植物细胞质弹状病毒侵染性克隆、表达载体及其构建方法与应用

文档序号：1751429 发布日期：2019-11-29 浏览：28次 >En<

阅读说明：本技术 植物细胞质弹状病毒侵染性克隆、表达载体及其构建方法与应用 (Plant cytoplasm rhabdovirus infectious clone, expression vector and its construction method and application ) 是由王献兵高强许文雅邸垫平严滕曹青于嘉林张爱红苗红芹韩成贵王颖于 2018-05-21 设计创作，主要内容包括：本发明属于基因工程技术领域,具体公开了一种植物细胞质弹状病毒侵染性克隆、表达载体及其构建方法与应用。本发明所提供的植物细胞质弹状病毒表达载体为含有大麦黄条点花叶病毒(BYSMV)全基因组反向互补链的载体。本发明首次提供一种构建虫传植物病毒侵染性克隆的策略,即通过将前述表达载体与表达BYSMV的核衣壳(N)、磷蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)等病毒元件的载体经农杆菌介导在本生烟建立侵染性病毒,再利用本生烟发病汁液通过飞虱类昆虫接种单子叶植物并建立系统性侵染。不仅如此,本发明还进一步提供了所述植物细胞质弹状病毒表达载体在单子叶植物或飞虱类昆虫体内进行蛋白高效表达或者基因编辑等方面的广泛应用。(The invention belongs to gene engineering technology field, a kind of plant cytoplasm rhabdovirus infectious clone, expression vector and its construction method and application are specifically disclosed.Plant cytoplasm Rhabdovirus expression vectors provided by the present invention are the carrier containing barley Huang item point mosaic virus (BYSMV) full-length genome reverse complementary strand.The present invention provides a kind of strategy of building worm biography plant virus infectious clone for the first time, i.e. by the way that the carrier of the viral components such as the nucleocapsid (N) of foregoing expression vectors and expression BYSMV, phosphoprotein (P), big polymerase protein (L) is established infectivity virus in this life cigarette through mediated by agriculture bacillus, recycles this life cigarette morbidity juice to be inoculated with monocotyledon by plant hopper insect and establish systematicness and infect.Moreover, the present invention still further provide the plant cytoplasm Rhabdovirus expression vectors carried out in monocotyledon or plant hopper insect bodies albumen high efficient expression or in terms of extensive use.)

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及植物细胞质弹状病毒侵染性克隆、表达载体及其构建方法与应用。

背景技术

植物基因工程中利用植物具有合成、折叠以及翻译后修饰等优势，用植物可以低成本地大量生产外源蛋白，例如疫苗抗原，抗体以及药用蛋白等。最常用的方法是利用转基因技术将外源蛋白的基因整合到植物基因组中，可以持续不断地表达外源蛋白。这种稳定转化的方法表达量一般较低，并且转基因过程比较费时费力，还有一些单子叶作物遗传转化非常困难，这些因素严重影响了利用转基因植物作为生物反应器的产业化进程。

从上世纪80年代开始，科学家开始探索利用植物病毒载体高效表达外源基因，其基本过程是在植物病毒侵染性克隆的基础上，对其病毒基因组进行基因操作，可以将目的基因导入到病毒载体中，随着病毒侵染寄主细胞增殖时大量表达外源蛋白。与基因遗传稳定转化相比，病毒载体导入过程简单，不需要人为直接地将目的基因***植物染色体上，因此从构建到表达的周期短；此外，由于病毒在寄主细胞的大量增殖，表达的外源蛋白也随之增加，一般比稳定转基因高数百倍。目前构建的病毒表达载体在外源蛋白表达、功能基因组研究以及其他领域应用都发挥重要的作用。

目前，植物病毒表达载体主要以正链RNA病毒的使用较为广泛，例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)，马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)，烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)，烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)，黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaicvirus，CMV)，狼尾草花叶病毒(Foxtail mosaic virus，FoMV)，豇豆花叶病毒(Cowpeamosaic virus，CPMV)，雀麦花叶病毒(Brome mosaic virus，BMV)。然而，以上述正链RNA病毒为基础的病毒表达载体的稳定性较差，病毒表达载体中***的外源基因一般小于500bp，最长不超过1000bp，一旦超过此范围，外源片段极易丢失。病毒表达载体的接种方法一般通过农杆菌浸润技术，且一般在双子叶植物上具有较好的效果，在大多数单子叶植物上很难利用农杆菌浸润技术。

