阅读说明：本技术 抑制产铁载体菌和防治产铁载体菌引起的植物病害的方法 (Inhibit the method for producing siderophore bacterium and the anti-microbial plant disease of siderophore of managing property ) 是由 何翔 张庆 杨佩文 李铭刚 朱红业 倪明 杨群辉 杨明英 于 2019-07-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及农业微生物领域,公开了抑制产铁载体菌和防治产铁载体菌引起的植物病害的方法。本发明公开的抑制产铁载体菌的方法包括将铁离子螯合剂与产铁载体菌进行接触。本发明公开的防治产铁载体菌引起的植物病害的方法包括将铁离子螯合剂施用于植物。本发明的方法能够有效抑制产铁载体菌的生长,并防治产铁载体菌引起的植物病害。(The present invention relates to field of agricultural microorganism, the method for inhibiting to produce siderophore bacterium and the anti-microbial plant disease of siderophore of managing property is disclosed.The method disclosed by the invention for inhibiting production siderophore bacterium includes contacting iron chelator with siderophore bacterium is produced.The method of the anti-microbial plant disease of siderophore of managing property disclosed by the invention includes that iron chelator is applied to plant.Method of the invention can effectively inhibit to produce the growth of siderophore bacterium, and the anti-microbial plant disease of siderophore of managing property.)

抑制产铁载体菌和防治产铁载体菌引起的植物病害的方法

技术领域

本发明涉及农业微生物领域，具体涉及抑制产铁载体菌和防治产铁载体菌引起的植物病害的方法。

背景技术

铁在地壳和土壤中的含量十分丰富，同时铁作为地球上几乎所有生物体必需的营养元素之一，在各项机能代谢活动和酶促反应中发挥着重要作用；但在自然界中性或碱性有氧条件下，铁主要以难溶的Fe³⁺化合物形式存在，可溶性铁含量较匮乏，生物可利用率极低。此外，农业生产中植株缺铁现象较为普遍，给农林作物生物量的生产和植株系统抗性造成极大的影响。因此，为适应高氧低铁的胁迫环境，许多微生物自身诱导合成分泌一类与Fe³⁺具高亲和性且能与其特异性螯合的小分子次级代谢产物—铁载体，用以螯合宿主体内或周围环境中大量难溶性的铁，并通过氧化还原反应将其转化为可溶性的铁，为生物体提供充足的铁元素，同时也能有效减少环境中病原菌可利用铁的含量而降低其致病力，增强植株抗性。

关于产铁载体菌，目前多为利用其产铁载体的性能而促进植物生长的积极应用，鲜有抑制其生长的研究报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中鲜有抑制产铁载体菌的问题，提供抑制产铁载体菌和防治产铁载体菌引起的植物病害的方法。

本发明的发明人在研究中发现，部分产铁载体菌(如恶臭假单胞菌，Pseudomonasputida)会引起植物病害，因此，抑制产铁载体菌的生长从而防治产铁载体菌引起的植物病害具有重要意义。进一步地，本发明的发明人发现，使用铁离子螯合剂能够有效抑制产铁载体菌的生长和防治产铁载体菌引起的植物病害，因此，为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种抑制产铁载体菌的方法，该方法包括将铁离子螯合剂与产铁载体菌进行接触。

本发明第二方面提供了一种防治产铁载体菌引起的植物病害的方法，该方法包括将铁离子螯合剂施用于植物。

本发明的方法能够有效抑制产铁载体菌的生长，并防治产铁载体菌引起的植物病害。在本发明的优选实施方式中，通过使用乙二胺四乙酸(EDTA)，对保藏编号是CGMCCNo.17926的恶臭假单胞菌的抑制率达85％，抑制效果尤其明显。

生物保藏

本发明中涉及的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，于2019年6月13日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.17926。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“抑制产铁载体菌”指的是产铁载体菌的生长和繁殖被抑制。“产铁载体菌”指能够产生小分子次级代谢产物—铁载体的微生物，包括真菌和细菌。本发明中使用的术语“防治”意指预防和/或治疗。

