具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。

一种间充质干细胞制备抗衰去皱化妆品的方法，其包括以下步骤：

获取间充质干细胞原代细胞；

将间充质干细胞原代细胞进行传代培养，得到间充质干细胞；

收集第3代以后的间充质干细胞的上清液，加入六胜肽、寡肽-1，寡肽-3，胶原蛋白、玻尿酸、绿藻提取物、绵毛多管藻提取物、凝结多糖和水，得到混合溶液，将混合溶液经冻干工艺后，得到抗衰去皱化妆品。

在本发明的一些实施例中，上述间充质干细胞原代细胞的来源包括人或动物的骨髓、脐带、胎盘、脂肪和牙齿中的一种。

在本发明的一些实施例中，上述间充质干细胞原代细胞的来源为胎盘。采用胎盘来源的间充质干细胞对于皮肤抗衰老抗皱方面相比于其他来源的间充质干细胞具有更好的效果。

在本发明的一些实施例中，上述获取间充质干细胞原代细胞的步骤具体为：将样本细胞经清洗和首次离心后按照体积比为1：(1～1.5)加入细胞分离液，再经梯度离心获取单个核细胞层，再次离心后将沉淀进行接种培养，每隔48～72h进行换液，去除非贴壁细胞，得到间充质干细胞。

在本发明的一些实施例中，上述清洗具体为将样本细胞重悬在完全培养基中，用吸管反复吹打制得单细胞悬液，首次离心的转速为400～600rpm，离心时间为20～40min，所述细胞分离液采用比重为1.07～1.09g/ml的Percoll细胞分离液，所述梯度离心具体为先在1000～1100rpm离心10～15min，然后在1150～1200rpm离心10～15min，最后在1500～1600rpm离心15～20min。

在本发明的一些实施例中，上述传代培养具体为：当细胞的融合度达到80～90％时，加入胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化，消化结束后采用胎牛血清进行终止，然后离心后弃去上清液，用完全培养基重悬，按照1：(3～5)进行传代培养。

在本发明的一些实施例中，上述胰蛋白酶-EDTA溶液中胰蛋白酶的浓度为0.2～0.3mg/ml，所述EDTA的浓度为0.02～0.1mg/ml。

在本发明的一些实施例中，上述培养的条件为37℃、4～6％CO₂饱和湿度。

在本发明的一些实施例中，上述混合溶液中各原料的重量份为：30～40份间充质干细胞液、1～3份六胜肽、0.5～1份寡肽-1、0.5～1份寡肽-3，3～5份胶原蛋白、3～5份玻尿酸、1～3份绿藻提取物、0.5～2份绵毛多管藻提取物、2～5份凝结多糖和35～50份水。

间充质干细胞具有旁分泌效应，具有生长快、活性强的特点，在代谢过程中可以分泌出大量抗凋亡因子和细胞因子，包括：EGF(表皮生长因子)、HGF(肝细胞成长因子)、IGF-1(胰岛素1号生长因子)、PDFG(血小板衍生生长因子)、TGF-β(转化生长因子)、EGF(血管内皮细胞生长因子)和bFGF(成纤维细胞生长因子)，上述抗凋亡因子和细胞因子可以促进内源性修复，一旦间充质干细胞在体内激活并工作，身体内部环境中的细胞因子数量增加，有助于其他细胞的损伤修复及再生，使机体重获活力。

六胜肽能够减能缓肌肉收缩的力量，让肌肉放松，减少动态纹的发生，还可以消除细纹，重新组织胶原弹力，可以增加弹力蛋白的活性，使脸部线条放松，抚平皱纹改善松弛。寡肽-1能促进细胞生长和提高细胞活性，修复受损肌肤。修复胶原纤维和弹性纤维。寡肽-3可诱导干细胞分化，促进组织修复,修复基底层成纤维细胞。玻尿酸具有很强的保湿能力，不但能锁住肌肤内的水分，还能将外界环境的水分子抓住，能持续保持肌肤湿润，使皮肤水嫩、紧致，预防肌肤松弛、皱纹产生。胶原蛋白由动物皮提取，皮中除胶原蛋白外还含有透明质酸、硫酸软骨素等蛋白多糖，它们含有大量极性基团，是保湿因子，且有阻止皮肤中的酪氨酸转化为黑色素的作用，故胶原蛋白有纯天然保湿、美白、防皱和祛斑等作用。在本发明中，六胜肽用于预防皱纹的产生，寡肽-3刺激间充质干细胞的活性，寡肽-1促进细胞分子的生长，增加皮肤的代谢能力，玻尿酸与胶原蛋白起到保湿的能力。

