阅读说明：本技术 一种红细胞渗透脆性测定方法及其试剂盒 (A kind of osmotic fragility measuring method and its kit ) 是由 廉正鑫 祁晖 于 2019-09-04 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种红细胞渗透脆性测定方法及其试剂盒,其中测定方法包括：S1、在两个比色杯中分别加入等量的不同浓度的低渗透压盐溶液,其中一管是不完全溶血管,其加入的低渗透压盐溶液不能使全血完全溶血,另一管是完全溶血管,其加入的低渗透压盐溶液可以使全血完全溶血；S2、分别往两个比色杯中加入等量全血,混匀后,立即检测不完全溶血管中混合液的散射光值A0、完全溶血管中混合液的散射光值B0；S3、在溶血结束后的某一特定时间,测定不完全溶血管中混合液的的散射光值A1、完全溶血管中混合液的B1；S4、根据公式：溶血百分率%=(A0-A1)/(B0-B1)×100%计算不完全溶血管的溶血百分率。该测定方法的检测结果更精确,且能够实现结果标准化和一致性。(The present invention provides a kind of osmotic fragility measuring method and its kit, wherein measuring method include: S1, be separately added into two cuvettes equivalent various concentration Hyposmolality salting liquid, wherein a pipe is incomplete haemolysis pipe, its Hyposmolality salting liquid being added cannot make whole blood complete hemolysis, another pipe is complete hemolysis pipe, and the Hyposmolality salting liquid being added can make whole blood complete hemolysis；S2, equivalent whole blood is added into two cuvettes respectively, after mixing, detect immediately the scattering light value A0 of mixed liquor in incomplete haemolysis pipe, in complete hemolysis pipe mixed liquor scattering light value B0；S3, a certain specific time after haemolysis, measure the scattering light value A1 of mixed liquor in incomplete haemolysis pipe, in complete hemolysis pipe mixed liquor B1；S4, according to formula: percentage of hemolysis %=(A0-A1)/(B0-B1) × 100% calculates the percentage of hemolysis of incomplete haemolysis pipe.The testing result of the measuring method is more accurate, and can be realized result standardization and consistency.)

一种红细胞渗透脆性测定方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及红细胞渗透脆性测定技术领域，具体涉及一种红细胞渗透脆性测定方法及其试剂盒。

背景技术

人体内成熟红细胞的正常寿命约为120天，存活期间在循环体系中约穿行500公里，多次挤过比自身直径小得多的血管和孔隙，因此红细胞必须具有良好的韧性和变形能力。红细胞主要靠红细胞膜来维持变形性和稳定性，若膜上某种蛋白发生变化，可引发溶血，如遗传性球形红细胞增多症。

红细胞渗透脆性是检验红细胞膜缺陷的一个临床常用指标，红细胞渗透脆性试验是测定红细胞在不同浓度的低渗盐水溶液内，所能承受的吸水膨胀能力。正常的红细胞为双凹圆盘形，若将红细胞置于低渗溶液中，因细胞内外存在渗透压差，水分子进入红细胞，使其发生肿胀，乃至红细胞破裂而发生溶血。红细胞在低渗透压盐溶液中出现溶血的特征即为红细胞渗透脆性，其主要取决于红细胞的表面积与体积之比。表面积大而体积小者对低渗盐水容易的抵抗力较大(脆性较小)，反之则抵抗力较小（脆性增加）。（尚红、王毓三、申子瑜，全国临床检验操作规程（第4版）[M].北京:人民卫生出版社，2015.66）。

渗透脆性增加见于遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症和部分遗传性口形红细胞增多症，亦可见于自身免疫性溶血性贫血。渗透脆性降低见于各型珠蛋白生成障碍性贫血，HbC、HbD、HbE病，缺铁性贫血，地中海贫血、脾切除术后及其他一些红细胞膜异常的疾病如肝脏疾病等。（尚红、王毓三、申子瑜，全国临床检验操作规程（第4版）[M].北京:人民卫生出版社，2015.66）

