发酵姜黄及其制备方法
阅读说明：本技术 发酵姜黄及其制备方法 (Fermented turmeric and its preparation method ) 是由 黄荣增 宋成武 金姝娜 张丽君 舒劲松 丁英平 韩永明 陈成 向星亮 于 2021-08-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及姜黄制备技术领域,具体而言,涉及发酵姜黄及其制备方法。发酵姜黄的制备方法包括：利用冠突散囊菌对姜黄原料进行发酵。通过该制备方法能够有效减少姜黄中含有的挥发油成分,大大减小姜黄的刺激性气味,增加姜黄中水溶性更高的姜黄素类物质,使姜黄活性成分整体生物利用度有效提高,继而发酵姜黄具有更好的调节糖脂代谢作用、抗肿瘤作用、抗风湿性关节炎作用、抗氧化应激作用和调节肠道菌群作用等。(The invention relates to the technical field of turmeric preparation, and particularly relates to fermented turmeric and a preparation method thereof. The preparation method of the fermented turmeric comprises: the curcuma longa raw material is fermented by using eurotium cristatum. The preparation method can effectively reduce volatile oil components contained in the turmeric, greatly reduce pungent smell of the turmeric, increase curcumin substances with higher water solubility in the turmeric, effectively improve the overall bioavailability of active ingredients of the turmeric, and then the fermented turmeric has better functions of regulating glycolipid metabolism, resisting tumors, resisting rheumatoid arthritis, resisting oxidative stress, regulating intestinal flora and the like.)
技术领域
本发明涉及姜黄制备技术领域，具体而言，涉及发酵姜黄及其制备方法。
背景技术
姜黄的主要有效成分为姜黄素。姜黄在中国作为一个药食同源的中药，并不像其在西方国家普遍使用为食品添加剂、着色剂等。由于姜黄中天然的主要活性物质，即姜黄素类成分均属于脂溶性化合物，难溶于水，生物利用度低，口服吸收率低、生物半衰期短、稳定性差，严重制约了在临床的广泛应用。并且由于姜黄中的挥发油气味极具刺激性，限制了姜黄相关加工产品在我国的发展和推广。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供发酵姜黄及其制备方法。通过该制备方法能够有效减少姜黄中含有的挥发油成分，大大减小姜黄的刺激性气味，增加姜黄中水溶性更高的姜黄素类物质，使姜黄活性成分整体生物利用度有效提高，继而发酵姜黄具有更好的调节糖脂代谢作用、抗肿瘤作用、抗风湿性关节炎作用、抗氧化应激作用和调节肠道菌群作用等。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种发酵姜黄的制备方法，包括：利用冠突散囊菌对姜黄原料进行发酵。
在可选的实施方式中，包括：活化冠突散囊菌种形成冠突散囊菌孢子悬液，将所述姜黄原料与无机盐缓冲液混合形成发酵原料，而后将所述冠突散囊菌孢子悬液种至所述发酵原料中进行发酵。
在可选的实施方式中，活化包括：将所述冠突散囊菌种接种于活化培养基内进行活化培养，而后，收集成熟菌落形成所述冠突散囊菌孢子悬液；
优选地，活化培养的条件包括：温度为30-35℃，湿度为40-60％，时间为7-8天；