绿藻提取物中的绿藻多糖可以促进胶原蛋白的生长，与水分子反应生成氢键，提高皮肤的含水量，既可以搭配绵毛多管藻提取物，在皮肤表面形成保护膜，对水分进行进一步的锁住，又能搭配凝结多糖促进细胞的吸水性能，对皮肤起到长效的保湿效果，进而达到延缓皱纹的效果。

在本发明的一些实施例中，上述冻干工艺具体为：先将混合液在-50～-40℃下预冻10～12h，然后在-60～-50℃下预冻2～4h，最后在0.2～0.6Pa、-48～-42℃下真空冷冻20～40h。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

一种骨髓间充质干细胞来源制备抗衰去皱化妆品的方法，包括以下步骤：

将抽取的骨髓细胞经无菌水冲洗后重悬于完全培养基中，用吸管反复吹打制得单细胞悬液；将单细胞悬液先在室温下以500rpm的转速进行离心20min，丢弃脂肪层，然后按照体积比为1：1加入比重为1.075g/ml的Percoll细胞分离液经1000rpm、10min，1200rpm、10min，1500rpm、15min的梯度离心，弃掉上层的混合液，取位于液体界面的云雾状单个核细胞层，再经500rpm离心5min后去上清，留沉淀用无菌水清洗，以密度为1×10⁷个细胞/cm²接种到细胞培养瓶中，培养基为含6.5％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养条件是37℃、5％CO₂饱和湿度，每隔72h换一次液，去除非贴壁细胞，最终得到骨髓间充质干细胞；

当细胞的融合度达到80～90％时，用胰蛋白酶的浓度为0.25mg/ml，EDTA浓度为0.04mg/ml的胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化，当通过显微镜发现细胞突起收缩变形呈圆形并大部分漂浮于细胞培养瓶时，加入胎牛血清终止消化，然后在1200rpm下离心8min，弃去上清液，用完全培养基重悬，按照1：5进行传代培养；

收集传代数为第3代以后的细胞骨髓间充质干细胞上清液，经过滤除菌后得到骨髓间充质干细胞液；往30重量份间充质干细胞液中加入1重量份六胜肽、0.5重量份寡肽-1、1重量份寡肽-3、3重量份胶原蛋白、4重量份玻尿酸、3重量份绿藻提取物、1重量份绵毛多管藻提取物、2重量份凝结多糖和35重量份水，得到混合溶液，将混合溶液先在-48℃的温度下预冻12h，然后在-60℃下冷冻2h，最后在0.2Pa、-48℃下真空冷冻28h，即可得到骨髓间充质干细胞来源制备的抗衰去皱化妆品。

实施例2

一种脐带间充质干细胞来源制备抗衰去皱化妆品的方法，包括以下步骤：

将脐带组织剪成3～5mm³的碎片，然后经无菌水冲洗后重悬于完全培养基中，用吸管反复吹打制得单细胞悬液；将单细胞悬液先在室温下以600rpm的转速进行离心30min，丢弃脂肪层，然后按照体积比为1：1.5加入比重为1.08g/ml的Percoll细胞分离液经1100rpm、10min，1150rpm、15min，1600rpm、15min的梯度离心，弃掉上层的混合液，取位于液体界面的云雾状单个核细胞层，再经600rpm离心3min后去上清，留沉淀用无菌水清洗，以密度为1×10⁷个细胞/cm²接种到细胞培养瓶中，培养基为含6％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养条件是37℃、6％CO₂饱和湿度，每隔48h换一次液，去除非贴壁细胞，最终得到脐带间充质干细胞；

当细胞的融合度达到80～90％时，用胰蛋白酶的浓度为0.2mg/ml，EDTA浓度为0.08mg/ml的胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化，当通过显微镜发现细胞突起收缩变形呈圆形并大部分漂浮于细胞培养瓶时，加入胎牛血清终止消化，然后在1100rpm下离心10min，弃去上清液，用完全培养基重悬，按照1：3进行传代培养；

