阅读说明：本技术 用于在gmr生物传感器阵列上进行准确的温度测量的方法 (Method for accurate temperature measurement on GMR biosensor arrays ) 是由 G·瑞兹 S·X·王 于 2018-05-01 设计创作，主要内容包括：针对磁阻传感器阵列提供了改进的温度测量和校正。通过在已知温度下测量参考传感器的电阻来根据阵列中的一个或多个参考传感器确定电阻相对于温度的线性系数,这使得电阻测量能够用于确定阵列的所有传感器中的未知温度。双重调制导致具有中心音调的MR传感器输出,该中心音调可用于校正侧音调MR信号中的温度依赖性。该校正可以根据线性拟合或多项式拟合。应用包括需要准确的温度数据的生物测定,诸如,DNA熔解曲线的准确确定。(Improved temperature measurement and correction is provided for magnetoresistive sensor arrays. Determining a linear coefficient of resistance versus temperature from one or more reference sensors in the array by measuring the resistance of the reference sensor at a known temperature enables the resistance measurement to be used to determine an unknown temperature in all sensors of the array. The dual modulation results in an MR sensor output having a center tone that can be used to correct for temperature dependence in the side tone MR signal. The correction may be according to a linear fit or a polynomial fit. Applications include bioassays that require accurate temperature data, such as the accurate determination of DNA melting curves.)

用于在GMR生物传感器阵列上进行准确的温度测量的方法

技术领域

本发明涉及用于磁阻(MR)生物感测应用的改进方法。

背景技术

为了准确地测量生物相互作用的温度依赖性性质(例如：DNA熔解温度、亲和性、亲合力、吸附和去吸附速率等)，需要对反应条件有准确的了解。在GMR(巨磁阻)生物传感器阵列的特定情况下，跨芯片区域的均匀温度的工作假设仅对于在室温下处于热平衡的系统成立。在每一种其他情况下，芯片的固有形状和温度控制方法的细节都引起跨芯片表面的温度梯度。相应地，提供用于处理磁阻传感器阵列中的温度测量和/或校准的改进方法将是本领域的进步。

发明内容

在示例性实施例中，GMR生物传感器芯片包括以正方形阵列分布的、间距约为400μm的多于80个GMR电阻器。GMR材料的电阻率线性地依赖于0-100℃工作范围内的温度。通过测量阵列上每个传感器的电阻，表征跨芯片的温度梯度并在随后的数据分析中对其进行校正是可能的。

我们提供了一种借助于双重调制感测协议来测量每个传感器温度的方法，该协议允许同步测量磁性纳米粒子结合事件(用于生物感测)以及由于温度引起的电阻率变化。该方法可以单独地应用于每个传感器，因此确保芯片上温度的二维量化。此外，我们描述了一种用于校正对于磁场灵敏度的传感器灵敏度的温度依赖性的方法，该温度依赖性将影响磁性纳米粒子检测。

附图说明

图1示出了本发明的实施例。

图2是在双重调制感测系统中的理想化输出信号的图。

图3是来自示例性磁阻传感器阵列的测得温度的表。

图4示出了针对芯片上的若干MR传感器测得的ΔST/ST₀相对于ΔCT/CT₀的关系的曲线。

图5A示出了针对芯片上的若干MR传感器以0.05C/s的温度上升期间的DNA信号相对于时间的关系。

图5B是阵列中每个传感器相对于芯片上要熔解的第一传感器(在第5行，第6列)的以分钟为单位的熔解延迟的表。

图6A示出了温度校准后来自第2-4行中的传感器的熔解曲线。

图6B是在温度校准后在每个传感器上测得的熔解温度的表。

图7是适合于结合本发明的实施例进行实践的测定的流程图。

图8示出了用于执行图7的测定的示例性装置。

图9A-9B示出了与图7的测定相关的进一步细节。

具体实施方式

A)示例性硬件配置

图1示出了在本发明的实施例中操作的示例性磁阻传感器阵列。在该示例中，磁阻传感器的阵列102设置在衬底100上，并且将衬底100设置在温度控制构件104上。在图1的俯视图中，温度控制构件104以虚线示出，因为它与衬底100的背侧接触，并且因此在俯视图中不可见。如图1所示，通常的情况是阵列102中的磁阻传感器中的一些被设置成使得它们与温度控制构件104的热接触比其他磁阻传感器更好。将这一个或多个MR传感器称为参考MR传感器是方便的。图1中的参考MR传感器被添加阴影。简而言之，主要思想是使用一个或多个参考传感器，通过在两个或更多个已知温度T下测量电阻R来确定零场电阻的线性温度系数α(图1中的106)。一旦α已知，就可以根据阵列中任何传感器的电阻确定温度(图1中的108)。在提供该温度测量方法的进一步细节之前，首先考虑双重调制感测的含义是方便的。