目前临床上检测红细胞渗透脆性的方法主要有以下三种：

一、传统手工法（尚红、王毓三、申子瑜，全国临床检验操作规程（第4版）[M].北京:人民卫生出版社，2015.66）：

检测步骤如下：

（1）取清洁干燥小试管14支，各管按表1加蒸馏水和10g/L氯化钠溶液。

（2）用干燥灭菌注射器取被检者静脉血1mL，针头斜面向上，平执注射器，通过针头在每管加入1滴全血，轻轻摇匀；以同样方法取正常人血加于正常对照组试管。

（3）将各管静置室温中2小时，从高浓度开始观察全部14管溶血现象。

试管号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
															蒸馏水（滴）	20	19	18	17	16	15	14	13	12	11	10	9	8	7
10g/LNaCl(滴)	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18
															氯化钠浓度（g/L）	2.0	2.4	2.8	3.2	3.6	4.0	4.4	4.8	5.2	5.6	6.0	6.4	6.8	7.2

表1 氯化钠溶液稀释表

二、改良Sanford法（简易半定量法）（王维维、袁向亮、费奇力、沈立松，流式细胞术快速测定红细胞渗透脆性的应用[J].检验医学，2016;31(10)，911-915）：

检测步骤如下：

取13支试管编号，用9g/L NaCl和无菌水配制成下述浓度的NaCl溶液：1.0 g/L、2.0 g/L、3.0 g/L、3.5 g/L、4.0 g/L、4.5 g/L、5.0 g/L、5.5 g/L、6.0 g/L、6.5 g/L、7.0 g/L、7.5g/L、8.5 g/L；

每管加肝素抗凝全血50μl，轻轻颠倒混匀，室温（20℃）放置30min；

将各管混匀1次，3000×g离心3min，取上清200μl至96孔平底板，测定各管上清液吸光度A值；

以1.0 g/L NaCl完全溶血管的A值为100%，由各管的A值计算相应的溶血百分率（%）=（测定管A值/完全溶血管A值）×100%，以出现50%溶血的NaCl浓度为红细胞脆性判断浓度；

结果判定：正常红细胞溶血的NaCl浓度范围为4.00-4.45g/L，当待测红细胞溶血的NaCl浓度高于此范围上限时，判定为红细胞渗透脆性增高。

三、一管法：该方法是杜传书在手工法的基础上进行创新的一种方法，采用了仪器进行判读，并通过广州市米基医疗器械有限公司进行了商业化生产和销售，是目前医院广泛接纳并使用的一种方法。具体测量方法如下：

（1）配制某特定浓度的低渗透压盐溶液和溶血剂。

（2）取两份等量的红细胞悬浮液分别置于某特定浓度的低渗透压盐溶液和溶血剂中，混匀。

（3）37℃温浴5min后。

（4）使用530nm波长分光光度计分别测定两份溶液的吸光度A和C。

（5）溶血率%=（1-A/C）×100%。

（6）参考值：<65%。

除此之外，还有一些科研人员提出了新的或者改良的红细胞渗透脆性检测方法，但这些技术尚未在临床医院普及，包括：

1、基于微流控芯片的红细胞渗透脆性检验方法（叶大田、李雷、周亚浩.用于检验红细胞渗透脆性的微流控芯片:中国，101464458B[P].2013-01-09.）：