不仅如此，昆虫中的表达载体目前都是利用杆状病毒表达载体，主要是在鳞翅目昆虫或者其细胞系中表达外源蛋白。但对于半翅目的昆虫，目前还有没有能在成虫中表达外源蛋白的有效表达载体，严重阻碍了半翅目昆虫的研究进展和科学防治。

植物弹状病毒是负链RNA病毒，2015年，苦苣菜黄网弹状病毒 (Sonchus yellownet rhabdovirus，SYNV)的侵染性克隆首先被报道，是第一个植物负链病毒的侵染性克隆，也为其他负链病毒的构建提供参考(Jackson and Li，2016；Wang et al.，2015)。然而，苦苣菜黄网弹状病毒(SYNV)通过蚜虫传播，主要侵染双子叶植物，不能侵染单子叶植物和飞虱类昆虫，因此不能作为单子叶农作物和飞虱类农业昆虫的表达载体。

因此，亟需研究并开发一种可侵染单子叶植物和飞虱类昆虫，并且可表达大片段外源蛋白的植物病毒表达载体，克服目前植物病毒表达载体在应用方面的局限性。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种植物细胞质弹状病毒侵染性克隆、表达载体及其构建方法与应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明基于植物细胞质弹状病毒，提供一种植物细胞质弹状病毒表达载体，该表达载体可以稳定表达长度为5000bp以内，并且可以同时表达2-3个外源基因。

不仅如此，该表达载体可在植物和飞虱类昆虫中高效表达外源蛋白，且不同于现有技术中的植物病毒表达载体，本发明所提供的植物病毒表达载体能够系统侵染单子叶植物，实现外源蛋白在单子叶植物中的高效表达。

进一步地，所述植物细胞质弹状病毒为大麦黄条点花叶病毒 (BYSMV)。

具体地说，本发明所提供的植物细胞质弹状病毒表达载体，为含有BYSMV全基因组反向互补链的载体。

BYSMV属于细胞质弹状病毒，其基因组为单股负链RNA，全长 12706nt，NCBI登录号为KM213865。BYSMV基因组能够转录9条 mRNA，其中一条mRNA编码两个蛋白，因此BYSMV共编码10个蛋白，包括5个结构蛋白和5个辅助蛋白。5个结构蛋白包括核衣壳蛋白(nucleoprotein，N)，磷蛋白(phosphoprotein，P)，基质蛋白(matrix protein，M)，糖蛋白(glycoprotein，G)，大聚合酶蛋白(large polymerase protein，L)(Yan et al.，2015)。在P和M蛋白之间，编码四个辅助蛋白，依次是P3，P4/P5，P6，其中P4和P5的编码框重叠；在G和L蛋白之间，编码P9辅助蛋白。

由于所述大麦黄条点花叶病毒为负链RNA病毒，因此，其全基因组的反向互补链即为正链cDNA全长。

进一步地，本发明提供了前述表达载体的构建方法，所述构建方法的核心内容为：对大麦黄条点花叶病毒的基因组RNA进行反转录和 PCR扩增，得到正链cDNA，将所述正链cDNA构建到载体中。

所述载体包括但不限于pXT1或者pCass4-Rz等载体。含有花椰菜花叶病毒35S启动子，丙肝病毒核酸酶(HDVRz)序列(NCBI登录号为L35896.1或L35897.1)及转录终止子序列(例如胭脂碱合酶终止子，NCBI登录号为AJ007624.1)的植物表达载体均可作为所述载体进行植物细胞质弹状病毒表达载体的构建。

pXT1载体，全序列NCBI登录号为JN029690.1；pCass4-Rz载体，可参考已公开发表的文献(P.Annamalai,A.L.N.Rao,Virology, 338(2005)96-11)。在本发明的

具体实施方式

中，采用载体pXT1作为示例性说明。

进一步地，在所述构建方法中，可采用酶切连接或同源重组的方式将所述正链cDNA构建到载体中。

本发明经实验研究发现，若将BYSMV全长采用常规实验手段完整的直接构建到pXT1中，BYSMV中有1-4个关键核苷酸发生错配，导致侵染性克隆失败。为了更好保证获得的BYSMV cDNA的保真性和最终载体的可操作性，病毒序列可以分为两段或者三段扩增并连入载体，可有效降低构建cDNA克隆时的错误率。第二方面，本发明提供了一种侵染性克隆，所述侵染性克隆由农杆菌介导以下(1)～(2) 或(1)～(3)所述的载体共侵染本生烟后所得：

