阅读说明：本技术 一种提高水稻性细胞基因组变异诱导效率的方法 (Method for improving rice sexual cell genome variation induction efficiency ) 是由 郭涛 陈淳 李丹丹 黄翠红 周丹华 夏澳运 王慧 陈志强 于 2019-10-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高水稻性细胞基因组变异诱导效率的方法,属于植物育种技术领域。该方法包括如下步骤：水稻种子萌发后,待幼苗长出时移植在营养液中生长,控制其分蘖,只保留少数主茎；待水稻幼穗发育期,选取适宜的水稻主茎幼穗,用酒精棉球消毒幼穗苞叶表面,在幼穗上部位置慢慢注入浓度为0.01％～0.1％的化学诱变剂EMS,待药液从穗顶部中心孔溢出时,停止注射并等待5-10min,再次注入同浓度EMS,操作时不断对幼穗苞叶表面消毒；EMS处理的植株继续在营养液中培养,待水稻幼穗发育结实并收获全部种子,取样萌发后进行基因组测序,根据测序数据计算突变频率。该诱导方法处理水稻性细胞可获得更高的诱导效率,同时具有更高的安全性。(The invention discloses a method for improving the efficiency of rice sexual cell genome variation induction, and belongs to the technical field of plant breeding. The method comprises the following steps: after the rice seeds germinate, transplanting the rice seeds to grow in nutrient solution when seedlings grow out, controlling tillering of the rice seeds and only keeping a few main stems; selecting proper main stem young ears of the rice at the young ear development period of the rice, disinfecting the surfaces of the bracts of the young ears by using an alcohol cotton ball, slowly injecting a chemical mutagen EMS with the concentration of 0.01-0.1% into the upper position of the young ears, stopping injecting and waiting for 5-10min when liquid medicine overflows from the center hole at the top of the ears, injecting the EMS with the same concentration again, and continuously disinfecting the surfaces of the bracts of the young ears during operation; and continuously culturing the plant treated by the EMS in the nutrient solution, obtaining all seeds after the young ear of the rice grows and fructifies, sampling and germinating, then carrying out genome sequencing, and calculating mutation frequency according to sequencing data. The induction method can obtain higher induction efficiency and higher safety when used for treating the rice sexual cells.)

一种提高水稻性细胞基因组变异诱导效率的方法

技术领域

本发明属于植物育种技术领域，尤其涉及一种提高水稻性细胞基因组变异诱导效率的方法。

背景技术

甲基磺酸乙醋(ethyl methan sulfonate，EMS)属于烷化剂的一种，是最常用的一种化学诱变剂(汪斌等，2016)。EMS能够诱导产生大量的点突变(张敏等，2011)，且避免因转基因存在的安全性和稳定性问题(崔清志等，2013)，目前在遗传研究和遗传改良上都有广泛的应用。它的诱变作用机理是将烷基加到DNA的核苷酸鸟嘌呤上，导致在DNA复制过程中产生错误的转换，产生点突变(即G:C碱基对转换为A:T碱基对)，或是EMS试剂促使这些烷基化鸟嘌呤自动降解，从而导致在DNA链上出现空位，最终出现DNA链的断裂、碱基易位甚至细胞死亡。

近年来随着分子标记技术的应用，EMS诱变技术在遗传机理分析上也有所突破。目前，EMS诱变技术广泛已经应用于番茄(Gady et al.,2009)、草莓(Bhat et al.,2017)、玉米(安伟等，2008)、小麦(Mishraet al.,2016)等植物遗传改良育种研究中。例如，ZHU etal.(,年份)从拟南芥突变体库中筛选到1株小花发育延迟突变体drm1，并已经被应用到小花发育的研究中。王培英等(2000)利用EMS处理大豆，筛选出一批高蛋白(45％～50％)、高亚油酸(60％以上)、低亚麻酸的优良突变系。

