Ub2/ub3基因在调控玉米多果穗发育中的应用

文档序号：1717437 发布日期：2019-12-17 浏览：22次 >En<

阅读说明：本技术 Ub2/ub3基因在调控玉米多果穗发育中的应用 (Application of UB2/UB3 gene in regulation and control of multiple-ear development of corn ) 是由王海洋孔德鑫魏洪彬王宝宝赵永平刘宇婷赵斌斌李全权薛伟聪于 2019-08-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了UB2/UB3基因在调控玉米多果穗发育中的应用,具体为UB2和UB3基因双突变在调控玉米多果穗发育中的应用。本发明利用CRISPR/Cas9转基因技术对玉米中的UB2和UB3这两个靶点进行了基因编辑,使UB2基因的靶位点有碱基的缺失,导致移码突变,而UB3基因则大片段的删除；结果显示,UB2和UB3双突变体植株的雄穗分枝数减少,并首次观察到UB2和UB3双突变体的果穗数增加,主穗的穗柄上长出新的雌穗,表现出多穗性,下部的腋生分生组织也脱抑制发育成雌穗,并且伴有气生根增多的表型；表明敲除UB2和UB3基因后,可使玉米突变体植株表现出多果穗表型,本发明对玉米多穗性的遗传改良提供了理论依据,具有较大的应用前景。(The invention discloses an application of UB2/UB3 genes in regulation and control of multiple-ear development of corn, and particularly relates to an application of UB2 and UB3 gene double mutation in regulation and control of multiple-ear development of corn. The invention utilizes CRISPR/Cas9 transgenic technology to edit two target points of UB2 and UB3 in corn, so that the target point of UB2 gene has base deletion, thereby causing frame shift mutation, and deleting the large fragment of UB3 gene; the results show that the number of tassel branches of UB2 and UB3 double mutant plants is reduced, the number of ears of UB2 and UB3 double mutants is increased for the first time, new ears grow on the ear stems of the main ears, the ears are shown to be multi-tassel, the axillary meristem at the lower part is also removed to inhibit the development of the ears, and the phenotype of increased aerial root is accompanied; the deletion of UB2 and UB3 genes shows that the maize mutant plant can show a multi-spike phenotype, the invention provides theoretical basis for genetic improvement of maize multi-spike property, and has great application prospect.)

UB2/UB3基因在调控玉米多果穗发育中的应用

技术领域

本发明涉及玉米遗传育种技术领域，更具体地，涉及UB2/UB3基因在调控玉米多果穗发育中的应用。

背景技术

玉米(拉丁学名：Zea mays L.)是禾本科玉蜀黍属一年生草本植物，玉米是一年生雌雄同株异花授粉植物，植株高大，茎强壮，是重要的粮食作物和饲料作物，也是全世界总产量最高的农作物，其种植面积和总产量仅次于水稻和小麦。合理增加玉米种植密度是提高玉米单产的有效途径之一，但密植带来的光质量改变(低R/FR比例)会激发植株一系列的避荫反应：例如株高和穗位高增高、抗倒伏能力差、叶面积减小、分枝减少、雌雄花开花间隔延长、结实率下降等，最终导致减产。因此，培育耐密植、高光效、适宜机械化作业理想株型品种是提高我国玉米单产的最重要技术措施。

SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)是植物特有的一类转录因子，广泛存在于绿色植物中。SPL在植物形态建成、发育阶段转变、孢子发生、花和果实发育、花青素积累、逆境胁迫应答以及激素信号转导等多个生理生化过程中发挥重要调控作用(Gouet al.,2011)。例如，拟南芥AtSPL3、AtSPL4、AtSPL5、AtSPL9、AtSPL10等可以控制植物幼年期到成年期以及成花转变；拟南芥AtSPL8不仅参与调控GA信号转导，而且在维持植物育性方面发挥重要作用；拟南芥AtSPL9和AtSPL10可以通过MYB-bHLH-WD40复合体以及DFR调控花青素合成代谢，过量表达AtSPL9和AtSPL10会抑制花青素积累；水稻OsSPL14是控制水稻株型的关键基因，它可以减少水稻的分蘖数，增加花序分枝、穗粒数以及千粒重，从而提高水稻产量；OsSPL16则可以控制米粒大小、形状和色泽；番茄LeSPL-CNR是控制果实成熟的一个关键基因，该基因发生突变会抑制果实的正常成熟。

