阅读说明：本技术 一种测定人体神经丝轻链蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒及其制备方法 (A kind of magnetic microparticle chemiluminescence detection kit and preparation method thereof measuring human nerve silk light chain protein content ) 是由 王国武 郭健夫 王鹏 于 2019-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种测定人体神经丝轻链蛋白含量的磁微粒化学发光试剂盒及其制备方法,试剂盒包括：神经丝轻链蛋白测定R1试剂、R2试剂、磁分离试剂、校准品液系列和化学发光底物液。本发明采用的夹心法的反应模式,利用化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合的原理,定量检测人血清、血浆或脑脊液等多种样本中的神经丝轻链蛋白含量,确保了检测的灵敏度,本试剂盒与传统试剂盒相比灵敏度高、无污染、特异性强、操作简单、并且对样品的前处理要求低、可检测样本类型广泛、可快速高通量检测大批量样本,便于临床试剂应用。本发明为临床检测人血清中的神经丝轻链蛋白提供了一种更准确、精确、方便、快捷和简单的方法。(The invention discloses a kind of magnetic microparticle chemiluminescence kit and preparation method thereof for measuring human nerve silk light chain protein content, kit includes: neurofilament light chain protein determination R1 reagent, R2 reagent, Magneto separate reagent, calibration object liquid series and Chemoluminescent substrate.The reaction pattern for the sandwich method that the present invention uses, the principle that isolation technics combines is immunized with magnetic particle using chemiluminescence detection technology, neurofilament light chain protein content in a variety of samples such as quantitative detection human serum, blood plasma or cerebrospinal fluid, ensure the sensitivity of detection, this kit compared with conventional reagents box high sensitivity, pollution-free, high specificity, it is easy to operate and to the pre-treatment of sample require low, detectable sample type extensively, can fast high-flux detect high-volume sample, be convenient for clinical reagent application.The present invention provides a kind of more acurrate, accurate, convenient, fast and simple method for the neurofilament light chain albumen in clinical detection human serum.)

一种测定人体神经丝轻链蛋白含量的磁微粒化学发光检测试 剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种采用磁微粒化学发光技术和抗原-抗体结合技术检测人体神经丝轻链蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒及其制备方法。本发明属于医用诊断试剂领域。

背景技术

神经丝蛋白是神经元主要的细胞骨架蛋白，分别由神经丝蛋白轻链、中链和重链组成，特异性地表达于轴索和轴突。神经丝蛋白的主要功能是为轴突提供结构支持并调控神经轴突的生长直径，影响着神经传输的速率和准确性。神经丝蛋白轻链(neurofilamentlight，NFL)是神经丝蛋白中最重要的组成成分，分子量为68KDa，是轴索损伤的标志物。神经丝轻链组成了重链的骨架，重链聚集形成了神经丝纤维。由于直接的创伤或者缓慢的退化过程，受损的神经细胞内容物释放至周边的隔室，所以可以定量检测轴突蛋白。在多种退行性疾病如脑损伤、多发性硬化症、额颞痴呆和其他多种神经退行性疾的患者的神经丝轻链蛋白水平会有所升高。

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种进行性发展的神经系统退行性疾病，临床中常以记忆障碍、人格及行为改变等痴呆表现为基本特征，65岁以后发病的称之为迟发性AD。随着全球人口老龄化，AD患者的人数快速增加，预计到2030年，全球AD患者将达到6,600万人，我国将超过1,600万人。与正常老年人相比，AD患者生活自理能力差，同时常伴有精神行为异常，给家庭和社会带来极大的负担，其花费超过了心肌梗死、癌症、中风的总和，给社会和家庭造成巨大压力。目前该病的病因未明，曾有研究报道AD与脑脊液中和血液中的神经丝蛋白含量有一定联系，尤其是与其中的轻链蛋白(neurofilamentlight，NFL)关系密切。因此，研究开发神经丝轻链蛋白诊断试剂盒具有非常重要的临床价值。

目前已知的神经丝轻链蛋白检测方法主要为酶联免疫吸附测定法、荧光免疫分析法。但是，这些方法仍存在灵敏度低、线性范围窄、结果不稳定等缺陷。

因此，目前尚需一种灵敏度高、操作简单、自动化程度高、结果稳定、成本低廉的神经丝轻链蛋白检测试剂盒和使用方法。

发明内容

本发明旨在开发一种灵敏度高、操作简单、自动化程度高、结果稳定、成本低廉的一种测定人体神经丝轻链蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒及其制备方法。

