阅读说明：本技术 嵌合分子及其用途 (Chimeric molecule and application thereof ) 是由 K·J·沙佩尔 D·沃特森 P·R·杨 于 2018-03-29 设计创作，主要内容包括：公开了基于病毒膜融合蛋白的嵌合多肽。更具体地,本发明公开了包含病毒融合蛋白的病毒粒表面暴露部分和异源性结构稳定化部分的嵌合多肽和这些嵌合多肽的复合体。本发明还公开了这些复合体在组合物中的用途和用于激发针对包膜病毒融合蛋白或所述融合蛋白复合体的免疫应答的方法和/或用于治疗或预防包膜病毒感染的方法。本发明进一步公开了异源性结构稳定化部分用于寡聚异源目的分子的用途。(Disclose the chimeric polyeptides based on virus membrane-fusion protein.More specifically, the invention discloses the virion surface expose portions comprising virus amalgamation protein and heterologous structural to stabilize the chimeric polyeptides of part and the complex of these chimeric polyeptides.The invention also discloses the purposes of these complexs in the composition and the methods for exciting the method for the immune response for being directed to enveloped virus fusion protein or the fusion protein complex and/or for treating or preventing infection of coated virus.The present invention further discloses heterologous structurals to stabilize the purposes that part is used for the heterologous molecules of interest of oligomerization.)

具体实施方式

中所示的发明进行众多变动和/或修改而不脱离如充分描述的本发明的精神和范围。因此，本发明的实施方案应从全部方面视为说明性而非限制性的。

为了可以轻易理解本发明并产生实际效果，现在将通过以下非限制性实施例描述具体的优选实施方案。

实施例

实施例1

作为产生嵌合多肽(其包含受约束处于融合前构象的病毒融合蛋白的胞外结构域)的本发明能力的示例，提供了呼吸道合胞体病毒融合蛋白的代表性证据。

材料和方法

嵌合多肽设计：

RSV F的胞外结构域以及按照McLellan等人(Science,2013.342(6158):592-8)，在4个位点(S155C、S290C、S190F和V207L)包含突变的RSV-F胞外结构域突变体(RSV F dscav)各自有效地与包含一对衍生自HIV-1 GP160的互补的七肽重复序列区的下游异源性结构稳定部分(SSM)连接。还产生了缺少这种SSM的对照胞外结构域构建体和包含与折叠SSM(foldon SSM)有效连接的RSV F ds cav的阳性对照构建体(RSV F ds cav折叠)。下文呈现有关蛋白质的氨基酸序列。

RSV F的胞外结构域(1-520)：

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKNKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTQATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCEIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGK[SEQID NO:146]。

RSV F的胞外结构域(1-520)–基于HIV GP160的SSM：

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKNKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTQATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCEIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAGGSGGHTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQPAKDEQELLE[SEQ ID NO:147]。

RSV F的胞外结构域(1-520)–DScav突变-基于HIV GP160的SSM：

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKNKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTQATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAGGSGGHTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQPAKDEQELLE[SEQ ID NO:150]。

RSV F的胞外结构域(1-513)–DScav突变–折叠SSM(按照McLellan等人(Science, 2013.342(6158):592-8)，对照)：

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKNKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTQATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSGSAWSHPQFEK[SEQ ID NO:151]

蛋白质表达和纯化：

将编码嵌合融合蛋白RSV F钳夹、RSV F ds cav钳夹、RSV F ds cav折叠和缺少HIV-1 HRA序列和HRB序列的对照RSV F胞外结构域的密码子优化DNA序列各自并入pIRES-2真核表达载体中的CMV启动子下游。将所产生的质粒转染入化学成分确知的CHO(CD-CHO)培养基(Gibco)中生长的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，转染为在密度为1x10⁶个细胞/mL的300mLCHO细胞中含有600μg质粒和2.4mg线型聚乙烯亚胺。与转染试剂温育4小时后，将细胞沉淀并重悬于含有8mM Glutamax(Gibco)、100单位/mL青霉素(Gibco)、100μg/mL链霉素(Gibco)、7.5％CHO CD高效补料A(Gibco)和7.5％CHO CD高效补料B(Gibco)的300mL CD-CHO中。随后将细胞在37℃、5％CO₂温育7天，按约120转/分钟振摇。7天后，通过在6,000x g离心10分钟移除细胞，并过滤上清液。

用共价偶联于HiTrap NHS活化型HP柱(GE)的特异性单克隆抗体通过亲和色谱纯化重组蛋白。通过与HIV-1 HRA和HRB形成的6螺旋束结合的mAb1281(Frey等人,Nat StructMol Biol.2010.17(12):1486-91)，纯化钳夹稳定化的嵌合RSV F。使用mAb 101F(McLellan等人J Virol.2010.84(23):12236-44)，纯化RSV F ds cav钳夹、RSV F ds cav折叠嵌合蛋白和对照RSV F。通过SDS-PAGE确认目的蛋白质的纯化。

结果

蛋白质构象：

用构象特异性单克隆抗体评估蛋白质构象。在胞外结构域下游并入的基于HIV-1GP160 HR1序列和HR2序列的SSM充当了抑制融合胞外结构域多肽重排成融合后构象的‘分子钳夹’。在图1A-C中显示证据：这类嵌合融合蛋白以融合前构象稳定化，同时相应的裸(即，单独表达的)胞外结构域形成融合后形式。

