阅读说明：本技术 一种对间充质细胞标记和示踪方法 (A kind of pair of mesenchymal cell label and tracing method ) 是由 孙桂珍 于 2019-10-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种对间充质细胞标记和示踪方法,包括以下方法步骤,S1,将含有目标基因的间充质细胞转入到营养培养基中,诱导细胞进行多次分裂；S2,然后向培养液中加入甘油或二甲亚砜保护剂,置于液氮中,渗透压控制250～325mmol/L；S3,然后切取间充细胞置于100％葡萄糖中10s,充分浸透后膜变为半透明状,然后进行振摇3min；S4,利用荧光染料对其进行充分标记；S5,采用同位素示踪方法进行示踪。本发明的方法采用了多种荧光染料进行标记,整体灵敏度高,方法简便,简化了实验过程,定位定量准确,符合生理条件,同时同位素示踪方法能快速进行定位,并且辐射作用小,准确检测,整个方法较为科学效率,值得推广。(The invention discloses a kind of pair of mesenchymal cell label and tracing methods, comprise the following methods, S1, the mesenchymal cell containing target gene are transferred in nutrient medium, inducing cell is repeatedly divided；Then glycerol or dimethyl sulfoxide protective agent are added into culture solution, is placed in liquid nitrogen by S2, osmotic pressure controls 250~325mmol/L；Then S3 cuts cellula intersitialis and is placed in 10s in 100% glucose, full penetration caudacoria becomes translucent, then carries out shaking 3min；S4 sufficiently marks it using fluorescent dye；S5 carries out tracer using tagging method.Method of the invention uses a variety of fluorescent dyes and is marked, overall sensitivity is high, method is easy, simplifies experimentation, positioning and quantitative is accurate, meet physiological condition, tagging method can be positioned quickly simultaneously, and radiation effects is small, accurate to detect, the more scientific efficiency of entire method, is worthy to be popularized.)

一种对间充质细胞标记和示踪方法

技术领域

本发明涉及医疗细胞工程技术领域，尤其是一种对间充质细胞标记和示踪方法。

背景技术

间充质细胞是分化程度很低的细胞，核大，卵椭圆，核仁明显，胞质呈弱嗜碱性。细胞质内除含有一定数量的线粒体之外，还有少量的粗面内质网、游离核糖体、高尔基体及散在的溶酶体和脂粒等。间充质的间质是无色透明的液体，细胞质内除含有一定数量的线粒体之外，还有少量的粗面内质网、游离核糖体、高尔基体及散在的溶酶体和脂粒等。间充质的间质是无色透明的液体。有很强的***和分化能力，在胚胎发育的过程中不仅是各种***的共同祖先，而且分化和发育成血管的内皮及平滑肌等其他种类的组织。在成年的动物的***中仍然可以看见一些具有发育潜力的间充质细胞。MSCs是干细胞家族的重要成员，可分化为脂肪、骨、软骨、心肌等多种组织细胞，在修复骨骼、软骨及受损心脏细胞，治疗炎症和免疫系统疾病方面具有很大潜力。然而，目前在美国使用MSCs进行临床治疗的数百个病例中，结果喜忧参半：有的病人反应良好，有的病人则没有反应。要弄清其原因，研究人员需要在这些细胞进入人体后对其进行跟踪，看它们是否被移植到了合适位置。而要做到这一点，需利用超顺磁性氧化铁对比剂对细胞进行标记，并用磁共振成像技术对病人成像。

目前传统的对间充质细胞的标记方法和示踪方法，效率较低，耗时较长，并且准确性较低，针对以上，在这里我们提出一种对间充质细胞标记和示踪方法。

发明内容

本发明针对背景技术中的不足，提供了一种对间充质细胞标记和示踪方法。

本发明为解决上述技术不足，采用改性的技术方案，一种对间充质细胞标记和示踪方法，包括以下方法步骤，S1,将含有目标基因的间充质细胞转入到营养培养基中，诱导细胞进行多次***；

S2，然后向培养液中加入甘油或二甲亚砜保护剂，置于液氮中，渗透压控制250～325mmol/L；

S3，然后切取间充细胞置于100％葡萄糖中10s，充分浸透后膜变为半透明状，然后进行振摇3min；

S4，利用荧光染料对其进行充分标记；

S5，采用同位素示踪方法进行示踪。

作为本发明的进一步优选方式，步骤S4中，荧光染料标记法是使用某些能够结合到细胞膜或细胞内不同组织上的荧光染料进行观察，常用的主要有PKH26、DAPI、Dil、CFSE和荧光蛋白。

作为本发明的进一步优选方式，所述荧光蛋白标记技术是利用基因载体将荧光蛋白基因导入待标记细胞，通过筛选获得表达荧光蛋白的细胞，可通过荧光显微镜直接观察，而不需反应底物，荧光蛋白为可自发产生荧光的蛋白质，主要包括绿色荧光蛋白和其衍生物黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白，以及红色荧光蛋白；所述绿色荧光蛋白基因具有高效、稳定、无毒、易于检测特性，能在活细胞中直观地观察其表达，可较快筛选其修饰的细胞。

