一种蒲公英提取物的制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种蒲公英提取物的制备方法及其应用 (Preparation method and application of dandelion extract ) 是由 董自波 王倩楠 石锦峰 王晗毓 郑家勤 李媛媛 许锦涛 于 2021-08-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种蒲公英提取物的制备方法及其在治疗或预防食管癌中的应用。所述的制备方法包括：(1)蒲公英粉末加水和纤维素酶溶液活化,煎煮后滤出煎液,浓缩成浸膏；(2)步骤(1)得到的浸膏稀释后用D101大孔树脂过柱浓缩纯化。本发明提高了有机酸的提取率和纯化效率,蒲公英提取物对炎症小鼠具有明显的预防和治疗作用,对于食管癌细胞具有很好的抑制增殖和细胞迁移的能力。(The invention provides a preparation method of a dandelion extract and application thereof in treating or preventing esophageal cancer. The preparation method comprises the following steps: (1) activating herba Taraxaci powder with water and cellulase solution, decocting, filtering decoction, and concentrating into extract; (2) diluting the extract obtained in the step (1), and then concentrating and purifying the extract by using a D101 macroporous resin column. The invention improves the extraction rate and purification efficiency of organic acid, and the dandelion extract has obvious functions of preventing and treating inflammatory mice and has good capability of inhibiting proliferation and cell migration of esophageal cancer cells.)
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及蒲公英及其提取物在制备抗食管炎与防治食管癌药物中的应用。
背景技术
食管癌为死亡率较高的恶性肿瘤，致病因素多且复杂，多与饮食习惯、肥胖、胃食管反流性疾病和巴雷特食管相关。研究发现食管在慢性炎症中常常伴随炎症细胞、细胞因子的转变和炎症通路的激活，改造适合肿瘤增殖与转移的微环境，在炎症-化生-癌变的过程中发挥重要作用。所以弄清炎症与食管癌发生发展的关系，可为食管癌的防治提供新思路。
蒲公英作为我国传统中药，价廉易得，成分主要有黄酮类、甾醇类、三萜类、酚酸类、色素类、倍半萜内酯类、香豆素类等，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等功效，可以抑制细胞增殖、改善炎症微环境，最重要的是，可以减轻机体对激素、抗生素药物的耐药作用，提高机体免疫力，改善患者的生活质量。
中国专利202110279290.8中公开了一种治疗食管癌炎症的中药制剂，包括夏枯草5-15克、玄参5-15克、黄柏3-10克、金银花5-15克、连翘5-15克、蒲公英5-15克、皂角0.5-1.5克、冰片0.5-2克、薄荷2-10克、牛蒡子2-10克、山豆根2-10克、僵蚕2-10克和甘草2-10克。其成分较为复杂，且治疗效果不甚理想。
中国专利202110493457.0中公开了一种治疗慢性胃炎的中药制剂，该中药制剂是由以下重量份的原料制成：高良姜280-320份、天花粉280-320份、白术280-320份、莪术180-220份、丹参180-220份、海螵蛸80-120份、大黄80-120份、甘松40-80份、枳壳80-120份、白芍40-80份、鸡内金40-80份、蒲公英60-100份、黄芩40-80份、桔梗40-80份；该中药制剂具有温脾散寒、养阴和胃、行气化瘀的功效。但其实际药理不明。