实施例2

作为产生嵌合多肽(其包含受约束处于融合前构象的病毒融合蛋白的胞外结构域)的本发明能力的另一个示例，提供了甲型流感病毒(INFA)血凝素(HA)蛋白的代表性证据。另外，对INFA HA蛋白提供以下代表性证据：借助前述方法约束处于融合前构象的嵌合蛋白能够在施用至小鼠时诱导改善的中和性免疫应答。

材料和方法

嵌合多肽设计：

INFA HA的胞外结构域有效地与包含一对衍生自HIV-1GP160的互补的七肽重复序列区的下游异源性结构稳定部分连接。下文呈现所得的嵌合蛋白及其对照的氨基酸序列。

INFA HA的胞外结构域(1-529)：

MKTIIALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGEICDSPHQILDGKNCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWTGVTQNGTSSACIRRSKNSFFSRLNWLTHLNFKYPALNVTMPNNEQFDKLYIWGVHHPGTDKDQIFLYAQASGRITVSTKRSQQTAIPNIGSRPRVRNIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGESSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKD[SEQ ID NO:148]。

INFA HA的胞外结构域(1-529)–基于HIV GP160的SSM：

MKTIIALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGEICDSPHQILDGKNCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWTGVTQNGTSSACIRRSKNSFFSRLNWLTHLNFKYPALNVTMPNNEQFDKLYIWGVHHPGTDKDQIFLYAQASGRITVSTKRSQQTAIPNIGSRPRVRNIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGESSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDGSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAGGSGGHTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQPAKDEQELLE[SEQ ID NO:149]。

蛋白质表达和纯化：

将编码嵌合融合蛋白流感H3钳夹或缺少HIV-1 HRA序列和HRB序列的对照胞外结构域的密码子优化DNA序列各自并入pIRES-2真核表达载体中的CMV启动子之后。将所得的质粒转染入CHO细胞，并且培育转染的细胞并且根据实施例1收集。

用共价偶联于HiTrap NHS活化型HP柱(GE)的特异性单克隆抗体通过亲和色谱纯化重组蛋白。通过与HIV-1 HRA和HRB形成的6螺旋束结合的mAb1281(Frey等人,Nat StructMol Biol.2010.17(12):1486-91)，纯化钳夹稳定化的嵌合流感HA。用mAb C05纯化流感HA的胞外结构域(Ekiert等人,Nature,2012.489(7417):526-32)。通过SDS-PAGE确认目的蛋白质的纯化。2015年季度的商用四价流感疫苗(QIV)购自Sanofi Pasteur，Fluquadri^TM。

结果

蛋白质构象：

用构象特异性单克隆抗体和大小排阻层析评估蛋白质构象。在各自的胞外结构域下游并入基于HIV-1GP160 HR1序列和HR2序列的SSM充当抑制融合胞外结构域多肽重排成融合后构象的一种‘分子钳夹’。在图2和图3中显示证据：这类嵌合融合蛋白以融合前构象稳定化，同时裸(即，单独表达的)胞外结构域形成融合后形式。

动物免疫接种：

为了检验通过并入6-螺旋束形成部分以其融合前形式稳定化的病毒融合蛋白作为免疫原的实用性，将BALB/c小鼠用钳夹稳定化的嵌合流感HA、相应的未稳定化胞外结构域或商业QIV免疫接种。用5μg纯化的蛋白质(或PBS)加3μg皂苷佐剂Quil-A一起免疫接种每组五只BALB/c小鼠。借助皮内递送进行免疫接种并且将小鼠免疫接种两次，相隔三周。在第二次免疫接种后三周，处死小鼠并采集血清。在蚀斑减少中和试验(PRNT)中，评估来自每个组的合并血清针对甲型流感病毒/河北保定Anguo/51/2010(H3N2)的中和作用。来自钳夹稳定化的嵌合流感HA接种的小鼠的血清显示强烈的病毒中和活性，IC₅₀值为1:14,000(95％CI11,000-17,000)，而来自相应HA胞外结构域接种的小鼠的血清甚至在测试的最高剂量1:20不显示中和活性，并且来自商业QIV接种的小鼠血清显示IC₅₀值约1:180的中和活性。因此，通过并入包含HIV-1 HR1和HR2的结构稳定化部分使流感HA的融合前形式稳定化对强烈的中和性免疫应答至关重要并且与当前的商业灭活疫苗相比，能够增加中和性免疫应答大约80倍。

为了确认钳夹稳定化的HA诱导不与融合后HA sol或商业QIV相互作用的新抗体群体，将H3钳夹接种的小鼠血清与H3sol或QIV预温育，以移除能够结合这些形式的任何抗体(图4，白色柱)。与H3sol或QIV温育均未导致病毒中和作用下降，然而与H3钳夹预温育导致完全消除病毒中和活性。为了检验诱导的免疫应答是否对HA的头部亚结构域或茎部亚结构域特异，比较对完整H3钳夹和仅H3茎部结构域的ELISA反应性(如上文第2.3.2部分中概述)。在ELISA之前，将小鼠血清与EBOV GP钳夹预温育(如上文第2.3.12部分中概述)，以再吸附对钳夹结构域本身特异的抗体。随后添加血清至H3钳夹或H3茎部包被的ELISA板并且通过ELISA测量体液性抗体反应性。比较产生半数最大吸光度的稀释倍数，以评估对茎部结构域特异的免疫百分数。通过从总数扣除茎部结构域特异性免疫估计对头部结构域的免疫(参见图5)。H3钳夹免疫接种产生大约25％与茎部结构域反应的体液免疫和75％与头部结构域反应的体液免疫。相反，QIV免疫接种产生仅4％与茎部结构域反应的体液免疫和96％与头部结构域反应的体液免疫，并且H3sol免疫接种产生仅1％与茎部结构域反应的体液免疫和99％与头部结构域反应的体液免疫。

