阅读说明：本技术 基于BPEI-CuNCs荧光探针快速检测铜离子的方法 (Method for rapidly detecting copper ions based on BPEI-CuNCs fluorescent probe ) 是由 李胎花 宫磊 黄磊 于 2019-09-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了基于BPEI-CuNCs荧光探针快速检测铜离子的方法,包括以下步骤：支链聚乙烯亚胺BPEI在铜离子和抗坏血酸AA的共同作用下反应生成具有荧光性质的BPEI-CuNCs；将待测样品加入到含有BPEI-CuNCs的缓冲溶液中,基于BPEI-CuNCs荧光探针检测铜离子的浓度。通过荧光光谱仪,在激发波长为360nm,检测发射波长为430nm的荧光强度,根据Cu<Sup>2+</Sup>标准浓度梯度曲线,得到铜离子的浓度。铜离子的最低检出限为0.01μmol/L,加标回收率达96％-99％。该方法简单快速、高选择、高灵敏度。在生物和环境领域的选择性测定金属铜离子方面具有广阔的应用前景。(The invention discloses a method for rapidly detecting copper ions based on a BPEI-CuNCs fluorescent probe, which comprises the following steps: the branched polyethyleneimine BPEI reacts under the combined action of copper ions and ascorbic acid AA to generate BPEI-CuNCs with fluorescence; and adding a sample to be detected into a buffer solution containing BPEI-CuNCs, and detecting the concentration of copper ions based on a BPEI-CuNCs fluorescent probe. Detecting fluorescence intensity of 430nm emission wavelength at excitation wavelength of 360nm by fluorescence spectrometer according to Cu 2+ And (5) obtaining the concentration of the copper ions by a standard concentration gradient curve. The lowest detection limit of copper ions is 0.01 mu mol/L, and the recovery rate of the added standard reaches 96-99%. The method is simple, rapid, high in selectivity and high in sensitivity. Has wide application prospect in selectively measuring metal copper ions in the fields of biology and environment.)

基于BPEI-CuNCs荧光探针快速检测铜离子的方法

技术领域

本发明涉及金属离子的检测领域，具体涉及基于BPEI-CuNCs荧光探针快速检测铜离子的方法。

背景技术

铜(Copper)作为动植物和人类生长发育所必须的微量元素，起着促进动植物生长的重要作用。铜元素对人体健康至关重要，在Cu(I)/Cu(II)的氧化还原活性过程中，对许多酶有催化和辅助作用；但它也可能会促进活性氧类(ROS)的生成，从而干扰细胞信号的传导，破坏细胞结构，导致细胞凋亡。高浓度的铜离子也会引起肝硬化、吐逆、运动障碍和知觉神经紊乱等现象，影响生物的正常生长发育，严重时可能会导致死亡。此外，如果铜长期积累在神经元细胞质中，会引起运动障碍和神经紊乱，严重时则会导致阿尔兹海默症、震颤麻痹和肌萎缩性脊髓侧索硬化症等疾病。因此，样本中铜离子的检测及其含量的精确测定，无论是对环境保护还是人类健康都具有重要意义。

世界卫生组织WHO规定饮用水中铜含量的最高阈值为2mg/kg，美国环保局EPA规定的标准为1.0mg/L。我国生活饮用水卫生标准(GB5749-2006)也规定了饮用水中铜含量的限值为1.0mg/L

关于重金属铜离子的检测方法很多样，除了中华人民共和国环境保护标准(HJ486-2009)规定的原子吸收分光光度法以外，还有火焰原子吸收法、石墨炉原子吸收法、伏安法、比色法、电感耦合等离子体原子发射光谱法、原子荧光光谱法等，这些方法具有操作复杂、需要依赖大型仪器、成本较高等不足。因此，建立一种简单快速、高选择、高灵敏度的Cu²⁺检测方法十分有必要。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于BPEI-CuNCs荧光探针快速检测铜离子的方法，该方法操作简单，选择性高，灵敏度高，不需要依赖大型的设备仪器，对检测环境和时间要求不严格。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