但蒲公英提取物组成成分复杂、种类繁多，各成分的生物活性、量效与构效间的关系尚未明确，给蒲公英在医药方面的研究带来阻碍。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种蒲公英提取物的制备方法及其在治疗或预防食管癌中的应用。
一方面，本发明提供了一种蒲公英提取物的制备方法。
包括以下步骤：
(1)蒲公英粉末加水和纤维素酶溶液活化，煎煮后滤出煎液，浓缩成浸膏；
(2)步骤(1)得到的浸膏稀释后用D101大孔树脂过柱浓缩纯化。
所述的步骤(1)中的蒲公英粉末可以是蒲公英全草、蒲公英根、蒲公英叶、蒲公英花中的任意一种或多种的干粉末。
所述的步骤(1)中水的添加量与蒲公英粉末的量的比值为1：2-5(体积/质量)。
所述的步骤(2)中浸膏的稀释比例为1：10蒸馏水稀释。
所述的步骤(2)中进样液体积(mL)与大孔树脂质量(g)比值为10-14，优选为12。
所述的步骤(2)中进样液pH优选为2。
所述的步骤(2)中用D101大孔树脂过柱浓缩纯化时吸附流速为1-2BV/h，解吸液乙醇浓度为40-60％，解吸流速为1.5-3BV/h，解吸液用量为1-4BV。
优选地，所述的步骤(2)中用D101大孔树脂过柱浓缩纯化时吸附流速为为1.5BV/h，解吸液乙醇浓度为50％，解吸流速为2BV/h，解吸液用量为3BV。
另一方面，本发明提供了一种蒲公英提取物。
所述的蒲公英提取物通过前述制备方法制备得到。
再一方面，本发明提供了蒲公英在制备食管炎或食管癌相关药物中的应用。
所述的药物包括但不限于用于食管炎或食管癌的预防和/或治疗和/或预后修复。
所述的蒲公英通过前述的方法制备提取物然后进行药物的制备。
再一方面，本发明提供了前述的蒲公英提取物在制备食管炎或食管癌相关药物中的应用。
所述的药物包括但不限于用于食管炎或食管癌的预防和/或治疗和/或预后修复。
又一方面，本发明提供了一种用于食管炎或食管癌的预防和/或治疗和/或预后修复的药物。
所述的药物中包括前述的蒲公英提取物。
优选地，所述的药物为液体。
所述的药物中蒲公英提取物的浓度为2500-10000μg生药/mL。所述的生药指纯化产物。
所述的生药指未经加工的中药材，2500μg生药/mL表示的是纯化产物每1mL相当于原药材的2500μg。
所述的药物的剂型包括但不限于：汤剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、酒剂、糖浆剂、浸膏剂、茶剂、栓剂、糊剂、糕剂、洗搽剂、油剂、冲剂、口服液剂、胶囊剂、滴丸剂、气雾剂、灌肠剂、针剂。
所述的药物中还包括其他药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的有益效果：
1、本发明优化了蒲公英有机酸的提取工艺，提高了有机酸的提取率，操作便捷，重复性高。
2、大孔吸附树脂可以直接对提取液进行分离，提高了纯化效率，树脂可重复再生利用，增加了利用率，减低成本，实现利益最大化。
3、蒲公英提取物对炎症小鼠具有明显的预防和治疗作用，降低小鼠体内炎症，缓解小鼠发病症状，能够很好的减轻小鼠对抗生素药物的耐药作用，提高小鼠免疫力。对于食管癌细胞具有很好的抑制增殖和细胞迁移的能力。
附图说明
图1为水与乙醇提取率效率对比结果。
图2为不同水提方式提取率效率比较。
图3为HPLC色谱图，其中A为混合对照品，B为D101纯化供试品。
图4为HPD600纯化供试品色谱图。
图5为蒲公英不同浓度对大鼠肉芽肿质量的影响。
图6为蒲公英提取物降低KYSE70细胞增殖能力效果。
图7为蒲公英提取物对KYSE 70细胞划痕实验结果图。
图8为蒲公英提取物减慢KYSE70细胞划痕愈合速率。
图9为蒲公英提取物纯化前绿原酸、咖啡酸和菊苣酸含量测定的HPLC图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1蒲公英水提取物的制备
包括以下步骤：
(1)称取5g的蒲公英全草粉末(过40目筛)置于的圆底烧瓶中，加15倍量水和12.5mL纤维素酶溶液(终浓度50U/mL，购自：上海麦克林生化科技有限公司，货号：C805042)50℃下活化30min后，微沸状态下煎煮1h，趁热滤出煎液后用烧杯收集。4℃条件下静置24h，滤过，滤液用旋转蒸发仪浓缩成相对密度1.1-1.15(50℃)的浸膏，置于4℃冰箱保存备用，平行做三次实验。
(2)蒲公英水提取物中绿原酸含量的测定
对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品6.493mg置于100mL的容量瓶中，加超纯水定容至刻度，得对照品溶液。