使用H5钳夹构建体，与来自禽流感H5N1的H5比较免疫应答的反应性(如上文第2.3.3部分中概述)。分析中还包括来自H5钳夹或H1钳夹接种的小鼠的血清。在ELISA之前，将小鼠血清与EBOV GP钳夹预温育(如上文第2.3.12部分中概述)，以再吸附对钳夹结构域本身特异的抗体。随后添加血清至H5钳夹包被的ELISA板并且通过ELISA测量抗体的体液反应性。计算终点滴度并呈现在图6中。H3钳夹和H1钳夹均显示与H5的明显交叉反应性，其显著大于QIV的交叉反应性(分别是27倍增加和81倍增加)。

发明人接着着手确定负责H5交叉反应性的亚结构域。用H5 ELISA测量ELISA反应性之前，将小鼠血清与EBOV GP钳夹(如上文第2.3.12部分中概述)和/或H3茎部仅H3茎部结构域(如上文第2.3.2部分中概述)预温育，以预吸附对钳夹结构域本身和/或H3茎部结构域特异的抗体，或添加人单克隆抗体FI6v3(Corti等人,PNAS 2011)以竞争胜出茎部特异性抗体。随后添加血清至H5钳夹包被的ELISA板并且通过ELISA计算终点滴度(图7)。QIV免疫接种的小鼠显示与H5的低反应性，所述反应性仅最低限度受茎部吸附/Fi6V3竞争影响。来自H5钳夹免疫接种的小鼠的血清显示不受茎部吸附/Fi6V3竞争影响的高反应性，提示强烈的头部特异性免疫应答。但是，来自H1钳夹或H3钳夹免疫接种的小鼠的血清显示与H5的强烈反应性，并且这种反应性由茎部吸收/Fi6V3竞争显著降低，提示茎部特异性应答对H5交叉反应性负责。

实施例3

作为产生嵌合多肽(其包含受约束处于融合前构象的病毒融合蛋白的胞外结构域)的本发明能力的又一个示例，提供了中东呼吸综合征(MERS)病毒刺突蛋白的代表性证据。

材料和方法

嵌合多肽设计：

MERS刺突蛋白的胞外结构域有效地与包含一对衍生自HIV-1GP160的互补的七肽重复序列区的下游异源性结构稳定部分连接。下文呈现所得嵌合蛋白的氨基酸序列。

MERS刺突蛋白的胞外结构域(1-1296)–基于HIV GP160的SSM：

MIHSVFLLMFLLTPTESYVDVGPDSVKSACIEVDIQQTFFDKTWPRPIDVSKADGIIYPQGRTYSNITITYQGLFPYQGDHGDMYVYSAGHATGTTPQKLFVANYSQDVKQFANGFVVRIGAAANSTGTVIISPSTSATIRKIYPAFMLGSSVGNFSDGKMGRFFNHTLVLLPDGCGTLLRAFYCILEPRSGNHCPAGNSYTSFATYHTPATDCSDGNYNRNASLNSFKEYFNLRNCTFMYTYNITEDEILEWFGITQTAQGVHLFSSRYVDLYGGNMFQFATLPVYDTIKYYSIIPHSIRSIQSDRKAWAAFYVYKLQPLTFLLDFSVDGYIRRAIDCGFNDLSQLHCSYESFDVESGVYSVSSFEAKPSGSVVEQAEGVECDFSPLLSGTPPQVYNFKRLVFTNCNYNLTKLLSLFSVNDFTCSQISPAAIASNCYSSLILDYFSYPLSMKSDLGVSSAGPISQFNYKQSFSNPTCLILATVPHNLTTITKPLKYSYINKCSRLLSDDRTEVPQLVNANQYSPCVSIVPSTVWEDGDYYRKQLSPLEGGGWLVASGSTVAMTEQLQMGFGITVQYGTDTNSVCPKLEFANDTKIASQLGNCVEYSLYGVSGRGVFQNCTAVGVRQQRFVYDAYQNLVGYYSDDGNYYCLRACVSVPVSVIYDKETKTHATLFGSVACEHISSTMSQYSRSTRSMLKRRDSTYGPLQTPVGCVLGLVNSSLFVEDCKLPLGQSLCALPDTPSTLTPRSVRSVPGEMRLASIAFNHPIQVDQFNSSYFKLSIPTNFSFGVTQEYIQTTIQKVTVDCKQYICNGFQKCEQLLREYGQFCSKINQALHGANLRQDDSVRNLFASVKSSQSSPIIPGFGGDFNLTLLEPVSISTGSRSARSAIEDLLFDKVTIADPGYMQGYDDCMQQGPASARDLICAQYVAGYKVLPPLMDVNMEAAYTSSLLGSIAGVGWTAGLSSFAAIPFAQSIFYRLNGVGITQQVLSENQKLIANKFNQALGAMQTGFTTTNEAFRKVQDAVNNNAQALSKLASELSNTFGAISASIGDIIQRLDVLEQDAQIDRLINGRLTTLNAFVAQQLVRSESAALSAQLAKDKVNECVKAQSKRSGFCGQGTHIVSFVVNAPNGLYFMHVGYYPSNHIEVVSAYGLCDAANPTNCIAPVNGYFIKTNNTRIVDEWSYTGSSFYSPEPITSLNTKYVAPQVTYQNISTNLPPPLLGNSTGIDFQDELDEFFKNVSTSIPNFGSLTQINTTLLDLTYEMLSLQQVVKALNESYIDLKELGNYTYYNKWPGGSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAGGSGGHTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE[SEQ ID NO:152]。