B)双重调制感测

GMR传感器在频率f_v处以电压V偏置。以频率f_h施加外部磁场H。理想地，输出信号(即，传感器中的电流)具有4个主要分量，如图2所示。在频率f_v处的中心音调(CT)分量，在f_v±f_h处的两个相同的侧音调(ST)分量以及在f_h处的由磁场感应的磁拾取噪声分量。以f_v>>f_h运行，将信号与f_h处的噪声以及与1/f噪声隔离是可能的。通过频谱分析检测CT分量和ST分量。发现这些是：

其中V是偏置电压，R₀是传感器的零磁场电阻，而ΔR₀是当施加磁场H时电阻的变化。磁阻传感器的品质因数是磁阻比，定义为MR＝ΔR₀/R₀。在双重调制感测中，适当的品质因数变为MR＝4ST/CT。磁阻比受传感器表面处或传感器表面附近存在磁性纳米粒子的影响，从而允许进行生物感测。

C)温度测量

GMR传感器的电阻率取决于温度，因此在双重调制方案中：

R(T)＝R₀(1+αΔT)， (3)

其中α是取决于GMR材料的热系数，但可以假设α在芯片上是恒定的。可以通过为与温度调节系统更好地热接触的一个或若干参考传感器在两个已知温度下测量电阻来获得系数α。如果使用多于一个传感器，则可以对各个α值求平均。

一旦已知热系数α，我们就可以测量芯片上的每个传感器的温度。更明确地，一种用于在磁阻传感器的阵列中进行温度测量的方法包括以下步骤：

1)提供磁阻传感器的阵列，其中该磁阻传感器的阵列包括至少一个参考磁阻传感器；

2)R₀是参考温度T₀处的零场电阻率，T是温度，α是磁阻传感器的材料参数，而磁阻传感器具有由R＝R₀(1+α(T-T₀))给出的零场电阻率R；

3)在两个或更多个已知温度下测量(多个)参考磁阻传感器的零场电阻率以确定α；以及

4)测量磁阻传感器的阵列中的一个或多个磁阻传感器的零场电阻率，以根据测得的R和已知的α确定一个或多个磁阻传感器的相应的温度T。

在采用多于一个参考磁阻传感器的情况下，可以通过对两个或更多个参考磁阻传感器的α值求平均来完成确定α。一旦α已知，就可以根据用于阵列中任何传感器的零场电阻来确定温度，而不论该传感器是否用作用于确定α的参考传感器。

在本发明的一个实施例中使用的温度受控的盒具有与图1类似的配置。装配盒，使得GMR芯片管芯(即，衬底100)的背侧与温度受控的盒(即，温度控制构件104)热接触。在该情况下，接触面积是直径为1-2mm的圆形。有限的接触面积在芯片表面上引起温度梯度。图3示出了通过上述方法确定的针对该示例的跨芯片的温度分布。从芯片的中心到边缘，温度变化约1.5C。这里描述的过程允许对每个传感器进行准确的温度测量并且校正跨GMR芯片的温度梯度。

D)用于双重调制的温度校正

侧音调(ST)也取决于温度，因为GMR传感器的电阻率和磁电阻率两者都与温度有关。对于小的温度变化，这通常被假设为是线性的。由此

通过CT和ST的初始值来归一化CT和ST

从中我们获得

因此，CT可以用作内部温度测量以表征和校正ST的温度依赖性。

如图4所述，系数K跨芯片变化。发现K的大于10％的变化。因此，应当在每个单个传感器上执行ST到CT的校准。

对于±10℃的小温度变化，上述方法足以校正ST，因为ΔST/ST₀相对于ΔCT/CT₀的关系可以被认为是线性的。对于更大的温度范围，发现ΔST/ST₀与ΔCT/CT₀之间的关系是非线性的。应该将更高阶的多项式(P_n)拟合到曲线以完全校正ST的温度依赖性。