基于上述目的，本发明提供一种测定人体神经丝轻链蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒，包括：R1试剂、R2试剂、磁分离试剂、校准品液系列和化学发光底物液；其中，R1试剂为异硫氰酸荧光素标记的抗神经丝轻链蛋白单克隆抗体稀释液，R2试剂为碱性磷酸酶标记的抗神经丝轻链蛋白抗体稀释液，磁分离试剂为抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒稀释剂，校准品液系列为含有不同浓度神经丝轻链蛋白的抗原稀释液，化学发光底物液为碱性磷酸酶催化发光的底物液。

其中，优选的，所述R1试剂是由缓冲液稀释而成的浓度为0.3～0.9μg/mL的异硫氰酸荧光素标记的抗神经丝轻链蛋白单克隆抗体稀释液。

其中，优选的，用于制备R1试剂的缓冲液pH值为7.2～8.0，缓冲液包括浓度为12.0～12.3g/L的Tris、浓度为1.98～1.99g/L的叠氮钠、浓度为5.7～5.9g/L的氯化钠、摩尔浓度为1M的氯化镁溶液0.8～1.2mL/L、摩尔浓度为0.1M的氯化锌溶液0.8～1.2mL/L、浓度为5-20g/L的鱼皮明胶、浓度为2～5g/L的牛血清白蛋白以及浓度为10～50g/L的新生牛血清，其余为去离子水。

其中，优选的，所述R2试剂是由缓冲液稀释而成的浓度为0.5～2.0μg/mL碱性磷酸酶标记的抗神经丝轻链蛋白抗体稀释液。

其中，优选的，用于制备R2试剂的缓冲液的pH值为7.2～8.0，优选为商品化的APConjugate Stabilizer。

其中，优选的，所述磁分离试剂是由缓冲液稀释而成的浓度为0.5～2mg/mL的抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒溶液。

其中，优选的，用于制备磁分离试剂的缓冲液的pH值为7.5～9.0，缓冲液组分为包括浓度为10.5～11.3g/L的Tris、浓度为1.91～1.95g/L的叠氮钠、浓度为5.5～5.7g/L的氯化钠、摩尔浓度为1M的氯化镁溶液0.8～1.2mL/L、摩尔浓度为0.1M的氯化锌溶液0.8～1.2mL/L、浓度为4.7～4.9g/L的牛血清白蛋白以及浓度为4.8～5.0g/L的特级马血清，其余组分为去离子水。

其中，优选的，所述校准品液系列是由缓冲液稀释而成的含有不同浓度神经丝轻链蛋白的抗原稀释液。

其中，优选的，用于制备校准品液系列的缓冲液包括浓度为8.5～10.2g/L Tris、浓度为11.8～14.5g/L的氯化钠、浓度为0.008～0.028g/L的四环素盐酸盐、浓度为0.008～0.028g/L的硫酸新霉素、浓度为1.5～2.0g/L的叠氮钠、浓度为6.0～10.0g/L的酪蛋白以及浓度为2.6-～3.4g/L吐温20，其余组分为去离子水。

其中，优选的，所述校准品液系列的浓度范围为0～500pg/ml，缓冲液pH值为7.0～8.0。

其中，优选的，所述校准品液系列包括分别含有浓度为0pg/ml、10pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、250pg/ml、500pg/ml神经丝轻链蛋白的抗原稀释液。

其中，优选的，所述化学发光底物液是由缓冲液稀释而成的含有0.2～0.4mg/mL碱性磷酸酶催化发光底物的化学发光底物液；更优选的，所述的缓冲液为pH值为8～10的摩尔浓度为0.1-0.3M的Tris-HCl缓冲液，所述的碱性磷酸酶催化发光底物为二氧杂环乙烷化合物(APCL)。

其中，优选的，所述化学发光底物液是由pH值为9.3的摩尔浓度为0.2M的Tris-HCl缓冲液稀释而成的含有0.3mg/mL的二氧杂环乙烷化合物(APCL)的化学发光底物液。