蛋白质表达和纯化：

将编码嵌合融合蛋白MERS S钳夹的密码子优化DNA序列并入pIRES-2真核表达载体中的CMV启动子之后。将所得的质粒转染入CHO细胞，并且培育转染的细胞并且根据实施例1收集。如实施例1中所述，用mAb 1281(Frey等人,Nat Struct Mol Biol.2010.17(12):1486-91)通过亲和色谱纯化重组蛋白。

结果

蛋白质构象：

使用SDS-PAGE和大小排阻层析，评估蛋白质构象。图8中展示的结果显示，MERS S钳夹嵌合融合蛋白以融合前构象稳定化。

实施例4

作为产生嵌合多肽(其包含受约束处于融合前构象的病毒融合蛋白的胞外结构域)的本发明能力的再一个示例，提供了EBOV糖蛋白(GP)的代表性证据。提供进一步证据作为这种嵌合多肽在高温以延长的时间维持稳定性的展示。另外，对EBOV GP提供以下代表性证据：借助前述方法约束处于融合前构象的嵌合蛋白能够在施用至小鼠时诱导中和性免疫应答。

材料和方法

嵌合多肽设计：

缺少黏蛋白样结构域的EBOV GP有效地与包含一对衍生自HIV-1GP160的互补的七肽重复序列区的下游异源性结构稳定部分连接。下文呈现所得嵌合蛋白的氨基酸序列。

扣减黏蛋白样结构域的EBOV GP胞外结构域(1-311、462-650)–基于HIV GP160的 SSM

MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSIPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVGGNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGWRQGGSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAGGSGGHTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE[SEQ ID NO:139]。

蛋白质表达和纯化：

将编码EBOV GPΔ黏蛋白钳夹的密码子优化DNA序列并入pIRES-2真核表达载体中的CMV启动子下游。将所得的质粒转染入CHO细胞，并且培育转染的细胞并且根据实施例1收集。使用mAb Kz52(Murin等人,PNAS.201411(48):17182-7)，通过亲和色谱纯化重组蛋白。

结果

蛋白质构象：

通过存在和不存在还原条件的SDS-PAGE并用构象特异性单克隆抗体评估蛋白质构象。图9至图11中展示的结果显示，EBOV GPΔ黏蛋白钳夹嵌合融合蛋白以融合前构象稳定化并且这种构象甚至在相对高的温度持续延长的期间是稳定的(参见图11)。

动物免疫接种：

为了进一步检验通过并入6-螺旋束形成部分以其融合前形式稳定化的病毒融合蛋白作为免疫原的实用性，将BALB/c小鼠用钳夹稳定化的EBOV GPΔ黏蛋白构建体免疫接种。用1μg纯化的蛋白质(或PBS)伴随或不伴随3μg皂苷佐剂Quil-A免疫接种每组五只BALB/c小鼠。借助皮内递送进行免疫接种并且将小鼠免疫接种三次，每次相隔三周。在第三次免疫接种后三周，处死小鼠并采集血清。每次免疫接种后评估EBOV GP特异性应答(图12)。在澳大利亚动物保健实验室(AAHL)PC4条件下在蚀斑减少中和试验(PRNT)中，针对活ZEBOV评估来自每只小鼠的血清的中和作用(图13)。来自钳夹稳定化的嵌合EBOV GPΔ黏蛋白构建体接种的小鼠的血清显示强烈的中和活性，导致蚀斑形成单位降低50％的几何平均滴度经计算是52.8(95％CI 24.5-114.0)。

实施例5

这个实施例显示本发明产生嵌合多肽的能力，在所述嵌合多肽中，修饰钳夹序列的溶剂暴露区以并入N联糖基化。提供EBOV GP的代表性证据，并且显示这些修饰促进屏蔽钳夹结构域免受适应性免疫系统识别。

材料和方法

嵌合多肽设计：

缺少黏蛋白样结构域的EBOV GP有效地与四个不同的下游异源SSM连接，所述下游异源SSM各自包含一对衍生自HIV-1GP160的互补的HRA区和HRB区，其中各个HRB区域携带促进N联糖基化并入的不同突变。下文呈现这些嵌合蛋白的氨基酸序列。

扣减黏蛋白样结构域的EBOV GP胞外结构域(1-311、462-650)–基于HIV GP160的 SSM+G1：

MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSIPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVGGNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGWRQGGSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAGGSGGTTWMNWTREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE[SEQ ID NO:153]

扣减黏蛋白样结构域的EBOV GP胞外结构域(1-311、462-650)–基于HIV GP160的 SSM+G2：

MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSIPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVGGNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGWRQGGSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAGGSGGTTWMEWDREINNYTSLIHNLTEESQNQQEKNEQELLE[SEQ ID NO:154]

扣减黏蛋白样结构域的EBOV GP胞外结构域(1-311、462-650)–基于HIV GP160的 SSM+G3：

MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSIPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVGGNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGWRQGGSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAGGSGGTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQTEKNEQELLE[SEQ ID NO:155]

扣减黏蛋白样结构域的EBOV GP胞外结构域(1-311、462-650)–基于HIV GP160的 SSM+G4：

MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSIPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVGGNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGWRQGGSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAGGSGGTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNENETLE[SEQ ID NO:156]