(1)前述植物细胞质弹状病毒表达载体；

(2)分别表达BYSMV的N、P、L的载体；或同时表达BYSMV 的N、P、L的载体；

(3)同时表达基因沉默抑制子p19、HCpro和γb的载体。

本发明经研究发现，(2)中，同时表达BYSMV的N、P、L的载体侵染性效果远远分别表达N、P、L的载体。当(3)所述载体参与共侵染时，能够提高(1)～(2)所述两个载体的表达量，极大地增加侵染性克隆的成功率。

在此基础上，本发明提供了一种虫传植物病毒的侵染性克隆新方法，即利用侵染本生烟瞬时表达建立细胞水平侵染，将所得侵染性病毒注射介体昆虫，利用介体昆虫接种并系统侵染单子叶植物。

所述介体昆虫优选为飞虱类昆虫，包括灰飞虱、白背飞虱以及褐飞虱，但不限于此。

该过程具体为，将被侵染的本生烟叶片加入病毒提取液后研磨，将研磨后得到的病毒汁液，或将所述病毒汁液进一步离心后得到的病毒粗提液，注射至飞虱类昆虫体内。

更进一步地，本发明提供了一种单子叶植物中的侵染性克隆，由侵染本生烟后所得的侵染性病毒经飞虱作为侵染介体，侵染单子叶植物后所得。

其中，所述单子叶植物包括但不限于大麦、小麦、谷子、玉米等。

第三方面，本发明提供了前述表达载体在侵染单子叶植物或飞虱类昆虫方面的应用。

进一步地，基于前述表达载体的优势，可利用所述表达载体携带外源基因侵染单子叶植物或飞虱类昆虫并表达外源基因，所述外源基因为长度5000bp，所述外源基因为1-3个，即所述表达载体还可以同时表达2-3个外源基因。本发明所述表达载体相对于现有表达载体，在对长度为1000bp～5000bp的大片段外源基因的表达上，存在格外明显的优势。

在引入外源基因时，优选将所述外源基因与所述表达载体酶切线性化后，通过同源重组的方式***表达载体的N(核衣壳蛋白)和P (磷蛋白)之间或P(磷蛋白)和P3(TengYan,et al.,2015,Virology,478: 112-122.)。

需要说明的是，***外源基因的位置并不限于上述两个位置，在 P6和M(基质蛋白)，M(基质蛋白)与G(糖蛋白)，G(糖蛋白) 与P9，或者P9与L(复制酶)之间也可设计***位点，进行外源蛋白表达。

其中，设计的酶切位点可选择在全长病毒载体上不具有的酶切位点，例如MluI、BmtI或者PacI等，但并不局限于此。

更为具体地，在上述优选方案中，在N和P之间可以加入两个表达框，分别加入MluI和BmtI，酶切线性化后可以通过同源重组或酶切连接等方式***外源基因片段：在P和P3之间***PacI，酶切线性化后可以通过同源重组的方式***外源基因片段。

进一步地，根据本发明所述植物细胞质弹状病毒的表达特点，正义链方向，靠近5′端的基因表达量高，因此如果外源基因需要高表达，优选***到N后第一个表达框；当外源基因需要低水平表达时，优选***到P和P3之间。

基于本发明的发明构思，本发明所述的表达载体还可用作蛋白功能的科学研究，即通过利用所述表达载体超表达/过表达单子叶植物某未知功能的蛋白，观察所侵染的单子叶植物的表型，从而分析/鉴定该蛋白的功能。

因此，本发明还提供了前述表达载体在快速鉴定基因功能方面的应用。

第四方面，本发明提供了前述表达载体在对飞虱类昆虫或单子叶植物进行基因编辑方面的应用，利用所述表达载体能够同时表达Cas9 蛋白和gRNA，或者表达其他类型基因编辑元件，直接对寄主植物基因组或者昆虫介体基因组进行有效编辑。

利用本发明所述的表达载体实现对飞虱类昆虫或单子叶植物的基因编辑的优势在于，Cas9无需通过转基因方式整合到飞虱类昆虫或单子叶植物的基因组上，仅通过瞬时表达即可实现对其基因组的编辑，避免了转基因的安全风险。

换言之，本发明所述表达载体可作为基因编辑的输送工具，在植物(尤其是单子叶植物)和/或昆虫中进行基因编辑的应用。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果至少在于：