玉米中与水稻IPA1/OsSPL14直接同源的两个SPL基因UNBRANCHED2(UB2，编码ZmSBP8蛋白)和UNBRANCHED3(UB3，编码ZmSBP30蛋白)同时突变后，植株表现出雄穗分枝显著减少，果穗穗行数增加的表型(Chuck et al.,2014；Liu et al.,2015a)。但是，ZmUB2/UB3在调控果穗数目及如何响应密植栽培条件尚不清楚。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供UB2/UB3基因在调控玉米多果穗发育中的应用。本发明利用CRISPR/Cas9转基因技术敲除UB2和UB3基因后，在玉米突变体植株中观察到多果穗表型，该研究结果对玉米多穗性的遗传改良提供了理论依据。

本发明的第二个目的在于提供UB2/UB3基因在多果穗玉米育种中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明利用CRISPR/Cas9转基因技术对玉米中的UB2和UB3基因的两个靶点进行了基因编辑，使UB2基因的靶位点有碱基的缺失，导致移码突变，而UB3基因则大片段的删除，得到了基因编辑后序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所述的UB2和UB3基因的双突变体；结果显示，UB2和UB3双突变体植株的雄穗分枝数减少，且首次观察到UB2和UB3双突变体的果穗数增加，主穗的穗柄上长出新的雌穗，表现出多穗性，下部的腋生分生组织也脱抑制发育成雌穗，并且伴有气生根增多的表型，表明敲除UB2和UB3基因后，可使玉米突变体植株表现出多果穗表型，对玉米多穗性的遗传改良提供了理论依据。

本发明首先保护UB2/UB3基因在调控玉米多果穗发育中的应用。

具体地，所述UB2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，UB3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，

具体地，为UB2和UB3基因的双突变在调控玉米多果穗发育中的应用。

具体地，为UB2和UB3基因的敲除突变在调控玉米多果穗发育中的应用。

具体地，为SEQ ID NO:3所述的UB2基因突变型和SEQ ID NO:4所述的UB3基因突变在调控玉米多果穗发育中的应用。

同时，本发明还提供UB2/UB3基因在多果穗玉米育种中的应用，为敲除、突变玉米中的UB2和UB3基因，得到UB2和UB3基因双突变玉米植(多果穗玉米植株)。

具体地，删除玉米中SEQ ID NO:1所示UB2基因第2420～2423bp和第3197bp及SEQID NO:2所示UB3基因第2980～3308bp，从而获得如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所述的UB2和UB3基因双突变玉米植株(多果穗玉米植株)。

优选地，所述敲除突变为利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行，具体为将UB2和UB3基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体转化玉米，得到UB2/UB3转基因玉米植株(多果穗玉米植株)。

优选地，所述CRISPR/Cas9基因编辑载体中UB2基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:3～4所示，UB3基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:5～6所示；具体为，将含有SEQ ID NO:3～6所示sgRNA的CRISPR/Cas9基因编辑载体通过农杆菌介导法转化玉米，得到UB2/UB3转基因玉米植株(多果穗玉米植株)。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了UB2/UB3基因在调控玉米多果穗发育中的应用，具体为UB2和UB3基因的双突变体在调控玉米多果穗发育中的应用。本发明利用CRISPR/Cas9转基因技术对玉米中的UB2和UB3这两个靶点进行了基因编辑，使UB2基因的靶位点有碱基的缺失，导致移码突变，而UB3基因则大片段的删除；结果显示，UB2和UB3双突变体植株的雄穗分枝数减少，并首次观察到UB2和UB3双突变体的果穗数增加，主穗的穗柄上长出新的雌穗，表现出多穗性，下部的腋生分生组织也脱抑制发育成雌穗，并且伴有气生根增多的表型；表明敲除UB2和UB3基因可使玉米突变体植株表现出多果穗表型，双突变UB2和UB3基因可应用于培育多果穗玉米品种，具有较大的应用前景。

附图说明

图1为UB2/UB3转基因植株的基因型鉴定，PCR产物测序后与野生型的序列进行比对。

图2为UB2/UB3调控玉米的雄穗分枝数、雌穗多穗性、气生根等表型。

图3为玉米UB2/UB3双突变体的雌穗在V14时期差异显著。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 玉米UB2和UB3基因的CRISPR/Cas9转基因植株的构建

1、方法

UB2(SEQ ID NO:1)和UB3基因(SEQ ID NO:2)的CRISPR/Cas9敲除载体的构建过程为：首先，利用SnapGene Viewer软件及同源序列比对设计和筛选UB2/UB3基因特异的靶标序列(sgRNA)，为了保证基因编辑效率，每个基因选取两个最优的靶标序列：

