一种解脂耶氏酵母生产脂肪酸乙酯的方法及其发酵培养基
阅读说明：本技术 一种解脂耶氏酵母生产脂肪酸乙酯的方法及其发酵培养基 (A kind of method and its fermentation medium of Yarrowia lipolytica production fatty-acid ethyl ester ) 是由 花强 程博谦 韦柳静 高琪 刘顺成 陈骏 于 2018-05-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种解脂耶氏酵母生产脂肪酸乙酯的方法及其发酵培养基。该发酵培养基中,所述解脂耶氏酵母为重组解脂耶氏酵母菌株GQY001、GQY004和GQY007中的一种或多种；所述发酵培养基包括碳源和氮源,所述碳源为油酸和/或葵花籽油。利用本发明的发酵培养基生产脂肪酸乙酯可大幅提高脂肪酸乙酯的产量,有利于生物柴油的产业化应用,节能环保,有非常好的应用前景。(The invention discloses the methods and its fermentation medium of a kind of Yarrowia lipolytica production fatty-acid ethyl ester.In the fermentation medium, the Yarrowia lipolytica is one of recombination Yarrowia lipolytica strain GQY001, GQY004 and GQY007 or a variety of；The fermentation medium includes carbon source and nitrogen source, and the carbon source is oleic acid and/or sunflower oil.The yield that fatty-acid ethyl ester can be greatly improved using fermentation medium production fatty-acid ethyl ester of the invention, is conducive to the industrial application of biodiesel, energy conservation and environmental protection has extraordinary application prospect.)
技术领域
本发明涉及一种解脂耶氏酵母生产脂肪酸乙酯的方法及其发酵培养基。
背景技术
随着世界人口的不断增加，我们面临着石油能源枯竭和防止全球变暖的环境要求的挑战。如果化石燃料更换成生物燃料时，总CO2排放可降低60-90％。生物燃料的两个常见形式是生物乙醇和生物柴油(生物柴油(biodiesel)是指以动植物油脂、微生物油脂、餐饮垃圾油等为原料油通过酯交换工艺制成的可替代石化柴油的液体燃料，与柴油相溶性极佳，而且能够与国标柴油混合或单独使用)。由于在环境上的优势，生物燃料可以显著降低温室气体CO、CO2和SOX的废气排放，生物燃料引起越来越多的关注。脂肪酸乙酯(FAEE)具有与目前的粗柴油类似的性质，因此可能对未来可持续燃料的发展提供重要贡献。开发用于有效生产乙酸乙酯(FAEE)的新型细胞工厂及方法是非常重要的。
目前，中国已成为世界上最大能源消费国，中国占全球能源消费量的23％。2017年7月发布的《BP世界能源统计年鉴(2017年)》(中文版)显示，2016年，全球探明石油储量增加150亿桶(0.9％)至1.7万亿桶，按照2016年的产量水平，这足够世界50.6年的产量。全球石油用量增长强劲，增幅1.6％，每天的用量增加160万桶，连续第二年高于其十年平均增速。印度(增长30万桶/天)、欧洲(增长30万桶/天)和中国(增长40万桶/天)。此外，2016年可再生能源继续保持最快的增长速度，可再生能源增长了12％(包括风能、地热、太阳能、生物质能、垃圾发电和生物燃料，不包括水电)，这是有史以来最大的年增加量(增加5500万吨油当量，超出煤炭消耗量的减少量)。其中，2016年生物质燃料产量增长了2.6％，高于2015年0.4％。