本发明在全世界范围内首次公开了一种基于植物细胞质弹状病毒的表达载体。

所述表达载体至少具有以下优势：

(1)可以稳定表达大片段的外源基因，并且可以系统侵染单子叶植物；

(2)在植物体内表达量比较高，周期比较短；

(3)由飞虱类昆虫介体传播，并且昆虫终身带毒，可以高效接种大量植物寄主，产生高丰度的外源蛋白；

(4)只侵染寄主植物和飞虱类昆虫，不感染其他动物和人，安全性高；

(5)可以同时表达多个蛋白，可以用于表达几个有功能的蛋白亚基，直接进行体内组装；

(6)仅介导瞬间的基因表达，不整合到宿主细胞基因组中，不会像转基因植物可能产生的生物安全性和大众心里接受等问题。

(7)具有真核细胞内的翻译修饰等优势。

本发明进一步基于所述表达载体的特点和优势，提供了所述表达载体在快速鉴定基因功能方面的应用，以及所述植物细胞质病毒载体作为编辑输送工具，在植物和/或昆虫中进行基因编辑的应用。

附图说明

图1为pCB-BYSMV质粒的构建流程图。

图2为pGD-VSRs质粒和pGD-NPL质粒的构建流程图；其中， A：pGD-VSRs质粒，B：pGD-NPL质粒。

图3为微型复制子表达载体pBYMR的构建流程图。

图4为本生烟上建立BYSMV微型复制子体系的荧光细胞观察， Bars＝100μm。

图5为pCB-BYSMV-RFP载体示意图。

图6为本生烟观察结果；其中，A：pCB-BYSMV-RFP注射本生烟的单细胞荧光图，B：本生烟样品中观察到的BYSMV病毒粒子。

图7为pCB-BYSMV-RFP侵染飞虱的荧光观察图；左侧图为 pCB-BYSMV-RFP侵染的飞虱，在体式荧光显微镜下可观察到红色荧光；右侧图为健康飞虱(对照)。

图8为pCB-BYSMV-RFP侵染飞虱后接种大麦的荧光观察结果。

图9为pCB-BYSMV-EGFP表达载体骨架。

图10为长波紫外灯下pCB-BYSMV-EGFP侵染大麦后整株呈现出绿色荧光。

图11为pCB-BYSMV-GUS注射本生烟后经病毒复制可产生β- D-葡糖醛酸酶与底物反应后细胞呈蓝色，不注射pGD-NPL作为对照。

图12为pCB-BYSMV-GUS侵染大麦后GUS染色结果，健康大麦作为对照组。

图13为pCB-BYSMV-EGFP-RFP双表达载体骨架。

图14为pCB-BYSMV-EGFP-RFP侵染飞虱后在可同时观察到 GFP与RFP荧光，健康飞虱作为对照，Bars＝1mm。

图15为pCB-BYSMV-EGFP-RFP侵染大麦后可在同一个细胞内同时观察到GFP和RFP荧光。

图16为pCB-BYSMV-EGFP-RFP-ECFP多重表达载体构建流程。

图17为BYSMV基因编辑载体(BYSMV-CAS9-16C)注射16c 本生烟后检测CAS9蛋白表达。

图18为16c本生烟注射BYSMV编辑载体(BYSMV-CAS9-16C)，提取DNA经NdeI酶切后，PCR扩增检测出特异条带。

具体实施方式

需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中用到的引物列表

实施例1

1、BYSMV全长cDNA克隆构建

A.反转录-扩增获得BYSMV全长cDNA序列：取BYSMV系统侵染的大麦病叶，利用Trizol(Invitrogen)法提取叶片总RNA，以病毒基因组3′端特异引物primer1，反转录酶(SuperScript^TMIII Reverse Transcriptase，Invitrogen)进行反转录，得到病毒基因组全长cDNA。

B.获得BYSMV正链cDNA的前半段载体pCB-BYSMV^1-6131：利用引物primer1，primer2，Phusion高保真酶(Phusion High-Fidelity DNA Polymerase，NEB)，以上面得到的BYSMVcDNA为模板扩增BYSMV 1-6131bp的片段，琼脂糖凝胶电泳回收特异片段后用无缝克隆试剂盒(NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)重组至StuI、SalI双酶切线性化的pXT1载体(GenBank:JN029690.1，南京农业大学陶小荣教授馈赠)，通过以上实验得到pCB-BYSMV¹ ^-6131。