UB2：CCAGCTGCCTGAATTCGACC(SEQ ID NO:3)，

CCAGTTCTCAGGTGAGCTCGAGC(SEQ ID NO:4)；

UB3：CCACAACCTGGCCGAATTTGACC(SEQ ID NO:5)，

GGTTCGACCTGGTGGTGAAAGGG(SEQ ID NO:6)；

之后将这些靶标序列引入到sgRNA表达盒中。同时，将人类中的hSpCas9序列用商业化的PCR Cloning Kit试剂盒克隆到pCPB载体中，构建成为pCPB-ZmUbi:hSpCas9载体。接着，将两个sgRNA表达盒通过HD Cloning Kit试剂盒***到pCPB-ZmUbi:hSpCas9的HindIII酶切位点间。最终构建成的CRISPR/Cas9基因编辑载体经过PCR测序验证无误后用于后续的遗传转化。

所构建的CRISPR/Cas9载体通过农杆菌介导的方法转化玉米自交系ZC01，得到UB2/UB3转基因玉米植株。

2、结果

(1)基因型鉴定

PCR扩增UB2/UB3转基因玉米植株的UB2/UB3基因，PCR产物测序后与野生型的序列进行比对。结果如图1所示，显示UB2基因的靶位点有碱基的缺失，具体为SEQ ID NO:1所示UB2基因第2420～2423bp和第3197bp有碱基的缺失，导致移码突变，而UB3基因有大片段的删除，具体为SEQ ID NO:2所示UB3基因第2980～3308bp有大片段的删除；得到突变的UB2基因序列如SEQ ID NO:7所示，突变的UB3基因序列如SEQ ID NO:8所示。

(2)转基因植株表型观察

结果如图2所示，UB2和UB3双突变体植株的雄穗分枝数减少，与Chuck et al.(2014)报道的表型一致。此外，我们首次观察到UB2和UB3双突变体的果穗数增加，主穗的穗柄上长出新的雌穗(多穗性)。下部的腋生分生组织也脱抑制发育成雌穗。并且伴有气生根增多的表型。气生根增多，表明根系发达，抓地稳，会提升玉米的抗倒伏能力。

(3)玉米野生型和UB2和UB3双突变体的雌穗在不同发育时期的差异比较

结果如图3所示，在玉米V14时期，观察到突变体的雌穗穗柄处已具有腋生分生组织的发育，将来会发育为成熟的多果穗表型；而野生型玉米则没有，表明UB2和UB3双突变(SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)可以增加玉米的果穗数，使玉米表现多果穗性状，可用于培育多果穗玉米品种。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> UB2/UB3基因在调控玉米多果穗发育中的应用

<141> 2019-08-28

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3724

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays L.)