到目前为止，2006年，Kalscheuer等人首次将一个构建好的含有乙醇生产途径的质粒导入大肠杆菌，使其能由葡萄糖和油酸作为底物生产乙醇并催化转酯作用来生产FAEEs。在随后的研究中，使用甘油作为碳源并且外源添加油酸，通过将该工程菌进行半工业的发酵生产，使产量达到了19g/L，这也是目前使用微生物生产FAEEs获得的最高产量。而在外源添加脂肪酸由酿酒酵母生产的FAEEs的最高能够达到0.5g/L，由于产量较低，酿酒酵母生产FAEEs的研究仍处于实验研究阶段，目前还不能应用到工业生产之中。
因此，如何提高脂肪酸乙酯的产量是本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中通过酵母菌株生产脂肪酸乙酯产量不高的缺陷，而提供了一种解脂耶氏酵母生产脂肪酸乙酯的方法及其发酵培养基。本发明的生产脂肪酸乙酯的方法可大幅提高脂肪酸乙酯的产量，有利于生物柴油的产业化应用，节能环保，有非常好的应用前景。
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明提供一种解脂耶氏酵母生产脂肪酸乙酯的发酵培养基，所述解脂耶氏酵母为重组解脂耶氏酵母菌株GQY001、GQY004和GQY007中的一种或多种；所述发酵培养基包括碳源和氮源，所述碳源为油酸和/或葵花籽油。
本发明中，所述重组解脂耶氏酵母菌株GQY001、GQY004和GQY007是指尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母，即自身难以合成尿嘧啶和亮氨酸的解脂耶氏酵母，本发明中GQY001、GQY004和GQY007按照中国专利CN 107815425 A(说明书[0050]-[0070]段)中记载的制备方法制得。
本发明中，所述重组解脂耶氏酵母菌株优选为GQY004或GQY007，更优选为GQY007。
本发明中，当所述碳源为油酸时，所述重组解脂耶氏酵母菌株优选为GQY004。
本发明中，当所述碳源为葵花籽油时，所述重组解脂耶氏酵母菌株优选为GQY007。
本发明中，所述碳源的含量可为本领域常规的含量，优选为20～80g/L，更优选为20～40g/L，例如20、40、60或80g/L。
本发明中，所述氮源可为本领域常规的氮源种类，例如蛋白胨和/或酵母提取物。所述蛋白胨可为本领域常规的蛋白胨，优选购自OXOID公司。所述酵母提取物可为本领域常规的酵母提取物，优选购自OXOID公司。
本发明中，所述氮源的含量可为本领域常规的含量，例如10～30g/L，再例如10g/L和20g/L。
当所述氮源包括蛋白胨时，所述蛋白胨的含量优选为15～25g/L，更优选为20g/L。
当所述氮源包括酵母提取物时，所述酵母提取物的含量优选为8～12g/L，更优选为10g/L。
本发明中，优选地，所述发酵培养基包括油酸和/或葵花籽油、蛋白胨和酵母提取物；更优选地，所述发酵培养基由油酸和/或葵花籽油、蛋白胨和酵母提取物组成。
本发明中，优选地，所述发酵培养基包括20～40g/L的碳源、10～30g/L的氮源；更优选地，所述发酵培养基由20～40g/L的碳源、10～30g/L的氮源组成。
在本发明一优选实施方式中，所述发酵培养基包括20～40g/L的油酸和/或葵花籽油、15～25g/L的蛋白胨和8～12g/L的酵母提取物，所述重组解脂耶氏酵母菌株为GQY001、GQY004或GQY007。
在本发明一优选实施方式中，所述发酵培养基由下列质量体积的组分组成：20～40g/L的油酸和/或葵花籽油、15～25g/L的蛋白胨和8～12g/L的酵母提取物，所述重组解脂耶氏酵母菌株为GQY001、GQY004或GQY007。