C.获得BYSMV正链cDNA的全长载体pCB-BYSMV：利用引物 primer3，primer4，Phusion高保真酶，以BYSMV cDNA为模板扩增BYSMV 6132-12706片段。琼脂糖凝胶回收特异片段后用无缝克隆试剂盒重组至SalI、SmaI双酶切线性化的pCB-BYSMV^1-6131质粒。通过上述步骤获得pCB-BYSMV全长cDNA克隆，在植物体内经35S启动子转录产生病毒正链基因组，并且RNA3′端携带有HDVRz核酶序列进而保证精确产生病毒RNA。另外在正链的后半部分6131-6232nt后面***SalI酶切位点便于后续对病毒进行遗传操作，构建过程如(图1) 所示。

2、BYSMV微型复制子体系建立

A.构建BYSMV的N、P和L蛋白的顺势表达载体pGD-N、pGD-P、 pGD-L：以步骤1得到pCB-BYSMV质粒为扩增模板，分别利用引物 primer5、primer6扩增N蛋白序列，引物primer7、primer8扩增P蛋白序列，primer9、primer10扩增L蛋白序列，然后使用无缝连接试剂盒分别重组到经HindIII线性化的pGD载体，见公开发表文献(Goodin et al.， ThePlant Journal(2002)31(3)，375-383)，由此得到质粒pGD-N、 pGD-P、pGD-L。

B.构建同时表达p19、HCpro以及γb的载体pGD-VSRs：

第一步：pGD-p19，pGD-HCpro，和pGD-γb等载体的构建

pGD-p19构建，根据NCBI中已报道p19序列(GenBank: AJ288942.1)人工合成该基因片段，并在片段两端加上XhoI与SalI酶切位点，回收片段经XhoI和SalI双酶切消化后使用T4DNA ligase连接到pGD载体获得载体pGD-p19；

pGD-HCpro构建，根据NCBI中已报道HCpro序列(GenBank: KX832617.1)人工合成该基因片段且在两端分别加上XhoI与SalI酶切位点，回收片段经XhoI和SalI双酶切消化后使用T4DNA ligase连接到 pGD载体获得载体pGD-HCpro；

pGD-γb构建，根据NCBI中已报道γb序列(GenBank: U13917.1)人工合成该基因片段且在两端分别加上加上XhoI与SalI酶切位点，回收片段经XhoI和SalI双酶切消化后使用T4DNA ligase连接到pGD载体获得载体pGD-γb。

第二步：将三个抑制子的表达框连入一个载体

以pGD-p19为模板用引物primer11、primer12扩增35S promoter-p19-NOSterminator序列；以pGD-HCpro为模板用引物 primer13、primer14扩增35S promoter-HCpro-NOS terminator序列；以 pGD-γb为模板用primer15、primer16为引物，扩增35Spromoter-γb-NOS terminator序列；最后以载体pGD为模板用引物primer17、primer18扩增线性化载体。参考NEB无缝连接试剂盒说明书将载体与上面扩增得到的4个序列混合在一个反应体系中，最终得到质粒pGD-VSRs，可在植物体内同时表达三个基因沉默抑制子p19、HCpro和γb，构建流程如图2A所示。

C.构建微型复制子表达载体pBYMR：首先利用引物primer19、 primer20对质粒模板pCB-BYSMV进行反向PCR后自连接得到保留 leader-N-P-L 3’UTR-trailer序列质粒pBYSMV-NP；然后用引物 primer21、primer22反向扩增pBYSMV-NP得到的线性化载体与经引物 primer23、primer24扩增得到的GFP序列重组，进而获得GFP报告基因替换N蛋白序列的质粒pBYMR-GFP-P；最后利用引物primer19、 primer25线性化载体pBYMR-GFP-P并与经引物primer26、primer27扩增的RFP序列重组得到RFP报告基因替换P蛋白序列的微型复制子表达载体pBYMR，构建流程如图3所示。