作为本发明的进一步优选方式，所述羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)是一种可穿过细胞膜的荧光染料,进入细胞后不可逆地与细胞内具有非酶促水解作用的梭基荧光素二醋酸盐基团结合，偶联到细胞蛋白质上，且不会引起细胞发生凋亡或死亡，CFSE进入细胞后就不能从细胞中释出,并与胞内蛋白和膜表面蛋白结合，CFSE可用于活细胞标记，在细胞传代时均匀地将标记的荧光分配到子代细胞中，细胞经CFSE染色后,在***增殖的过程中，标记的CFSE可平均分配到子代细胞中，使荧光在细胞***增殖过程中被逐漸稀释，荧光强度逐渐减弱，CFSE标记适用于短时期示踪。

作为本发明的进一步优选方式，所述PKH26是一种红色荧光染料，具有亲脂性，能够与细胞膜的脂质区域稳定结合，在标记条件下，PKH26不影响细胞的增殖和分化能力，当细胞***时，PKH26可平均地分配到2个子代细胞中，其荧光强度是亲代细胞的1/2,细胞膜能发出红色荧光，不干扰细胞膜表面标记物的表达，PKH26可应用于体内、外短期的细胞示踪。

作为本发明的进一步优选方式，步骤S5中，同位素示踪法是利用放射性核素作为示踪剂对研究对象进行标记的微量分析方法，利用同位素的放射特性对组织细胞进行放射自显影、显微镜观察计数、灰度测定等，观察细胞形态，对细胞功能进行判断；示踪标记的核素有³H-、¹²⁵I-.³²p-、⁹⁹Tc^m-,还包括以氚标记的脱氧胸腺嘧啶核苷，氚(³H)标记的脱氧胸腺嘧啶核苷是DNA的合成前体，能够有效地掺入到S期细胞的DNA中，氚能够放射低能量的β射线，对细胞染色体的影响较小，射线的射程7μm，在细胞外基本无辐射作用，对正常组织损伤小，射线半衰期12.3年。

本发明所达到的有益效果是：本发明的方法采用了多种荧光染料进行标记，整体灵敏度高，方法简便，简化了实验过程，定位定量准确，符合生理条件，同时同位素示踪方法能快速进行定位，并且辐射作用小，准确检测，整个方法较为科学效率，值得推广。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种技术方案：一种对间充质细胞标记和示踪方法，包括以下方法步骤，S1,将含有目标基因的间充质细胞转入到营养培养基中，诱导细胞进行多次***；

S2，然后向培养液中加入甘油或二甲亚砜保护剂，置于液氮中，渗透压控制250～325mmol/L；

S3，然后切取间充细胞置于100％葡萄糖中10s，充分浸透后膜变为半透明状，然后进行振摇3min；

S4，利用荧光染料对其进行充分标记；

S5，采用同位素示踪方法进行示踪。

步骤S4中，荧光染料标记法是使用某些能够结合到细胞膜或细胞内不同组织上的荧光染料进行观察，常用的主要有PKH26、DAPI、Dil、CFSE和荧光蛋白。

所述荧光蛋白标记技术是利用基因载体将荧光蛋白基因导入待标记细胞，通过筛选获得表达荧光蛋白的细胞，可通过荧光显微镜直接观察，而不需反应底物，荧光蛋白为可自发产生荧光的蛋白质，主要包括绿色荧光蛋白和其衍生物黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白，以及红色荧光蛋白；所述绿色荧光蛋白基因具有高效、稳定、无毒、易于检测特性，能在活细胞中直观地观察其表达，可较快筛选其修饰的细胞。

所述羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)是一种可穿过细胞膜的荧光染料,进入细胞后不可逆地与细胞内具有非酶促水解作用的梭基荧光素二醋酸盐基团结合，偶联到细胞蛋白质上，且不会引起细胞发生凋亡或死亡，CFSE进入细胞后就不能从细胞中释出,并与胞内蛋白和膜表面蛋白结合，CFSE可用于活细胞标记，在细胞传代时均匀地将标记的荧光分配到子代细胞中，细胞经CFSE染色后,在***增殖的过程中，标记的CFSE可平均分配到子代细胞中，使荧光在细胞***增殖过程中被逐漸稀释，荧光强度逐渐减弱，CFSE标记适用于短时期示踪。

所述PKH26是一种红色荧光染料，具有亲脂性，能够与细胞膜的脂质区域稳定结合，在标记条件下，PKH26不影响细胞的增殖和分化能力，当细胞***时，PKH26可平均地分配到2个子代细胞中，其荧光强度是亲代细胞的1/2,细胞膜能发出红色荧光，不干扰细胞膜表面标记物的表达，PKH26可应用于体内、外短期的细胞示踪。

步骤S5中，同位素示踪法是利用放射性核素作为示踪剂对研究对象进行标记的微量分析方法，利用同位素的放射特性对组织细胞进行放射自显影、显微镜观察计数、灰度测定等，观察细胞形态，对细胞功能进行判断；示踪标记的核素有³H-、¹²⁵I-.³²p-、⁹⁹Tc^m-,还包括以氚标记的脱氧胸腺嘧啶核苷，氚(³H)标记的脱氧胸腺嘧啶核苷是DNA的合成前体，能够有效地掺入到S期细胞的DNA中，氚能够放射低能量的β射线，对细胞染色体的影响较小，射线的射程7μm，在细胞外基本无辐射作用，对正常组织损伤小，射线半衰期12.3年。

本发明方法表格如下：表1

传统方法表格如下：表2

通过表1和表2明显，看出本发明更优。

综上述，本发明的方法采用了多种荧光染料进行标记，整体灵敏度高，方法简便，简化了实验过程，定位定量准确，符合生理条件，同时同位素示踪方法能快速进行定位，并且辐射作用小，准确检测，整个方法较为科学效率，值得推广。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。