本发明提供了抑制产铁载体菌的方法，包括将铁离子螯合剂与产铁载体菌进行接触。

根据本发明，对铁离子螯合剂的用量没有特别的要求，但优选情况下，相对于10⁸个恶臭假单胞菌，所述铁离子螯合剂的用量为10-50μg(如10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、38μg、40μg、50μg或上述数值之间的任意值)。

根据本发明，所述铁离子螯合剂可以为本领域常见的铁离子螯合剂，如乙二胺四乙酸、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、柠檬酸、酒石酸、葡萄糖酸、羟乙基乙二胺三乙酸和二羟乙基甘氨酸。优选地，所述铁离子螯合剂为乙二胺四乙酸。

根据本发明，所述方法对产铁载体菌的种类没有特别的要求，可以为恶臭假单胞菌，也可以为迪克氏菌(Dickeyazeae)等。但是，本发明的方法尤其适用于抑制恶臭假单胞菌，特别是保藏编号为CGMCC No.17926的恶臭假单胞菌。因此，优选地，所述产铁载体菌为保藏编号是CGMCC No.17926的恶臭假单胞菌。

根据本发明，对接触的条件没有特别的要求，可以包括温度为25-35℃(如25℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、35℃或上述数值之间的任意值)。所述接触的条件还可以包括时间为10h以上(如10h、15h、16h、17h、18h、20h或上述数值之间的任意值)，优选为15h以上。

本发明还提供了防治产铁载体菌引起的植物病害的方法，包括将铁离子螯合剂施用于植物。

根据本发明，对所述铁离子螯合剂的用量没有特别的要求，但优选情况下，所述铁离子螯合剂的施用量为10-100μg/株/次。

根据本发明，对所述铁离子螯合剂和产铁载体菌的具体选择如前所述，在此不再赘述。

根据本发明，所述植物可以为各种受产铁载体菌引起的病害影响的植物。所述植物可以为延龄草科的植物，优选为重楼属的植物，更优选为滇重楼。

根据本发明，产铁载体菌(特别是恶臭假单胞菌)引起的植物病害通常为植物软腐病。本发明的发明人发现，恶臭假单胞菌，特别是保藏编号是CGMCC No.17926的恶臭假单胞菌还会引起植物软腐病，因此通过抑制恶臭假单胞菌能够在一定程度上实现防治植物软腐病的目的。

根据本发明另外的方面，本发明提供了一株恶臭假单胞菌，其保藏编号为CGMCCNo.17926。

根据本发明另外的方面，本发明还提供了制备儿茶酚型铁载体的方法，包括：将本发明的恶臭假单胞菌接种至液体培养基中进行培养。

根据本发明，所述液体培养基可以为常规的能够培养假单胞菌的培养基，优选情况下，所述液体培养基含有：牛肉膏1-5g/L水，蛋白胨8-15g/L水，氯化钠3-8g/L水，8-羟基喹啉0.5-1g/L水，pH6.8-7。更优选地，所述液体培养基含有：牛肉膏2.5-3.5g/L水，蛋白胨9.5-10.5g/L水，氯化钠4.5-5.5g/L水，8-羟基喹啉0.7-0.8g/L水，pH6.8-7。

根据本发明，对培养的条件没有特别的要求，但优选地，所述培养的条件包括：温度为25-30℃，更优选为27-29℃。优选地，所述培养的条件还包括：时间为65-80h，更优选为70-75h。

根据本发明另外的方面，本发明还提供了促进植物生长的方法，包括将含有本发明的恶臭假单胞菌的代谢产物的制剂施用于植物。

本发明中，所述代谢产物包括铁载体，所述代谢产物可以通过培养本发明的恶臭假单胞菌获得，例如，使用液体培养基对所述恶臭假单胞菌进行培养。所述液体培养基或培养的条件如前所述，在此不再赘述。本发明中，使用培养后的上清液(含有代谢产物-分泌型铁载体)作为制剂施用于植物，所述植物可以为各种对铁元素有需求的植物。