利用EMS诱导水稻植株产生的突变后代在不同株系及品种间的变异都比较丰富，且基因产生突变的稳定性较好，易于进行测序分析(杨峰等，2017)。因此EMS在诱变水稻育种的研究技术上手段逐渐成熟(任志强等，2016)，应用也越来越广泛。李学宝(1991)、阮伯胜(2008)、王彩芬等(2011)利用EMS诱变籼稻广陆矮4号、日本晴、宁粳28等品种，均获得了有价值的变异发生。陈忠明等(2004)通过EMS诱变籼稻“9311”，筛选到了大粒突变体“M316”和长穗颈突变体“9311ER”。王峰(2011)通过对水稻优良籼型恢复系缙恢10号进行EMS诱变处理，筛选出24份半矮化突变体；邓晓梅等(2012)对晚粳稻品种秀水09进行EMS诱变处理，得到1个全生育期黄绿叶突变体Ygl，其表现为黄绿叶且能够稳定遗传，成功定位了1对隐形基因，并验证这对基因控制黄绿叶的突变性状，同时检测到突变体发生了单碱基突变。Rayetal.(2000)已经将从水稻突变体库中筛选到的1株易感细菌病害的突变体应用到水稻抗病研究中。郝西等(2013)利用水稻EMS突变体库筛选出1个对高温敏感的侧根缺失突变体hts1，并进行了突变体的初步遗传分析，研究了该突变体苗期性状及农艺性状对不同温度梯度的反应。

EMS化学诱变最常用的处理对象为植物的种子(温日宇等，2015；刘威等，2017；于秀普等，1994；朱保葛等，1997)，可在短时间内构建大量突变群体。但是，种子胚部的细胞膜其他生物组织会阻碍EMS进入胚细胞，降低了诱变效果；EMS也会与水发生化学作用产生乙醇和甲磺酸，这两种化合物显著影响种子活力，甚至导致个体死亡。水稻种子为典型的二倍体体细胞组织，EMS诱变产生的突变细胞与正常的细胞存在竞争，突变细胞常受到抑制或消失；有时易形成嵌合体，影响选择效果(沈法富等，1999；于元杰等，1996；薛守旺等，1998)。此外，由于EMS多为隐性突变，所以在M2代才会表现出群体的显性突变，在M3代才能表现出隐性突变，需要较长时间才能得到突变体。因此，以种子为EMS诱变处理对象存在突变频率难以提高、周期长并且处理后种子活力低等限制性因素。而利用EMS诱变植物的幼穗、花粉、合子等性细胞可避免产生嵌合体，提高诱变频率；由于产生的突变可直接遗传下来形成种子，所以其突变体鉴定可提早一个世代，节约筛选时间；对由性细胞变异产生的种子进行混合测序，可以计算突变频率，进而指导诱变群体的种植规模，避免人力物力的浪费。但是，目前关于利用EMS诱发水稻性细胞变异的方法缺乏系统研究，其突变的频率及分子特征缺少关键数据。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种提高水稻性细胞基因组变异诱导效率的方法，本发明主要采用EMS注射法处理水稻特定时期的幼穗来诱发水稻性细胞基因组变异，并提出了诱变后代的频率计算方法。

为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：

(1)水稻种子萌发后，待幼苗长出时移植在营养液中生长，控制其分蘖，只保留少数主茎；

(2)待水稻幼穗发育期，选取适宜的水稻主茎幼穗，用酒精棉球消毒幼穗苞叶表面，在幼穗上部位置慢慢注入浓度为0.01％～0.1％的化学诱变剂EMS，待药液从穗顶部中心孔溢出时，停止注射并等待5-10min，然后在同一部位重复注入相同浓度的EMS，注意操作过程中不断对幼穗苞叶表面消毒；