基于BPEI-CuNCs荧光探针快速检测铜离子的方法，包括以下步骤：

1)支链聚乙烯亚胺BPEI在铜离子和抗坏血酸AA的共同作用下反应生成具有荧光性质的BPEI-CuNCs；

2)将待测样品加入到含有BPEI-CuNCs的缓冲溶液中，基于BPEI-CuNCs荧光探针检测铜离子的浓度。

步骤1)中，BPEI-CuNCs由以下步骤制成的：将去离子水和BPEI混合均匀，然后加入CuSO₄溶液，置于空气恒温摇床上搅拌10min；最后加入AA，在室温条件下振荡两天，过滤后得到BPEI-CuNCs溶液。

进一步的，BPEI-CuNCs溶液中PEI浓度为0.36mg/mL；CuSO₄与AA的摩尔比为1∶1。

步骤2)中，缓冲溶液为含0.03％CTAB的柠檬酸盐缓冲液，其pH值为4，浓度为20mmol/L。

步骤2)具体包括以下步骤：将不同浓度的铜离子加入到BPEI-CuNCs和20mmol/L，pH4含0.03％CTAB的柠檬酸盐缓冲液中，混合均匀，反应结束后，在激发波长为360nm，检测发射波长为430nm的荧光强度，以铜离子的浓度为横坐标，空白荧光强度值与含有铜离子的荧光强度值的差值为纵坐标作图，得到线性回归方程，检测铜离子的浓度。

进一步的，铜离子、BPEI-CuNCs、缓冲液的体积比为1∶2∶16。

进一步的，线性回归方程为y＝1.3588x+10.744，R²＝0.9752，铜离子的最低检出限为0.01μmol/L。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下的优势：

1)操作简单，用时短，灵敏方便，不需要依赖大型的设备仪器，对检测环境和时间要求不严格；

2)特异性好，具有良好的选择性，其他金属离子受干扰小，如Al³⁺、Cd²⁺、Fe²⁺、Mg²⁺、Pb²⁺，使用该方法检测铜离子时，可以排除样品中其他金属离子的干扰，结果更加可靠；

3)铜离子的最低检出限为0.01μmol/L，低于生活饮用水卫生标准(GB5749-2006)规定的1.0mg/L(约15.74μmol/L)限值；且铜离子加标实验回收率达96％-99％，BPEI-CuNCs探针在实际样本中对离子的检测具有准确性和可靠性，可适用于生活中对Cu²⁺定性定量的检测。

附图说明

图1是BPEI-CuNCs检测Cu²⁺的工作原理图；

图2是BPEI-CuNCs的电镜图；

图3是BPEI-CuNCs的荧光光谱图；图中，A为BPEI-CuNCs稀释10倍后的荧光光谱图；B为BPEI-CuNCs(原溶液)的荧光光谱图，设定的检测光波长Em＝430nm、Ex＝360nm；

图4是铜离子浓度与Δ荧光强度之间的关系图；

图5是BPEI-CuNCs检测不同重金属离子的荧光强度对比图；图中，不同重金属离子的浓度均为50μmol/L；

图6是铜离子加标实验中各水样的回收率；图中，各水样的铜离子浓度为50μmol/L。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明，但这些实施例并不用来限制本发明。

实施例1

1)BPEI-CuNCs的制备

BPEI-CuNCs采用抗坏血酸还原法制备。在洗净并烘干的烧杯中依次加入48.09mL去离子水和1.91mL 9.4mmol/L BPEI，混合均匀，然后加入835μL 10mmol/L CuSO₄溶液，置于空气恒温摇床上搅拌10min。最后加入835μL 100mmol/L AA，在室温条件下振荡两天，过滤后备用。

合成的BPEI-CuNCs溶液颜色随时间变化从蓝色逐渐变浅、最后变为草绿色，最终BPEI-CuNCs溶液中PEI浓度为0.36mg/mL。利用荧光光谱仪测量BPEI-CuNCs的荧光光谱，当Ex＝360nm时在430nm附近有一个吸收峰。

