阅读说明：本技术 极地雪藻细胞裂解物在制备预防、延缓或治疗皮肤老化的药物或化妆品中的应用 (Application of snowfield algae cell lysate in preparation of medicines or cosmetics for preventing, delaying or treating skin aging ) 是由 俞鸣铗 郑琳 王小博 吴民富 齐明 韩卫星 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种极地雪藻细胞裂解物在制备预防、延缓或治疗皮肤老化的药物或化妆品中的应用。本发明通过实验发现：抗衰老基因mRNA表达水平在孵育极地雪藻细胞裂解物脂质体后显著提高；在存在极地雪藻细胞裂解物脂质体的处理组,抗氧化/衰老基因mRNA表达水平对H<Sub>2</Sub>O<Sub>2</Sub>呈现积极正向诱导效应,但是对照组在受到H<Sub>2</Sub>O<Sub>2</Sub>胁迫后,则明显受到抑制。因此,本发明的极地雪藻细胞裂解物能够延缓皮肤老化,特别是由于氧化反应或者UV引起的皮肤老化,可以用于制备预防、延缓或治疗皮肤老化的药物或化妆品。(The invention discloses an application of a snow algae cell lysate in preparing a medicine or a cosmetic for preventing, delaying or treating skin aging. The invention discovers that: anti-aging gene mRNA tableThe reaching level is obviously improved after the snowflake algae cell lysate liposome is incubated; in the treatment group in which liposomes of cell lysate of snow algae are present, the expression level of mRNA of antioxidant/senescence gene is on H 2 O 2 Positive induction effect was exhibited, but the control group was exposed to H 2 O 2 After the stress, the stress is obviously inhibited. Therefore, the snow algae cell lysate of the present invention can delay skin aging, especially skin aging caused by oxidation reaction or UV, and can be used for preparing medicines or cosmetics for preventing, delaying or treating skin aging.)

极地雪藻细胞裂解物在制备预防、延缓或治疗皮肤老化的药 物或化妆品中的应用

技术领域：

本发明属医药化妆品领域，具体涉及极地雪藻细胞裂解物在制备预防、延缓或治疗皮肤老化的药物或化妆品中的应用。

背景技术：

皮肤是保护身体的第一道屏障，与其他组织一样，皮肤也会经历一个衰老过程，称之为皮肤老化。而如果皮肤被暴露紫外线辐射或者污染的空气中，会加速皮肤老化进程。老化的皮肤的特征在于表皮中细胞再生的减少、真皮中胶原蛋白的再生能力下降、皮肤弹性降低和缺乏水分等。

目前市场上用于治疗皮肤老化的化妆品中活性成分中主要是抗氧化剂，如视黄酸等。同时，富含天然抗氧化剂的植物、藻类、真菌提取物也已经应用于化妆品配方中。其中，在此方面最有潜力和吸引力的是生活在极端环境的生物，由于体内含有丰富的次级代谢物，例如类胡萝卜素(黄嘌呤，虾青素等)，低温活性酶/蛋白质(抗冻物质)或抗氧化剂等，因此开发极端环境生物将是一个重要的创新源头和行之有效的途径。雪藻属于绿藻，它们被系统地分类为绿藻科(Chlorophyceae)，生活在地球极地和极寒高山地区，包括北极、南极、阿拉斯加、格陵兰、喜马拉雅山等终年雪山和冰川表面。

发明内容

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本发明的目的是为了克服现有技术中的缺陷，提供一种极地雪藻细胞裂解物在制备上调I型胶原蛋白基因、III型胶原蛋白基因、Koltho基因、FOXO基因、脂肪酸结合蛋白基因、***基因、瘦素受体基因、基质金属蛋白酶基因和/或硫氧还蛋白基因mRNA表达水平的药物，或预防、延缓或治疗皮肤老化的药物或化妆品中的应用。

所述的极地雪藻细胞裂解物的剂型优选为极地雪藻细胞裂解物脂质体或纳米乳剂。

所述的极地雪藻细胞裂解物脂质体是通过以下方法制备的：将极地雪藻细胞与空脂质体混合，经高压均化后得到脂质提取物，脂质提取物与基质材料混合，干燥，得到极地雪藻细胞裂解物脂质体。