在本发明一优选实施方式中，所述发酵培养基包括20g/L的油酸和/或葵花籽油、20g/L的蛋白胨和10g/L的酵母提取物，所述重组解脂耶氏酵母菌株为GQY001、GQY004或GQY007。
在本发明一优选实施方式中，所述发酵培养基由下列质量体积的组分组成：20g/L的油酸和/或葵花籽油、20g/L的蛋白胨和10g/L的酵母提取物，所述重组解脂耶氏酵母菌株为GQY001、GQY004或GQY007。
本发明，所述发酵培养基的制备方法可为本领域常规的方法，只要将各组分以水，较佳地是蒸馏水溶解，再以高温灭菌即可。所述高温灭菌的条件可为本领域常规的条件，例如115℃灭菌25min。
本发明还提供了一种解脂耶氏酵母生产脂肪酸乙酯的方法，其包括如下步骤：将所述重组解脂耶氏酵母菌株的种子液接种于前述发酵培养基发酵生产脂肪酸乙酯，即可。
其中，以前述发酵培养基发酵培养重组解脂耶氏酵母菌株生产脂肪酸乙酯时，使用常规的方法即可，即将重组解脂耶氏酵母菌株的种子液接种于前述培养基，然后进行常规发酵即可。
所述接种的量优选为所述发酵培养基初始OD600＝0.01的接种量。
所述接种后、发酵前还可加入萃取剂。所述萃取剂可为本领域常规的可萃取溶解脂肪酸乙酯的试剂，优选为十二烷。所述萃取剂的用量可为本领域常规的用量，优选为8～12％，更优选为10％，百分比是指相对于初始发酵液的体积百分比。
所述发酵的温度可为本领域常规的温度，优选为28～32℃，更优选为30℃。
所述发酵过程可按本领域常规进行震荡培养。所述震荡的速度可为本领域常规的速度，优选为200～240rpm，更优选为220rpm。
所述发酵过程中还可加入乙醇。所述乙醇可每隔12小时添加一次。所述乙醇的添加量可为每次0.5～1.5％，例如1％，百分比是指相对于初始发酵液的体积百分比。
优选地，所述方法包括如下步骤：按照发酵培养基初始OD600＝0.01的接种量，将所述重组解脂耶氏酵母菌株的种子液接种于所述发酵培养基中，加入8～12％的十二烷作为萃取剂，置于发酵锥形培养瓶中在温度28～32℃于200～240rpm的条件下震荡培养，并且每隔12小时添加0.5～1.5％的乙醇，百分比是指相对于初始发酵液的体积百分比。
更优选地，所述方法包括如下步骤：按照发酵培养基初始OD600＝0.01的接种量，将所述重组解脂耶氏酵母菌株的种子液接种于所述发酵培养基中，加入10％的十二烷作为萃取剂，置于发酵锥形培养瓶中在温度30℃于220rpm的条件下震荡培养，并且每隔12小时添加1％的乙醇，百分比是指相对于初始发酵液的体积百分比。
本领域技术人员知晓，在用所述重组解脂耶氏酵母菌株的种子液发酵培养生产脂肪酸乙酯之前，可按照本领域常规操作制备得到重组解脂耶氏酵母菌株的种子液，一般包括如下步骤：
(1)将所述重组解脂耶氏酵母菌株接种于固体培养基上进行活化；
(2)将步骤(1)中活化得到的菌落接种于种子培养基培养得到种子液，即可。
其中，步骤(1)中，优选地，所述固体培养基的配方包括18～22g/L的葡萄糖、18～22g/L的蛋白胨和8～12g/L的酵母提取物；更优选地，所述固体培养基的配方包括20g/L的葡萄糖、20g/L的蛋白胨和10g/L的酵母提取物。
其中，步骤(1)中，优选地，所述固体培养基的配方由下列质量体积的组分组成：18～22g/L的葡萄糖、18～22g/L的蛋白胨和8～12g/L的酵母提取物；更优选地，所述固体培养基的配方由下列质量体积的组分组成：20g/L的葡萄糖、20g/L的蛋白胨和10g/L的酵母提取物。
其中，步骤(2)中，优选地，所述种子培养基的配方包括18～22g/L的葡萄糖、18～22g/L的蛋白胨和8～12g/L的酵母提取物；更优选地，所述种子培养基的配方包括20g/L的葡萄糖、20g/L的蛋白胨和10g/L的酵母提取物。
