阅读说明：本技术 多通路结构光照明的拉曼超分辨显微成像方法 (The Raman super-resolution micro imaging method of multi-path Structured Illumination ) 是由 王宏达 孙佳音 初宏亮 吴强 于 2019-08-29 设计创作，主要内容包括：多通路结构光照明拉曼超分辨显微成像方法,涉及微观粒子超分辨成像技术领域,在现有的结构光超分辨显微系统的成像光路中,加入拉曼分光成像模块,通过多种拉曼探针的选取,实现复杂体系中不同观测物的特异性成像。包括激发光模块、结构光照明模块和拉曼分光成像模块；选取特定的拉曼探针分子,将所述拉曼探针分子与抗体结合,对被测样品进行特异性标记；开启激发光模块,以倒置荧光显微镜为平台,结构光照明模块出射的光条纹激发被测样品；被激发出来探针的信号通过拉曼分光成像模块实现信号的特异性分选,然后在CCD处成像。本发明可用于内吞/转运单个分子及颗粒体系、病毒进入细胞机理、活细胞内分子的动态过程等研究方向。(Multi-path Structured Illumination Raman super-resolution micro imaging method, it is related to microcosmic particle super-resolution imaging technical field, in the imaging optical path of existing structure light super-resolution microscopic system, raman spectroscopy image-forming module is added, by the selection of a variety of Raman microprobes, the specificity imaging of different observation objects in complex system is realized.Including excitation module, Structured Illumination module and raman spectroscopy image-forming module；Specific Raman microprobe molecule is chosen, by the Raman microprobe molecule in conjunction with antibody, specific marker is carried out to sample；Excitation module is opened, using inverted fluorescence microscope as platform, the striations of Structured Illumination module outgoing excites sample；Be excited out probe signal by raman spectroscopy image-forming module realize signal specificity sorting, then CCD at imaging.The present invention can be used for endocytosis/transhipment individual molecule and granular system, cell entry celelular mechanism, the research directions such as dynamic process of molecule in living cells.)

多通路结构光照明的拉曼超分辨显微成像方法

技术领域

本发明涉及微观粒子超分辨成像技术领域，具体涉及一种多通路结构光照明拉曼超分辨显微成像方法。

背景技术

结构光照明超分辨荧光显微技术(SIM)是近几年发展来的一种新型的超分辨宽场成像技术。SIM超分辨技术以普通的倒置荧光显微镜为平台，利用特定的激发光路产生空间频率已知的正弦条纹，对样品进行荧光信号的激发，对采集到的信号进行数据的分离与重构，可获得具有二倍衍射极限的超分辨成像。SIM超分辨技术成像速度较快，不需要长时间、大量的采集样品信息，适用于活体细胞的成像分析。

光学探针是研究复杂生物系统中特定目标的有效工具。基于拉曼散射的拉曼探针，谱线十分锐利、分辨率高、特异性强。此外，水的拉曼信号很弱，拉曼探针可在水环境样品中进行直接检测。但是拉曼探针也有它的不足之处，就是它的信号强度较低(比荧光信号低两个数量级)。通过表面增强拉曼(SERS)探针以及共振拉曼(PR)探针标记的方法，能够将拉曼信号的强度提高10²-10⁶，可解决拉曼信号强度低的问题。综上，对于生物样品而言，尤其是活体细胞的观测，用拉曼探针进行特异性标记成像，是一种理想的分析手段。

细胞的荧光显微镜图像能显示荧光标记的分子，让研究人员实时观察活细胞或固定样品内特殊分子或蛋白复合物的运动，但荧光信号的特异性较差，无法满足复杂体系下观察某种(或某几种)特定目标的研究需求，此外，荧光标记的体积相对较大，在标记生物小分子时会改变其生物活性，但是相对于拉曼信号而言，荧光信号的强度较高，较易被相机采集。

发明内容

本发明提供了一种多通路结构光照明拉曼超分辨显微成像方法，在现有的结构光超分辨显微系统的成像光路中，加入拉曼分光成像模块，通过多种拉曼探针的选取，实现复杂体系中不同观测物的特异性成像。

多通路结构光照明拉曼超分辨显微成像方法，其特征是；包括成像系统，所述成像系统包括激发光模块、结构光照明模块和拉曼分光成像模块；该方法由以下步骤实现：

步骤一、选取特定的拉曼探针分子，将所述拉曼探针分子与抗体结合，对被测样品进行特异性标记；

步骤二、开启激发光模块，以倒置荧光显微镜为平台，所述结构光照明模块出射的光条纹激发被测样品；

步骤三、被激发出来探针的信号通过拉曼分光成像模块实现信号的特异性分选，然后在CCD处成像，重构获得具有二倍衍射极限的超分辨成像。

本发明的有益效果：

本发明提供多通路结构光照明拉曼超分辨显微成像方法，选取了488、532、633、785nm四个波长的激光器，可满足不同探针对激发波长的需求；

本发明提供多通路结构光照明拉曼超分辨显微成像方法，将拉曼探针标记技术与结构光超分辨成像技术相结合，能够实现特异性超分辨成像，提高了宽场拉曼成像的分辨率；

本发明提供多通路结构光照明拉曼超分辨显微成像方法，采用拉曼分光成像模块对不同探针的特征峰值信号进行选通，系统稳定性高，成像速度快；

本发明提供多通路结构光照明拉曼超分辨显微成像方法，对样品制备的要求较低，较适用于活体细胞的观察研究，能用于内吞/转运单个分子及颗粒体系、病毒进入细胞机理、活细胞内分子的动态过程等研究方向。