蛋白质表达和纯化：

将编码上述构建体的密码子优化的DNA序列各自并入pIRES-2真核表达载体中的CMV启动子下游。将所得的质粒转染入CHO细胞，并且培育转染的细胞并且根据实施例1收集。使用mAb Kz52(Murin等人,PNAS.201411(48):17182-7)，通过亲和色谱纯化重组蛋白。

结果

为了检验适应性免疫系统降低识别钳夹的潜力(免疫沉默)，在以基于HIV GP160的SSM为基础的钳夹序列的HRB内部引入可促进掺入N联糖基化的四个独立突变。

纯化了并入修饰的基于GP160的SSM的嵌合EBOV GP(缺少黏蛋白样结构域)并且评估与Kz52的反应性以确认纯化的蛋白质的正确构象。针对并入修饰的钳夹序列的嵌合EBOV蛋白测试来自钳夹稳定化的嵌合流感HA免疫接种的小鼠的血清反应性(图14)。反应性因每一单个位点处糖基化而显著降低，从而支持以下假设：该方法可以用来降低钳夹结构域的反应性。

实施例6

这个实施例展示了本发明产生下述嵌合多肽的一般能力，所述嵌合多肽包含来自广泛类型包膜病毒的病毒融合蛋白的胞外结构域，和通过钳夹结构域特异性单克隆抗体纯化这些多肽的一般能力。

材料和方法

嵌合多肽设计：

INFA HA、RSV F、尼帕F和HSV2 gB的胞外结构域有效地与包含一对衍生自HIV-1GP160的互补的七肽重复序列区的异源性结构稳定部分下游连接。下文呈现所得嵌合蛋白及其各自对照的氨基酸序列。对于流感，产生缺少SSM的可溶性胞外结构域，同时产生并入折叠SSM的对照。对于RSV-F，从设计中移除胞外结构域的一个非必需区(aa106-144)。产生缺少SSM的可溶性胞外结构域，同时还产生McLellan等人(Science,2013.342(6158):592-598)描述的阳性对照，所述阳性对照在4个位点包含如(S155C、S290C、S190F和V207L)的突变并包含折叠SSM。对于尼帕病毒和HSV，不产生未稳定化的对照。

流感HA(A Switzerland 2013,H3N2)的胞外结构域(1-533)：

MGWSCIILFLVATATGVHSEQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIEVTNATELVQNSSIGEICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSSCRRGSNSSFFSRLNWLTHLNSKYPALNVTMPNNEQFDKLYIWGVHHPVTDKDQIFLYAQSSGRITVSTKRSQQAVIPNIGYRPRIRDIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQSTLKLATGMRNVPERQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKD[SEQ ID NO:157]。

流感HA(瑞士2013,H3N2)的胞外结构域(1-533)–折叠SSM：

MGWSCIILFLVATATGVHSEQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIEVTNATELVQNSSIGEICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSSCRRGSNSSFFSRLNWLTHLNSKYPALNVTMPNNEQFDKLYIWGVHHPVTDKDQIFLYAQSSGRITVSTKRSQQAVIPNIGYRPRIRDIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQSTLKLATGMRNVPERQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDGGSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSGSAWSHPQFEK[SEQ ID NO:158]。

流感HA(瑞士2013H3N2)的胞外结构域(1-533)-基于HIV GP160的SSM：

MGWSCIILFLVATATGVHSEQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIEVTNATELVQNSSIGEICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSSCRRGSNSSFFSRLNWLTHLNSKYPALNVTMPNNEQFDKLYIWGVHHPVTDKDQIFLYAQSSGRITVSTKRSQQAVIPNIGYRPRIRDIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQSTLKLATGMRNVPERQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDGSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAGGSGGHTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQPAKDEQELLE[SEQ ID NO:159]。

流感HA(加利福利亚2009,H1N1pdm)的胞外结构域(1-526)：

MKVKLLVLLCTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADTYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTR[SEQ ID NO:160]。

流感HA(加利福利亚2009,H1N1pdm)的胞外结构域(1-526)–折叠SSM：

MKVKLLVLLCTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADTYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRGGSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSGSAWSHPQFEK[SEQ ID NO:161]。

流感HA(加利福利亚2009,H1N1pdm)的胞外结构域(1-526)-基于HIV GP160的SSM：

MMKVKLLVLLCTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADTYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRGSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAGGSGGHTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQPAKDEQELLE[SEQ ID NO:162]。

RSV F的胞外结构域(1-516)–His标签：

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKNKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTQATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVGGGGHHHHHH[SEQ ID NO:163]。

RSV F的胞外结构域(1-513)–DScav突变-折叠SSM：

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKNKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTQATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSGSAWSHPQFEK[SEQ ID NO:164]

RSV F的胞外结构域(1-105、145-511)–基于HIV GP160的SSM

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKNKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTQATNNGSGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEGSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAGGSGGHTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE[SEQ ID NO:165]。

尼帕F的胞外结构域(1-483)–基于HIV GP160的SSM

MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTGSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAGGSGGHTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE[SEQ ID NO:166]。

