一种分离纯化芝麻素酚三糖苷的方法
阅读说明：本技术 一种分离纯化芝麻素酚三糖苷的方法 (Method for separating and purifying sesaminol triglycoside ) 是由 高锦鸿 芦鑫 黄纪念 孙强 贾聪 王瑞丹 宋国辉 张丽霞 于 2019-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明属于油脂深加工技术领域,具体涉及一种分离纯化芝麻素酚三糖苷的方法,具体为：以粉碎过的芝麻或芝麻饼粕为原料,脱脂后,采用高压均质技术提取法,提取液经过超滤膜分离系统进行分离浓缩,浓缩液经聚酰胺柱层析分离纯化,即可获得98%以上的芝麻素酚三糖苷。相较于传统的芝麻素酚三糖苷提取纯化方法,本发明利用高压均质技术及膜分离结合柱层析分离纯化技术,具有提取率高、处理量大、操作简便、易回收,成本低等优点。本发明方法为芝麻素酚三糖苷的工业化制备提供了新的方法,这对于芝麻的提质增效开发开辟了新的途径,对于芝麻素酚三糖苷的研究及应用奠定了坚实的理论基础,具有积极的学术及经济价值。(The invention belongs to the technical field of deep processing of grease, and particularly relates to a method for separating and purifying sesaminol triglycoside, which specifically comprises the following steps: the method comprises the following steps of taking crushed sesame or sesame cake meal as a raw material, degreasing, extracting by adopting a high-pressure homogenization technology, separating and concentrating an extracting solution by using an ultrafiltration membrane separation system, and separating and purifying a concentrated solution by using polyamide column chromatography to obtain the sesaminol triglycoside with the concentration of more than 98%. Compared with the traditional sesaminol triglycoside extraction and purification method, the method disclosed by the invention has the advantages of high extraction rate, large treatment capacity, simplicity and convenience in operation, easiness in recovery, low cost and the like by utilizing a high-pressure homogenization technology and a membrane separation and column chromatography combined separation and purification technology. The method provides a new method for the