阅读说明：本技术 一种嵌入式Au纳米薄膜电极表面等离子体共振免疫分析的方法 (Surface plasma resonance immunoassay method for embedded Au nano-film electrode ) 是由 潘宏程 郭垠 陈雯 于 2019-10-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种嵌入式Au纳米薄膜电极表面等离子体共振免疫分析的方法。其方法步骤：采用柠檬酸钠还原法制备的胶体金,并利用自组装的方式将胶体金修饰在ITO电极上,通过简单的退火处理改变该传感器的局与表面等离子共振灵敏度,实现对鼠抗人IgG的灵敏检测。本发明方法制备过程简单,成本低廉。(The invention discloses a method for surface plasma resonance immunoassay of an embedded Au nano film electrode. The method comprises the following steps: the colloidal gold prepared by a sodium citrate reduction method is modified on an ITO electrode in a self-assembly mode, and the local and surface plasmon resonance sensitivity of the sensor is changed through simple annealing treatment, so that the sensitive detection of mouse anti-human IgG is realized. The method has simple preparation process and low cost.)

一种嵌入式Au纳米薄膜电极表面等离子体共振免疫分析的 方法

技术领域

本发明属于纳米薄膜材料领域及电化学传感器领域，具体为嵌入式Au纳米薄膜电极的制备方法。另外，本发明还涉及采用所述的表面等离子体共振免疫分析方法测定鼠抗人IgG的方法。

背景技术

表面等离子共振(SPR)现象是指在光波作用下，在电介质和金属交界面上形成改变光波传输的谐振波。当光照在大于全反射角的条件下入射到交界面上时，会有一部分光被反射,另外一部分光会被耦合进入等离子体内，在表面等离子中就会存在光的消失波。当入射光的波矢量平行于界面的分量和表面等离子波的波矢量，表面等离子在光作用下就会发生谐振，光波在传输中就发生了能量的损失，在宏观上展现为光波的被强烈的吸收，这种现象被称为等离子体谐振。SPR传感器的优点是；抗干扰能力强，测量的准确性高，体积小，响应速度快以及机械强度强等。因此，SPR技术在化学，生物和环境检测等领域具有广泛的应用前景。

而金纳米粒子在可见光的激励下表面等离子体激元共振效应(SPR)会在其表面产生非常大的场增强，例如以此为原理的表面增强拉曼散射可以使分子的拉曼信号增大几个甚至十几个数量级。SPR效应也使得金属纳米薄膜在定量分析生物分子相互作用等方面做出重要贡献。因此，金纳米粒子已作为一种功能材料已被广泛应用于传感器、电子、化学、医学、光学等领域。生物活性物质如抗体蛋白等，自身可检测的信号比较弱，难以定量分析或检测，需要引入外源标记物，通过其强的可检测信号来定量或示踪极微量的生物活性物质。已有的标记免疫分析包括酶免疫分析、化学发光免疫分析和荧光免疫分析等。在这些方法中基于量子点荧光的生物标记技术最受重视，然而这种方法的荧光谱峰较宽，信号的选择性较差，还存在光解和光致褪色现象，存在一定局限性。

目前，针对其它检测技术大都存在一些缺点，无法完全达到预期效果，满足实际工作中检测的需求。因此，发展高灵敏，快响应，痕量无损的目前，针对超低浓度物质的检测技术大都存在一些缺点，无法完全达到预期效果，满足实际工作中检测的需求。因此，发展高灵敏，快响应，低溶剂耗损，痕量无损的表面等离子体共振免疫分析技术，显得尤为重要。

发明内容

鉴于现有技术不足，本发明的目的是提供一种嵌入式Au纳米薄膜电极表面等离子体共振免疫分析的方法的材料制备及应用，以及提供一种采用所述的表面等离子体共振免疫分析测定鼠抗人IgG的方法。

为了达到上述的技术效果，本发明采取以下技术方案：

用纳米金修饰ITO电极，构建嵌入式Au纳米薄膜电极以实现对鼠抗人IgG的测定；一种嵌入式Au纳米薄膜电极表面等离子体共振免疫分析的方法，包括以下步骤：

(1)将事先裁好的ITO导电玻璃分别用分析纯丙酮、分析纯乙醇和二次水各超声清洗3min，并置于50℃烘箱中烘干；将烘干后洁净的ITO置于食人鱼溶液(70％H₂SO₄：30％H₂O₂)中浸泡，取出后用去离子水冲洗并超声清洗，氮气吹干；将烘干后的ITO置于10％KH550的乙醇溶液中浸泡2h，取出用乙醇超声清洗，氮气吹干，在120℃恒温箱中放置1小时，烘干待用。

(2)通过柠檬酸盐还原法合成金纳米溶胶，将1％氯金酸稀释100倍，取100mL稀释后的氯金酸水溶液(0.01％)至圆底烧瓶油浴加热至沸，在搅拌的状况下快速加入2mL 1％的柠檬酸三钠溶液作为还原剂，之后继续加热30min，观察溶液由淡黄色转灰再变为黑，最后变成橙红色，停止加热冷却至室温并储存在冰箱中直至使用。

(3)将步骤(1)中处理好的ITO浸泡在步骤(2)制备的金纳米溶胶中，浸泡24h。此后，将Au纳米薄膜电极置于管式炉中，通入氮气，等空气排尽后，在650℃下热退火5小时，等电极冷却至室温后，取出待用。