进一步的，本发明还提出了一种测定人体神经丝轻链蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

配制试剂R1：1)按照试剂R1缓冲液组分含量配制缓冲液，调节pH；2)制备异硫氰酸荧光素标记的抗神经丝轻链蛋白单克隆抗体；3)将异硫氰酸荧光素标记的抗神经丝轻链蛋白单克隆抗体用R1缓冲液进行稀释。

配制试剂R2：1)按照试剂R2缓冲液组分含量配制缓冲液，调节pH；2)制备碱性磷酸酶标记的抗神经丝轻链蛋白抗体；3)将碱性磷酸酶标记的抗神经丝轻链蛋白抗体用R2缓冲液进行稀释。

配制磁微粒：1)按照磁微粒缓冲液组分含量配制缓冲液；2)制备抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒；3)将磁微粒用Tris-HCl缓冲液进行稀释。

配制校准品：1)按照校准品缓冲液组分含量配制缓冲液；2)将神经丝轻链蛋白抗原溶解于校准品缓冲液中配置成不同的浓度。

配制化学发光底物液：1)按照化学发光底物液缓冲液组分含量配制缓冲液；2)将碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物溶解于缓冲液中。

更进一步的，本发明还提出了一种测定人体神经丝轻链蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒使用方法，包括如下步骤：

(1)将待测样本或校准品、试剂R1、试剂R2 37℃混合温育15min；

(2)将磁微粒加入上述反应体系后于37℃继续温育5min；

(3)洗涤，去除未结合的抗体和杂质后加入发光底物；

(4)加入发光底物，ALP催化底物发光后测定相对发光强度(RLU)。

在一定范围内RLU与神经丝轻链蛋白抗原浓度呈正比，通过内插法就可以从标准曲线上读取待测样本的神经丝轻链蛋白含量。

采用本发明上述检测试剂盒测定人体神经丝轻链蛋白含量时的方法学鉴定数据可达到如下指标：

灵敏度－最小检出量为0.1pg/ml；

神经丝轻链蛋白线性检测范围，0.1～500pg/ml；

精密度－分析内精密度和分析间精密度均小于8％，符合国家要求，说明本发明试剂盒在实验过程中具有很好的可重复性；

准确度－将已知神经丝轻链蛋白浓度的血清采用去激素血清经不同比例稀释后回收率为95％～115％；

干扰－若标本中含有的干扰物浓度满足以下要求，对检测结果无影响：胆红素≤400umol/L、血红蛋白≤5g/L、乳糜≤0.30％、V_C≤0.5g/L、肝素钠≤100IU/mL。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明采用的夹心法的反应模式，利用化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合的原理，定量检测人血清、血浆或脑脊液等多种样本中的神经丝轻链蛋白含量，确保了检测的灵敏度，本试剂盒与传统试剂盒相比灵敏度高(传统ELISA试剂盒灵敏度仅～0.1ng/ml)、无污染、特异性强、操作简单、并且对样品的前处理要求低、可检测样本类型广泛、可快速高通量检测大批量样本，便于临床试剂应用。本发明为临床检测人血清中的神经丝轻链蛋白提供了一种更准确、精确、方便、快捷和简单的方法。

附图说明

图1为本发明实施例2试剂盒中神经丝轻链蛋白的浓度－发光值曲线图；

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。

实施例1一种测定人体神经丝轻链蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的制备

所述的试剂盒包括R1试剂、R2试剂、磁分离试剂、校准品液系列和化学发光底物液。

其中，R1试剂包括：1)R1抗体：异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗神经丝轻链蛋白单克隆抗体，浓度为0.6μg/ml；2)缓冲液：包括Tris，浓度为12.0g/L；叠氮钠，浓度为1.98g/L；氯化钠，浓度为5.9g/L；摩尔浓度为1M的氯化镁溶液，1.0mL/L；摩尔浓度为0.1M的氯化锌溶液，1.0mL；鱼皮明胶，浓度为10g/L；牛血清白蛋白，5g/L；新生牛血清，30g/L；其余为去离子水。R1试剂的缓冲液pH值为8.0。

其中，R2试剂包括：1)R2抗体：碱性磷酸酶标记的抗神经丝轻链蛋白抗体，浓度为0.5μg/ml；2)缓冲液：为商品化的AP Conjugate Stabilizer。R2试剂的缓冲液pH值为8.0。