另外，根据本发明另外的方面，本发明还提供了所述恶臭假单胞菌在制备儿茶酚型铁载体中的应用。

此外，根据本发明另外的方面，本发明还提供了所述恶臭假单胞菌和/或其代谢产物在促进植物生长中的应用。其中，所述植物可以为各种对铁元素有需求的植物。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

实施例1

本实施例用来说明本发明涉及的菌株的形态鉴定和分子遗传学分类鉴定结果。

从中国云南省丽江市玉龙纳西族自治县黄山镇滇重楼[Paris polyphyllavar.yunnanensis(Franch)Hand(Trilliaceae)]种植地的一株滇重楼病株上分离得到恶臭假单胞菌TZT-058，将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.17926。

恶臭假单胞菌TZT-058在平板培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂约15g，蒸馏水1000mL，pH6.8-7)上菌落呈圆形，乳白色，不透明，菌落表面有光泽，分布于培养基表面；扫描电镜放大21000倍后呈杆状，为长杆状菌，长2.26μm，宽0.71μm，菌株表面附着少量细且短的菌毛，顶端着生粗且长的丝状单生鞭毛；形态鉴定结果与恶臭假单胞菌的形态相吻合。经分子遗传学分类鉴定，菌株与恶臭假单胞菌的一致性最高。

实施例2

本实施例用来说明本发明涉及的菌株的产铁载体性能。

(1)试管种培养

将恶臭假单胞菌TZT-058菌株接种到固体培养基斜面上，于30℃下培养72h，获得试管种；所述固体培养基的配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂约15g，蒸馏水1000mL，pH6.8-7；

(2)固体平板种子培养

采用平板培养基培养，方法如下：

①配制去铁固体平板种子培养基，按去铁固体平板种子培养基配方的各成分及其含量混合而成固体平板种子培养基，所述去铁固体平板种子培养基的配方是：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂约15g，8-羟基喹啉0.75g、去离子水1000mL，pH6.8-7；

②在每个三角瓶中装入200ml所述去铁固体平板种子培养基，121℃灭菌20min，冷却至50℃后均匀倒入90mm平板中，待凝固后采用平板划线法接入菌株，28℃微生物培养箱内培养72h得固体种子。

(3)分泌型铁载体产生菌定性初筛和定量复筛

采用CAS检测法和光吸收法筛选，方法如下：

①将去铁固体种子培养基上活化的恶臭假单胞菌TZT-058(固体种子)挑取单菌落接种至去铁液体培养基内，按去铁液体种子培养基配方的各成分及其含量混合而成液体种子培养基，所述去铁液体种子培养基的配方是：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，8-羟基喹啉0.75g、去离子水1000mL，pH6.8-7；

②将接种后的液体种子培养基置于28℃微生物培养箱内培养72h，当液体种子培养基表面出现浑浊时，吸取50μL培养液于96孔板内，加入等体积CAS检测液，充分混匀，所述CAS检测液的配制方法为：称取0.0605g铬天青S(chromeazurol S,CAS)溶于50mL去离子水中，并加入10mL FeCl₃溶液(1mmol/L FeCl₃·6H₂O+10mmol/L HCl)搅拌混匀，标记为“A液”；再称取0.0729g十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethyl ammonium bromide,HDTMA)溶于40mL去离子水，标记为“B液”；最后将A液缓慢倒入B液中，并搅拌均匀；

③将饱和的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(与CAS检测液反应呈红色)作为阳性对照，未接种的培养液与CAS检测液等体积混合作为阴性对照，观察到接种培养液的孔板颜色变为红色，所述饱和的EDTA溶液的配制方法是：称取40mg EDTA溶于2mL去离子水中，并用0.22μm无菌滤膜过滤后转入无菌EP管中保存备用，得到20mg/mL的无菌测试母液；