(3)EMS处理后的植株继续在营养液中培养，待水稻幼穗发育结实并收获全部种子；

(4)随机选取收获的种子50粒，萌发后取种子胚进行测序，计算突变频率，依据突变频率确定后代诱变群体种植数量。

进一步的，所述化学诱变剂EMS均以pH值为6.98的0.1M磷酸缓冲液配制。

进一步的，所述步骤(1)中待幼苗长出时移植在营养液中生长，幼苗生长程度为1-2cm。

进一步的，所述步骤(1)中待幼苗长出时移植在营养液中生长，营养液配方为：NaH₂PO₄·2H₂O 0.7485g，K₂SO₄1.305g，MnCl₂·4H₂O 0.054054g，(NH₄)₆MoO₂₄·4H₂O0.002754g，H₃BO₃0.03294g，ZnSO₄·7H₂O0.001337g，CuSO₄·5H₂O 0.001248g，FeCl₃·6H₂O0.29214g，柠檬酸水合物0.44625g，MgSO4·7H₂O 25.08g，Ca(NH₄).(NO₃)₃3.9g溶于30L水中，加入4.8ml 5M的NaOH将溶液PH调至约4.5。

进一步的，所述步骤(1)中待幼苗长出时移植在营养液中生长，控制其分蘖，只保留少数主茎，具体为将直径2cm的海绵中间打孔，将幼苗长度1-2cm的种子放置于孔中，漂浮于营养液面上，在水稻植株生长过程中去除小分蘖，只保留1个主茎分蘖。

进一步的，所述步骤(2)中适宜的水稻主茎幼穗，其判断为剑叶叶枕与倒二叶叶枕相齐的幼穗为适宜的处理幼穗。

进一步的，所述步骤(2)中在幼穗上部位置慢慢注入浓度为0.01％～0.1％的化学诱变剂EMS，其注射部位为幼穗上部距倒二叶叶枕2cm的位置，EMS化学诱变剂的浓度为0.05％。

进一步的，所述步骤(3)中EMS处理后的植株继续在营养液中培养，待水稻幼穗发育结实并收获全部种子，其培养条件为温度30℃，自然光照条件，营养液为每星期更换。

进一步的，所述步骤(4)中随机选取收获的种子50粒，萌发后取种子胚进行测序，所述测序为全基因组测序，测序数据量为40G。

进一步的，所述步骤(4)中随机选取收获的种子50粒，萌发后取种子胚进行测序，统计EMS处理后基因组变异数据，依据突变频率确定诱变群体种植个数，计算公式为：诱变群体所需种植的单株数Y＝预期突变体个数X3/(单个基因变异概率X1×非同义突变概率X2)；其中单个基因变异概率X1＝位于基因区域的SNP数目/40000，非同义突变概率X2＝非同义突变SNP个数/全部SNP突变个数。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明利用EMS诱发水稻适宜发育时期的幼穗性细胞产生变异，此时性细胞对于诱变剂高度敏感，易于发生变异，并可避免现有EMS诱发种子体细胞变异产生的嵌合体，提高诱变频率；与种子体细胞相比，幼穗性细胞更容易被诱变剂EMS渗透。

(2)本发明诱发水稻性细胞产生的变异可直接遗传下来形成种子，所以其突变体鉴定可比现有技术提早一个世代约6个月的时间，显著缩短育种时间。

(3)本发明提出对由性细胞变异产生的种子进行混合测序，通过分子水平的突变频率精确指导诱变群体的种植规模，避免传统方法难以科学估计诱变群体种植规模的不足，有效的节约人力物力。

(4)本发明对水稻幼穗性细胞进行EMS诱变，操作安全性高，对植株本身的危害性小，所收获种子活力基本正常，克服传统EMS浸泡处理种子后大量种子死亡及后代不育的不足。

(5)与现有EMS处理水稻种子相比，EMS幼穗注射法诱变水稻性细胞能产生颠换型单碱基变异(SNP)的比例相对较高。颠换型SNP的诱导相对较难，这表明EMS处理性细胞可获得更高的诱导效率。