D.在本生烟上建立BYSMV微型复制子体系：将以上获得的质粒pGD-N、pGD-P、pGD-L、pGD-VSRs、pBYMR分别转化农杆菌感受态细胞EHA105，取阳性克隆28℃摇菌后，悬浮于农杆菌重悬缓冲液 (10mM 2-吗啉乙磺酸，10mM MgCl₂，150μM乙酰丁香酮)。利用可见光分光光度计测OD600重悬菌的浓度并按照以下终浓度pGD-N (0.1OD600，下同)、pGD-P(0.1)、pGD-L(0.3)、pGD-VSRs(0.1)、 pBYMR(0.3)混合菌液后通过去除针头的无菌注射器将菌液注射到培育三周左右的本生烟叶片中。六天后取注射叶片在荧光显微镜下可以观察到GFP与RFP荧光蛋白表达，并且呈单细胞分布，表明微型复制子体系建立成功，克隆得到的复制相关元件皆能发挥功能，荧光结果如图4所示。

3、BYSMV全长侵染性克隆构建

A.构建pGD-NPL瞬时表达载体：为提高农杆菌表达效率，将 pGD-N、pGD-P和pGD-L中的表达单元串联到一个瞬时表达载体中，利用的方法同步骤2中的B部分，将三个表达框片段和pGD载体片段进行同源重组，最终得到质粒pGD-NPL，具体构建流程如图2B所示。将该质粒转化农杆菌感受态EHA105后，以终浓度0D600 0.3同含有 pBYMR(OD 0.3)，pGD-VSRs(OD 0.1)的农杆菌混合后注射本生烟叶片，六天后观察到pBYMR中成功表达，表明pGD-NPL构建成功，能同时表达有功能的N、P以及L蛋白。

B.构建携带有报告基因RFP的全长侵染性克隆 pCB-BYSMV-RFP：为便于检测构建的BYSMV cDNA克隆是否有效，在BYSMV的N和P两个基因之间***了RFP报告基因表达框，构建了 pCB-BYSMV-RFP质粒。首先用引物primer28、primer29以 pCB-BYSMV为模板扩增leader上游载体1057bp至P蛋白基因605bp片段，然后将之连入pMD-19T载体获得质粒pBYSNP-T；然后利用引物 primer30、primer31以pBYMR为模板扩增N^3U-RFP-P^5U之间的序列重组至经引物primer32、primer33线性化的载体pBYSNP-T，进而得到质粒pBYSNP-RFP-T；最后再次用引物primer28、primer29从质粒 pBYSNP-RFP-T扩增含有RFP的BYSMV序列通过无缝克隆试剂盒重组至经NotI、ClaI线性化的载体pCB-BYSMV得到重组载体 pCB-BYSMV-RFP，载体构建流程如图5所示。该质粒在植物宿主体内转录出病毒RNA可被病毒复制酶转录产生一个独立的RFP mRNA，可以通过荧光显微镜观察RFP报告基因判断BYSMV的cDNA克隆是否有效。

C.BYSMV全长侵染性克隆pCB-BYSMV-RFP在本生烟上的侵染性：将上面得到的质粒pCB-BYSMV-RFP转化农杆菌感受态EHA105，以终浓度OD600 1.0与含有pGD-NPL(OD6000.5)，pGD-VSRs(OD600 0.3)的农杆菌混合注射本生烟叶片，温室培养5-20天后在荧光显微镜下可观察到单细胞状态的RFP荧光(图6A)，表明全长的BYSMV在本生烟中进行了复制转录过程。进一步在电子显微镜下观察到类似于病毒粒子的棒状结构，表明该病毒在本生烟中能成功组装(图6B)。

D.BYSMV全长侵染性克隆pCB-BYSMV-RFP在飞虱建立侵染：称取注射区域本生烟叶片2-3g，置于提前酒精灼烧灭菌并在冰上预冷的研钵中，加入2ml病毒提取Buffer研磨(100mM Tris-HCl，10mM Mg(CH₃COO)₂，1mM MnCl₂，40mM Na₂SO₃，pH 6-9)。研磨后，将病毒汁液转移至1.5ml管中，12000g 4度离心10min，上清液即为病毒粗提液。将粗提液注射飞虱若虫体内。单个样品注射100头左右飞虱若虫，注射后置于水稻幼苗上孵育，隔天观察约有80％成活，10-20 天后在体式荧光显微镜下观察到20％左右飞虱体内有RFP荧光，表明这些飞虱成功被BYSMV-RFP重组病毒侵染，结果如图7所示。

E.BYSMV全长侵染性克隆pCB-BYSMV-RFP在大麦中的侵染性: 将带有RFP荧光的飞虱孵育10-20天后，接种健康大麦，10-20天后可观察到大麦呈现出类似于BYSMV野生病毒侵染后的症状。在荧光显微镜下能够观察到发病大麦细胞中有RFP蛋白表达(图8)，以上结果表明构建得到的侵染性cDNA克隆可以成功侵染大麦等寄主植物，产生具有生物活性的BYSMV病毒。