其中，步骤(2)中，优选地，所述种子培养基的配方由下列质量体积的组分组成：18～22g/L的葡萄糖、18～22g/L的蛋白胨和8～12g/L的酵母提取物；更优选地，所述种子培养基的配方由下列质量体积的组分组成：20g/L的葡萄糖、20g/L的蛋白胨和10g/L的酵母提取物。
优选地，所述重组解脂耶氏酵母菌株的种子液的制备包括如下步骤：
(1)将所述重组解脂耶氏酵母菌株接种于固体培养基上，28～32℃恒温培养箱中，平板培养1～3天，活化；
(2)将步骤(1)中活化得到的菌落接种于种子培养基，于28～32℃、转速200～240rpm的条件下震荡培养24小时，即可。
其中，步骤(1)中，所述恒温培养的温度优选为30℃。
其中，步骤(1)中，所述平板培养的时间优选为2天。
其中，步骤(2)中，所述震荡培养的温度优选为30℃。
其中，步骤(2)中，所述震荡培养的转速优选为220rpm。
本领域技术人员均知，发酵生产脂肪酸乙酯之后还优选包括收获脂肪酸乙酯的步骤。所述收获脂肪酸乙酯采用的方法一般为发酵72h后，取发酵液上层，离心后取有机相即得。
其中，所述脂肪酸乙酯的含量可采用本领域常规的手段进行检测，例如气相色谱法。
本领域技术人员均知，发酵生产脂肪酸乙酯之后还可包括收获菌体的步骤，所述收获脂肪酸乙酯采用的方法一般为将菌液离心、干燥即可。
其中，所述离心的条件优选为12,000rpm离心5min。
其中，所述干燥的条件优选为105℃中干燥至恒重。
其中，优选地，所述离心后，用去离子水洗涤2-3次。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)本发明中对重组解脂耶氏酵母菌株GQY001、GQY004和GQY007采用不同碳源进行培养，对比产量可知，其中使用油酸作为碳源时，脂肪酸乙酯的产量可达9.2～11.8g/L，是使用葡萄糖作为碳源的10倍之多；其中使用葵花籽油作为碳源时，脂肪酸乙酯的产量可达将近13.5～19.1g/L，最高可达葡萄糖作为碳源的20倍之多。此外，所生产的脂肪酸乙酯组分主要集中在C18:1和C18:2，不饱和脂肪酸乙酯所占比例较多能够降低脂肪酸乙酯的熔点，便于工业应用，且脂肪酸碳链越长，等摩尔下脂肪酸乙酯产能越高。
(2)本发明使用可再生的植物油作为碳源可大量生产生物柴油脂肪酸乙酯，这将使用微生物法生产生物柴油脂肪酸乙酯的成本降低，能够应用于商业化生产，有利于生物柴油的产业化应用，节能环保，有非常好的应用前景。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，重组解脂耶氏酵母菌株GQY001、GQY004和GQY007按照中国专利CN107815425 A(专利号201610818867.7)中记载的制备方法制得。
下述实施例中，蛋白胨和酵母提取物购自OXOID公司。
实施例1不同碳源生产脂肪酸乙酯
该实施例的实施步骤如下：
A：平板活化培养
按照20g/L葡萄糖溶解于蒸馏水中、20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物溶解于蒸馏水中，加入琼脂粉，然后在温度115℃的条件下灭菌25min，其中培养基中的葡萄糖需要和其他成分分开灭菌。
使用接菌环将重组解脂耶氏酵母菌株GQY007接种于装在平板中的固体培养基上，然后置于30℃恒温培养箱中，平板培养2天，得到平板培养物。
B：种子培养
按照20g/L葡萄糖溶解于蒸馏水中、20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物溶解于蒸馏水中，然后在温度115℃的条件下灭菌25min，其中培养基中的葡萄糖需要和其他成分分开灭菌。
使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种子培养基中，置于试管中温度30℃与220rpm的条件下震荡培养24小时。
C：发酵培养
