在本发明的一种实施方式中，所述取代的C_1-12的直链烷基或烯基、C_3-12的支链烷基或烯基、C_1-4芳基烷基、苄基、芳杂基、吡咯烷基、哌嗪基基、吗啉基、哌啶基、脯胺醇基中的取代基包括卤素、硝基、氰基、三氟烷基、氨基、羧基、烷氧基。

在本发明的一种实施方式中，所述芳杂基为含1-3个杂原子的芳基，所述杂原子包括S、N、O。

在本发明的一种实施方式中，所述氨基为-NR_aR_b，其中R_a、R_b独立选自氢、取代或未取代的C_1-12烷基，或者NR_aR_b为取代或未取代的吡咯烷基、哌嗪基、吗啉基、哌啶基、脯胺醇基。

在本发明的一种实施方式中，X优选氢，R₁和R₂为取代或未取代的C_1-12的直链烷基，取代或未取代的C_3-12的支链烷基；或者NR₁R₂为取代或未取代的吡咯烷基、哌嗪基、吗啉基、哌啶基、脯胺醇基；如下通式(II)所示：

在本发明的一种实施方式中，R₁、R₂进一步优选取代或未取代的C_1-3的直链烷基，或NR₁R₂为取代或未取代的吡咯烷基、哌嗪基、吗啉基、哌啶基。

本发明更进一步优选的方案结构如下：

在本发明的一种实施方式中，所述式(I)化合物是将中间体1与4-氨基苯甲醇反应得到中间体2，然后中间体2的醇羟基经溴代后再和不同取代的偶氮鎓二醇盐反应得到的；

在本发明的一种实施方式中，所述化合物的制备方法包括：

(1)将对硝基苯乙酮溶解在吡啶中，加入二氧化硒(SeO₂)，在回流和氮气保护下搅拌，得中间体1，其中对硝基苯乙酮和SeO₂摩尔比为1:(1-2)，其中优选1:1.5。

(2)以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为反应溶剂，加入中间体1、对氨基苯甲醇、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，在室温下搅拌得中间体2，其摩尔比为1:(0.8-1.5):(1-2):(1-2)，优选1:1:1.5:1.5。

(3)以二氯甲烷(DCM)为反应溶剂，加入中间体2、四溴化碳(CBr₄)和三苯基膦(PPh₃)，在室温和氮气保护下搅拌得中间体3，其摩尔比为1:(1-2):(1-2)，优选1:1.5:1.5。

(4)以DMF为反应溶剂，加入中间体3、不同结构的偶氮鎓二醇盐和碳酸氢钠(NaHCO₃)，在0℃和氮气保护下搅拌分别得A、B、C、D，其摩尔比为1:(1-2):(1-2)，优选1:1.5:1。

本发明的第二个目的是将式(I)化合物作为用于抗肿瘤药物的用途。

本发明的第三个目的是提供一种抗肿瘤制剂，所述制剂含有上述式I所示结构的的化合物。

在本发明的一种实施方式中，所述制剂还包括药物载体和/或药用辅料。

在本发明的一种实施方式中，所述制剂的剂型包括注射液、注射用冻干粉针、控释注射剂、脂质体注射剂、混悬剂、植入剂、栓塞剂、胶囊剂、片剂、丸剂和口服液。

在本发明的一种实施方式中，所述药物载体包括微囊、微球、纳米粒和脂质体。

在本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。

在本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素以及精制卵磷脂。

本发明有益效果：

与已报道的苯硼酸酯类偶氮鎓二醇盐相比，本发明的化合物稳定性高、对H₂O₂特异性响应效果好，不同结构可实现对不同肿瘤细胞的选择性抑制，提供了一类安全有效、普适性强的新型抗肿瘤药物，丰富了偶氮鎓二醇盐类NO供体的种类和潜在生物学价值。

在不存在H₂O₂的条件下，前药在不同pH的PBS溶液、GSH溶液和牛血浆液中表现出优异的稳定性，显著优于相应的苯硼酸酯类偶氮鎓二醇盐。在H₂O₂的作用下，前药迅速降解释放NO，其NO释放量与偶氮鎓二醇盐部分的结构相关。重要的是，前药特异性响应H₂O₂，对另一活性氧族过氧亚硝酸盐(ONOO^-)几乎不响应。与之相反，苯硼酸酯类偶氮鎓二醇盐除了响应H₂O₂也明显响应ONOO^-，特异性不足。