检测步骤如下：

（1）将血样通过血样进口输入微流控芯片内的不同检测池中；

（2）将两种不同浓度的NaCl溶液以相同的流速同时从上述两个溶液进口输入微流控芯片内，与检测池中的血样混合；

（3）用显微镜观察并拍摄检测池中的红细胞照片；

（4）从红细胞照片中识别每个检测池中完整红细胞并计数。

2、不透光动态比浊法：（杨鉴波. 一种红细胞渗透脆性的全自动测定仪器:中国，103033482A [P].2013-04-10.）：

检测步骤如下：

（1）准备好采血管、内置3.5g/L的NaCl-PBS缓冲液1.5mL的多联比色皿；

（2）仪器自动采样，并加样至含有1.5mL浓度为3.5g/L的NaCl-PBS缓冲液的比色皿，混匀。

（3）仪器自动将比色皿推至检测器中，检测混匀后首秒和末秒（经验值为40秒）时混合液的吸光度值。

（4）溶血率%=（测定首秒时的吸光度值-测定末秒时的吸光度值）/测定首秒时的吸光度值×100%。

3、流式细胞术（王维维、袁向亮、费奇力、沈立松，流式细胞术快速测定红细胞渗透脆性的应用[J].检验医学，2016;31(10)，911-915）：

检测步骤如下：

制备红细胞悬液：取全血用生理盐水经2步法稀释制的；

将上述悬液混匀上流式细胞仪分析（设门分析法），先获取细胞总数，再加入一定体积的无菌水（体积不同，渗透力不同），导致渗透性溶血，通过计算红细胞残留百分比来表示细胞渗透溶血的程度。按阳性对照组的红细胞残留百分比范围进行判定，当待测红细胞残留百分比低于其上限时判定红细胞渗透脆性增高。

4、散射比浊法（速率法）：（深圳普门科技有限公司，一种基于散射比浊技术的红细胞渗透脆性测定方法:中国，CN 105928907A[P].2016.0907.未授权）

检测步骤如下：

（1）在散射比浊分析模组的比色杯中，加入低渗透压的缓冲盐溶液；

（2）往上述比色杯中加入红细胞，搅拌混匀后，测定混合液的散射光值A0；

(3) 在混合液发生溶血后，达到溶血平衡状态前，测定混合液的散射光值A1；

（4）根据公式：溶血率%=（A0-A1）/A0×100%，计算溶血率，输出结果。

上述几种方法中，传统手工法和改良Sanford法是手工法，手工操作比较繁杂且耗时长；且受实验操作影响大：要求配制的各NaCl溶液必须准确，操作过程需减少机械振动，避免人为溶血；基于微流控芯片的红细胞渗透脆性检验方法，其仪器成本昂贵（微流控芯片+显微镜+电脑+软件），不利于普及；流式细胞术则存在仪器成本昂贵、仪器操作复杂，且需要预实验确定合适的渗透力，不满足临床实际使用需求。

一管法相对于手工法来说，大大减少了操作步骤，同时也缩短了检测时间，但是使用530nm波长测试溶液的吸光度时，未完全溶血的红细胞和细胞膜碎片会对溶液的吸光度产生干扰，导致结果不准确。

不透光动态比浊法，在一管法的基础上，做了进一步的改进，更换了对从红细胞溶出的游离血红蛋白等可溶有色物质有较强吸收的波长（530nm），采用对从红细胞溶出的游离血红蛋白等可溶有色物质有较弱吸收的特定波长作为测定波长（840-1200nm），测试的是溶液不透光动态浊度，即不透光动态比浊法（透射比浊法）。然而，虽然840-1200nm的波长对游离血红蛋白等可溶物质吸收较弱，但是依然会产生吸收，也会对检测结果造成影响。

散射比浊法（速率法），其反映的是红细胞溶血平衡状态前（即未完全溶血前）某一个时间点的溶血率。由于红细胞在低渗透压缓冲盐溶液中的溶血速度很快。不同时间点的溶血率是不一样的，速率法对时间控制要求较高，重复性难以保证。另外，速率法无法反映溶血全过程。

发明内容

为解决上述问题，本申请提供一种红细胞渗透脆性测定方法及其试剂盒，通过该测定方法得到的结果更加精确，且能够实现检测结果的标准化和一致性。

根据第一方面，一实施例中提供一种红细胞渗透脆性测定方法，包括以下步骤：

S1、在两个比色杯中分别加入等量的不同浓度的低渗透压盐溶液，其中一管是不完全溶血管，其加入的低渗透压盐溶液不能使全血完全溶血，另一管是完全溶血管，其加入的低渗透压盐溶液可以使全血完全溶血；