按照20g/L碳源溶解于蒸馏水中(不溶于水的碳源按照相应浓度添加，碳源种类可见表1)、20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物溶解于蒸馏水中，然后在温度115℃的条件下灭菌25min，其中培养基中的碳源需要和其他成分分开灭菌。
按照发酵培养基初始OD600＝0.01的接种量，将步骤B得到的种子培养物转接到液体发酵培养基中，加入10％的十二烷作为萃取剂，置于发酵锥形培养瓶中在温度30℃与220rpm的条件下震荡培养，并且每隔12小时添加1％的乙醇。本段中百分比是指相对于初始发酵液的体积百分比。
在发酵培养72小时后，取发酵液上层有机相，在12,000rpm条件下离心5分钟，得到分层，使用一次性注射器将上层有机相取出并过滤，与5μmol/L的十七烷酸乙酯按照3：1混合，用GC-MS检测；气相色谱仪为Agilent6890；质谱仪为Agilent 5975配四极杆质谱检测器；色谱柱为HP-5(30m×0.25mm×0.25μm)。载气为高纯氦气，流速1mL/min。起始柱温为180℃，保持2min，然后以8℃/min的升温速度升至200℃后保持0.5min，接着又以4℃/min的升温速度升至215℃，保持1.5min，最后以20℃/min的升温速度升至280℃。进样量为1μL，检测器温度为200℃，进样口温度为280℃，分流比为20:1。
取2mL的菌液至烘干并称重的2mL的离心管中，在12,000rpm的条件下离心5min，用去离子水洗涤2-3次，收集细胞置于105℃中干燥至恒重。称总重，菌体干重计算公式为：菌体干重DCW(g/L)＝(总重-离心管重量)/发酵液体积。
不同碳源生产得到脂肪酸乙酯的产量及菌体干重可见表1，脂肪酸乙酯的成分可见表2。
表1：不同碳源来生产脂肪酸乙酯(g/L)
注：①单位干细胞产物产量(g/g)＝产量(g/L)/菌体干重(g/L)，该值可以表征单个菌体产能的能力。
②表1中脂肪酸乙酯的含量是指在发酵液上层有机相中的含量。
表2：不同碳源生产脂肪酸乙酯的组分(mg/L)
注：①ND表示未检测到。
②表2中脂肪酸乙酯碳链中的数值是指脂肪酸碳链的碳原子个数以及脂肪酸链的不饱和度，例如14:0是指脂肪酸的碳链有14个碳原子，不饱和度为0。
由表1和表2可以看出：
(1)当GQY007选用油酸和葵花籽油作为碳源时，脂肪酸乙酯的产量可达9.2g/L以上，尤其是当选用葵花籽油用作碳源时，脂肪酸乙酯的产量高达19.1g/L，是使用葡萄糖作为碳源时脂肪酸乙酯产量的20倍之多。
(2)当选用葵花籽油用作碳源时，菌株干重可达3.2g/L，菌株生长较好，如果使用葵花籽油等廉价植物油作为发酵底物，这样将会使得生物法生产生物柴油成本降低，产量提高。
(3)当GQY007选用油酸和葵花籽油作为碳源时，脂肪酸乙酯中的成分以长链不饱和脂肪酸居多。如表2所示，C18:1和C18:2的脂肪酸乙酯占比可达85％以上。
实施例2使用不同重组菌株利用油脂作为碳源生产脂肪酸乙酯
该实施例的实施步骤如下：
A：平板活化培养
按照20g/L葡萄糖溶解于蒸馏水中、20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物溶解于蒸馏水中，加入琼脂粉，然后在温度115℃的条件下灭菌25min，其中培养基中的葡萄糖需要和其他成分分开灭菌。
使用接菌环将重组解脂耶氏酵母菌株GQY001、GQY004和GQY007分别接种于装在平板中的固体培养基上，然后置于30℃恒温培养箱中，平板培养2天，得到平板培养物。
B：种子培养
按照20g/L葡萄糖溶解于蒸馏水中、20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物溶解于蒸馏水中，然后在温度115℃的条件下灭菌25min，其中培养基中的葡萄糖需要和其他成分分开灭菌。
使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种子培养基中，置于试管中温度30℃与220rpm的条件下震荡培养24小时。