④将恶臭假单胞菌TZT-058用无铁查氏液体培养基(成分为：蔗糖30g，NaNO₃ 3g，K₂HPO₄ 1g，KCl 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，水1000mL，氢氧化钠调节pH至7.2-7.4)放置于28℃、150r/min的恒温摇床上培养48h，培养结束后，吸取5mL培养液用0.22μm无菌滤膜过滤后加入等体积的CAS检测液，静置1h后用全波长酶标仪测定其OD₆₃₀值(记作“As”)，用相同方法测定未接菌的液体培养基的吸光值作为参比值(记作“Ar”)。铁载体的浓度用铁载体活性单位(siderophore unit,SU)表示，其中SU＝[(Ar-As)/Ar]×100％，测定重复3次，取平均值。结果显示，恶臭假单胞菌TZT-058的OD₆₃₀值为0.448，As/Ar比值为0.3865，铁载体活性(SU)为61.35％，说明恶臭假单胞菌TZT-058为高产铁载体的优势菌株。通过邻菲罗啉检测法，可推算出恶臭假单胞菌TZT-058分泌铁载体的量为8.1776μg/mL。

实施例3

本实施例用来说明本发明涉及的菌株产生的铁载体的化学结构初步鉴定。

鉴定方法如下：

①异羟肟酸型(hydroxamates)铁载体的鉴定

采用氯化铁检测法(FeCl₃test)鉴定：1mL培养液中加入1mL 2％FeCl₃溶液，出现红色或紫色表明测试样品中含有铁载体物质。用紫外分光光度计检测，如果在420nm-450nm之间出现吸收峰则说明螯合物质为异羟肟酸型铁载体。四唑试验：在少量四唑盐中加入2滴2mol/L NaOH和1mL上述制备的3mg/L的铁载体溶液中。若立即呈现深红色则说明有异羟肟酸型铁载体的存在。

②儿茶酚型(catecholates)铁载体的鉴定

采用氯化铁检测法鉴定：1mL培养滤液中加入1mL 2％FeCl₃溶液，用紫外分光光度计检测，如果在495nm附近出现吸收峰则说明螯合物为儿茶酚型铁体。Arnow’s试验：在1mL上述制备的3mg/L的铁载体溶液中加入0.1mL 5mol/L HCl，0.5mL反应液(50mL水中溶解NaNO₂和Na₂MoO₄-2H₂O各10g)，待反应液变成黄色后加入0.1mL 10mol/L NaOH(将出现红色)并补足蒸馏水至5mL。515nm处将有吸收峰。

③羧酸盐型(carboxylates)铁载体的鉴定

采用分光光度法(Spectrophotometric test)鉴定：1mL培养滤液中加入1mL 0.25μmol/L CuSO₄溶液和2mL pH4的醋酸盐缓冲液(醋酸盐缓冲液的配制：847mL 0.1μmol/LH₃COOH+153mL 0.1μmol/L CH₃COONa)，用紫外分光光度计检测，如果在190nm-280nm之间出现吸收峰则说明螯合物为羧酸型铁载体。

实验结果数据：经氯化铁检测法和分光光度法鉴定后可知，恶臭假单胞菌TZT-058在495nm附近出现吸收峰，表明该菌株能合成分泌儿茶酚型铁载体。

实施例4

本实施例用来说明EDTA对恶臭假单胞菌TZT-058的抑制作用。

(1)定性检测

采用微量稀释法进行定性检测，方法是：

①分别在96孔板内添加100μL无菌TTC-LB液体培养基(成分为：LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH 6.8-7.0；TTC溶液：称取1g氯化三苯基四氮唑溶于10mL去离子水中，并用0.22μm无菌滤膜过滤后转入无菌EP管中保存备用；10mL常规无菌LB液体培养基中加入1mL的0.1g/mL TTC溶液，混匀后作为TTC-LB液体培养基，密封保存备用)；