收集传代数为第3代以后的细胞脐带间充质干细胞的上清液，经过滤除菌后得到骨髓间充质干细胞液；往40重量份间充质干细胞液中加入2重量份六胜肽、1重量份寡肽-1、0.5重量份寡肽-3、5重量份胶原蛋白、3重量份玻尿酸、2重量份绿藻提取物、0.5重量份绵毛多管藻提取物、5重量份凝结多糖和50重量份水，得到混合溶液，将混合溶液先在-45℃的温度下预冻10h，然后在-55℃下冷冻3h，最后在0.5Pa、-45℃下真空冷冻24h，即可得到脐带间充质干细胞来源制备的抗衰去皱化妆品。

实施例3

一种胎盘间充质干细胞来源制备抗衰去皱化妆品的方法，包括以下步骤：

将胎盘组织剪成3～5mm³的碎片，然后经无菌水冲洗后重悬于完全培养基中，用吸管反复吹打制得单细胞悬液；将单细胞悬液先在室温下以400rpm的转速进行离心40min，丢弃脂肪层，然后按照体积比为1：1加入比重为1.083g/ml的Percoll细胞分离液经1100rpm、15min，1200rpm、12min，1600rpm、20min的梯度离心，弃掉上层的混合液，取位于液体界面的云雾状单个核细胞层，再经600rpm离心3min后去上清，留沉淀用无菌水清洗，以密度为1×10⁶个细胞/cm²接种到细胞培养瓶中，培养基为含6％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养条件是37℃、6％CO₂饱和湿度，每隔60h换一次液，去除非贴壁细胞，最终得到胎盘间充质干细胞；

当细胞的融合度达到80～90％时，用胰蛋白酶的浓度为0.26mg/ml，EDTA浓度为0.1mg/ml的胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化，当通过显微镜发现细胞突起收缩变形呈圆形并大部分漂浮于细胞培养瓶时，加入胎牛血清终止消化，然后在1200rpm下离心8min，弃去上清液，用完全培养基重悬，按照1：4进行传代培养；

收集传代数为第3代以后的细胞胎盘间充质干细胞的上清液，经过滤除菌后得到骨髓间充质干细胞液；往34重量份间充质干细胞液中加入1重量份六胜肽、2重量份寡肽-1、0.8重量份寡肽-3、4重量份胶原蛋白、4重量份玻尿酸、3重量份绿藻提取物、2重量份绵毛多管藻提取物、4重量份凝结多糖和40重量份水，得到混合溶液，将混合溶液先在-48℃的温度下预冻10h，然后在-50℃下冷冻3h，最后在0.6Pa、-40℃下真空冷冻20h，即可得到胎盘间充质干细胞来源制备的抗衰去皱化妆品。

实施例4

一种脂肪间充质干细胞来源制备抗衰去皱化妆品的方法，包括以下步骤：

将脂肪组织经无菌水冲洗后重悬于完全培养基中，用吸管反复吹打制得单细胞悬液；将单细胞悬液先在室温下以450rpm的转速进行离心20min，丢弃脂肪层，然后按照体积比为1：1加入比重为1.09g/ml的Percoll细胞分离液经1000rpm、12min，1200rpm、15min，1600rpm、15min的梯度离心，弃掉上层的混合液，取位于液体界面的云雾状单个核细胞层，再经600rpm离心5min后去上清，留沉淀用无菌水清洗，以密度为1×10⁵个细胞/cm²接种到细胞培养瓶中，培养基为含6％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养条件是37℃、4％CO₂饱和湿度，每隔72h换一次液，去除非贴壁细胞，最终得到脂肪间充质干细胞；

当细胞的融合度达到80～90％时，用胰蛋白酶的浓度为0.28mg/ml，EDTA浓度为0.07mg/ml的胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化，当通过显微镜发现细胞突起收缩变形呈圆形并大部分漂浮于细胞培养瓶时，加入胎牛血清终止消化，然后在1200rpm下离心8min，弃去上清液，用完全培养基重悬，按照1：3进行传代培养；

收集传代数为第3代以后的脂肪间充质干细胞的上清液，经过滤除菌后得到骨髓间充质干细胞液；往36重量份间充质干细胞液中加入2.5重量份六胜肽、0.6重量份寡肽-1、0.9重量份寡肽-3、4重量份胶原蛋白、4重量份玻尿酸、2.5重量份绿藻提取物、1重量份绵毛多管藻提取物、3重量份凝结多糖和38重量份水，得到混合溶液，将混合溶液先在-40℃的温度下预冻10h，然后在-60℃下冷冻2h，最后在0.5Pa、-40℃下真空冷冻30h，即可得到脂肪间充质干细胞来源制备的抗衰去皱化妆品。