附图说明

图1为实施例1中水稻幼穗经EMS处理后结实率。

图2为实施例1中不同EMS处理对种子活力影响。

图3为实施例1中EMS处理后M₀代植株主要农艺性状值。

图4为实施例1中EMS诱发变异的总体分布图。

图5为实施例1中技术流程图。

具体实施方式

本申请所选用的试验材料为粳稻品种日本晴。于2018年5月至7月以水培的方式种植于华南农业大学农学院温室大棚内。

实施例1

1.水稻材料的种植

采用水培方式种植水稻，具体步骤如下：

(1)浸种催芽：取一定量的种子放入水中浸泡一天，然后，用湿抹布包裹放入30℃培养箱中催芽。

(2)育秧移栽：取适量催芽的种子放入发芽盒中，盒中有两层滤纸，然后，加入适量营养液，放入30度培养箱中培养，当种子幼苗长至1-2cm时即可取出移栽至营养液。

(3)配制营养液，营养液配方为：NaH₂PO₄·2H₂O 0.7485g，K₂SO₄1.305g，MnCl₂·4H₂O0.054054g，(NH₄)₆MoO₂₄·4H₂O 0.002754g，H₃BO₃0.03294g，ZnSO₄·7H₂O 0.001337g，CuSO₄·5H₂O 0.001248g，FeCl₃·6H₂O 0.29214g，柠檬酸水合物0.44625g，MgSO4·7H₂O25.08g，Ca(NH₄).(NO₃)₃3.9g溶于30L水中，加入4.8ml 5M的NaOH将溶液PH调至约4.5。

(4)将直径2cm的海绵中间打孔，将幼苗长度1-2cm的种子放置于孔中，漂浮于营养液面上，在水稻植株生长过程中去除小分蘖，只保留1个主茎分蘖。在生长过程中，每星期更换一次营养液。

(5)培养条件:自然光照，温度为30℃。

2.EMS诱变处理

(1)待水稻植株生长至剑叶叶枕与倒二叶叶枕相齐时，此时水稻幼穗花药中花粉母细胞处于减数***期，对诱变剂比较敏感，是EMS诱变处理的合适时期。

(2)化学诱变剂EMS处理浓度分别为0.01％、0.025％、0.05％、0.1％，共四个处理(编号M0.01 M0.025 M0.05 M0.1)，均以pH值为6.98的0.1M磷酸缓冲液配制，同时设置磷酸缓冲液处理为CK对照组。

(3)EMS诱变性细胞的处理方法(注射法)：在每日上午9～11时进行诱变处理，首先选取时期适宜的幼穗，用70％酒精棉球擦拭幼穗苞叶表面，摸准幼穗上部位置，慢慢注入药液，待药液从穗顶部中心孔溢出时，即表明药液已充满幼穗。操作过程中不断地以酒精和硫代硫酸钠消毒，以防污染。待药液从幼穗中渗出后，再重复注入一次相同浓度的EMS，CK对照株以同样方法注入磷酸缓冲液。最后挂好标签，注明处理浓度和处理时间。

(4)EMS处理后的植株继续在营养液中培养，待水稻幼穗发育结实并按处理分别收获种子。植株培养条件为温度30℃，自然光照条件，营养液为每星期更换。

(5)待植株成熟后收获种子，每个处理随机选取50粒种子，萌发48h后，取每粒种子的幼胚进行混合，混合样品进行Illumina全基因组测序分析，选用已经完成全基因组测定的粳稻品种日本晴序列为参考基因组序列。M0.01 M0.025 M0.05 M0.1每个样品测序深度为100×，测序数据量为40G；CK样品测序深度为10×，测序数据量为4G。