S2、分别往两个比色杯中加入等量全血，混匀后，立即检测不完全溶血管中混合液的散射光值A0、完全溶血管中混合液的散射光值B0；

S3、在溶血结束后的某一特定时间，测定不完全溶血管中混合液的的散射光值A1、完全溶血管中混合液的B1；

S4、根据公式：溶血百分率%=（A0-A1）/（B0-B1）×100%计算不完全溶血管的溶血百分率。

优选地，不完全溶血管的低渗透压盐溶液包含无机盐，以及缓冲液和防腐剂中的至少一种。

优选地，完全溶血管的低渗透压盐溶液包含无机盐、缓冲液和防腐剂中的至少一种。

优选地，无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸钠、硫酸镁中的至少一种。

优选地，防腐剂选自Proclin300和叠氮钠中的至少一种。

优选地，缓冲液选自磷酸盐缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、HEPES缓冲液中的至少一种。

优选地，不完全溶血管的低渗透压盐溶液中，无机盐采用浓度为3.5g/L-4.5g/L的氯化钠，或渗透压相当的其他无机盐。

优选地，完全溶血管的低渗透压盐溶液是蒸馏水，或纯水，或浓度为0.1g/L-2g/L的氯化钠溶液，或其渗透压与0.1g/L-2g/L的氯化钠溶液的渗透压相当的其他缓冲盐溶液。

优选地，全血和不完全溶血管中低渗透压盐溶液的体积比例为1:50-500。

根据第二方面，一实施例中提供一种适用于上述红细胞渗透脆性测定方法的试剂盒，包括：不完全溶血管的低渗透压盐溶液和完全溶血管的低渗透压盐溶液，不完全溶血管的低渗透压盐溶液包含无机盐，以及缓冲液和防腐剂中的至少一种，完全溶血管的低渗透压盐溶液包含无机盐、缓冲液和防腐剂中的至少一种。

依据上述实施例，由于使用了散射比浊技术，相对于透射比浊技而言，能够彻底消除从红细胞溶出的游离血红蛋白等可溶有色物质对光的吸收的影响，使结果更加准确；由于使用了散射比浊终点法，在溶血完成后再检测散射光值是，其检测结果受时间影响较小，重复性高；由于采用了双管法，以完全溶血管的散射光变化值为100%作为基准，计算得到特定浓度的低渗透压的盐溶液管的全血溶血百分率，从而实现了检测结果的标准化和一致性。

附图说明

图1为本发明的实施例一中正常人全血在不同浓度的氯化钠溶液下的溶血曲线；

图2为本发明的实施例一中贫血患者全血在不同浓度的氯化钠溶液下的溶血曲线。

具体实施方式

说明书中方法描述的各步骤也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。

本发明的红细胞渗透脆性测定原理如下：

在某一特定低渗透压盐溶液中，按一定比例加入全血样本，混匀后，全血样本中的红细胞充分分散于溶液中。由于混合液中红细胞内部的渗透压比低渗透压盐溶液的渗透压高，水分子通过细胞膜进入红细胞内部，当水分子渗透到红细胞内部达到一定程度时，红细胞发生膨胀破裂而溶血。在低渗透压盐溶液的浓度一定、全血和低渗透压盐溶液的比例一定的情况下，红细胞渗透脆性越大，其溶血百分率越大，即红细胞渗透脆性与溶血百分率成正比关系。通过散射比浊终点法测定特定低渗透压盐溶液的散射值，计算得到溶血百分率，从而直观反映红细胞渗透脆性情况。为了进一步实现检测结果的标准化和一致性，引入完全溶血管，以完全溶血管的散射光变化值为100%作为基准，计算得到的特定浓度的低渗透压的盐溶液管的全血溶血百分率更加精准。