实施例5

一种胎盘间充质干细胞来源制备抗衰去皱化妆品的方法，包括以下步骤：

将胎盘组织剪成3～5mm3的碎片，然后经无菌水冲洗后重悬于完全培养基中，用吸管反复吹打制得单细胞悬液；将单细胞悬液先在室温下以550rpm的转速进行离心20min，丢弃脂肪层，然后按照体积比为1：1.3加入比重为1.075g/ml的Percoll细胞分离液，经1000rpm、11min，1150rpm、15min，1550rpm、20min的梯度离心，弃掉上层的混合液，取位于液体界面的云雾状单个核细胞层，再经500rpm离心4min后去上清，留沉淀用无菌水清洗，以密度为1×10⁶个细胞/cm²接种到细胞培养瓶中，培养基为含6％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养条件是37℃、5％CO₂饱和湿度，每隔60h换一次液，去除非贴壁细胞，最终得到胎盘间充质干细胞；

当细胞的融合度达到80～90％时，用胰蛋白酶的浓度为0.25mg/ml，EDTA浓度为0.07mg/ml的胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化，当通过显微镜发现细胞突起收缩变形呈圆形并大部分漂浮于细胞培养瓶时，加入胎牛血清终止消化，然后在1100rpm下离心8min，弃去上清液，用完全培养基重悬，按照1：3进行传代培养；

收集传代数为第3代以后的细胞胎盘间充质干细胞的上清液，经过滤除菌后得到骨髓间充质干细胞液；往32重量份间充质干细胞液中加入1重量份六胜肽、0.7重量份寡肽-1、0.5重量份寡肽-3、3重量份胶原蛋白、4重量份玻尿酸、2.5重量份绿藻提取物、1.5重量份绵毛多管藻提取物、5重量份凝结多糖和40重量份水，得到混合溶液，将混合溶液先在-50℃的温度下预冻12h，然后在-60℃下冷冻3h，最后在0.6Pa、-40℃下真空冷冻25h，即可得到胎盘间充质干细胞来源制备的抗衰去皱化妆品。

对比例1

本对比例与实施例1的区别在于，本对比例中不加入六胜肽、寡肽-1、寡肽-3、胶原蛋白、玻尿酸、绿藻提取物、绵毛多管藻提取物、凝结多糖和水，直接将间充质干细胞液进行冻干成冻干粉，作为化妆品使用。

对比例2

本对比例与实施例1的区别在于，本对比例中将六胜肽、寡肽-1、寡肽-3、胶原蛋白、玻尿酸、绿藻提取物、绵毛多管藻提取物、凝结多糖和水进行混合，然后冻干成冻干粉，作为化妆品使用。

实验例

邀请160名35～67岁皮肤松弛有皱纹的女性作为实验者，分为青年组(年龄35～50岁)68名，老年组(年龄51～67岁)92名，随机分为7个小组，分别将实施例1～5和对比例1～2制备的化妆品进行使用，使用时间3个月，使用前后测定其皮肤的含水量，统计增长率，并且采用visia拍照记录，经visia分析，效果提高50％以上为显效，效果提高20～50％为显效，效果提高20％以下为无效。青年组和老年组的结果分别如表1和表2所示。

表1

表2

从表1和表2中能看出来，相比较实验组6和实验组7，采用本发明实施例1～5制备的化妆品的实验者在皮肤改善上有明显的效果，说明间充质干细胞比现在化妆品中常用的六胜肽、寡肽-1、寡肽-3、胶原蛋白和玻尿酸效果更好。尤其针对老年组，皮肤问题较严重的患者，实验组3和实验组5中的效果更突出，说明胎盘间充质干细胞对于抗衰老和抗皱的效果最好。

综上所述，本发明实施例提供一种间充质干细胞制备抗衰去皱化妆品的方法。本发明通过将人或动物的骨髓、脐带、胎盘或脂肪细胞经过分离后得到间充质干细胞原代细胞，然后经过传代培养得到间充质干细胞，并将第3代以后的间充质干细胞加入褪黑素、绿藻提取物、绵毛多管藻提取物、人血清白蛋白、凝结多糖和水经过冻干工艺后制作成可以用于皮肤抗衰老抗皱的冻干粉，从而实现将间充质干细胞应用于化妆品领域，具有创新意义。

本发明中采用间充质干细胞制备的化妆品针对皮肤松弛有皱纹的情况具有很好的抑制效果，尤其是胎盘来源的间充质干细胞对于提高皮肤的含水量、抚平肌肤和抑制皱纹具有非常好的效果。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。