优选地，以质量百分比计，所述活化培养基包括：10-20％的马铃薯浸粉、40-45％的葡萄糖和40-45％的琼脂的PDA培养基。
在可选的实施方式中，所述冠突散囊菌孢子悬液的浓度为1×106-1×107cfu/mL。
在可选的实施方式中，所述姜黄原料与所述冠突散囊菌孢子悬液的比例为10-20g：10mL。
在可选的实施方式中，所述无机盐缓冲液为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾配制而成的溶液；
形成所述发酵原料的条件包括：所述无机盐缓冲液的初始pH为5.0-6.0，每10g所述姜黄原料对应添加0.7-0.8g磷酸二氢钾和0.05-0.1g磷酸氢二钾。
在可选的实施方式中，发酵条件包括：温度为25-35℃，湿度为50％-80％，发酵时间为7-8天。
在可选的实施方式中，发酵前对所述姜黄原料进行预处理。
在可选的实施方式中，预处理包括对所述姜黄原料进行除杂、粉末和灭菌处理。
在可选的实施方式中，所述灭菌为高压灭菌；
优选地，所述高压灭菌的条件包括：温度为121-135℃，灭菌时间为20-40分钟。
第二方面，本发明提供一种发酵姜黄，其通过所述前述实施方式任一项所述的发酵姜黄的制备方法制备得到。
本发明具有以下有益效果：本发明实施例利用冠突散囊菌对姜黄进行发酵能够有效减少得到的发酵姜黄中含有的挥发油成分，大大减小得到的发酵姜黄的刺激性气味；同时通过微生物转化技术，能有效增加发酵姜黄中水溶性更高的姜黄素类物质，使发酵姜黄活性成分整体生物利用度有效提高。并其发酵姜黄具有更好的调节糖脂代谢作用、抗肿瘤作用、抗风湿性关节炎作用、抗氧化应激作用和调节肠道菌群作用等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实验例1的发酵姜黄的检测结果图；
图2为本发明对比例13的发酵姜黄的检测结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供一种发酵姜黄的制备方法，包括：
S1、姜黄原料预处理；
对姜黄原料除杂、清洗、烘干、粉碎得到姜黄干粉末，并收集于容器中，备用。
对姜黄干粉末进行灭菌处理，现有技术中的灭菌处理都在本发明实施例的保护范围内，但是优选为高压灭菌处理，其中，高压灭菌处理的条件包括：温度为121-135℃，灭菌时间为20-40分钟。采用上述灭菌方法以及灭菌条件更有利于姜黄的灭菌效果，又尽可能地减少灭菌对姜黄内活性成分的影响，有利于后续的发酵。
将磷酸二氢钾和磷酸氢二钾混合，并调节而二者的比例，使得形成的无机盐缓冲液的pH浓度为5.0-6.0。而后将上述姜黄干粉末与无机盐缓冲液混合形成发酵原料，其中，每10g所述姜黄原料对应添加0.7-0.8g磷酸二氢钾和0.05-0.1g磷酸氢二钾。
S2、活化冠突散囊菌种；
将纯净的冠突散囊菌种接种于活化培养基内进行活化培养，而后，收集成熟菌落形成所述冠突散囊菌孢子悬液；其中，活化培养的条件包括：温度为30-35℃，湿度为40-60％，时间为7-8天；以质量百分比计，所述活化培养基包括：10-20％的马铃薯浸粉、40-45％的葡萄糖和40-45％的琼脂的PDA培养基。采用上述活化条件有利于得到性能更优良的冠突散囊菌孢子，继而有利于后续对姜黄的发酵。
且得到的冠突散囊菌孢子悬液的浓度为1×106-1×107cfu/mL。采用上述浓度有利于后续的发酵。
S3、发酵；
将上述姜冠突散囊菌孢子悬液接种至发酵原料中进行发酵，其中，姜黄干粉末与所述冠突散囊菌孢子悬液的比例为10-20g：10mL。发酵条件包括：温度为25-35℃，湿度为50％-80％，发酵时间为7-8天。
采用上述发酵条件有利于姜黄进行发酵，有利于提升得到的发酵姜黄的性能。
将发酵完成，将发酵姜黄粉末再次烘干，然后放入密封袋中真空保存，即得成品。
本发明实施例提供一种发酵姜黄，其通过上述发酵姜黄的制备方法制备得到。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本发明实施例提供一种发酵姜黄的制备方法，包括：
S1、姜黄原料预处理；
对姜黄原料除杂、清洗、烘干、粉碎得到姜黄干粉末。称取15克姜黄干粉末，而后在温度为121℃的条件下高压灭菌20分钟。
后取0.8g磷酸二氢钾和0.05g磷酸氢二钾，溶解于5mL无菌水配制成pH为5.0的磷酸缓冲液，加入上述15克姜黄粉末中并混匀，制得发酵原料，备用。