供试品溶液的制备：精密称定蒲公英提取物99.342mg置于100mL的容量瓶中，加适量超纯水超声30min后定容至刻度，从中精密吸取1ml，用超纯水定容至50mL容量瓶中，即得。
标准曲线的绘制：精密量取经绿原酸对照品(0.0649mg/ml)0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml置于10mL的容量瓶中，用水定容至刻度。用紫外分光光度计全波长扫描对照品和供试品溶液，两者在323nm处有最大吸收，故将对照品溶液分别在323nm处测定吸光度，得回归方程为Y＝0.1035x+0.0151，相关系数r＝0.9991。
绿原酸含量测定：取蒲公英提取物供试品溶液0.5mL于10mL的容量瓶中，用水定容至刻度，在323nm处测定其吸光度，根据回归方程计算得供试品中绿原酸的含量，根据供试品溶液中绿原酸的含量计算得蒲公英提取物中绿原酸的平均提取率为1.084％。
实施例2蒲公英提取物的纯化
1)蒲公英提取物的D101大孔树脂纯化
由实施例1条件提取蒲公英浸膏按1：10加蒸馏水稀释，用的D101大孔树脂中进行过柱，进样液体积(mL)与大孔树脂质量(g)比值为12，pH＝2，吸附流速为1.5BV/h，解吸液乙醇浓度为50％，解吸流速为2BV/h，解吸液用量为3BV。用锥形瓶收取分离液，减压浓缩待用。
通过HPLC，比较纯化前后三种成分有机酸的含量。纯化前三种有机酸含量为71.91％(图9)，纯化后为84.57％。
2)蒲公英提取物的中绿原酸、咖啡酸和菊苣酸含量测定
对照品的配置：分别精密称取菊苣酸、咖啡酸与绿原酸对照品4.40、3.92、4.70mg于三个10mL量瓶中，用70％甲醇超声溶解，放冷至室温，再加70％甲醇定容至刻度并混匀；另精密吸取对照品储备液1mL混合于10mL量瓶中，用70％甲醇溶解并定容至刻度，配制成每含菊苣酸、咖啡酸与绿原酸分别为44μg/mL，39.2μg/mL，47μg/mL的混合对照品溶液。
供试品溶液的制备：取蒲公英纯化物0.0586g，置10mL量瓶中，加入适量70％甲醇，超声提取10min，放冷至室温，再用70％甲醇定容，过滤，取续滤液作为供试品溶液。
色谱条件：流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱(0-5min、10％-15％A，5-15min、15％-40％A，15-16min、40％-10％A，16-21min、10％A)，流速1.0mL·min-1，检测波长为328nm，柱温35℃，进样量20μL。分别精密吸取供试品、混合对照品和阴性样品溶液，在上述色谱条件下进样，记录色谱图，图3是HPLC色谱图，其中A为混合对照品，B为D101纯化供试品。绿原酸，咖啡酸和菊苣酸分别为32.06％，3.22％和49.29％。
实施例3蒲公英提取物作用于大鼠肉芽肿实验
本实施例的大鼠为SD大鼠，体重200-250g，由南京中医药大学实验动物中心提供。
大鼠模型的构建方法：大鼠用水合氯醛麻醉后，对腋下部分去毛并用75％酒精消毒，取浸有5mL 75％乙醇的50mg重的棉球植入大鼠前肢腋窝下。
将大鼠随机分为低、中、高药物剂量组与模型组，共四组，给药浓度低中高三组给药剂量按蒲公英换算分别为1.56g生药/kg、3.12g生药/kg、6.24g生药/kg，模型组给药生理盐水。大鼠模型持续给药7天，每100g大鼠体重灌胃1mL药物，第8天对大鼠进行脱颈处死，取出棉球于60℃烤箱烘干1天，计算肉芽肿质量，由图5可知，蒲公英给药各剂量均可降低棉球肉芽肿的干重。蒲公英各剂量中，高剂量的作用最强，说明蒲公英可以抑制肉芽组织增生。
实施例4蒲公英提取物对食管癌细胞KYSE70增殖实验作用
KYSE70癌细胞购于上海美轩生物科技有限公司。
在96孔板中配置100μL的细胞悬液，每孔5×103个细胞，在培养箱中孵育24h(37℃，5％CO2)。向孔板中加入10μL不同浓度的蒲公英提取物，配成终浓度为50、250、500、1000、2500、5000、7500、10000μg生药/mL。培育24h后，加入10μL CCK8溶液，孵育2h后，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。由图6可知，蒲公英可显著降低食管癌细胞的增殖。其中2500-10000μg生药/mL效果最好。
实施例5蒲公英提取物对KYSE 70细胞划痕实验作用