本发明提供一种红细胞渗透脆性测定方法及其试剂盒。

一方面，本发明提供一种红细胞渗透脆性测定方法，包括以下步骤：

S1、在两个比色杯中分别加入等量的不同浓度的低渗透压盐溶液，其中一管是不完全溶血管，其加入的特定浓度的低渗透压盐溶液不能使全血完全溶血，另一管是完全溶血管，其加入的低渗透压盐溶液可以使全血完全溶血。其中，不完全溶血管的低渗透压盐溶液包含无机盐，以及缓冲液和防腐剂中的至少一种，即不完全溶血管的低渗透压盐溶液可包含无机盐和缓冲液，或者包含无机盐和防腐剂，或者包含无机盐、缓冲液和防腐剂。无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸钠、硫酸镁中的至少一种。在一具体实施例中，无机盐采用浓度为3.5g/L-4.5g/L的氯化钠，或渗透压相当的其他无机盐。防腐剂选自Proclin300和叠氮钠中的至少一种。缓冲液选自磷酸盐缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、HEPES缓冲液中的至少一种。

完全溶血管的低渗透压盐溶液包含无机盐、缓冲液和防腐剂中的至少一种。其中，无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸钠、硫酸镁中的至少一种。防腐剂选自Proclin300和叠氮钠中的至少一种。缓冲液选自磷酸盐缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、HEPES缓冲液中的至少一种。在一具体实施例中，完全溶血管的低渗透压盐溶液是蒸馏水，或纯水，或浓度为0.1g/L-2g/L的氯化钠溶液，或其渗透压与0.1g/L-2g/L的氯化钠溶液的渗透压相当的其他缓冲盐溶液。

S2、分别往两个比色杯中加入等量全血，全血和不完全溶血管中低渗透压盐溶液的体积比例为1:50-500，全血和完全溶血管中低渗透压盐溶液的体积比例也是1:50-500。混匀后，立即检测不完全溶血管中混合液的散射光值A0、完全溶血管中混合液的散射光值B0。其中，混匀方式可以是搅拌棒搅拌混匀方式、磁力搅拌混匀方式或气泡混匀方式中的一种或多种。测定散射光值可采用波长为400-1200nm的光源，所使用的光源为激光光源、LED光源或普通钨灯光源的其中一种。

S3、在溶血结束后的某一特定时间，测定不完全溶血管中混合液的的散射光值A1、完全溶血管中混合液的B1。上述特定时间根据低渗透压盐溶液的渗透压的不同以及，全血和特定浓度的低渗透压盐溶液的比例的不同而有所差异，较佳时间为加样后40S以上，如40S、50S、60S、70S、80S、90S、100S、120S、150S、180S、200S等。

S4、以溶血结束后完全溶血管的散射变化值(B0-B1）为100%作为基准，计算溶血百分率。根据公式：溶血百分率%=（A0-A1）/（B0-B1）×100%计算得到不完全溶血管的溶血百分率。

另一方面，本发明提供一种适用于上述红细胞渗透脆性测定方法的试剂盒，包括：不完全溶血管的低渗透压盐溶液和完全溶血管的低渗透压盐溶液，不完全溶血管的低渗透压盐溶液包含无机盐，以及缓冲液和防腐剂中的至少一种。其中，不完全溶血管的低渗透压盐溶液包含无机盐，以及缓冲液和防腐剂中的至少一种，即不完全溶血管的低渗透压盐溶液可包含无机盐和缓冲液，或者包含无机盐和防腐剂，或者包含无机盐、缓冲液和防腐剂。无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸钠、硫酸镁中的至少一种。在一具体实施例中，无机盐采用浓度为3.5g/L-4.5g/L的氯化钠，或渗透压相当的其他无机盐。防腐剂选自Proclin300和叠氮钠中的至少一种。缓冲液选自磷酸盐缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、HEPES缓冲液中的至少一种。