3.EMS处理幼穗后M₀代植株表型的调查

利用注射法对水稻品种日本晴孕穗期的幼穗进行EMS诱变处理，并调查了M₀代植株穗长、总粒数、实粒数、十粒长、十粒宽和结实率表型。与对照比较，EMS诱变处理后植株的结实率随EMS浓度升高而逐渐降低，结果如图1所示，说明EMS浓度越高对水稻植株的损伤越大，导致所收获的种子减少。对不同浓度处理下收获的种子进行发芽率，发芽指数测定，结果如图2所示，低浓度的EMS诱变处理得到的种子的发芽率，发芽指数都较高，表明EMS处理幼穗对于种子的活力无显著影响。不同浓度EMS处理后，结果如图3所示，水稻的穗长、十粒长和十粒宽几乎相同，表明EMS处理幼穗对这三个性状影响不显著。

4.水稻全基因组测序数据质控分析

按照实验设计，每个处理随机选取50粒种子，萌发48h后，取每粒种子的幼胚进行混合，混合样品进行Illumina全基因组测序分析，选用已经完成全基因组测定的粳稻品种日本晴序列为参考基因组序列。为了保证数据质量，对水稻测序的原始数据进行质控，并且通过数据过滤来减少数据噪音，结果如表1所示。

表1过滤前后碱基信息统计表

注：M0.01、M0.025、M0.05、M0.1分别表示EMS的浓度是0.01％、0.025％、0.05％、0.1％。

从表1中可以看出，Q20的每个数据都大于97.34％，表明数据准确度非常高，测序结果可靠。

5.不同浓度EMS处理后水稻基因组变异情况

测序数据经质控后，以已公布的日本晴基因组为参考序列，比较诱变处理与对照CK在全基因组的变异。图4(circos图)是全部变异在基因组上的分布情况。

图4由外向里分别是：各条染色体的长度(单位：Mb)。用频率直方图表示染色体不同区域窗口内的基因密度。用散点图表示染色体不同区域窗口的SNP密度。窗口大小设定为10k。如果窗口SNP密度>0.0015，则点为红色正方形；如果0.0005＜窗口SNP密度大于≤0.0015，则点为灰色圆形；如果窗口SNP密度≤0.0005，则点为绿色三角型。橙色线表示DUP(串联重复)在染色体上的位置。紫色线表示DEL(大片段缺失)在染色体上的位置。绿色线表示INS(***类型的结构性变异)在染色体上的位置。蓝色线表示INV(倒置类型的结构性变异)在染色体上的位置。内圈的连线表示BND(染色体间易位类型的结构性变异)在两两染色体上的位置。

由图4可知，在每条染色体上均发生的SNP变异，其中包括串联重复、大片段缺失、***类型的结构性变异和倒置类型的结构性变异(0.0005＜SNP密度大于≤0.0015)，且chr2、chr4、chr6、chr10和chr12上的某些位置发生了较多的SNP变异(SNP密度>0.0015)。chr1上的变异主要是大片段缺失和***类型的结构性变异；chr2上的变异主要是大片段缺失；chr3上的变异主要是串联重复和***类型的结构性变异；chr4上的变异较多，但主要是串联重复、大片段缺失***类型的结构性变异；此外chr9、chr10、chr11和chr12易与其它染色体发生染色体间易位类型的结构性变异。

6.水稻性细胞诱变后样本中SNV(SNPs、In Del)分析

(1)不同诱变处理的SNP、InDel的总体情况

通过整理分析，得到四种浓度EMS处理下的SNP和InDel的变异数据，如表2所示。

表2 SNP及InDel变异统计

注：M0.01、M0.025、M0.05、M0.1分别表示EMS的浓度是0.01％、0.025％、0.05％、0.1％。

由表2可以看出，M0.01有478个突变位点，其中66.95％是SNP突变，33.05％的InDel突变；M0.025有735个突变位点，包括71.16％的SNP突变和28.84的InDel突变；M0.05有804个突变位点，其中72.39％为SNP突变，27.61％为InDel突变；在四个处理中，M0.1的突变位点最多，一共有865个突变位点，其中SNP占72.37％，InDel只有27.63％。四个处理中均出现SNP占突变总量的60％以上的现象，说明单碱基突变是EMS诱变性细胞的主要突变类型，而且可以看出M0.05的SNP突变比例最高。