HSV1 gB的胞外结构域(28-741)–IgK信号肽–基于HIV GP160的SSM：

MGWSCIILFLVATATGVHSERASGDVAATVAANGGPASQPPPVPSPATTKARKRKTKKPPKRPEATPPPDANATVAAGHATLRAHLREIKVENADAQFYVCPPPTGATVVQFEQPRRCPTRPEGQNYTEGIAVVFKENIAPYKFKATMYYKDVTVSQVWFGHRYSQFMGIFEDRAPVPFEEVIDKINAKGVCRSTAKYVRNNMETTAFHRDDHETDMELKPAKVATRTSRGWHTTDLKYNPSRVEAFHRYGTTVNCIVEEVDARSVYPYDEFVLATGDFVYMSPFYGYREGSHTEHTSYAADRFKQVDGFYARDLTTKARATSPTTRNLLTTPKFTVAWDWVPKRPAVCTMTKWQEVDEMLRAEYGGSFRFSSDAISTTFTTNLTQYSLSRVDLGDCIGRDAREAIDRMFARKYNATHIKVGQPQYYLATGGFLIAYQPLLSNTLAELYVREYMREQDRKPRNATPAPLREAPSANASVERIKTTSSIEFARLQFTYNHIQRHVNDMLGRIAVAWCELQNHELTLWNEARKLNPNAIASATVGRRVSARMLGDVMAVSTCVPVAPDNVIVQNSMRVSSRPGTCYSRPLVSFRYEDQGPLIEGQLGENNELRLTRDALEPCTVGHRRYFIFGGGYVYFEEYAYSHQLSRADVTTVSTFIDLNITMLEDHEFVPLEVYTRHEIKDSGLLDYTEVQRRNQLHDLRFADIDTVIRADANAAMFAGLCAFFEGMGDLGRGGGGSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAGGSGGHTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE[SEQ ID NO:167]。

麻疹F的胞外结构域(1-488)–基于HIV GP160的SSM：

MGLKVNVSAIFMAVLLTLQTPTGQIHWGNLSKIGVVGIGSASYKVMTRSSHQSLVIKLMPNITLLNNCTRVEIAEYRRLLRTVLEPIRDALNAMTQNIRPVQSVASSRRHKRFAGVVLAGAALGVATAAQITAGIALHQSMLNSQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQAGQEMILAVQGVQDYINNELIPSMNQLSCDLIGQKLGLKLLRYYTEILSLFGPSLRDPISAEISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLGILESRGIKARITHVDTESYFIVLSIAYPTLSEIKGVIVHRLEGVSYNIGSQEWYTTVPKYVATQGYLISNFDESSCTFMPEGTVCSQNALYPMSPLLQECLRGSTKSCARTLVSGSFGNRFILSQGNLIANCASILCKCYTTGTIINQDPDKILTYIAADHCPVVEVNGVTIQVGSRRYPDAVYLHRIDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLESSDQILRSMKGGRSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAGGSGGHTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE[SEQ ID NO:168]。

拉沙病毒GPC的胞外结构域(1-423)–基于HIV GP160的SSM：

MGQIVTFFQEVPHVIEEVMNIVLIALSVLAVLKGLYNFATCGLVGLVTFLLLCGRSCTTSLYKGVYELQTLELNMETLNMTMPLSCTKNNSHHYIMVGNETGLELTLTNTSIINHKFCNLSDAHKKNLYDHALMSIISTFHLSIPNFNQYEAMSCDFNGGKISVQYNLSHSYAGDAANHCGTVANGVLQTFMRMAWGGSYIALDSGRGNWDCIMTSYQYLIIQNTTWEDHCQFSRPSPIGYLGLLSQRTRDIYISRRLLGTFTWTLSDSEGKDTPGGYCLTRWMLIEAELKCFGNTAVAKCNEKHDEEFCDMLRLFDFNKQAIQRLKAEAQMSIQLINKAVNALINDQLIMKNHLRDIMGIPYCNYSKYWYLNHTTTGRTSLPKCWLVSNGSYLNETHFSDDIEQQADNMITEMLQKEYMERQGSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAGGSGGHTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE[SEQ ID NO:169]。

蛋白质表达和纯化：

将编码嵌合融合蛋白、流感H1折叠、流感H1钳夹、流感H3折叠、流感H3钳夹、RSV F钳夹、RSV F ds cav折叠、MERS S钳夹和埃博拉GP钳夹Δ黏蛋白、尼帕病毒F钳夹、麻疹病毒F钳夹、拉沙病毒GPC钳夹、单纯疱疹2病毒gB钳夹(以及RSV F和流感H3的缺少HIV-1 HRA序列和HRB序列的相应胞外结构域)的密码子优化DNA序列各自并入pIRES-2或pNBF真核表达载体中的CMV启动子之后。将所产生的质粒转染入化学成分确知的CHO(CD-CHO)培养基(Gibco)中或ExpiCHO表达培养基(Gibco)中生长的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。通过将密度为1x10⁶个细胞/mL的300mL CHO细胞中的600μg质粒和2.4mg线型聚乙烯亚胺或16μg质粒与640μl OPTI-pro无血清培养基(SFM)和51.2μl Expifectamine(Gibco)合并，转染CHO细胞。与转染试剂温育4小时后，沉淀用线型聚乙烯亚胺转染的CHO细胞，移除含有转染试剂的培养基，并且将细胞重悬于含有8mM Glutamax(Gibco)、100单位/mL青霉素(Gibco)、100μg/mL链霉素(Gibco)、7.5％CHO CD高效补料A(Gibco)和7.5％CHO CD高效补料B(Gibco)的300mLCD-CHO中。对于Expifectamine转染的细胞，在24小时温育后，添加96μl ExpiCHO增强物和3.84ml ExpiCHO补料。随后将两组细胞在37℃、7.5％CO₂温育7天，按约120转/分钟振摇。在7天后，通过在6,000x g离心10分钟移除细胞，并过滤上清液。