其中，完全溶血管的低渗透压盐溶液包含无机盐、缓冲液和防腐剂中的至少一种。其中，无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸钠、硫酸镁中的至少一种。防腐剂选自Proclin300和叠氮钠中的至少一种。缓冲液选自磷酸盐缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、HEPES缓冲液中的至少一种。在一具体实施例中，完全溶血管的低渗透压盐溶液是蒸馏水，或纯水，或浓度为0.1g/L-2g/L的氯化钠溶液，或其渗透压与0.1g/L-2g/L的氯化钠溶液的渗透压相当的其他缓冲盐溶液。

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

实施例一

本实施例提供一种红细胞渗透脆性测定方法，具体步骤包括：

S0、配备不完全溶血管低渗透压盐溶液和完全溶血管低渗透压盐溶液。

不完全溶血管低渗透压盐溶液包含：

4g/L 氯化钠

0.1%(v/v) Proclin300

完全溶血管低渗透压盐溶液包含：

1g/L 氯化钠

0.1%(v/v) Proclin300

S1、在两个比色杯中分别加入1000uL的不完全溶血管低渗透压盐溶液和完全溶血管低渗透压盐溶液；

S2、往上述两个比色杯中分别加入6uL的全血，混匀后，开始计时，并立即使用散射分析仪，以波长为600nm的激光作为光源，检测不完全溶血管中混合液的散射光值A0、完全溶血管中混合液的散射光值B0。

S3、在溶血结束后的180S，测定不完全溶血管中混合液的的散射光值A1、完全溶血管中混合液的B1。

S4、根据公式：溶血百分率%=（A0-A1）/（B0-B1）×100%计算不完全溶血管的溶血百分率。

实施例二

本实施例提供一种适用于上述红细胞渗透脆性测定方法的试剂盒，包括：不完全溶血管的低渗透压盐溶液和完全溶血管的低渗透压盐溶液。

不完全溶血管低渗透压盐溶液包含：

4g/L 氯化钠

0.1%(v/v) Proclin300

完全溶血管低渗透压盐溶液包含：

1g/L 氯化钠

0.1%(v/v) Proclin300。

使用实施例一所述的测定方法进行下列测试：

a.反应曲线

分别用正常人全血和贫血患者全血，通过上述实施例一的测定方法进行红细胞渗透脆性测定，使用信号采集软件采集反应过程的信号值，得到如图1和图2所示的溶血曲线。

从图1和图2可看出，在相同的低渗透压盐溶液中，正常人样本的红细胞溶血速度比阳性样本（贫血患者样本）红细胞溶血速度快，红细胞渗透脆性不同，其溶血程度也不同，根据该溶血曲线，通过计算公式得到的溶血百分率也不同。

b.临床符合率

在医院收集40例样本，分别使用传统手工法（“金标准”）及本发明实施例一方法进行测试，测试结果如下：

表1 临床样本检测结果

表2 配对计数资料统计表

从表1和表2的结果可以看出，用传统手工法（“金标准”）和实施例一方法及试剂同时检测40份临床样本，阳性符合率为11/11=100%，阴性符合率为29/29=100%，总符合率为40/40=100.0%；

观察一致性：Pa=(a+d)/n=40/40=1.0000；机遇一致性：Pe=((a+b)(a+c)+(c+d)(b+d))/n2=（11*11+29*29)/40^2=0.60125；Kappa系数=(Pa-Pe)/(1-Pe)=1.0000>0.8。说明实施例一方法及试剂和传统手工法（“金标准”）的检测结果具有高度的一致性。

c.重复性

取阳性样本和阴性样本各1个，使用实施例一方法及试剂分别测试10次，测试结果如下。

表3 重复性测试结果

从表3的结果可以看出，阳性样本和阴性样本的测试结果变异系数均小于3%，标准差小于0.01，说明该测定方法具有很好的重复性。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。