(4)将步骤(3)制备好的纳米金ITO电极放入不同浓度的鼠抗人IgG溶液中，37℃恒温水浴1小时后，4℃冰箱放置过夜，再用PBST洗涤液冲洗电极表面，除去未结合的包被液。之后放入封闭液(5％脱脂奶粉-PBST溶液)中，37℃恒温水育1小时后用PBST洗涤液冲洗。得嵌入式Au纳米薄膜电极表面等离子体共振免疫传感器。

一种利用上述方法制备的电极检测鼠抗人IgG的方法，当当嵌入式Au纳米薄膜电极表面未结合鼠抗人IgG并***RI＝1.333的溶液中，利用紫外-可见吸收光谱进行测试，得到的LSPR峰波长W₀；当嵌入式Au纳米薄膜电极表面结合不同浓度的鼠抗人IgG并***RI＝1.333的溶液中，得LSPR峰波长W，以W-W₀为分析信号，进行鼠抗人IgG的测定；

由于上述方法制备的嵌入式电极可以检测鼠抗人IgG，因此，本发明提供了上述的传感器在检测鼠抗人IgG含量中的应用。

与现有技术相比，本发明涉及的电化学传感器具有如下优点和显著地进步：

(1)本发明方法制备的嵌入式Au纳米薄膜制备过程简单，效率高。

(2)利用退火的方法，简单巧妙的提高嵌入式Au纳米薄膜的表面等离子体共振效应。

(3)利用表面等离子体共振效应与免疫分析结合，对生物活性物质，蛋白等进行高灵敏，快响应，痕量无损的检测。

本发明利用嵌入式制备Au纳米薄膜ITO电极，以鼠抗人IgG为检测对象，利用紫外-可见吸收光谱进行测试，提供了基于嵌入式Au纳米薄膜电极表面等离子体共振免疫分析的方法的材料制备过程及检测鼠抗人IgG的方法。

有益效果：在优选的实验条件下，目标物鼠抗人IgG的浓度在1×10^-3g/L～9×10^{- 3}g/L范围内与LSPR峰波长成线性函数关系式(图3)。线性函数关系式分别为：w＝1.3288c+568.63(c为IgG的浓度)，相关系数R²＝0.9869，实验检出限达到1.457×10^-4g/L。

附图说明

图1嵌入式Au纳米薄膜电极的扫描电子显微镜照片(SEM)。

图2不同退火温度的优化。图中a-e分别为经过未退火，450℃，350℃，550℃，650℃处理的嵌入式Au纳米薄膜紫外-可见吸收光谱。

图3紫外-可见吸收光谱与鼠抗人IgG浓度关系图。

具体实施方式

实施例1嵌入式Au纳米薄膜电极不同退火温度的优化

退火处理后，Au纳米粒子的球形度增高，粒度增大，局部场强增强，退火温度越高，现象越为明显，退火温度对紫外-可见吸收光谱产生一定影响。分别对未退火，450℃，350℃，550℃，650℃处理的嵌入式Au纳米薄膜的紫外-可见吸收光谱进行测量。图2为不同退火温度下的嵌入式Au纳米薄膜的紫外-可见吸收光谱响应，由图可知，当退火温度为650℃时，表面等离子体共振吸收峰相比未高温退火处理的吸收峰发生明显红移，因此选择650℃为最佳退火温度。

实施例2方法灵敏度

嵌入式Au纳米薄膜电极的制备

(1)将事先裁好的ITO导电玻璃分别用分析纯丙酮、分析纯乙醇和二次水各超声清洗3min，并置于50℃烘箱中烘干；将烘干后洁净的ITO置于食人鱼溶液(70％H₂SO₄：30％H₂O₂)中浸泡，取出后用去离子水冲洗并超声清洗，氮气吹干；将烘干后的ITO置于10％KH550的乙醇溶液中浸泡2h，取出用乙醇超声清洗，氮气吹干，在120℃恒温箱中放置1小时，烘干待用。

(2)通过柠檬酸盐还原法合成金纳米溶胶，将1％氯金酸稀释100倍，取100mL稀释后的氯金酸水溶液(0.01％)至圆底烧瓶油浴加热至沸，在搅拌的状况下快速加入2mL 1％的柠檬酸三钠溶液作为还原剂，之后继续加热30min，观察溶液由淡黄色转灰再变为黑，最后变成橙红色，停止加热冷却至室温并储存在冰箱中直至使用。

(3)将步骤(1)中处理好的ITO浸泡在步骤(2)制备的金纳米溶胶中，浸泡24h。此后，将Au纳米薄膜电极置于管式炉中，通入氮气，等空气排尽后，在650℃下热退火5小时，等电极冷却至室温后，取出待用。

(4)将步骤(3)制备好的纳米金ITO电极放入不同浓度的鼠抗人IgG溶液中，37℃恒温水浴1小时后，4℃冰箱放置过夜，再用PBST洗涤液冲洗电极表面，除去未结合的包被液。之后放入封闭液(5％脱脂奶粉-PBST溶液)中，37℃恒温水育1小时后用PBST洗涤液冲洗。得嵌入式Au纳米薄膜电极表面等离子体共振免疫传感器。

由于上述方法制备的电极可以检测鼠抗人IgG，因此，本发明提供了上述的表面等离子体共振免疫分析检测鼠抗人IgG含量中的应用。

考察了方法测定的灵敏度和线性范围等分析特性。在在优选的实验条件下，目标物鼠抗人IgG的浓度在1×10^-3g/L～9×10^-3g/L范围内与LSPR峰波长成线性函数关系式(图3)。线性函数关系式分别为：w＝1.3288c+568.63(c为IgG的浓度)，相关系数R²＝0.9869，实验检出限达到1.457×10^-4g/L。