所述的基质材料优选为异麦芽酮糖醇。

所述的极地雪藻细胞是将极地雪藻接种于3N-BBM培养基中发酵后转移到营养限制型培养基中进行诱导，极地雪藻颜色由绿色转变成红色，得到发酵培养物，将发酵培养物中的极地雪藻细胞与培养基分离，去掉培养基，得到极地雪藻细胞。

所述的营养限制型培养基优选为去除NaNO₃的3N-BBM培养基。

所述的极地雪藻细胞裂解物是极地雪藻藻株(Chlamydocapsa Nivalis)裂解物。

本发明的另一个目的是提供一种预防、延缓或治疗皮肤老化的药物或化妆品，所述的预防、延缓或治疗皮肤老化的药物或化妆品包含有效量的极地雪藻细胞裂解物作为活性成分。

本发明使用的极地雪藻细胞裂解物，可以免受外来因素的影响，无需添加保护剂。

本发明的极地雪藻细胞裂解物能够延缓皮肤老化，特别是由于氧化反应或者UV引起的皮肤老化，可以用于制备预防、延缓或治疗皮肤老化的药物或化妆品。

附图说明

图1是四种抗衰老基因基因mRNA表达水平在孵育极地雪藻细胞裂解物脂质体后显著提高；其中以无极地雪藻细胞裂解物脂质体孵育的作为对照组，图中显示的是经过极地雪藻细胞裂解物脂质体孵育后48h后，细胞抗衰老基因的表达的上升倍数；Beta-actin为参考基因，N＝5。

图2是五种抗氧化/衰老基因mRNA表达水平在受到极地雪藻细胞裂解物脂质体孵育48h后对H₂O₂具有显著的正向反应；在缺少极地雪藻细胞裂解物脂质体孵育的对照组中，五种抗氧化/衰老基因mRNA对H₂O₂呈现下调的趋势，而经过极地雪藻细胞裂解物脂质体孵育后，对H₂O₂呈现出不同倍数(1.8-8.2)的提高；Beta-actin为参考基因，N＝5。

具体实施方式

以下通过具体实施例来对本发明进一步说明，但并非限制本发明。

实施例1：极地雪藻的培养

(1)极地雪藻藻株(Chlamydomonas nivalis)，购自Culture Collection ofAlgae and Protozoa(CCAP)，其保藏号为：CCAP11/128。

(2)在管式反应器系统中分两个阶段进行培养：A.生产的第一阶段，将活化的极地雪藻接入pH为5.5的3N-BBM培养基中，在培养温度为14.5℃，光照强度2000±200lx条件下通气培养6d，得到第一阶段发酵培养物；在14.5℃的培养条件下，极地雪藻28h可增殖1倍。B.在完成第一阶段后，将第一阶段发酵培养物按50％的接种量转移到营养限制型培养基(3N-BBM without NaNO₃)中进行诱导，在培养温度为14.5℃，光照强度5000±500lx条件下通气培养3d，极地雪藻颜色由绿色转变成红色，完成营养相到静止相的转变，得到第二阶段发酵培养物。

(3)完成两个阶段的培养后，将第二阶段发酵培养物的极地雪藻细胞与培养基分离，去掉培养基，得到极地雪藻细胞，然后在-20℃冷冻保存。

实施例2：生产脂质提取物

(1)将冷冻的极地雪藻细胞解冻，然后与羟苯甲酯(0.1％)混合，得到混合物；

(2)混合物中极地雪藻细胞的浓度为约10g/L；

(3)将该混合物在1200巴(1.2×10⁸Nm^-2)的压力下进行四次高压均化，以溶解极地雪藻的细胞壁，释放细胞溶质的脂肪和水溶性组分，得到脂质提取物。

同时将极地雪藻细胞裂解后包封在液体纳米乳剂中，制备得到纳米级别的极地雪藻细胞裂解物乳剂，以这种方式产生的极地雪藻细胞裂解物纳米乳剂可以同时利用胞质可溶性和不溶性物质。

实施例3：用流化床干燥法干燥脂质提取物制备极地雪藻细胞裂解物脂质体

(1)将脂质提取物和异麦芽酮糖醇按质量比1:1进行混合；

(3)脂质提取物与异麦芽酮糖醇混合后，通过流化床干燥以50至60g/min的喷雾速率，平均干燥温度为50℃；

(4)干燥后的残留水分不超过5％，得到极地雪藻细胞裂解物脂质体。

实施例4：极地雪藻细胞裂解物脂质体在成纤维细胞中诱导抗衰老基因的表达

(1)取对数生长期的人类皮肤成纤维细胞系BJ细胞以每毫升(2～4)×10⁵个细胞接种在24孔板中，于37℃、5％CO₂培养箱中铺板培养(用含5％胎牛血清的DMEM培养基培养)；