细胞毒试验表明，本发明合成的部分偶氮鎓二醇盐类前药对不同的肿瘤细胞呈现特异性的抑制作用。例如，化合物D对肺癌细胞A549抑制作用尤为突出(IC₅₀＝0.88μM)，化合物B对黑色素瘤细胞B16的抑制活性很强(4.27μM)。重要的是，化合物对正常结肠上皮细胞CCD 841CON的毒性均较低，肿瘤细胞选择性突出，提示其具有较好的安全性。

以化合物D为例进行了抗肿瘤机制研究，结果表明，D能够诱导肿瘤细胞G2/M期阻滞、诱导肿瘤细胞凋亡、降低肿瘤细胞线粒体膜电位。

以上结果表明本发明合成的偶氮鎓二醇盐类抗肿瘤前药具有潜在的临床价值。

附图说明

图1为α-酮酰胺结构的偶氮鎓二醇盐前药在H₂O₂作用下降解释放NO的机制示意图；

图2为化合物A的¹H NMR和¹³C NMR(CDCl₃)；

图3为化合物B的¹H NMR和¹³C NMR(CDCl₃)；

图4为化合物C的¹H NMR和¹³C NMR(CDCl₃)；

图5为化合物D的¹H NMR和¹³C NMR(DMSO)；

图6为化合物A和4在不同条件下的稳定性；

图7为室温下，HPLC监测受试化合物(100μM)对H₂O₂及ONOO^-的响应；其中，A)化合物D或5与H₂O₂(10eq.)孵育在PBS 7.4/DMSO(v:v，1:1)混合溶液中；B)化合物D和不同浓度的H₂O₂孵育在PBS 7.4/DMSO(v:v，1:1)混合溶液中1h；(C)化合物D或5与H₂O₂或ONOO^-(10eq.)孵育在PBS 7.4/DMSO(v:v，1:1)混合溶液中1h；

图8为化合物D体外经H₂O₂作用生成对硝基苯甲酸和对氨基苯甲醇的质谱图；

图9为化合物D在A549细胞内的NO释放结果示意图；

图10为化合物D诱导A549细胞周期阻滞结果示意图；

图11为化合物D诱导A549细胞凋亡结果示意图；

图12为化合物D诱导A549细胞线粒体膜电位改变结果示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，仅仅是示例性的说明，对所举例化合物的物理数据与这些化合物所指定的结构一致。但所举实例并不限制本发明的范围。

实施例1：化合物A的合成

第一步：中间体1的合成

具体操作：对硝基苯乙酮(1g，6.06mmol)溶解在吡啶(10mL)中，加入SeO₂(1g，9.08mmol)，其中对硝基苯乙酮和SeO₂摩尔比为1:1.5。将混合物通入氮气保护，在90℃搅拌4h，反应结束后冷却过滤，滤饼用乙酸乙酯(EA)洗3次，收集有机层后用2M HCl洗，最后合并有机层，加无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，柱层析洗脱(PE/EA v/v，7:3)得黄色中间体1。

第二步：中间体2的合成

具体操作：中间体1(1g，5.13mmol)溶解在四氢呋喃THF(10mL)中，依次加入对氨基苯甲醇(0.64g，5.13mmol)、EDCI(1.475g，7.7mmol)和DIPEA(1.28mL，7.7mmol)，在室温下搅拌1～2h。反应结束后，依次用水和饱和食盐水洗，合并有机层，加无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂得黑褐色中间体2，直接进行下一步反应。

ESI-MS:299.3[M–H]^-.

第三步：中间体3的合成

具体操作：中间体2(0.3g，1mmol)溶于无水DCM中，在0℃、氮气保护下搅拌，再依次加入PPh₃(0.395g，1.5mmol)和CBr₄(0.5g，1.5mmol)，恢复至室温后继续搅拌1h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂、柱层析洗脱得(PE/EAv/v，9:1)黄色中间体3。

m.p.133–135℃.

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.98(s,1H,NH),8.66–8.54(m,2H,ArH),8.41–8.29(m,2H,ArH),7.74–7.63(m,2H,ArH),7.50–7.39(m,2H,ArH),4.51(s,2H,ArCH₂).

¹³CNMR(100MHz,Chloroform-d)δ185.94,157.80,151.10,137.64,136.30,135.35,132.76,130.29,123.71,120.33,32.98.

ESI-MS:361.1[M–H]^-.