在其中精确校正温度驱动的变化是必要的那些应用中，应使用3阶或更高阶的多项式。在一种特定情况下，将五阶多项式标识为最优模型。

根据这些原理，上述温度校正方法可以进一步包括根据以下步骤的双重调制：

1)将磁阻传感器的阵列设置在具有调制频率f_h的挠性磁场(tickling magneticfield)中；

2)向具有调制频率f_v的磁阻传感器的阵列提供电激励，其中f_h和f_v是不同的，并且其中磁阻传感器的阵列中每个磁阻传感器的输出频谱包括频率f_v处的载波音调(CT)和频率f_v±f_h处的侧音调(ST)，其中载波音调具有CT幅度而侧音调具有ST幅度；

3)对于磁阻传感器的阵列中的每个磁阻传感器，单独地确定输出频谱中CT幅度与ST幅度之间的基线关系；

4)对于磁阻传感器的阵列中的每个磁阻传感器，当存在样本时单独地测量相应的CT幅度和ST幅度以提供输入CT测量和输入ST测量；

5)对于磁阻传感器的阵列中的每个磁阻传感器，使用相应的基线关系和相应的输入CT测量单独地校正输入ST测量，以提供相应的经校正的ST测量(例如，根据公式11进行线性校正而根据公式12进行多项式拟合校正)；以及

6)对于磁阻传感器的阵列中的每个磁阻传感器，单独地提供经校正的ST测量作为输出。

通过收集针对每个传感器的ST相对于CT数据并确定与该ST相对于CT数据的相应的曲线拟合，可以针对阵列中的每个传感器单独地确定CT幅度与ST幅度之间的基线关系。结果是单独地对应于阵列中的每个传感器的曲线拟合。如上所述，这些曲线拟合可以是线性拟合和/或更高阶的多项式曲线拟合。

E)在生物测定中的应用

生物测定是本方法的重要应用。这里，我们将DNA熔解曲线测量作为温度敏感生物测量的示例。在该示例中，将磁性标记的单链DNA靶与表面束缚的单链DNA探针杂交。在结合后，升高温度，并在升高温度的同时测量熔解曲线。

图5A示出了针对此类熔解的时间序列。将S形拟合应用于曲线以计算针对每个传感器的熔解时间。相对时间延迟结果在图5B的表中示出。图5B中的中央传感器处于更高温度，并且因此更早地使DNA杂交体溶解。0.7分钟的熔解时间差对应于必须加以考虑的2.1C的温度差。

如上所述，使用针对每个传感器测得的温度，我们可以提供该校正，如图6A-6B所示。在图6A中，在该温度校正和校准之后，测得的熔解曲线彼此相似。图6B示出了通过S形拟合获得的熔解温度。针对第1-5行的测得的熔解温度变化小于1C。在该特定情况下，其他行受布线和环氧树脂密封的影响。

根据这些原理，上述温度校正和双重调制方法可进一步包括生物测定，其中样本包括用磁性纳米粒子标记的分析物，并且其中磁阻传感器中的一个或多个具有设置在这一个或多个磁阻传感器上的与分析物相应的捕获试剂，使得用相应的捕获试剂结合和固定分析物提供了磁阻测定。