在24孔板中配置1mL的细胞悬液，每孔2×105个细胞，每种细胞设立4个平行孔，加样时要缓慢，旋转的加样，轻转细胞培养板使细胞均匀平铺，在饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱中培养24h。待细胞汇聚度为90％时，用200μL枪头在细胞表面水平划平行三道划痕，吸去旧培养基，用500μL无菌PBS缓冲液冲洗2次，然后加入1％血清的培养基，在饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱中继续培养，每间隔分别在0、6、12、24和48h测量划痕面积。伤口闭合率公式：(S0-St)/S0×100，其中S0是伤口初次划痕形成时的面积，St是测量时间点时划痕的面积。由图7和图8可知，蒲公英有机酸可以显著减慢KYSE70细胞划痕愈合率，显著减慢食管癌细胞的迁移。
实施例6蒲公英不同部位提取物抗癌效果研究
参照实施例1-2的实验方法，针对蒲公英不同部位进行水提取物的制备，具体为：蒲公英根、蒲公英叶、蒲公英花。
得到的产物进行抗癌效果检测，并以全草制备的水提取物为对照，结果如下：
(1)大鼠肉芽肿实验
组别
给药量
肉芽肿/g
空白
--
0.1081±0.0364
全草
6.24g/kg
0.0682±0.0307
蒲公英根
6.24g/kg
0.0801±0.0395
蒲公英叶
6.24g/kg
0.0657±0.0316
蒲公英花
6.24g/kg
0.0925±0.0349
(2)对食管癌细胞KYSE70增殖实验作用
组别
给药量
存活率/％
空白
--
100％
全草
5000μg/mL
88.45％
蒲公英根
5000μg/mL
90.55％
蒲公英叶
5000μg/mL
87.49％
蒲公英花
5000μg/mL
94.31％
(3)对KYSE 70细胞划痕实验作用
组别
给药量
6h
12h
24h
48h
空白
--
8.4317％
21.3853％
21.3906％
23.8004％
全草
5000μg/mL
-0.7194％
-1.7425％
-3.9739％
-18.5266％
蒲公英根
5000μg/mL
-0.0254％
-1.4906％
-2.7822％
-8.2393％
蒲公英叶
5000μg/mL
-1.0488％
-2.0647％
-5.6265％
-19.7053％
蒲公英花
5000μg/mL
1.2317％
-0.8643％
-2.4722％
-5.3481％
对比例1蒲公英乙醇提取物的制备
称取5g的蒲公英全草粉末(过40目筛)置于的圆底烧瓶中，加15倍量80％乙醇和12.5mL纤维素酶溶液50℃下活化30min后，微沸状态下煎煮1h，趁热滤出煎液后用烧杯收集。4℃条件下静置24h，滤过，滤液用旋转蒸发仪浓缩至无醇味，置于4℃冰箱保存备用，平行做三次实验。
以绿原酸为对照品，对上述提取物进行紫外分光光度法，检测其中绿原酸含量，算出提取率，即浸提的平均提取率为1.013％。
由图1可知，水的提取效率优于乙醇。
对比例2蒲公英超声方式提取物的制备
称取0.5g粉末样品，置于100mL锥形瓶中，加入15倍量水，放入超声波清洗器中处理20min，然后将上清液转移到干净锥形瓶中，残渣用蒸馏水清洗2次，合并上清液。将上清液置于3000r/min的离心机中离心5min，将上清液转移至50mL容量瓶中定容，冷藏备用，平行做三次实验。
以绿原酸为对照品，对上述提取物进行紫外分光光度法，检测其中绿原酸含量，算出提取率，即超声的平均提取率为0.706％。
对比例3蒲公英浸提方式提取物的制备
取5g蒲公英粉末样品，按照1∶15比例加水和纤维素酶溶液12.5mL，置于50℃水浴加热35min，并于70℃下浸提2h，提取2次，合并浸提液，浓缩至5mL，置于4℃冰箱保存备用，平行做三次实验。
以绿原酸为对照品，对上述提取物进行紫外分光光度法，检测其中绿原酸含量，算出提取率，即浸提的平均提取率为0.905％。
由图2可知，加热回流的提取效率优于浸提。
对比例4蒲公英提取物HPD600大孔树脂纯化
由上述条件提取蒲公英浸膏按1：10加蒸馏水稀释，用HPD600大孔树脂中进行过柱，进样液体积(mL)与大孔树脂质量(g)比值为12，pH＝2，吸附流速为1.5BV/h，解吸液乙醇浓度为50％，解吸流速为2BV/h，解吸液用量为3BV。用锥形瓶收取分离液，减压浓缩待用。
由实施例4条件制备供试品溶液，在相同的色谱条件下，由图4可知，绿原酸，咖啡酸和菊苣酸分别为34.66％，5.66％和44.98％。
由图3与图4对比可知，D101对绿原酸、咖啡酸和菊苣酸的富集效果更优。
对比例5-11纯化条件对比
参照实施例2设置对比例，对比例与实施例2的差别仅在于步骤1)的吸附条件中部分操作不同，具体设置如下：
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