2)缓冲溶液的制备

为了使缓冲溶液更加稳定，加入了少量的阳离子表面活性剂即CTAB溶液。首先，将65.5mL 0.1M柠檬酸溶液和34.5mL 0.1M柠檬酸钠溶液充分混匀，利用雷磁pH计调节pH至4，得到100mmol/L的柠檬酸盐缓冲溶液(pH＝4)。然后取10mL 100mmol/L柠檬酸盐缓冲溶液、15mL 0.1％CTAB与25mL去离子水混合，配制成20mmol/L柠檬酸盐缓冲溶液(0.03％CTAB，pH＝4)，备用。

3)Cu²⁺标准浓度梯度曲线绘制

取1.5mL离心管，依次加入800μL 20mmol/L pH4柠檬酸盐缓冲溶液(0.03％CTAB)、100μL BPEI-CuNCs和50μL不同浓度的Cu²⁺离子，每组浓度制备三次。最终检测的Cu²⁺离子浓度梯度范围为0～500μmol/L。利用荧光光谱仪360nm波长的激发光，扫描400nm～650nm区间的荧光光谱。如图4所示，提取出峰值430nm处的荧光强度数据，将0μmol/L Cu²⁺离子浓度的荧光强度减去各浓度的荧光强度，得到关于Cu²⁺离子浓度梯度的荧光强度差值ΔF，平均三个差值并计算标准偏差。选取Cu²⁺浓度(0.1～10μmol/L)与Δ荧光强度值作图，得到二者的线性曲线，画出趋势线和误差棒，线性回归方程为ΔF＝1.3588x+10.744(R2＝0.9752)。铜离子的最低检出限为0.01μmol/L，低于生活饮用水卫生标准(GB5749-2006)规定的1.0mg/L(约15.74μmol/L)限值。

4)重金属特异性实验

取1.5mL离心管，依次加入800μL 20mmol/L pH4柠檬酸盐缓冲溶液(0.03％CTAB)、100μL BPEI-CuNCs和50μL 50μmol/L不同的重金属离子(Cu²⁺、Al³⁺、Cr³⁺、Cd²⁺、Fe²⁺、Mg²⁺、Pb^{2 +})，同时设置超纯水的空白对照。利用荧光光谱仪360nm波长的激发光，扫描400nm～650m区间的荧光光谱，将各金属离子的荧光强度进行对比。

如图5所示，Al³⁺、Cd²⁺、Fe²⁺、Mg²⁺、Pb²⁺这些重金属离子对BPEI-CuNCs的荧光强度基本没有干扰；其中Cr³⁺可能会使荧光有所降低，但其降低幅度较小，与Cu²⁺相比可以忽略。表明BPEI-CuNCs对Cu²⁺离子具有比较好的选择性。

5)实际水样中铜离子的加标实验

选取四种水样类型：河水采样于南京林业大学紫湖溪；矿泉水选取常见的瓶装饮用水农夫山泉品牌；自来水采样于南京林业大学自来水管道；以及实验室用超纯水。设定50μmol/L为最终测量的Cu²⁺浓度，测量各水样样品的荧光强度，以超纯水作为对照组，重复三组实验。利用荧光光谱仪360nm波长的激发光，扫描在400nm～650nm区间的荧光光谱，选取吸收峰峰值处数值进行对比，并作误差棒。

如表1和图6所示，河水、矿泉水、自来水三种水样关于铜离子浓度的测量结果在数值上没有特别明显的差异。同时经过计算后发现环境水样中对于Cu²⁺的定量峰回收率都比较高：河水样品中Cu²⁺的定量峰回收率为96.15％，矿泉水样品中Cu²⁺的回收率为97.93％，自来水样品中Cu²⁺的回收率为99.49％。结果表明，BPEI-CuNCs探针在实际样本中对离子的检测具有准确性和可靠性，可适用于生活中对Cu²⁺定性定量的检测。

表1 不同水样的来源与回收率

需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。