S2、活化冠突散囊菌种；
将纯净的冠突散囊菌种接种于活化培养基内进行活化培养，而后，收集成熟菌落形成所述冠突散囊菌孢子悬液；其中，活化培养的条件包括：温度为30℃，湿度为50％，时间为7天；所述活化培养基包括：12％的马铃薯浸粉、45％的葡萄糖和43％的琼脂的PDA培养基，得到的冠突散囊菌孢子悬液浓度为4×106cfu/mL。
S3、发酵；
将10克发酵原料与10毫升的上述冠突散囊菌孢子悬液混合进行发酵，发酵条件包括：温度为30℃，湿度为70％，时间为7天。
将发酵完成的发酵粉末进行冷冻干燥处理，得成品，密封保存。
试验例1
基于飞行时间液质联用仪分析对姜黄素类成分进行鉴定：
待测样品的制备：取干燥样品约100mg，精确称量，加入5mL80％甲醇超声提取10min，然后4000rpm离心，取上清液。此步骤分别使用50％甲醇和纯甲醇各重复提取一次，合并三次提取液，经0.22μm微孔滤膜过滤得待测样品。
仪器型号：Waters ACQUITY UPLC M-Class system。
色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18反相色谱柱(100×2.1mm,1.7μm)；流速：0.3mL·min-1；柱温：40℃；进样量：2.0μL；流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为乙腈，色谱洗脱梯度：0.01min,20％B；10min,35％B；30min,55％B；40min,95％B；43min,95％B；43.1min,20％B；46min,20％B。
质谱条件：电喷雾离子源；MSe模式采集一级和二级质谱解离碎片；ESI离子源温度：100.0℃；电喷雾电压：3kV；干燥气：流速600L·h-1，温度250℃；锥孔气流速：50L·h-1；一级碰撞解离能量：10V；二级碰撞解离能量：30V；一级和二级全扫描质量数范围为：m/z100-1000。
试验例2
样品药理活性指标体外测量：
(1)体外α葡萄糖苷酶抑制率测量：
待测样品的制备：同试验例1。
样品测定：首先配制浓度为0.1mol·L-1，PH为6.8的磷酸缓冲液(PBS)，作为测量过程中使用的溶剂。取50μL样品和200μLPBS与50μLα葡萄糖苷酶(1U·mL-1)混合，在37℃下孵育15min。再将150μL对硝基苯酚-β-葡萄糖醛酸苷(p-NPG，5mmol·L-1)作为底物加入反应体系，在37℃下反应20min。最后加入300μL碳酸钠(0.2mol·L-1)终止反应。未加入待测样品的混合体系作为阴性对照。样品的吸光度使用酶标仪在405nm波长下进行测量，并计算抑制率。
计算公式：
其中，A1为加入供试品反应后溶液的吸光度，A0为阴性对照样品的吸光度。
(2)体外自由基清除率测量：
待测样品的制备：同试验例1。
样品测定：以浓度95％甲醇作为测量过程中使用的溶剂，将1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)配制成浓度为0.1mmol·L-1的溶液。取50μL样品和250μL DPPH溶液，在室温下避光反应1h后进行测定。未加入待测样品的混合体系作为阴性对照。样品的吸光度使用酶标仪在515nm波长下进行测量，并计算清除率。
计算公式：
其中，A1为加入供试品反应后溶液的吸光度，A2为供试品溶液的吸光度，A0为阴性对照样品的吸光度。
试验例3
检测昆明种小鼠血脂各项指标：
待测样品的制备：对目标小鼠进行异戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，摘眼球取血，血液静置0.5h，5000r·min-1离心10min取血清1mL，-80℃低温冰箱存储血清。
(1)血清总胆固醇(TC)的测定：
血清总胆固醇含量的测定按照总胆固醇(T-CHO)测试盒的说明进行操作，具体操作如下：
TC含量测定操作表：
根据测定各孔吸光度值计算TC含量。
计算公式：
其中，A1为样品孔吸光度，A2为校准孔吸光度，A0为空白孔吸光度，C为校准品浓度(mmol·L-1)。
(2)低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的测定：
