应用于减少表柔比星副作用的磁性纳米载体材料制备方法
阅读说明：本技术 应用于减少表柔比星副作用的磁性纳米载体材料制备方法 (Preparation method of magnetic nano carrier material for reducing side effect of epirubicin ) 是由 陈波 王震 陈乙东 高波 于皓 王子墨 索浣丹 陶祚 于 2021-07-28 设计创作，主要内容包括：本发明属于磁性纳米材料应用于药物载体领域,公开了应用于减少表柔比星副作用的磁性纳米载体材料制备方法。本发明将表柔比星负载到磁性四氧化三铁/石墨烯纳米材料载体之上(以下称为Fe-(3)O-(4)/GO),其靶向作用可使表柔比星定向浓聚并释放到特定肿瘤部位,大幅度减小其毒副作用。磁性Fe-(3)O-(4)/GO纳米材料与已投产的载体纳米材料相比,具有高磁饱和、高稳定性、低细胞毒性、低生产成本的优势。GO与Fe-(3)O-(4)的组合可实现性能的极大提升,因此可制备磁性Fe-(3)O-(4)/GO纳米材料载体,并应用于减少表柔比星副作用,由此生产出理想的磁性靶向药物载体。(Hair brushBelongs to the field of application of magnetic nano materials to drug carriers, and discloses a preparation method of a magnetic nano carrier material for reducing side effects of epirubicin. The epirubicin is loaded on a magnetic ferroferric oxide/graphene nano material carrier (hereinafter referred to as Fe) 3 O 4 GO) with targeting function, which can make epirubicin directionally concentrate and release to specific tumor part, and greatly reduce its toxic side effect. Magnetic Fe 3 O 4 Compared with the produced carrier nano material, the/GO nano material has the advantages of high magnetic saturation, high stability, low cytotoxicity and low production cost. GO and Fe 3 O 4 The combination of (A) can achieve a great improvement in performance, and thus can produce magnetic Fe 3 O 4 the/GO nano material carrier is applied to reduce the side effect of epirubicin, thereby producing an ideal magnetic targeting drug carrier.)
技术领域
本发明属于磁性纳米材料药物载体领域，具体涉及到四氧化三铁/石墨烯纳米材料的制备。
背景技术
表柔比星是临床上常用的化疗药物，用于治疗白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌等多种恶性疾病。其在实际使用时，患者可能会出现心肌损伤、心力衰竭、肝肾功能损害、骨髓抑制、恶心呕吐、关节疼痛等毒副作用，严重降低了患者的生活质量和治疗依从性，因此有必要开发一种靶向表柔比星输送系统，既可减少表柔比星用量，又可降低药物对人体的副作用。
表柔比星结构里的胺基基团使得表柔比星在酸性环境下的药物释放速度大于中性环境。而几乎所有实体肿瘤中都存在低PH的肿瘤微环境，这个特性使得具有PH敏感性为的靶向表柔比星输送成为可能。目前已开始利用纳米材料作为表柔比星的载体，从而降低药物毒副作用，提高化疗疗效。但已投产的载体纳米材料(脂质体、聚合物纳米颗粒、金属纳米颗粒等)在患者体内并无明确的针对性靶向作用，治疗效果差强人意。
发明内容
本发明内容为克服上述表柔比星药物载体现有技术存在的不足，制备磁性Fe3O4/GO复合药物载体新型材料，并将表柔比星负载在该载体上。