4、BYSMV表达载体构建和应用

A.pCB-BYSMV-EGFP表达载体骨架的构建：

第一步：用引物primer19、primer25线性化质粒pBYMR片段，用引物primer34、primer35扩增的EGFP片段，两个片段进行重组，获得质粒pBYMR-EGFP，在此载体中，EGFP两端分别引入了MluI酶切位点；

第二步：用引物primer30、primer31以pBYMR-EGFP为模板扩增 N 3U-EGFP-P 5U之间的序列重组至经引物primer32、primer33线性化的载体pBYSNP-T，获得质粒pBYSNP-EGFP-T；

第三步：用引物primer28、primer29从质粒pBYSNP-EGFP-T扩增含有EGFP的BYSMV序列通过无缝克隆试剂盒重组至经NotI、ClaI线性化的载体pCB-BYSMV得到重组载体pCB-BYSMV-EGFP，构建流程和载体示意图如图9所示。该重组病毒携带有EGFP报告基因，可用长波紫外灯监测感染植物的发病情况(图10)，更重要的是能够将EGFP 用核酸内切酶MluI切下来替换为其他目的基因。

B.pCB-BYSMV-EGFP表达载体骨架的应用：

为了显示表达载体的表达片段大小的容量，选用了GUS(1812 bp)基因作为外源表达的目的片段。

首先，利用引物primer36、primer37扩增GUS序列，重组入经MluI 线性化的pCB-BYSMV-EGFP载体得到pCB-BYSMV-GUS重组质粒。将质粒pCB-BYSMV-GUS转化农杆菌感受态EHA105后与包含有质粒 pGD-NPL和pGD-VSRs的农杆菌共同注射本生烟叶片中，大约5-20天15天后取注射区域叶片进行GUS染色可观察到部分细胞呈现深蓝色 (图11)，表明BYSMV携带的GUS基因在本生烟中成功表达。进一步采用步骤3中的D部分和E部分的方法，将pCB-BYSMV-GUS发病的本生烟叶片由飞虱接种到健康大麦，10-20天后可观察到大麦显症，对整株发病大麦进行GUS染色表明根、茎、叶中均有GUS蛋白高丰度积累(图12)。

C.BYSMV双表达载体的构建：

BYSMV双表达载体构建，利用引物primer19、primer25线性化质粒pBYMR，重组入经primer38、primer39扩增的RFP片段获得质粒 pBYMR-2，这样在RFP两端***了BmtI酶切位点。以pBYMR-2为模板，用引物primer30、primer31扩增N 3U-RFP(Bmt1)-P 5U序列片段重组入引物primer32、primer40线性化的载体pBYSNP-EGFP-T得到载体pBYSNP-EGFP-RFP-T。再接着用引物primer28、vector-R以质粒 pBYSNP-EGFP-RFP-T为模板扩增含有EGFP-RFP的BYSMV片段重组入经NotI、ClaI双酶切线性化的pCB-BYSMV载体，获得质粒 pCB-BYSMV-EGFP-RFP，其中EGFP序列两端是MluI酶切位点，RFP 两端为BmtI酶切位点，如果替换需要表达的目的片段可以在相应片段的两端加入MluI或者BmtI替换EGFP或者RFP(图13)。

将该质粒转入EHA105农杆菌感受态后与包含有质粒pGD-NPL 和pGD-VSRs的农杆菌共同注射本生烟叶片中，大约5-20天后可在荧光显微镜下观察到同一个细胞内同时发出GFP和RFP荧光，表明 BYSMV病毒携带的GFP和RFP基因能够顺利表达。将本生烟病毒粗提液注射飞虱体内，10-20天后可在荧光显微镜下观察到飞虱体内的同时呈现出GFP、RFP荧光(图14)，由飞虱将该病毒接入大麦后也可在大麦细胞内同时观察到GFP与RFP荧光(图15)。