血清低密度脂蛋白胆固醇含量的测定按照低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测试盒的说明进行操作，具体操作如下：
LDL-C含量测定操作表：
根据测定各孔吸光度值计算LDL-C含量。
计算公式：
其中，A1为样品孔吸光度，A2为校准孔吸光度，A0为空白孔吸光度，C为校准品浓度(mmol·L-1)。
(3)高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的测定：
血清高密度脂蛋白胆固醇含量的测定按照高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测试盒的说明进行操作，具体操作如下：
HDL-C含量测定操作表：
根据测定各孔吸光度值计算HDL-C含量。
计算公式：
其中，A1为样品孔吸光度，A2为校准孔吸光度，A0为空白孔吸光度，C为校准品浓度(mmol·L-1)。
鉴定
利用飞行时间液质联用仪分析中的色谱条件检测实施例1中的姜黄干粉末(未发酵)以及发酵姜黄的成分的个数，以及不同水溶性物质的个数，试验方法参见试验例1，结果如下表和图1：
注：根据飞行时间液质联用仪分析检测使用的流动相梯度，将早于30％乙腈出峰的化合物定义为高水溶性，将在30％乙腈和45％乙腈出峰的化合物定义为中水溶性，将晚于45％乙腈出峰的化合物定义为低水溶性。根据上述表格可知，根据飞行时间液质联用仪分析中的色谱条件，将姜黄素类成分按照保留时间分成高水溶性组、中水溶性组和低水溶性组。发现发酵后样品在高水溶性组中有7个成分含量显著性增加。
实施例2-3
参照实施例1提供的制备方法制备发酵姜黄，区别仅在于活化培养冠突散囊菌种的温度不同，具体如下表：
根据上表可知，冠突散囊菌种在温度30-33℃时，长势最好。其中在30℃时，菌落直径最大，菌落数最多。
实施例4-8
参照实施例1提供的制备方法制备发酵姜黄，区别仅在于活化培养冠突散囊菌种的湿度不同，具体参见下表：
根据上表可知，冠突散囊菌种在湿度40％-60％时，长势没有明显区别。其中在50℃时，菌落直径最大，菌落数较多。
实施例9-10
参照实施例1提供的制备方法制备发酵姜黄，区别仅在于活化培养冠突散囊菌种的时间不同，具体参见下表：
根据上表可知，冠突散囊菌种在7天内逐渐生长至成熟期，其中通过菌落直径和颜色可以判断第7天为最佳采集时间。
实施例11-实施例14
参照实施例1提供的制备方法制备发酵姜黄，区别仅在于发酵条件不同，此方法参见试验例2，具体地发酵原料与孢子悬液的质量比例不同，参见下表：
根据上表可知，使用此方法发酵，姜黄发酵原料质量在10g-20g内，冠突散囊菌能保持较高的转化能力，并具有较高的α葡萄糖苷酶抑制率和自由基清除率。
实施例15-实施例17
参照实施例1提供的制备方法制备发酵姜黄，区别仅在于发酵条件不同，此方法参见试验例2，具体地发酵温度不同，具体参见下表：
根据上表可知，在发酵温度25-35℃范围内，冠突散囊菌能保持较高的转化能力，并具有较高的α葡萄糖苷酶抑制率和自由基清除率。
实施例18-20
参照实施例1提供的制备方法制备发酵姜黄，区别仅在于发酵条件不同，此方法参见试验例2，具体地发酵湿度不同，具体参见下表：
根据上表可知，在发酵湿度50％-80％范围内，冠突散囊菌能保持较高的转化能力，并具有较高的α葡萄糖苷酶抑制率和自由基清除率。
对比例13：参照实施例1提供的制备方法制备发酵姜黄，区别仅在于将冠突散囊菌替换为红曲霉菌，得到的发酵姜黄中的活性成分的个数参见图2。
分别检测对比例13和实施例1得到的发酵姜黄的α葡萄糖苷酶抑制率和自由基清除率，此方法参见试验例2，结果见下表：
根据上表可知，冠突散囊菌发酵姜黄相比红曲霉菌发酵姜黄以及未发酵姜黄，具有更高的α葡萄糖苷酶抑制率和自由基清除率，一定程度上反应冠突散囊菌发酵姜黄具有更好的调节血糖和自由基清除的药理活性。
分别检测对比例13和实施例1得到的发酵姜黄的对高脂血症小鼠血脂代谢调节药理活性，此方法参见试验例3，结果如下表：
根据上表可知，冠突散囊菌发酵姜黄相比红曲霉菌发酵姜黄以及未发酵姜黄，能显著性调节高脂血症小鼠血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，说明冠突散囊菌发酵姜黄对高脂血症小鼠血脂具有更好的调节作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。