②A1-A12设置为阴性对照，只添加100μL无菌TTC-LB液体培养基，不添加菌悬液，B1-B12设置为生长对照，添加100μL无菌TTC-LB液体培养基和100μL菌悬液(恶臭假单胞菌TZT-058的含量为10⁸个/mL)；

③在C1、D1、E1孔内加入100μL的20mg/mL的无菌EDTA药液，并对EDTA药物进行倍半稀释直至最后一孔，此时该三列孔内浓度从左往右依次为：10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625……(单位:mg/mL)，而后再加入100μL稀释好的菌悬液(恶臭假单胞菌TZT-058的含量为10⁸个/mL)，此时每孔的药液浓度从左到右依次为：5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.0781……(单位:mg/mL)；

④将96孔板放入30℃恒温培养箱培养16h，定期观察并记录孔板的颜色变化。

(2)定量测定

采用微量稀释法进行定性检测，方法是：

①分别在96孔板内添加100μL无菌LB液体培养基(成分为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH 6.8-7.0)；

②A1-A12设置为阴性对照，只添加100μL无菌LB液体培养基，不添加菌悬液，B1-B12设置为生长对照，添加100μL无菌LB液体培养基和100μL菌悬液(恶臭假单胞菌TZT-058的含量为10⁸个/mL)；

③在C1、D1、E1孔内加入100μL的20mg/mL的无菌EDTA药液，并对EDTA药物进行倍半稀释直至最后一孔，此时该三列孔内浓度从左往右依次为：10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625……(单位:mg/mL)，而后再加入100μL稀释好的菌悬液(恶臭假单胞菌TZT-058的含量为10⁸个/mL)，此时每孔的药液浓度从左到右依次为：5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.0781……(单位:mg/mL)；

将96孔板放入30℃恒温培养箱培养16h，测定每块板的OD₆₂₅值，并根据公式计算EDTA对供试菌株的抑菌率，OD₆₂₅值＝0.5051说明供试菌株被较好地抑制。换算成麦氏比浊浓度或微生物的近似浓度(×10⁸/ml)，从而计算杀菌(抑菌)率。其计算公式为：抑制率＝“生长对照组微生物浓度(或麦氏比浊浓度)”—“药品组微生物浓度(或麦氏比浊浓度)”/“生长对照组微生物浓度(或麦氏比浊浓度)”×100％。

(3)实验结果

据微量稀释法对恶臭假单胞菌TZT-058进行定性、定量抑菌活性测定结果及判定标准可知，EDTA对恶臭假单胞菌TZT-058有较好的抑菌活性，其中，定性结果显示在0.0195mg/mL的药液浓度下颜色最深(粉红色)，说明在此浓度下对恶臭假单胞菌TZT-058的抑制效果最佳；定量结果进一步显示在0.0195mg/mL的药液浓度下OD₆₂₅值＝0.5051，EDTA抑菌率高达85.16％。

实施例5

本实施例用来说明EDTA对迪克氏菌(Dickeyazeae，购自中国普通微生物保藏管理中心，CGMCC No.1.3614)的抑制作用。

按照实施例4的方法进行测试，定性结果显示在0.3125mg/mL的药液浓度下颜色最深(粉红色)，说明在此浓度下对迪克氏菌的抑制效果最佳；定量结果进一步显示在0.3125mg/mL的药液浓度下OD₆₂₅值＝0.5051，EDTA抑菌率为80.08％。

进一步地实验显示，EDTA对恶臭假单胞菌TZT-058的抑制作用明显优于对其它菌种的抑制作用，说明EDTA尤其适用于抑制恶臭假单胞菌TZT-058。

此外，本发明的发明人针刺接种所述恶臭假单胞菌TZT-058至盆栽植物(如滇重楼)上，发现滇重楼出现软腐病症状(植株茎秆腐烂、植株倒伏)，而通过进一步施用铁离子螯合剂(如EDTA)发现滇重楼的软腐病症状得到有效缓解。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。