D.BYSMV多重表达载体的构建

BYSMV三重超表达蛋白载体构建，第一步利用primer41、 primer42以pCB-BYSMV为模板扩增P63U-M5U序列片段连接入 pMD19T载体得到质粒pP63UM5U-T，并在M5U后加入PacI酶切位点；第二步用引物primer43、primer44扩增ECFP片段经内切酶Pac1消化后用T4DNA连接酶与经Pac1线性化的P63UM5U-T载体连接得到质粒 pBYSECFP-T，在ECFP两端保留有Pac1酶切位点；第三步用引物 primer45、primer46以pCB-BYSMV为模板扩增P-P3之间序列片段连接入pMD19T载体得到质粒pPP3-T；第四步以pBYSECFP-T为模板利用引物primer47、primer48扩增P63U-M5U-ECFP片段重组入经引物 primer49、primer50线性化的载体pPP3-T后获得质粒pPP3ECFP-T；最后利用引物primer51、primer52以质粒pPP3ECFP-T为模板扩增P-ECFP-P3序列片段无缝克隆入经ClaI、SwaI双酶切线性化的 pCB-BYSMV-EGFP-RFP载体得到质粒 pCB-BYSMV-EGFP-RFP-ECFP，该载体再ECFP两端又添入Pac1酶切位点，可将ECFP替换为想要超表达的目的基因，同时也可分别替换 EGFP、RFP进而表达三个蛋白(图16)。

同前述过程一致，将该质粒转入EHA105农杆菌感受态后与包含有质粒pGD-NPL和pGD-VSRs的农杆菌共同注射本生烟叶片中，大约 5-20天后可在荧光显微镜下观察到同一个细胞内同时发出GFP、RFP 和CFP荧光，表明BYSMV病毒携带的GFP、RFP和CFP基因能够顺利表达。将本生烟病毒粗提液注射飞虱体内，10-20天后可在荧光显微镜下观察到飞虱体内的同时呈现出GFP、RFP和CFP荧光，由飞虱将该病毒接入大麦后也可在大麦细胞内同时观察到GFP、RFP和CFP荧光。

E.BYSMV介导基因编辑载体的应用

以上结果表明BYSMV可容纳较大的外源基因***，因此尝试将其改造为可以用于基因敲除的病毒载体。

在EGFP的位置***cas9蛋白，在P后面***guideRNA+gRNA scaffold。首先利用引物cas9-F、cas9-R扩增cas9基因***Mlu1线性化的pCB-BYSMV-EGFP载体得到质粒pCB-BYSMV-CAS9；然后利用引物primer53、primer54扩增gRNA scaffold片段重组入经vector-11F、vector-11R线性化的载体pPP3-T得到质粒pPP3gs-T，这样可以通过反向PCR后自连接在gRNA scaffold前融合入guide RNA。在这里选用了稳定转入GFP基因的本生烟16C(M.Teresa Ruiz et al.，1998)作为材料来验证BYSMV编辑载体。

首先以pPP3gs-T为模板，用引物primer55、primer54反向PCR*** 20bp guideRNA用来靶标mGFP，该靶标位置有NdeI酶切位点可用来酶切检测编辑结果；然后用引物primer56、primer57以前一步得到的质粒为模板扩增片段P-(GFP guide)gRNA scaffold-P3重组入NcoI线性化的pCB-BYSMV-CAS9载体；最后将该载体将该质粒转入EHA105 农杆菌感受态后与包含有质粒pGD-NPL和pGD-VSRs的农杆菌共同注射本生烟叶片中，大约10-15天后可通过western blot检测到Cas9蛋白的表达(图17)。

CTAB法提取注射本生烟16c注射叶片和无处理对照组16c叶片 DNA，取2000ng，加NdeI内切酶37℃过夜酶切，以2μL酶切产物为模板用引物primer58、primer59经NEB高保真phusion DNA聚合酶扩增36个循环后琼脂糖电泳检测PCR产物。结果表明注射病毒编辑载体的DNA样品，在目的大小位置处能检测到特异条带，而对照 DNA样品无条带。说明此位置NdeI位点能够被基因编辑的靶标并破坏，不能被NdeI酶正常剪切。而健康对照，没有经过编辑处理的基因组该位点的NdeI酶切位点正常被NdeI酶切割成小片段。下图为测序结果，也进一步确定上述位点被基因编辑靶标，并造成不同程度的缺失。将目的条带切胶回收后DNA后连接pMD-19T载体测序后得出mGFP基因被guide RNA靶标区域确实产生突变(图18)。

应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 植物细胞质弹状病毒侵染性克隆、表达载体及其构建方法与应用

<141> 2018-05-09

<160> 75

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 59

<212> DNA