其中，磁分离试剂包括：1)磁微粒：抗异硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体包被的磁微粒，浓度为1mg/ml；2)缓冲液：包括Tris，浓度为11.08g/L；叠氮钠，浓度为1.917g/L；氯化钠，浓度为5.56g/L；摩尔浓度为1M的氯化镁溶液，1.0mL/L；摩尔浓度为0.1M的氯化锌溶液，1.0mL/L；牛血清白蛋白，浓度为4.81g/L；特级马血清，浓度为4.91g/L，其余组分为去离子水。磁分离试剂的缓冲液pH值为8.0。

其中，校准品液系列包括：1)神经丝轻链蛋白抗原；2)缓冲液：包括Tris，浓度为9.1g/L；氯化钠，浓度为12.9g/L；四环素盐酸盐，浓度为0.01g/L；硫酸新霉素，浓度为0.01g/L；叠氮钠，浓度为2.0g/L；酪蛋白10.0g/L；吐温20，浓度为3.1g/L。校准品液系列的缓冲液pH值为7.6。校准品系列包括含有不同浓度(0pg/ml、5pg/ml、10pg/ml、25pg/ml、50pg/ml、100pg/ml)神经丝轻链蛋白抗原的校准品。

其中，化学发光底物液是由pH值为9.3的摩尔浓度为0.2M的Tris-HCl缓冲液稀释而成的含有0.3mg/mL的二氧杂环乙烷化合物(APCL)的化学发光底物液。

实施例2测定人体神经丝轻链蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的使用方法

(1)将实施例1的50μl的校准品系列(神经丝轻链蛋白抗原浓度分别为0pg/ml、10pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、250pg/ml、500pg/ml)分别与实施例1的50μl试剂R1、50μl试剂R2依次加入反应管中，37℃条件下混合温育15min；

(2)将上述试剂系列分别再与实施例1的25μl磁分离试剂结合后于37℃继续温育5min；

(3)用清洗液洗涤3次以去除未结合的抗体和杂质；

(4)加入实施例1的发光底物液150μl，ALP催化底物发光后采用化学发光检测仪测定相对发光强度(RLU)，结果如下表1所示：

表1

校准品(pg/ml)	0	10	50	100	250	500
							RLU(100000)	0.013	1.419	6.178	12.238	28.562	54.967

(5)根据表1的数值进行拟合，获得图1所示的神经丝轻链蛋白浓度-发光值标准曲线。

(6)将50μl的待测血清样品与实施例1的50μl试剂R1、50μl试剂R2依次加入反应管中，37℃条件下混合温育15min；

(7)将上述试剂再与实施例1的25μl磁分离试剂结合后于37℃继续温育5min；

(8)用清洗液(含有0.02％的吐温20和15w/w％的氯化钠的0.1M、pH值为8的Tris-HCl缓冲液。)洗涤3次以去除未结合的抗体和杂质；

(9)加入实施例1的发光底物液150μl，ALP催化底物发光后采用化学发光检测仪测定相对发光强度RLU为142000；

(10)根据步骤(5)的神经丝轻链蛋白浓度-发光值标准曲线计算RLU为142000的待测血清样品对应的神经丝轻链蛋白浓度值为10pg/ml。

本发明提供的人体神经丝轻链蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒可以与全自动化学发光分析仪联用，操作步骤极大简化，加大了检测速度和检测通量，提高了检测效率，同时避免了人为操作导致的误差。

对比例本发明的试剂盒与传统ELISA试剂盒的灵敏度对比实验

分别使用本发明的试剂盒以及传统ELISA试剂盒，对同一样本进行检测，确定二者的灵敏度，结果如表2和表3所示：

表2本发明试剂盒灵敏度

表3传统ELISA试剂盒灵敏度

分别使用本发明的试剂盒以及传统ELISA试剂盒，对CSF样本、血清样本以及血浆样本进行检测，结果如表4所示：

表4本发明试剂盒与传统ELISA试剂盒样本检测比对数据

以上结果表明，本试剂盒与传统ELISA试剂盒相比灵敏度高、可检测样本类型广泛，可快速高通量检测大批量样本，便于临床试剂应用。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。