用共价偶联于HiTrap NHS活化型HP柱(GE)的特异性单克隆抗体通过亲和色谱纯化重组蛋白。通过与HIV-1 HRA和HRB形成的6螺旋束结合的mAb 1281(Frey等人,NatStruct Mol Biol.2010.17(12):1486-91)，纯化钳夹稳定化的嵌合流感HA、RSV F、MERS S、埃博拉GP、Lassa GPC、尼帕F、麻疹F和HSV2 gB。用mAb 5J8(Hong等人,J Virol,2013.87(22):第12471-80页)纯化钳夹稳定化和折叠稳定化的嵌合流感H1和相应的H1胞外结构域。用mAb C05(Ekiert等人,Nature,2012.489(7417):526-32)纯化钳夹稳定化和折叠稳定化的嵌合流感H3和相应的H3胞外结构域。用mAb 101F(McLellan等人J Virol.2010.84(23):12236-44)纯化钳夹稳定化和折叠稳定化的并入ds cav突变的嵌合RSV F以及相应的RSV F胞外结构域。通过SDS-PAGE确认目的蛋白质的纯化。

结果

分子钳夹作为蛋白质表达和纯化的一般方法：

通过SDS-PAGE确认来自八种病毒的钳夹稳定化的嵌合病毒融合蛋白的表达和纯化(图15)。在胞外结构域下游并入基于HIV-1GP160 HR1序列和HR2序列的SSM允许利用与HIV-1 HRA和HRB形成的6螺旋束结合的mAb 1281(Frey等人,Nat Struct MolBiol.2010.17(12):1486-91)回收多样性嵌合蛋白。

流感病毒H1N1PDM攻击后的小鼠保护研究：

为了扩展显示将6-螺旋束形成部分纳入流感HA胞外结构域可以激发广泛交叉反应性免疫应答的结果，我们在C57b小鼠内实施流感攻击实验。这项研究还着手就诱导来自趋异性流感亚型的广谱交叉保护作用方面，将分子钳夹6-螺旋束形成部分与折叠SSM直接比较。用PBS、H1sol、H3sol、H1折叠、H3折叠、H1钳夹或H3钳夹接种C57b小鼠。疫苗是剂量匹配的，各自含有5μg HA和3μg QuilA，小鼠接受间隔两周给予的三剂疫苗。然后在首剂后六周，用流感Cal/09(H1N1pdm)攻击小鼠(n＝5只小鼠/组)。设计这项研究旨在评估针对相同毒株的保护作用和针对高度趋异性亚型的保护作用。通过鼻内途径用甲型流感病毒H1N1pdm按1x10²个蚀斑形成单位(PFU)的‘低剂量’和5.5x10³个PFU的‘高剂量’攻击小鼠。每日测量体重下降历经14天时间，如果它们丢失其原始体重>20％，处死小鼠。

这项研究确认，H1钳夹能够针对匹配的流感毒株提供完全保护，H1sol和H1折叠也是如此(图16A和B)。特别感兴趣的是，还显示H3钳夹免疫接种部分地针对流感H1N1pdm保护。对于H3钳夹，当低剂量流感H1N1pdm攻击时，3/5小鼠幸存，并且当高剂量流感H1N1pdm攻击时，2/5小鼠幸存(图16C和D)。相比之下，用低剂量或高剂量流感H1N1pdm攻击时，用H3sol或H3折叠免疫接种的小鼠均未幸存，并且用低剂量流感H1N1pdm攻击时，仅1/5用PBS模拟免疫接种的小鼠幸存。与模拟接种或H3sol或H3折叠接种后幸存的小鼠(1/30)相比，在H3钳夹接种后幸免于H1N1pdm的小鼠(5/10)之间的比较，显示H3钳夹介导的广谱流感防护作用的统计显著性(p＝0.0003；卡方计算器)。由于H3亚型和H1亚型属于流感系统发生树内部分开的组，这个结果提示广泛水平的保护作用，并且可以合理预期，对等同或较少趋异的全部流感毒株和亚型具有广谱的保护作用。

包括钳夹SSM时热稳定性增加：

为了直接比较钳夹SSM和折叠SSM提供的稳定性，将纯化的抗原，即流感H1折叠、流感H1钳夹、RSV F ds cav折叠、和RSV F钳夹，在43℃温育72小时并且使用与mAb的反应性作为热稳定性的度量。为了比较RSV F，使用三种融合前特异性mAb：D25(McLellan等人,Science,2013.340(6136):第1113-7页)、MPE8(Corti等人,Nature,2013.501(7467):第439-43页)和AM22(McLellan等人,Science,2013.340(6136):第1113-7页)。为了比较流感HA，使用两个茎部特异性mAb：CR6261(Ekiert等人,Science,2009.324(5924):第246-51页)和Fi6V3(Corti等人,Science,2011.333(6044):第850-6页)，并且使用一个头部特异性mAb：5J8(Hong,等人,J Virol,2013.87(22):第12471-80页)。直接比较揭示，在升高的温度温育后，RSV F钳夹保留比RSV F ds cav折叠显著更高的与融合前特异性mAb的反应性(图17A)。类似地，直接比较揭示了流感H1钳夹保留比流感H1折叠显著更高的与HA茎部特异性mAb的反应性(图17B)。与头部特异性mAb的反应性的保留在流感H1钳夹和流感H1折叠之间相当。总之，这些结果展示与折叠SSM相比，钳夹SSM的稳定性优越。