industrial preparation of sesaminol triglycoside, opens up a new way for the quality-improving and efficiency-increasing development of sesame, lays a solid theoretical foundation for the research and application of sesaminol triglycoside, and has positive academic and economic values.)
技术领域
本发明属于油料及副产品深加工和生物活性成分分离纯化技术领域，具体涉及一种分离纯化芝麻素酚三糖苷的方法，该方法通过脱脂、高压均质提取、膜分离、柱层析获得芝麻素酚三糖苷。
背景技术
芝麻，是世界上主要的传统优质油料之一，具有悠久的种植历史，我国的芝麻产量居世界之首，素有“芝麻王国”之称。目前，国内芝麻加工以芝麻油生产为主，75%的芝麻用于榨油。榨油过程中会产生大量芝麻饼粕，据测算，我国每年产生50万吨以上芝麻饼粕。受加工水平所限，国内芝麻饼粕主要用作饲料与肥料，芝麻饼粕资源未得到充分合理利用。如何实现芝麻饼粕的资源化利用成为亟待解决的产业问题。
芝麻及其饼粕中，除含有丰富的蛋白资源以外，还含有一定的芝麻素酚糖苷。芝麻素酚糖苷是水溶性芝麻木脂（酚）素一种，主要以三糖苷形式存在，其分子式为C38H48O22，是芝麻中含量最高的水溶性木酚素，平均含量约为0.68 mg/g，其具有一定的抗氧化性，能抑制DNA氧化损伤、消炎等。例如，芝麻素酚三糖苷在肠内微生物作用下可转化为哺乳类木脂素、肠二醇和肠内酯，它们可以预防激素类疾病；芝麻素酚三糖苷能够通过它的抗氧化性保护神经元细胞不受损伤，对于治愈氧化导致的神经元变性疾病是有效的，例如阿尔茨海默氏病。
为获得芝麻素酚三糖苷，传统芝麻素酚三糖苷的制备方法为正己烷脱脂后、利用乙醇水溶液经磁力搅拌或超声波辅助提取，提取物经浓缩冷冻干燥，先经过聚酰胺柱层析分离纯化后，再经HW-40s葡聚糖凝胶柱分离纯化。该方法虽然具有芝麻素酚三糖苷纯度高的优点，但存在处理量小，耗时长、产率低，且操作繁琐，不利于工业放大生产等缺陷。因此，有必要对上述工艺进行改进与创新。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种具有工业转化潜力的分离纯化芝麻素酚三糖苷的方法，该方法具有生产效率高、处理量大、操作简单、产品纯度高、污染小、原材料易回收等优点。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种分离纯化芝麻素酚三糖苷的方法，其包括如下步骤：
1）原料的预处理：
以粉碎过的芝麻或芝麻饼粕（优选使用低温的冷榨芝麻饼粕）为原料，采用亚临界萃取或索氏抽提进行脱油，然后减压蒸馏除去残留的亚临界流体或有机溶剂，获得脱油后的芝麻饼粕，备用；
2）芝麻素酚三糖苷的提取：
将步骤1）获得的脱油后的芝麻饼粕粉碎至80-120目，按料液比1g：20-60ml加入60-80%乙醇溶液配制成悬浊液后，置于高压均质机中，在压力为20-60 MPa条件下高压均质10-40min，高压均质结束后，离心，收集上清液，减压浓缩获得浓缩液，备用；
3）芝麻素酚三糖苷的分离浓缩：
将步骤2）获得的浓缩液用超纯水稀释2-5倍，采用超滤膜进行超滤分离，收集芝麻素酚三糖苷所在的截留浓缩液即为粗提物溶液，保存于-4℃冰箱中，备用；
4）芝麻素酚三糖苷的进一步分离纯化：
采用聚酰胺层析柱对步骤3）所得粗提物溶液进一步分离纯化，用超纯水进行洗脱，HPLC法检测，分部收集器收集，收集富含芝麻素酚三糖苷的洗脱液，合并后经减压旋转浓缩、真空冷冻干燥后即获得纯度为98%以上的芝麻素酚三糖苷。