C：发酵培养
按照20g/L的葵花籽油或油酸、20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物溶解于蒸馏水中，然后在温度115℃的条件下灭菌25min，其中培养基中的碳源需要和其他成分分开灭菌。
按照发酵培养基初始OD600＝0.01的接种量，将步骤B得到的种子培养物转接到液体发酵培养基中，分别加入10％的十二烷作为萃取剂，置于发酵锥形培养瓶中在温度30℃与220rpm的条件下震荡培养，并且每隔12小时添加1％的乙醇。本段中百分比是指相对于初始发酵液的体积百分比。
在发酵培养72小时后，取发酵液上层有机相，在12,000rpm条件下离心5分钟，得到分层，使用一次性注射器将上层有机相取出并过滤，与5μmol/L的十七烷酸乙酯按照3：1混合，用GC-MS检测；气相色谱仪为Agilent6890；质谱仪为Agilent 5975配四极杆质谱检测器；色谱柱为HP-5(30m×0.25mm×0.25μm)。载气为高纯氦气，流速1mL/min。起始柱温为180℃，保持2min，然后以8℃/min的升温速度升至200℃后保持0.5min，接着又以4℃/min的升温速度升至215℃，保持1.5min，最后以20℃/min的升温速度升至280℃。进样量为1μL，检测器温度为200℃，进样口温度为280℃，分流比为20:1。
取2mL的菌液至烘干并称重的2mL的离心管中，在12,000rpm的条件下离心5min，用去离子水洗涤2-3次，收集细胞置于105℃中干燥至恒重。称总重，菌体干重计算公式为：菌体干重DCW(g/L)＝(总重-离心管重量)/发酵液体积。
不同菌株生产得到脂肪酸乙酯的产量及菌体干重可见表3。
表3不同菌株发酵生产脂肪酸乙酯(g/L)
注：表3中脂肪酸乙酯的含量是指在发酵液上层有机相中的含量。
由表3可以看出：
(1)重组解脂耶氏酵母菌株GQY001、GQY004和GQY007生产脂肪酸乙酯均能得到较高的产量，使用油酸作为碳源时，脂肪酸乙酯的产量可达9.2～11.8g/L；使用葵花籽油作为碳源时，脂肪酸乙酯的产量可达13.5～19.1g/L。且使用葵花籽油作为碳源时，相较于油酸，菌株的干重较高，说明葵花籽油作为碳源时，菌株的生长较好。
(2)重组解脂耶氏酵母菌株GQY007在以油酸作为碳源时，生长和脂肪酸乙酯的产量相较于其他重组菌株要差，但是以葵花籽油作为碳源时，脂肪酸乙酯的产量明显提高。说明重组菌株GQY007在以葵花籽油作为碳源时能够得到较高的脂肪酸乙酯的产量。
实施例3
发酵培养基中葵花籽油的添加量如表4所示，其余同实施例1。脂肪酸乙酯的含量可见表4。
表4不同菌株发酵生产脂肪酸乙酯(g/L)
注：表4中脂肪酸乙酯的含量是指在发酵液上层有机相中的含量。
由表4可知，随着葵花籽油的添加量增加，脂肪酸乙酯的产量逐步增加，但以20g/L添加量可以得到的转化率最高。
对比例1
发酵培养基中碳源种类更改为葡萄糖、甘油和果糖，其余同实施例1。脂肪酸乙酯的产量和菌株的干重可见表5，碳源改变后脂肪酸乙酯的组分可见表6。
表5：不同碳源来生产脂肪酸乙酯(g/L)
注：①单位干细胞产物产量(g/g)＝产量(g/L)/菌体干重(g/L)，该值可以表征单个菌体产能的能力。
②表5中脂肪酸乙酯的含量是指在发酵液上层有机相中的含量。
表6：不同碳源生产脂肪酸乙酯的组分(mg/L)
注：表6中脂肪酸乙酯碳链中的数值是指脂肪酸碳链的碳原子个数以及脂肪酸链的不饱和度，例如14:0是指脂肪酸的碳链有14个碳原子，不饱和度为0。
由表5和表6可以看出：
(1)当GQY007选用葡萄糖、甘油或果糖物作为碳源时，脂肪酸乙酯的产量低于0.9g/L，相比于实施例1，其产量下降至少10倍。
(2)当GQY007选用葡萄糖、甘油或果糖物作为碳源时，脂肪酸乙酯的碳链多集中于16:0，相比于实施例1，碳链的长度和不饱和度都有所下降。