<400> 1

atggagtccg gcggtggcgg ggacgaccag ctgcacggcc tcaagttcgg caagaagatc 60

tacttcgagg acgccgccgg ctccagcagc ggcagcagca gcggcggtgg cagcgcgccc 120

gcgcctccag cgacgcagca gccgtcgccg ccggccgctt cgcctagggc cccggccggc 180

ggcggcagga ggggcagggc cgcggccggc ggcgcgggcc cctcgacggc gcccgcgccc 240

gcgcgctgcc aggtcgacgg ctgcaacgtt gacctcaccg acgtcaagcc cgcctactac 300

tgccgccaca aggtgtgcaa aatgcactcc aaggagcccc gcgtcctcgt caacggcctc 360

gagcagcgct tctgccagca gtgcagcagg tcaccaccca gccccgcccc gccattgctg 420

cacagttgca ctccccccct cttccacctc cacctctcat tcaattgatt gtttccagtt 480

gtcacttgtt ggttgcattc gctctgcagt ctgctccccc gtgttttttt ttccagtccc 540

actcccttca ttcacagtct agggttttag ggaggctacc tagacgaaga ccagacggtt 600

tcaggtccat cataccacgg acacgctaca aaactataga tgcgctaaac agtgggagct 660

agggaaagaa acttggctcg gtttgacgga gcttccatcc catttcatct atggcgacgg 720

cttctcctcc tgaagctgaa caagaacgaa ggaggaaaaa aacaaaagct gctttggcat 780

tactgctacg ctttaatgtt tcgcttgaat ggtgctcatg agcacaggta ggtctgatgg 840

atgctcctcc taaaaatatg atagagtgat gtgactcagc ctgcccctgc cctgccctgc 900

ctgtctgtca gttcgctttg cattagattc caccgctaat actactcggg tatcccagtg 960

aagcctgtca gctaacaagc cattacaata agcgattagt agccttgagc ctggttatac 1020

gtgtggtccc caaaaaagga acagcaacag tgaggaattt tcaaaggagt ctttgctttg 1080

ccgatgcagt agtattttaa tttagaggag tcccaacttt gcacaggttg acactatcca 1140

ttgttttagc tagctagcct gcctcaaata tagcattata cattgtttgt cccctgtact 1200

taaccatact acatcgggca tccttcgccc ccgccccccc cccccccccc cccctttttt 1260

tttttgcatt atgcaaatgg tcccccgagg aagaacaagt tgtagccttt gcaatgtgtt 1320

gttcttggcg ctgcaacttt acaggttgta cgatcctgtt catccggtgt aagatctgga 1380

ggatttctag tcccttcagg tgctacacca aactagactg ttcctggaac agctttgttt 1440

cctttggata caattagcat tttcattcat aaatcttaat tcagtcatct atctaatttg 1500

acatacaata gagagagaga gagaaactaa acatgatggt ggcgagctgc atctaatttg 1560

atatgggtag ggcctggaca cattacccta gcggcgaccg caggctttgt gctttaggac 1620

taggctacag gagtgtcctc atgtccccag caaaagagaa gggcgccaca gttctggatt 1680

tggggctctc tactaaacca cactgccact tatagcaaca aggcatatca ttagagaaga 1740

gctaagttgg accagccacc agtaccactt ggcgttatta gatggaaacc tcattattgg 1800

tgggtgtgta ctgttgtgtt aagcccggca tcacacatct ctatgaaatg attacacaca 1860

cactttctct ttgcttttct tttcttttta gtatggatgt gcaggtgtca ttatgagcgg 1920

cataagacag aggttaatgt taatctttaa tgggggatgt gcagtagtac aaccctaacc 1980

tagggagaag agaaatgtta ctctctttga tgattgtact ggcattccca ctggctttga 2040

cctaaagtgt ggtttcctat atccatgtcg cgctaagcgc tatgcatgtt gctagctact 2100

actgagataa actagtgcct tcaacttgct acgtactgtc ccaccattca gcttgcactt 2160

tattctactg taagagttac tactatggta aatggtttat gcttggtcca tggaactttt 2220

ttactgcctg atttgtttgc attctacaca aaagctatga atctacagca atgtatatgt 2280

ggatttatag aatgcaactt ccattactta taaaaattct gttgctgtgc caccaacttc 2340

cattacctgt aataaactgg gatcaagggc gcgtgaatga acacacctct gtttgtcgca 2400

tcaatcgcag gttccaccag ctgcctgaat tcgaccagct aaagaagagc tgccgcaaac 2460

gcctcgcagg ccacaacgag cgccggagga ggccgccgcc tggacccctt gcgtcacgat 2520

acggccgtca cgctgcgtcg ctcggcggta accaaaagct ggtttttacc ctgtgatgtc 2580

gtctcggcga ccaaagttcc cgtctttttt ttgtaaccgc taatgttcat gtgcttggtc 2640

cagaagagcc cggcaggctc agaagcttca tgctggattt ctcgtacccg agggtctcaa 2700

gcgccatgag gggtgggttt ccggcggtga ggcccggtgg tgaaagggtg cctggcggta 2760

tccagtggca agcgggcttg gatcctcgtc accaccaagg cgcggtcgcg ggatacggcg 2820

cccactatgg gagcgagggt ggtagctcgt cgtcggcgag gccgccggtg ttccctggcc 2880

cggagctgcc cccaggtgga tgccttgcag gagtccccgc ggactccagc tgtgctctct 2940

ctcttctgtc aactcagcca tgggatgctg cccacagcca cagccacagc cacgctgcgc 3000

caacagcggg tttcgacggc ggcagccctg tggcgccctc cctcatggcg gcgagtagct 3060

acatcgcgcc gagcccctgg accgagaccg actcctgggg ccacgaaggc gggcggagcg 3120

tgcctcagct gccacctgac gacgtccccc tcggcgaggt gcactccggc tcgagcagcc 3180

accacggcca gttctcaggt gagctcgagc tcgccctgca gggaaacagg ccagcgccag 3240

ggtcggcggc accgccagcg ccgcgcaata atcagggctc cgcgggcacg ttcgaccagg 3300

ctggcaacac gatggactgg tcgctctagg ccgggggccg aaataaagcg cagcagatcc 3360

tagccgcgca gggagatgga ggaggctgaa agtctgatgc tgcacgctgc ttgcttagct 3420

tagagcatcc agcatgataa gagtgatgaa ctgatgcggt gtcaggagac tagtttattc 3480

tgtgcttcac catgaactcg tctgtcgcgg cgtctatgta gacagacggc acacgtccgt 3540

ggttcgaagt taccagtatg cttgtcgggg actttgctcg cgatgcatta atctcattgt 3600

tcaccatcca gaaatctcat gttctctact cgtttgctgg cccgtccatg ctgccgctgc 3660

tgtggtcttt acatcaccat ggctccgcct ccatgcatca tcatttctac tgaataataa 3720

tgtg 3724

<210> 2

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<211> 23

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays L.)

<400> 4

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<210> 5

<211> 23

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<210> 7

<211> 3719

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays L.)

<400> 7