第四步：化合物A的合成

偶氮鎓二醇盐(64mg，0.42mmol)和NaHCO₃(23mg，0.28mmol)溶于于无水DMF(2mL)中，在0℃、氮气保护下搅拌，再加入中间体3(100mg，0.28mmol)，恢复至室温后继续搅拌1～2h。反应结束后依次用水和饱和食盐水洗，合并有机层，加无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，柱层析洗脱得(PE/EA v/v，7:3)目标化合物A(38％)。

m.p.117–118℃.

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.987(s,1H,NH),8.63–8.59(m,2H,ArH),8.38–8.33(m,2H,ArH),7.73–7.68(m,2H,ArH),7.50–7.41(m,2H,ArH),5.28(s,2H,ArCH₂),3.61–3.44(m,4H,NCH₂×2),1.98–1.90(m,4H,CH₂×2).

¹³C NMR(100MHz,Chloroform-d)δ186.07,157.94,151.12,137.74,136.42,133.65,132.73,129.92,123.69,120.11,74.66,51.06,22.95.

ESI-MS:428.30[M–H]^-.

实施例2：化合物B的合成

偶氮鎓二醇盐(71mg，0.42mmol)和NaHCO₃(23mg，0.28mmol)溶于无水DMF(2mL)中，在0℃、氮气保护下搅拌，再加入中间体3(100mg，0.28mmol)，恢复至室温后继续搅拌1～2h。反应结束后依次用水和饱和食盐水洗，合并有机层，加无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂、柱层析洗脱(PE/EA v/v，6:4)得粗品，进一步通过DCM/EtOH重结晶得目标化合物B(27％)。

m.p.149–150℃.

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.01(s,1H,NH),8.63–8.57(m,2H,ArH),8.38–8.33(m,2H,ArH),7.74–7.68(m,2H,ArH),7.48–7.42(m,2H,ArH),5.22(s,2H,ArCH₂),3.85–3.80(m,4H,OCH₂×2),3.43–3.37(m,4H,NCH₂×2).

¹³C NMR(100MHz,Chloroform-d)δ186.00,157.91,151.11,137.68,136.62,133.08,132.74,130.00 123.70,120.16,75.15,65.80,51.73.

ESI-MS:428.30[M–H]^-.

实施例3：化合物C的合成

偶氮鎓二醇盐(100mg，0.42mmol)和NaHCO₃(23mg，0.28mmol)溶于无水DMF(2mL)中，在0℃、氮气保护下搅拌，再加入中间体3(100mg，0.28mmol)，恢复至室温后继续搅拌1～2h。反应结束后依次用水和饱和食盐水洗，合并有机层，加无水硫酸钠干燥、减压蒸馏除去溶剂，柱层析洗脱(PE/EA v/v，7:3)得目标化合物C(47％)。

m.p.145–146℃.

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.01(s,1H,NH),8.60–8.55(m,2H,ArH),8.36–8.30C(m,2H,ArH),7.72–7.67(m,2H,ArH),7.44–7.38(m,2H,ArH),5.20(s,2H,ArCH₂),4.13(q,J＝7.1Hz,2H,OCH₂),3.62(dd,J＝6.0,4.4Hz,4H,CONCH₂×2),3.41–3.28(m,4H,NCH₂×2),1.25(t,J＝7.1Hz,3H,CH₃).

¹³C NMR(100MHz,Chloroform-d)δ185.95,157.90,155.18,151.05,137.63,136.64,132.90,132.68,129.95,123.65,120.14,75.19,61.94,51.16,42.38,14.70.

ESI-MS:499.38[M–H]^-.

实施例4：化合物D的合成

偶氮鎓二醇盐(76mg，0.42mmol)和NaHCO₃(23mg，0.28mmol)溶于无水DMF(2mL)中，在0℃、氮气保护下搅拌，再加入中间体3(100mg，0.28mmol)，恢复至室温后继续搅拌1～2h。反应结束后依次用水和饱和食盐水洗，合并有机层，加无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂、柱层析洗脱(DCM/MeOH v/v，95:5)得目标化合物D(16％)。

m.p.142–143℃

¹H NMR(400MHz,d⁶-DMSO)δ11.02(s,1H,NH),8.39(d,J＝8.8Hz,2H,ArH),8.29(d,J＝8.8Hz,2H,ArH),7.71(d,J＝8.3Hz,2H,ArH),7.30(d,J＝8.2Hz,2H,ArH),4.58(s,1H,OH),3.45(s,3H,ArCH₂+HOCH),2.67(d,J＝10.5Hz,2H,NCH₂),2.06(s,2H,NCH₂),1.75–1.62(m,2H,CHCH ₂),1.45–1.33(m,2H,CHCH ₂).