具体的，步骤1）中所述亚临界萃取条件为：30-60℃萃取3-5次，每次萃取时间为20-40 min，每1kg芝麻或芝麻饼粕添加2-5L液化丁烷或丙烷作为溶剂；索氏抽提条件为：选用***或石油醚作为溶剂，加热回流6-8 h（一般在30-70℃）。步骤1）中脱油后的芝麻饼粕中残油含量不超过1%。
进一步的，步骤1）中减压蒸馏的条件具体为：于压力-0.08--0.12MPa、温度40-70℃蒸馏20-100min。此外，冷榨芝麻饼粕优选粉碎至20-80目。若采用亚临界萃取时，粉碎后的芝麻饼粕需装袋进行萃取，袋子可以使用尼龙袋、棉袋、布袋等，其目数在200目以上；若采用索氏抽提时，粉碎后的芝麻饼粕应用滤纸进行包装。
具体的，步骤2）中高压均质结束后，优选于3000-5000 rpm离心10-30 min。
具体的，步骤2）中将离心获得的沉淀按料液比1g：20-60ml重新加入60-80%的乙醇溶液配制成悬浊液然后置于高压均质机中进行高压均质，重复上述操作1-3次，最后合并上清液，经减压浓缩（以除去溶液中的乙醇）获得浓缩液。
进一步的，步骤3）中所用超滤膜为平膜或卷式膜，超滤膜采用UE或UF系列的超滤膜，截留分子量为1000-100000，操作压力为0.5-3.0 MPa。进一步优选的，在将步骤2）获得的浓缩液用超纯水稀释2-5倍后，采用截留分子量为1000-100,000的超滤膜进行超滤分离，首先选用芝麻素酚三糖苷可透过的较大截留分子量的超滤膜进行分离浓缩，浓缩至截留液为原超滤溶液质量的5-20%，收集透过液，再选用芝麻素酚三糖苷不可透过的较小截留分子量的超滤膜进一步分离浓缩，浓缩至截留液为原超滤溶液质量的5-20%，收集浓缩截留液，保存于-4℃冰箱中，备用。
本发明首次将高压均质提取及膜分离技术应用于芝麻素酚三糖苷的提取及分离浓缩，其中，均质技术是目前应用相当广泛的细化和乳化技术，它被广泛应用于乳品、饮料、化妆品食品和化工行业等，高压均质技术是目前应用最好的均质技术，物料经高压均质后，平均粒径可以达到1μm以下，该技术可以在空穴效应、撞机效应及剪切效应的共同作用下最大限度的将物料的细胞组织破碎，效果较好，因此将其应用于芝麻素酚三糖苷的提取，将有益于芝麻素酚三糖苷提取率的提高，提高资源利用率。
膜分离技术属于高新技术范畴，由于具备在常温下进行、无相态变化、无化学变化、选择性好、分子级过滤及过滤过程简单、易于控制和放大，且兼有分离、浓缩、纯化和精制的功能等特征，目前已广泛应用于食品、医药、生物、化学等多个领域，产生了巨大的经济效益和社会效益。超滤是膜分离的重要分支，其膜孔径为1-20nm，所施加的压力差为0.1-1.0MPa，常用于溶液中大分子的除去，大小分子间分离及大分子间的分级。
本发明中应用高压均质提取技术及超滤分离结合柱层析技术来替代传统的磁力搅拌或超声波辅助提取工艺及单一的柱层析纯化，在提高样品产率、处理量和生产效率的同时，降低了生产成本，易于实现自动化，为工业化制备芝麻素酚三糖苷提供了理论指导和实现的可能性。与传统经两次柱层析制备芝麻素酚三糖苷相比，本发明方法具有的优点与有益效果如下：
1）本发明中采用的高压均质提取技术，控制高压均质压力，高压均质提取时间，在节约提取时间同时，使芝麻（芝麻饼粕）中芝麻素酚三糖苷提取更完全，与超声波辅助提取相比，同质量的芝麻(芝麻饼粕)原料中，芝麻素酚三糖苷的提取得率提高8.23%；
2）本发明中采用膜分离对芝麻素酚三糖苷进行分离，处理量大、高效节能、易清洗回收、进行二次利用且成本低；可对截留液进行多次稀释超滤，减少原料中目标物的损失，与不经膜分离、直接称取同质量芝麻素酚三糖苷粗提物经聚酰胺柱层析分离纯化相比，经等体积聚酰胺柱层析分离纯化，芝麻素酚三糖苷的产率提高23.65%，且纯度可达98%以上；
3）本发明制备的芝麻素酚三糖苷纯度高、品质好，不但可以应用于后续研究，也可以应用于食品、药品等行业；