(2)培养6h后往培养基中加入体积分数1％的极地雪藻细胞裂解物脂质体，于37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时，对照组加入等体积的异麦芽酮糖醇；

(3)收集细胞，利用trizol分离法提取RNA；

(4)取1μg RNA进行反转录；

(5)利用Realtime PCR检测抗衰老基因的表达量。

(6)结果显示多种抗衰老基因I型胶原蛋白基因(collagen1 alpha1 Gene)、III型胶原蛋白基因(collagen3 alpha1 Gene)、Koltho基因、FOXO基因mRNA表达水平在孵育极地雪藻细胞裂解物脂质体后显著上升(见图1)。

实施例5：极地雪藻细胞裂解物脂质体在H₂O₂氧化诱导成纤维细胞氧化损伤中的保护功能

(1)取对数生长期的人类皮肤成纤维细胞系BJ细胞以每毫升(2～4)×10⁵个细胞接种在24孔板中，于37℃、5％CO₂培养箱中铺板培养(用含5％胎牛血清的DMEM培养基培养)；

(2)培养6h后往培养基中加入体积分数1％的极地雪藻细胞裂解物脂质体，于37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时(处理组)，对照组加入等体积的异麦芽酮糖醇；

(3)随后分别向处理组和对照组细胞加入600μM的H₂O₂，处理2h；

(4)收集细胞，利用trizol分离法提取RNA；

(5)取1μg RNA进行反转录；

(6)利用Realtime PCR检测抗氧化/衰老基因的表达量。

(7)结果显示，在存在极地雪藻细胞裂解物脂质体的条件下，脂肪酸结合蛋白基因(fatty acid binding protein Gene)、***基因(insulin like growthfactor Gene)、瘦素受体基因(leptin receptor Gene)、基质金属蛋白酶基因(matrixmetalloproteinase Gene)和硫氧还蛋白基因(thiredoxin Gene)mRNA对H₂O₂呈现积极正向诱导效应，但是对照组在受到H₂O₂胁迫后，则明显受到抑制(见图2)。

实施例6：含有极地雪藻细胞裂解物脂质体的细胞保护精华素

表1含有极地雪藻细胞裂解物脂质体的细胞保护精华素配方

如上表1所示，为含有极地雪藻细胞裂解物脂质体的细胞保护精华素组分成分。含有极地雪藻细胞裂解物脂质体的细胞保护精华素的具体制备方法如下：

(1)将C相的组分与一半的防腐剂(F相的脱氢乙酸和苄醇)混合，得到混合物1；

(2)将B相的组分混合并加入到混合物1中，得到混合物2；

(3)然后将A相的组分混合，加入剩余的防腐剂(F相的脱氢乙酸和苄醇)，得到混合物3；将混合物3加入到混合物2中，得到混合物4；

(4)将D相极地雪藻细胞裂解物脂质体加入混合物4中，得到混合物5；

(5)最后将增稠剂E加入混合物5中，搅拌直至均匀分布，得到混合物6；

(6)使用氢氧化钠溶液或柠檬酸调节混合物6的pH至5.5和6.0之间，得到含有极地雪藻细胞裂解物脂质体的细胞保护精华素。

实施例7：含有极地雪藻细胞裂解物脂质体的抗衰老水凝胶

表2含有极地雪藻细胞裂解物脂质体的抗衰老水凝胶配方

如上表2所示，为含有极地雪藻细胞裂解物脂质体的抗衰老水凝胶组分成分。含有极地雪藻细胞裂解物脂质体的抗衰老水凝胶的具体制备方法如下：

(1)首先将水相W1的组分混合；

(2)然后将相W2的苯氧基乙醇溶解在水相W1中，得到混合物A；

(3)然后将增稠剂W3撒入混合物A中并剧烈搅拌，孵育2小时，得到混合物B；

(4)最后将极地雪藻细胞裂解物脂质体加入混合物B中并搅拌混合物直至均匀，得到混合物C；

(5)使用氢氧化钠溶液或柠檬酸调节混合物C的pH至5.5和6.0之间，得到含有极地雪藻细胞裂解物脂质体的抗衰老水凝胶。