¹³CNMR(101MHz,d⁶-DMSO)δ187.71,161.60,150.52,137.59,136.25,131.55,129.36,123.94,120.10,61.54,50.72,34.34,30.33.

用¹H NMR，¹³C NMR和ESI-MS表征化合物分子结构，并将获得的产物在4℃下保存。

¹H NMR，¹³C NMR结果分别如图2-5所示，表明化合物A、B、C和D成功合成。

实施例5：前药稳定性考察

要实现NO的选择性释放，前药在没有H₂O₂存在的条件下应该足够稳定。我们通过HPLC对前药在不同pH的PBS溶液中、在谷胱甘肽(GSH)存在下和在牛血浆中的稳定性进行了考察，并与已报道的硼酸酯类偶氮鎓二醇盐进行了比较。以化合物A为例，试验表明，其在PBS(pH＝5.0,7.4,8.0)、GSH和牛血浆中孵育48h有较好的稳定性，降解率低于10％。与A对应的苯硼酸酯化合物4则稳定性较差，有明显的降解(图6)。该试验说明本发明合成的前药稳定性高，显著优于已报道同样是过氧化氢响应机制的化合物。

实施例6：前药的H₂O₂响应性能研究

我们通过HPLC和LCMS对前药在H₂O₂存在下的活化行为进行了检测。以化合物D为例，加入H₂O₂后前药在1.5h内几乎全部降解，与对应的苯硼酸酯化合物5的降解速度相当(图7A)。同时，HPLC和LC-MS均清楚地检测到了降解副产物对硝基苯甲酸和对氨基苯甲醇的生成(图8)。此外，D对H₂O₂的响应呈现浓度依赖性(图7B)。重要的是，D对活性氧簇过氧亚硝酸盐(ONOO^-)几乎不响应，体现出优异的H₂O₂特异性，而苯硼酸酯化合物5在ONOO^-存在时有明显降解，特异性不足(图7C)。

实施例7：肿瘤细胞内NO释放检测

对数生长期人肺腺癌细胞A549细胞以1×10⁶cells/孔接种于6孔板，置于37℃、5％CO₂条件下培养，直至细胞50％融合后，用无血清的RPMI1640培养基孵育2h使细胞同步化。随后，弃去上清，以终浓度为0、3、6μM的化合物作用48h。给药孵育后的细胞用不含EDTA的胰酶消化后，1500rpm，4℃离心5min收集细胞。每个样中加入1.5mL浓度为5μM的DAF-FMDA工作液，于37℃避光孵育20min。孵育完毕后，1500rpm离心10min，小心弃染色反应液，每孔加入200μL PBS清洗2次，每次离心5min，后再用200μL PBS重悬细胞。半个小时内用BD小型流式细胞仪FL1通道检测10000个细胞中细胞的荧光信号值，得出峰移曲线(细胞内NO多时，荧光信号强，峰右移)，进而测定细胞内NO水平。

试验结果如图9所示，同浓度的化合物A、B、C、D分别作用于细胞后，NO释放量有所差异，其中D的NO释放量最多，而A的NO释放量最少(图9A)。该结果表明，前药偶氮鎓二醇盐部分的结构差异(R₁和R₂)会影响化合物H₂O₂活化后最终的NO释放量。含4-羟基哌啶结构的前药D在A549细胞内的NO释放最佳。用20mM NAC(H₂O₂清除剂)或50μM C-PTIO(NO清除剂)预处理细胞1h，均能显著抑制化合物D诱导的细胞内NO释放(图9B)。

实施例8：体外抗肿瘤活性测定

筛选细胞株：急性粒细胞白血病细胞HL-60、人肺腺癌细胞A549、人结肠癌细胞HCT-116、黑色素、人正常结肠上皮细胞CCD 841CON。

试验方法：

(1)将细胞消化、计数，配制细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液；96孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h；用培养基稀释药物至所需工作液浓度，每孔加入100μL相应的含药培养基，同时设立阴性对照组；96孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中培养72小时；将96孔板进行MTT染，λ＝490nm，测定OD值；1)每孔加入20μLMTT(5mg/mL)，在培养箱继续培养4h；2)弃上清，每孔加入150μL DMSO，摇床10min轻轻地混匀；3)λ＝490nm，酶标仪读出每孔的OD值，计算抑制率以及半抑制浓度IC₅₀。