附图说明

图1为本发明所述的多通路结构光照明拉曼超分辨显微成像方法中单模光纤耦合的多通路激发光模块示意图；

图2为本发明所述的多通路结构光照明拉曼超分辨显微成像方法中结构光照明模块示意图；

图3为本发明所述的多通路结构光照明拉曼超分辨显微成像方法中拉曼分光成像模块示意图；

图4为本发明所述的多通路结构光照明拉曼超分辨显微成像方法中成像系统的整体光路结构图；

图5为本发明所述的多通路结构光照明拉曼超分辨显微成像方法中的流程图。

具体实施方式

具体实施方式一、结合图1至图5说明本实施方式，多通路结构光照明拉曼超分辨显微成像方法，该成像方法中包括成像系统，所述成像系统包括激发光模块、结构光照明模块和拉曼分光成像模块；所述激发光模块包括488nm、532nm、633nm以及785nm波长的激光器、耦合器1和单模光纤2；所述结构光照明模块包括准直器3、声光调制器4、扩束镜组5、半波片6、PBS分束器7、铁电液晶8、第一组透镜9、普克尔盒10、反射镜11、第二组透镜12、第一汇聚镜13、掩模板14、准直镜15和第二汇聚镜16；所述拉曼分光成像模块包括管镜17、载有滤波片的电动转轮18和CCD；

所述488nm、532nm、633nm、785nm波长的激光器经由各自对应的二向色镜反(透)射汇聚于耦合器1处，后由耦合器耦合至单模光纤2中。

单模光纤耦合出射的发散光束首先经过准直器3准直；再由声光调制器4在上述四种激发波长中进行遴选；后由扩束镜组5对光束口径进行扩大；而后通过半波片6将光束偏振态调节为S方向；进一步经过PBS分束器7，将S方向的光束反射至铁电液晶8上，通过对铁电液晶像素的加载，可以将一束光衍射成多束出射；为了适合普克尔盒10的通光口径，在其前后分别放置第一组透镜9以及第二组透镜12，使得光束无阻碍地普克尔盒，而普克尔盒的作用则是对出射光束的偏振方向进行调制，以保证干涉条纹具有最佳的对比度；反射镜11，在系统中的作用是转折光束，以压缩整个系统的长度；调制好偏振态的光束通过第一汇聚镜13，到达掩模板14，掩模板14上打有6个孔洞，这些孔洞对应着平面内三个不同的照明方向下±1级光束汇聚的空间位置，能够滤除0级光束以及其它高级次衍射光；光束进一步向前传播，先后通过15)准直镜的准直以及第二汇聚镜16的聚焦，而后进入倒置荧光显微镜，最后在物镜的焦平面处实现结构光照明。

图3为拉曼分光成像模块示意图。样品激发出来的拉曼(荧光)信号先经由管镜17，再进一步向前传播至载有不同中心波长窄带滤光片(例如，Semrock FF01-575/5-25、FF01-680/13-25型滤光片等)的电动转轮18。窄带滤光片的中心波长与拉曼探针的拉曼特征峰值相对应，它的作用是能够将其它背景信号滤除，仅使所需的特异性拉曼信号通过。拉曼信号进一步向前传播到达CCD相机，参与数据的采集。而当系统进行荧光成像时，转轮可转到空位置，使得荧光信号通过。滤光片转轮的采用，提高了系统的成像速度，非扫描的一次性成像方式，也大大降低了系统的不稳定性。通过不同探针标记的不同观测目标激发出来的特征信号，可以对复杂体系下的多个观测目标进行特异性快速超分辨成像。

在拉曼分光成像模块中，也兼具荧光成像的功能，使得拉曼探针与荧光探针实现使用范围上的互补。由于探针是具有波长选择性的，因此，系统以多通路激发光模块作为拉曼信号的激发光源。

本实施方式中，结合图4的成像系统结构图，基于各个模块的多通路结构光照明超分辨拉曼显微成像方法，能够实现复杂体系下，多种目标成分的超分辨显微成像分析，成像速度快，可靠性强，此外，该成像方法还可通过改变或优化其中的某一模块以满足不同应用领域的需求，具有较强的灵活性和广泛的适用性。

结合图5说明本实施方式，本实施方式的成像方法具体由以下步骤实现：

步骤一、选取488nm、532nm、633nm以及785nm波长的激光器，以单模光纤作为耦合媒介，组合搭建形成多通路激发光模块；

步骤二、选取特定的拉曼探针分子(荧光探针分子)，将其与抗体结合，对样品进行特异性标记；

步骤三、开启激发光模块，以倒置荧光显微镜为平台放置待测样品，并利用激发光路产生的结构光条纹对样品进行探针信号的激发；值得注意的是，为了实现各向同性的超分辨成像，需采用三个不同方向的正弦条纹，对样品进行激发照明。由于激发光源模块包含四种不同激发波长，因此在光路中加入能够对波长进行分选的声光调制器，根据具体采用的探针对入射波长进行选通；

步骤四、被激发出来探针的信号将到达拉曼分光成像模块，通过成像模块中的滤光片转轮实现信号的特异性分选，而后成像于CCD；

步骤五、对采集的信号进行数据处理，重构获得具有二倍衍射极限的超分辨成像。

本实施方式中，用于特异性标记的探针为拉曼探针或荧光探针。被测样品包括活细胞、细胞膜、人工磷脂膜、能内吞或转运单个分子及颗粒的体系。所述抗体可以为表皮生长因子受体(EGFR)抗体或葡萄糖转体蛋白(GLUT1)抗体等。

本实施方式中将多通路结构光照明超分辨显微成像方法与特异性拉曼成像技术相结合，能够在复杂体系下，获取不同拉曼探针标记下的多个目标观测物的特异性超分辨成像信息，可用于内吞/转运单个分子及颗粒体系、病毒进入细胞机理、活细胞内分子的动态过程等研究方向。