更具体地，根据该方法的示例性测定具有作为互补的DNA链的分析物和捕获物，并且进一步包括以下步骤：

1)对含有甲基化和未甲基化位点的DNA链执行亚硫酸氢盐转化，以产生具有错配的碱基对的经转化的DNA链；

2)对经转化的DNA链进行聚合酶链反应(PCR)扩增；

3)在PCR扩增的经转化DNA链中磁性地标记单链靶DNA链；

4)使经磁性标记的单链靶DNA链与固定到磁阻传感器阵列上的互补的DNA链杂交；

5)增加严格条件，以使磁性标记的单链靶DNA链从固定到磁阻传感器阵列上的互补的DNA链变性；

6)在增加严格条件期间，实时读出由变性的经磁性标记的单链靶DNA链产生的变性信号；以及

7)根据变性信号确定甲基化和未甲基化的DNA链的严格条件。

按此方法，可以将变性信号与相应的磁阻传感器温度T组合以单独地为每个磁阻传感器提供准确的DNA熔解曲线，如以上图6A-6B的示例所示。

E1)关于生物测定应用的进一步细节

图7是提供甲基化检测方法的概述的流程图，该方法提供了DNA链中甲基化密度的定量描述。在步骤700中，对含有甲基化和未甲基化位点的DNA链进行亚硫酸氢盐转化，以产生具有错配的碱基对的经转化的DNA链。在步骤702中，对经转化的DNA链进行PCR扩增。在步骤704中，在PCR扩增的经转化DNA链中磁性地标记单链靶DNA链。在步骤706中，使经磁性标记的单链靶DNA链与固定到在磁阻(MR)传感器阵列上的互补的DNA链杂交。在一些实施方式中，在杂交期间实时读出结合信号。

在步骤708中，增加严格条件以使磁性标记的单链靶DNA链从固定到磁阻(MR)传感器阵列上的互补的DNA链变性。在步骤710中，在增加严格条件期间，实时读出由变性的经磁性标记的单链靶DNA链产生的变性信号。在步骤712中，根据变性信号确定甲基化和未甲基化的DNA链的严格条件。

严格条件可以是温度，在这种情况下，增加严格条件包括在盐浓度保持恒定的同时提高温度。在这种情况下确定甲基化和未甲基化的DNA链的严格条件包括确定甲基化和未甲基化的DNA链的熔解温度。替代地，严格条件可以是盐浓度，在这种情况下，增加严格条件包括在温度保持恒定的同时降低盐浓度。在这种情况下确定甲基化和未甲基化的DNA链的严格条件包括确定甲基化和未甲基化的DNA链的熔解盐浓度。

在一些实施方式中，该方法可用于与甲基化位点同时确定突变位点。在该情况下，对包含甲基化和未甲基化位点的DNA链执行亚硫酸氢盐转化包括：对包含甲基化和未甲基化位点的DNA链以及野生型基因和突变基因执行亚硫酸氢盐转化。此外，在这种情况下根据变性信号确定甲基化和未甲基化的DNA链的严格条件包括：根据变性信号确定甲基化和未甲基化的DNA链以及野生型基因和突变型基因的严格条件。

图8提供了用于使用GMR生物传感器设备800对经磁性标记的DNA的检测的协议802的示意性概览图。在反向链变性和标记后，将PCR产物注射到芯片804上的反应井中。在杂交步骤812中，用MNP(磁性纳米粒子)806标记的DNA在37℃下与互补的表面束缚的探针杂交1小时，从而产生用MNP 808标记的经杂交的DNA。未结合的样本通过冲洗移除。在熔解步骤814中，温度从20℃扫描到65℃，使来自探针810的DNA变性以测量熔解温度T_m。

为了检测DNA突变，我们使用非歧视性引物对感兴趣的基因组区域进行PCR扩增。然后使用生物素化的引物和链霉亲和素涂覆的磁性纳米粒子(MNP)对PCR产物进行磁性标记。在双链PCR产物的磁柱分离和变性后，将偶联至MNP的ssDNA(MNP-ssDNA)引入GMR生物传感器阵列，其中多个DNA探针单独地束缚于每个传感器的表面。在将注射的MNP-ssDNA与表面束缚的互补的探针杂交时，GMR生物传感器产生了与结合的MNP成比例的传感器磁阻比的变化(ΔMR)。为了基因型突变，我们采用了样本的野生型(WT)和突变型(MT)序列互补的一组两个探针。在低严格下的杂交期间，扩增子以相似的亲和性与WT探针和MT探针两者都杂交。为了获得单碱基特异性，通常在DNA微阵列中杂交后使用严格冲洗。为了实现用于单碱基突变的检测的更灵活的系统，我们通过提高温度并对GMR生物传感器阵列上的所有探针同时连续地测量DNA熔解来挑战杂交体。

图9A-9B是亚硫酸氢盐转化过程的示意图。在亚硫酸氢盐处理902、912时，DNA 910中的未甲基化胞嘧啶在DNA 914中被转化为尿嘧啶(图9B)，而DNA 900中的5-甲基胞嘧啶被保留在DNA 904中(图9A)。在后续的产生产物908、918的PCR 906、916中，914中的尿嘧啶被胸腺嘧啶代替。因此，甲基化的胞嘧啶被映射到扩增子的单碱基改变(C>T)。