结果如表1所示，偶氮鎓二醇盐类化合物A-D对HCT-116、A549、HL-60、B16具有不同程度的抑制作用，且呈现一定的细胞株特异性。例如，化合物D对A549细胞抑制作用尤其突出(IC₅₀＝0.88μM)，化合物B对A549细胞的抑制活性不如D，但对B16细胞的抑制作用很强(IC₅₀＝4.27μM)。上述结果表明，α-酮酰胺结构和偶氮鎓二醇盐结构共同决定了该类前药的细胞毒性和细胞特异性，也提示我们，通过不同的结构变化有望得到针对不同肿瘤细胞的高活性抗肿瘤前药，具有较强的普适性。

表1 MTT试验结果

实施例9：细胞周期阻滞试验

将1×10⁶cells/孔的A549细胞接种到6孔板，每孔1.5mL，培养24h，以终浓度为0、3、6μM的化合物D或6μMJS-K作用48h，或细胞先用20mM NAC或50μM C-PTIO预处理1h后，再加入6μM化合物D作用48h。药物处理结束后用胰蛋白酶消化细胞，4℃、1000rpm离心5min，加1mLPBS清洗细胞，离心弃上清，并重复上述步骤，加入400μL PI(碘化丙啶)染色均匀，4℃避光30min，上机检测，记录激发波长488nm处红色荧光。

试验结果如图10所示，随着化合物D的浓度增加，G2/M期的细胞逐渐增加(30–50％)，而G0/G1期和S期的细胞显著降低，G2/M期阻滞作用略高于阳性对照JS-K。NAC或C-PTIO预处理显著削弱了化合物D诱导的细胞G2/M期阻滞作用。由此可见化合物D通过H₂O₂和NO依赖的方式诱导肿瘤细胞G2/M期阻滞。

实施例10：细胞凋亡检测

将1×10⁶cells/孔的A549细胞接种到6孔板，每孔1.5mL，培养24h，以终浓度为0、3、6μM的化合物D或6μMJS-K作用48h，或细胞先用20mM NAC或50μM C-PTIO预处理1h后，再加入6μM化合物D作用48h。药物处理结束后用胰蛋白酶消化细胞，4℃、1000rpm离心5min，弃上清，加1mLPBS清洗细胞，离心弃上清，并重复上述步骤，然后加5μLAnnexinV-FITC混匀并避光反应15min，采用流式细胞仪进行检测。

试验结果如图11所示，化合物D浓度依赖性地诱导A549细胞凋亡，活性略高于阳性对照JS-K。NAC或C-PTIO预处理显著削弱D诱导细胞凋亡的能力。由此可见化合物D通过H₂O₂和NO依赖的方式诱导肿瘤细胞凋亡。

实施例11：线粒体膜电位检测

对数生长期细胞以1×10⁶cells/孔接种于6孔板，置于37℃、5％CO₂条件下培养，直至细胞50％融合后，用无血清的RPMI1640培养基孵育2h使细胞同步化。随后，弃去上清，以终浓度为0、3、6μM的化合物D或6μMJS-K作用48h，或细胞先用20mM NAC或50μM C-PTIO预处理1h后，再加入6μM化合物D作用48h。孵育结束后，分别收集细胞置于流式管中，每管加入0.5mL细胞培养液，重悬后加入0.5mL JC-1染色工作液，混匀，置于37℃孵箱中孵育30min，孵育期间，按照每1mL JC-1染色缓冲液加入4mL蒸馏水的比例，配置适量的JC-1染色缓冲液，并放置于冰浴，孵育结束后，1000rmp、4℃离心4min，弃上清，每管中加入1mL JC-1染色缓冲液洗涤细胞两次，最后使用JC-1染色缓冲液重悬细胞，30min内进行上机检测。

试验结果如图12所示，化合物D浓度依赖性地诱导A549细胞线粒体膜电位下降，活性高于阳性对照JS-K。NAC或C-PTIO预处理明显削弱D诱导细胞线粒体膜电位降低的能力。由此可见化合物D通过H₂O₂和NO依赖的方式降低肿瘤细胞的线粒体膜电位。