综上，相较于传统的芝麻素酚三糖苷提取纯化方法，本发明利用高压均质技术及膜分离结合柱层析分离纯化技术，具有提取率高、处理量大、操作简便、易回收，成本低等优点。本发明方法为芝麻素酚三糖苷的工业化制备提供了新的方法，这对于芝麻的提质增效开发开辟了新的途径，对于芝麻素酚三糖苷的研究及应用奠定了坚实的理论基础，具有积极的学术及经济价值。
附图说明
图1为实施例1中步骤2）中高压均质提取芝麻粕中芝麻素酚三糖苷溶液，离心后上清液的高效液相色谱仪检测图谱；与对照例1超声波辅助提取溶液的高效液相色谱仪检测图谱相比，同种同质量的芝麻饼粕原料中，芝麻素酚三糖苷的提取得率提高8.23%；
图2为对照例1即超声波辅助提取芝麻粕中芝麻素酚三糖苷所得溶液，离心后上清液的高效液相色谱仪检测图；
图3为实施例1中步骤3）中UE003截留液所得高效液相检测图谱，与图1对比可知，溶液经超滤膜分离纯化后，芝麻素酚三糖苷的浓度由125 μg/mL提高到1083 μg/mL，且溶液中的部分杂质被除去或含量降低，芝麻素酚三糖苷的液相纯度由39.67%提高到58.53%，可实现芝麻素酚三糖苷的分离浓缩；
图4为实施例1中步骤4）中将步骤3经膜分离后所得芝麻素酚三糖苷粗提物为原料，经聚酰胺层析柱分离纯化后，分部收集器收集芝麻素酚三糖苷含量及纯度最高部分的高效液相检测图谱，与对照例2不经膜分离、直接进行步骤3）聚酰胺层析柱分离纯化，分部收集器收集的芝麻素酚三糖苷溶液相比，芝麻素酚三糖苷的含量提高23.65%，且芝麻素酚三糖苷的液相纯度从95.25%提高到98.13%；
图5为实施例1中步骤4）中获得的芝麻素酚三糖苷经超高分辨质谱仪检测后的超高分辨质谱仪图谱；
图6为对照例2即将步骤2）获得的芝麻素酚三糖苷浓缩液不经膜分离、直接进行步骤3）聚酰胺层析柱分离纯化，分部收集器收集芝麻素酚三糖苷含量及纯度最高的部分的高效液相检测图谱，其中高效液相纯度为95.25%。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
本发明中，如无特殊说明，乙醇均指的体积浓度。
实施例1：
一种分离纯化芝麻素酚三糖苷的方法，其包括如下步骤：
1）原料预处理
称取适量冷榨芝麻饼粕，粉碎至80目，装入滤纸筒中，放入索氏抽提器中，加入400-600mL石油醚进于50℃回流萃取8h。然后在-0.12 MPa、40℃下减压蒸馏80 min除去残余的石油醚，获得脱油后芝麻饼粕；
2）芝麻素酚三糖苷的高压均质提取：
将步骤1）获得的脱油后芝麻饼粕粉碎至过100目筛，称取20g，按料液比1g：40 mL加入70%乙醇溶液配制成悬浊液后，置于高压均质机中，高压均质压力为50 MPa，高压均质时间为15 min，高压均质提取结束后，5000 rpm离心10-30 min，收集上清液，备用；将离心获得的沉淀按料液比1g：40 mL重新加入70%的乙醇溶液配制成悬浊液后，置于高压均质机中，重复上述操作1次，最终合并上清液，经高效液相检测（其高效液相图谱见图1）后，芝麻素酚三糖苷的得率为5.03 mg/g芝麻饼粕，经减压浓缩，除去溶液中乙醇，收集剩余溶液即为浓缩液，备用；
3）芝麻素酚三糖苷的分离浓缩：
将步骤2）获得的浓缩液，用超纯水稀释4倍获得超滤溶液，装入超滤装置，采用普通平膜型UE050（采用的超滤膜截留分子量为50000）进行超滤分离浓缩，操作压力为0.8 Mpa，浓缩至截留液为原超滤溶液质量的10%，结束超滤，收集透过液；再将透过液装入超滤装置，选用普通平膜型UE003（采用的超滤膜截留分子量为3000），操作压力为0.8 Mpa，进一步将芝麻素酚三糖苷提取液分离浓缩，浓缩至截留液为原超滤溶液质量的10%，结束超滤，收集截留液（其高效液相图谱见图3）即为粗提物溶液，保存于-4℃冰箱中，备用；
4）芝麻素酚三糖苷的分离纯化：