RSV F钳夹诱导的中和性免疫应答：

为了检验通过并入6-螺旋束形成部分以其融合前形式稳定化的病毒融合蛋白作为免疫原的实用性，将BALB/c小鼠用RSV F钳夹、RSV F ds cav折叠、相应的RSV胞外结构域(RSV Fsol)免疫接种或用PBS模拟免疫接种。用5μg纯化的蛋白质(或PBS)加3μg皂苷佐剂Quil-A一起免疫接种每组五只BALB/c小鼠。借助皮内递送进行免疫接种并且将小鼠免疫接种三次，每次相隔三周。在第三次免疫接种后三周，处死小鼠并采集血清。在蚀斑减少中和试验(PRNT)中，针对RSV毒株A2评估来自各只小鼠的血清的中和作用(图18)。来自钳夹稳定化嵌合RSV F钳夹接种的小鼠的血清显示几何平均IC₅₀值为8,124(95％CI＝1,968-33,543)的强烈中和活性，而来自RSV F ds cav折叠接种的小鼠的血清显示几何平均IC₅₀值为2,859(95％CI＝794-10,290)的中和活性，并且来自RSV Fsol接种的小鼠的血清显示几何平均IC₅₀值为562(95％CI＝242-1,410)的中和活性。因此，通过并入包含HIV-1 HR1和HR2的结构稳定化部分使RSV F的融合前形式稳定化对强烈的中和性免疫应答至关重要，所述中和性免疫应答大约3倍高于备选的稳定化方案‘ds cav折叠’诱导的中和性免疫应答(McLellan等人,Science,2013.342(6158):第592-8页)。

稳定尼帕病毒F的融合前构象：

为了进一步验证钳夹SSM使病毒融合蛋白的融合前构象稳定化的实用性，将钳夹SSM并入尼帕病毒F的胞外结构域中并且在CHO细胞中表达。随后使用superdex 200柱，通过大小排阻层析分析借助免疫亲和色谱纯化的蛋白质。在大约11.5mL处洗脱的尼帕病毒F钳夹的主要部分大致等于三聚体蛋白质的预期大小，约180kDa(图19)。如已经对副黏病毒属F充分展示的那样(Connolly等人,PNAS,2006.103(47):第17903-8页)，尼帕病毒F转变成融合后构象将预计导致疏水性融合肽暴露，因而驱动蛋白质聚集。存在可溶性三聚体蛋白因此是支持融合前构象存在的证据。还通过负染透射电子显微术(TEM)分析纯化的尼帕病毒F钳夹(图19，插图)。在展示的TEM图像内，明确可见尼帕病毒F钳夹的颗粒具有与预期融合前构象相符的均一大小和拓扑结构。展示的数据进一步支持钳夹SSM使病毒融合蛋白的融合前构象稳定化的能力。

尼帕病毒F钳夹诱导的中和性免疫应答：

为了进一步检验通过并入6-螺旋束形成部分以其融合前形式稳定化的病毒融合蛋白作为免疫原的实用性，将BALB/c小鼠用尼帕病毒F钳夹免疫接种或用PBS模拟免疫接种。用5μg纯化的蛋白质(或PBS)加3μg皂苷佐剂Quil-A一起免疫接种每组四只BALB/c小鼠。借助皮内递送进行免疫接种并且将小鼠免疫接种两次，相隔三周。在第二次免疫接种后三周，处死小鼠并采集血清。在BSL4防护下，在蚀斑减少中和试验(PRNT)中，针对活尼帕病毒(马来西亚株)评估来自各只小鼠的血清的中和作用(图20)。来自钳夹稳定化的嵌合尼帕病毒F钳夹接种的小鼠的血清均显示几何平均IC₅₀值为48(95％CI＝6-384)的强烈中和活性，而来自PBS模拟免疫接种的小鼠的血清在测试的最高血清浓度不显示中和活性。这个结果因此提供了进一步证据：并入钳夹SSM的嵌合病毒融合蛋白能够在接种后激发中和性免疫应答。

钳夹SSM并入III类病毒融合蛋白：

为了进一步验证钳夹SSM使病毒融合蛋白稳定化的实用性，将钳夹SSM并入HSV2gB的胞外结构域中并且在CHO细胞中表达。随后在superose 6柱上，通过大小排阻层析分析借助免疫亲和色谱纯化的蛋白质。在大约15mL处洗脱的HSV2 gB钳夹的主要部分大致等于三聚体蛋白质的预期大小，约300kDa(图21)。还通过负染透射电子显微术(TEM)分析纯化的HSV2 gB钳夹(图21，插图)。在展示的TEM图像内，明确可见HSV2 gB钳夹的颗粒具有与之前通过X射线结晶学解析的结构(Heldwein等人,Science,2006.313(5784):217-20)相符的均一大小和拓扑结构。假设这种构象是HSV2 gB融合后构象。值得注意地，HSV2 gB钳夹还能够结合针对HSV2的大部分中和抗体并且可以用作亚单位疫苗候选物(Cairns等人,JVi,2014.88(5):P.2677-89)。除病毒I类融合蛋白之外，展示的数据还进一步支持钳夹SSM稳定化并纯化病毒III类融合蛋白的能力。

本文呈现的结果显示，包含受约束处于融合前构象的病毒融合蛋白的胞外结构域的嵌合多肽可以：

·诱导更广泛的交叉保护性免疫应答；

·在升高的温度稳定；

·诱导优越的中和性免疫应答；并

·使用I类或III类胞外结构域形成。

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