(2)EMS诱变处理诱导SNP变异特点

EMS处理幼穗诱导的突变中SNP(single nucleotide polymorphism)是发现最多的突变类型。SNP包括转换(A:G；T:C)和颠换(A>C/T；G>C/T；C>A/G；T>A/G)，M0.01、M0.025、M0.05、M0.1的转换与颠换的比率(Ti/Tv)分别为1.818、1.433、1.564、1.687(图2)。一般具有转换型的SNP占SNP总量的2/3左右，转换的之所以高，是因为CpG二核苷酸上的胞嘧啶(C)是基因组中最容易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发脱去氨基而形成胸腺嘧啶(T)(朱玉贤，2013)。两种处理下诱导的SNP中，A>G，T>C的含量均较高。在M0.01中有100个A>G突变，100个T>C突变，M0.025中有155个A>G突变，153个T>C突变，M0.05中有167个A>G突变，188个T>C突变，M0.1中有177个A>G突变，216个T>C突变，M1中有1214个A>G突变，1312个T>C突变。从上述结果中可以看出，EMS处理性细胞诱导的颠换型SNP的比率更高，而颠换型SNP的诱导相对较难，这表明EMS处理性细胞会有更高的诱导效率。

(3)EMS诱发SNP变异的分布情况

SNP突变发生的位置大部分都集中在intergenic region(表3)。在0.01％的处理中有69.06％的SNP在intergenic，8.75％在intronic，6.88％在upstream，3.75％在downstream，5％在exonic。0.025％的处理中有83.37％的SNP在intergenic，3.44％在intronic，4.21％在upstream，2.1％在downstream，2.1％在exonic。0.05％的处理中有71.13％的SNP在intergenic，8.59％在intronic，6.7％在upstream，3.95％在downstream，3.95％在exonic。0.1％的处理中有71.25％的SNP在intergenic，8.31％在intronic，6.39％在upstream，4.63％在downstream，4.31％在exonic。对比分析发现，四组处理中intergenic的SNP都达到了60％以上，0.025％的处理中达到了80％。

表3 SNP变异分布统计

7.合适诱变剂量的选择及诱变群体种植数量计算

四种不同浓度的EMS处理水稻幼穗，均可产生基因组变异，但变异的数目与处理浓度高度相关。随着处理浓度的升高，基因组变异数目显著增加，其中M0.05和M0.1所诱发变异的数目接近，并显著高于M0.01和M0.025。比较M0.05和M0.1处理对于水稻幼穗的影响，发现M0.05处理的穗长、总粒数、十粒长、十粒宽均与M0.1处理无显著差别，但M0.05处理的结实率显著高于M0.1处理，说明M0.05处理的生物毒性较小。综合以上分析，M0.05处理诱发基因组突变频率较高且生物毒性较小，是合适的诱发水稻性细胞基因组变异的方法。

诱变群体种植的规模直接影响突变的选择效率，而已有的利用EMS诱发种子产生变异，后代群体种植规模通常根据经验判断，导致大量人力物力的浪费。本方法以M0.05处理水稻幼穗后，在种子的基因组上产生了804个变异，其中SNP是主要的变异类型。在582个SNP变异中，有168个位于基因区域，这些变异可能导致基因功能的改变。由于水稻约有40000个预测基因，相当于单个基因产生变异的概率为168/40000＝0.42％，如果预期得到任一个基因的突变，那么后代至少需要种植238个单株。在M0.05处理中，由于非同义突变占全部变异的59.26％，因此任一基因发生功能突变的概率为0.42％×59.26％＝0.25％。根据以上计算，如果预期得到任一基因的功能改变的突变体，后代至少需要种植400株。对于育种而言，至少需要20个单株才能进行育种评价，因此诱变群体种植20×400＝8000个单株。

诱变群体规模计算公式为：

式中：单个基因变异概率X1＝位于基因区域的SNP数目/40000

非同义突变概率X2＝非同义突变SNP个数/全部SNP突变个数

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。