阅读说明：本技术 一种利用杀虫真菌降解番茄黄化曲叶病毒衣壳蛋白的方法 (A method of utilizing disinsection fungal degradation tomato yellow leaf curl virus capsid protein ) 是由 郭慧芳 孙帅 张志春 王娜 于 2019-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用杀虫真菌爪哇棒束孢降解番茄黄化曲叶病毒衣壳蛋白的方法。针对生产上尚未有植物病毒病治疗药剂的问题,利用爪哇棒束孢直接降解病毒衣壳蛋白,从而影响病毒核酸的稳定性,实现病毒病的治疗。同生产上传统的病毒病防控利用抗病虫品种、化学或物理手段控制介体、病毒拮抗剂控制病害等手段相比,本技术利用杀虫真菌爪哇棒束孢直接降解植物病毒的衣壳蛋白,不仅能治疗病毒病,也能侵染病毒传毒介体,控害方式新颖,控害功能复合,将具有广阔的应用前景。(The invention discloses a kind of methods using disinsection fungal Java Isaria degradation tomato yellow leaf curl virus capsid protein.There has been no aiming at the problem that viroses of plant healing potion, to influence the stability of viral nucleic acid realizing the treatment of virosis using Java Isaria viral capsid proteins of directly degrading in production.Compared with the upper traditional virosis prevention and control of production utilize Resistant kind, the chemically or physically means such as means control mediator, viral antagonist control disease, this technology utilizes the capsid protein of the direct degrading plant virus of disinsection fungal Java Isaria, virosis can not only be treated, also virus can be infected and pass virus mediator, pest controlling mode is novel, Biological control efficiency is compound, will have broad application prospects.)

一种利用杀虫真菌降解番茄黄化曲叶病毒衣壳蛋白的方法

一、技术领域

本发明属于病虫害防治技术领域，具体涉及一种利用杀虫真菌爪哇棒束孢降解番茄黄化曲叶病毒衣壳蛋白的方法。

二、背景技术

全世界范围内每年因植物病毒病的威胁可造成几百亿美元的损失。对病毒病的控制，目前主要以防为主，尚缺少有效治疗药剂。要实现病毒病的治疗，对病毒核酸的破坏最关键，而病毒核酸通常由衣壳蛋白作为其保护屏障，因此对病毒衣壳蛋白的破坏是病毒病治疗的突破口。然而，当前将病毒衣壳蛋白作为抗病毒物质的作用靶标还没有被充分认识和开发，值得研究探索。

从自然界中寻找抗病毒物质是筛选获得病毒治疗药物的重要途径，随着人们对环境保护的认识逐步提高，生物源抗病毒活性物质越来越被关注，已发现的抗病毒物质也越来越多，但尚未发现杀虫微生物能够直接破坏病毒衣壳蛋白。杀虫真菌作为重要的病原微生物，可在害虫的生物防治中发挥重要作用，一些杀虫真菌如白僵菌、绿僵菌等已被开发为生物杀虫剂，用于害虫的防控。杀虫真菌除对害虫有致死作用外，对植物病毒衣壳蛋白又有怎样的影响？尚未见研究报道。爪哇棒束孢Isaria javanica是一种重要的昆虫病原真菌，可侵染烟粉虱、叶蝉等害虫，适宜条件下，能在害虫种群中形成流行病，有效防控害虫，具有开发价值。番茄黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus， TYLCV)是烟粉虱传播的最重要植物病毒，为单链环状DNA病毒，番茄黄化曲叶病毒病在亚洲、非洲、美洲的许多国家都有发生流行，给番茄生产造成严重损失。研究爪哇棒束孢对番茄黄化曲叶病毒衣壳蛋白的影响，期望获得降解病毒衣壳蛋白的生物资源，实现病毒病的治疗，从而拓宽杀虫真菌的用途，更大程度上发挥杀虫真菌控害作用。

三、

发明内容

1、发明目的

提供一种安全的植物病毒衣壳蛋白降解方法，能有效降解番茄黄化曲叶病毒衣壳蛋白，为该病毒病的治疗提供新方法。

2、技术方案

本发明为一种植物病毒衣壳蛋白的降解方法，其特征在于利用爪哇棒束孢降解番茄黄化曲叶病毒衣壳蛋白。

3、有益效果

本发明的方法与现有技术相比，产生以下有益效果：(1)与常规的抗植物病毒剂抑制病毒侵染复制相比，本发明通过直接降解植物病毒衣壳蛋白来破坏病毒，防控思路新且针对性强；(2)与化学抗病毒剂相比，本发明利用杀虫真菌爪哇棒束孢，可切实提高植物病毒病的绿色防控水平，有效减少环境污染。

四、附图说明

图1番茄黄化曲叶病毒衣壳蛋白经杀虫真菌爪哇棒束孢处理后的SDS-PAGE电泳图

五、

具体实施方式

本发明的实施例是采用室内测定的方法。

测定方法如下：

1、病毒衣壳蛋白的原核表达

采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，设计全长拼接引物，合成番茄黄化曲叶病毒衣壳蛋白基因，连入载体pCzn1；获得的重组质粒pCzn1-Gene2转入TOP10克隆菌株和Arctic-ExpressTM表达菌株。使用IPTG诱导表达目的蛋白，Ni柱亲和纯化获得目的蛋白。

2、爪哇棒束孢降解病毒衣壳蛋白

将固体发酵的爪哇棒束孢孢子原粉配置成2×10⁸孢子/ml孢子悬浮液后，加至300mg/L番茄黄化曲叶病毒衣壳蛋白溶液中，使孢子悬浮液终浓度为2×10⁶孢子/ml，以不含真菌孢子的300mg/L番茄黄化曲叶病毒衣壳蛋白溶液作对照，在37℃恒温箱处理12h后，再在96℃水浴中放置8min，处理后蛋白溶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳后染色，拍照。

实施效果：

研究表明，300mg/L番茄黄化曲叶病毒衣壳蛋白经2×10⁶孢子/ml爪哇棒束孢处理后，与未经真菌处理的对照相比，其蛋白电泳条带明显变弱，表明爪哇棒束孢对番茄黄化曲叶病毒衣壳蛋白有明显的降解作用(图1)。