量取步骤3）所得的粗提物溶液，经过3.0×25cm聚酰胺层析柱分离纯化，用超纯水进行洗脱，采用分部收集器收集水洗脱组分，经过HPLC检测分析，收集富含芝麻素酚三糖苷的洗脱液，合并后经减压旋转浓缩、-58℃以下真空冷冻干燥48h，即获得68.70 mg高效液相纯度为98.13%的芝麻素酚三糖苷（其高效液相图谱见图4）。将得到的芝麻素酚三糖苷经超高分辨质谱仪检测（其高分辨质谱图见图5），测得分子量为856.2631，图5中为目标物加Na+后的分子量即879.2485，与文献报道相一致。
对照例1：
一种分离纯化芝麻素酚三糖苷的方法，其包括如下步骤：
1）原料预处理：同实施例1；
2）芝麻素酚三糖苷的超声波辅助提取：
将步骤1）获得的脱油后芝麻饼粕粉碎至过100目筛，称取20g，按照文献中报道的超声波辅助提取芝麻素酚三糖苷最佳提取工艺：乙醇浓度70 %、料液比1:40 g/mL、超声波温度40℃、超声波时间20 min，提取芝麻素酚三糖苷，超声波辅助提取结束后，5000 rpm离心10-30 min，收集上清液，经高效液相检测（其高效液相图谱见图2）后，芝麻素酚三糖苷的得率为4.65mg/g芝麻饼粕，低于实施例1中采用高压均质的得率为5.03 mg/g芝麻饼粕。
对照例2：
一种分离纯化芝麻素酚三糖苷的方法，其包括如下步骤：
1）原料预处理：同实施例1；
2）芝麻素酚三糖苷的高压均质提取：同实施例1；
3）芝麻素酚三糖苷的分离纯化，即不经过步骤3）的超滤分离浓缩，直接进行聚酰胺层析柱分离纯化：
将步骤2）获得的浓缩液，直接经过3.0×25cm聚酰胺层析柱分离纯化，用超纯水进行洗脱，采用分部收集器收集水洗脱组分，经过HPLC检测分析（其高效液相图谱见图6），收集富含芝麻素酚三糖苷的洗脱液，合并后经减压旋转浓缩、-58℃以下真空冷冻干燥48h，即获得约55.85mg高效液相纯度为95.25%的芝麻素酚三糖苷。
实施例2：
一种分离纯化芝麻素酚三糖苷的方法，其包括如下步骤：
1）原料预处理
称取适量芝麻，粉碎至60目，装入尼龙袋中，放入亚临界萃取器中，按照料液比1 kg：4L加入液化丁烷作为亚临界流体进行萃取，在40℃萃取4次，每次萃取40 min。然后在-0.10MPa、50℃下减压蒸馏60 min除去残余的液化丁烷，获得脱油后的芝麻饼粕；
2）芝麻素酚三糖苷的提取：
将步骤1）获得脱油后的芝麻饼粕粉碎过80目筛，称取500.00g脱油后芝麻饼粕，按料液比1g：30 mL加入80%乙醇溶液配制成悬浊液后，置于高压均质机中，高压均质压力为40MPa，高压均质时间为20 min，高压均质提取结束后，3000 rpm离心10-30 min，收集上清液，备用；将离心获得的沉淀按照料液比1g：30 mL重新加入80%乙醇溶液配制成悬浊液后，置于高压均质机中，重复上述操作2次，最终合并上清液，经减压浓缩除去溶液中乙醇后，收集剩余溶液即为浓缩液，收集备用；
3）芝麻素酚三糖苷的分离浓缩：
量取步骤2）获得的浓缩液，用超纯水稀释4倍获得超滤溶液，装入超滤装置，采用普通平膜型UE005（采用的超滤膜截留分子量为5000）进行超滤分离浓缩，操作压力为1Mpa，浓缩至截留液为原超滤溶液质量的20%，结束超滤，收集透过液；再将透过液装入超滤装置，选用普通平膜型UE003（采用的超滤膜截留分子量为3000），操作压力为1Mpa，进一步将芝麻素酚三糖苷提取液分离浓缩，浓缩至截留液为原超滤溶液质量的20%，结束超滤，收集截留液即为粗提物溶液，保存于-4℃冰箱中，备用；
4）芝麻素酚三糖苷的分离纯化：
量取步骤3）所得的粗提物溶液，经过3.0×30cm聚酰胺层析柱分离纯化，用超纯水进行洗脱，采用分部收集器收集水洗脱组分，经过HPLC检测分析，收集富含芝麻素酚三糖苷的洗脱液，合并后经减压旋转浓缩、-58 ℃以下真空冷冻干燥48 h，即获得1.72g高效液相纯度为98.23%的芝麻素酚三糖苷。