磁性Fe3O4/GO纳米材料与已投产的载体纳米材料相比，具有高磁饱和、高稳定性、低细胞毒性、低生产成本的优势。其表面存在-OH、COO-等官能团，而表柔比星分子中含有-OH和-NH2,在磁性Fe3O4/GO纳米载体和表柔比星之间涉及静电相互作用、氢键和化学键等多种相互作用，使得表柔比星能轻易负载到所制备的载体材料上。
Fe3O4存在Fe2+态，具有作为电子供体的电位，磁性饱和度高，该特性可实现将载体靶向运送到指定位置。且Fe3O4具有酸溶性，故可以对酸性肿瘤微环境做出反应，智能释放药物，保证了肿瘤抑制效果。但裸露的Fe3O4纳米粒子通常具有很高的化学活性，极易氧化，这往往会导致磁性下降，由此需要对其进行表面功能化。
石墨烯含有丰富的表面官能团，其中一些可用于药物装载各种机制和交互,如疏水作用和π-π堆积，再加上其拥有巨大的表面积，可进一步提高药物的负载量。现已有抗癌药物如盐酸盐素(DOX)、喜树碱(CPT)和紫杉醇(PTX)与石墨烯通过π-π堆叠和/或疏水作用已实现良好的药物储存。然而，由于石墨烯没有特异性识别分子，单纯石墨烯材料无法实现药物的靶向递送，故需要对GO进行修饰。
GO与Fe3O4的组合可实现性能的极大提升，因此可制备磁性Fe3O4/GO纳米材料载体，以生产出理想的磁性靶向药物载体。
如图1所示，(a)磁性Fe3O4纳米粒子呈现出均匀一致的纳米球形状，并且具有良好的分散性，纳米球的尺寸约为100-200nm。(b)放大后可见，纳米球的表面较为粗糙。(c)每个复合纳米球均由许多直径约为5-10nm的初级纳米颗粒相互连接形成，表明该复合纳米球拥有分级的纳米结构。(d)磁性Fe3O4纳米粒子表面存在厚度约为3nm的碳层。
为实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种磁性Fe3O4/GO纳米材料载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)Fe3O4磁性纳米粒子的制备与表面改性；
室温下将去离子水与DMF(二甲基甲酰胺)以体积比1：3～5制成DMF溶液，然后将六水合氯化铁、1,4-苯甲二酸溶于DMF溶液中搅拌，形成均匀溶液；
随后添加质量为六水合氯化铁2.5-3.5％的KH550，充分搅拌；
向均匀溶液以1-300滴/min滴加尿素，并且在滴加过程中不断搅拌，直至溶液pH达到8.0-9.5时停止滴加，超声处理混合均匀；
随后将混合溶液密封，进行水热处理，并在160℃下保持2-5h后冷却至室温，离心机以1500-3000r/min，15-30min收集制备的沉淀；
离心收集的中间体样品分别用DMF和无水乙醇洗涤数次直至中性；然后干燥，在80℃条件下烘干10-20h，取出后研磨研细，密封备用；
(2)氧化石墨烯的制备
GO是根据改良的Hummers方法从纯化的天然石墨中制备的。室温称取质量比为2：1的石墨粉末和硝酸钾并混合均匀，搅拌下加入到已冷却至0℃的质量百分数98％浓硫酸溶液中，随后在搅拌和冷却下逐渐加入高锰酸钾，高锰酸钾与石墨粉末的质量比为3：1，过程中将混合物的温度保持在10℃以下，持续搅拌10h；将混合物的温度升至35℃，再次加入质量百分数98％浓硫酸和高锰酸钾到混合物；搅拌24h后，将混合物倒入冷冻的质量百分数为10％H2O2溶液中以终止反应；所述质量百分数为10％H2O2溶液与质量百分数为98％浓硫酸体积比为5～8：1；加入与混合物相同体积的质量百分数为10％盐酸溶液并搅拌均匀；反复以8000r/min，5分钟/次进行离心，用蒸馏水洗涤，直到不能用氯化钡溶液测试到硫酸盐；通过离心将悬浮液分离成上清液和金色残余物；以8000转/分的速度运行5分钟；在上清液中获得脱落的GO；
(3)磁性Fe3O4/GO纳米材料载体的制备
将步骤(2)获得的GO悬浮液超声处理0.5-1.5h，随后将步骤(1)获得的磁性Fe3O4纳米粒子加入悬浮液中，并将混合物进一步超声处理1h；机械搅拌下于60℃反应1h后，通过使用磁分离获得Fe3O4/GO复合材料；GO悬浮液与磁性Fe3O4纳米粒子的质量比为20～35：1。
所述的步骤(1)中，KH550为氨基官能团硅烷，是一种优异的粘结促进剂，可改善颗粒表面极性，用于提升极性不同的两相间界面结合强度。
所述的步骤(1)中，使用超声处理的目的是在超声波作用下，使溶液剧烈充分混合，直到溶液变得均匀。
所述的步骤(2)中，第二次加入与第一次等量的98％浓硫酸，第二次加入的高锰酸钾与石墨粉末的质量比为(3.5-4.5)：1。
所述的步骤(2)中，10％H2O2溶液与98％浓硫酸体积比为(5～8：1)。
所述的步骤(2)中，上清液中的GO稳定地分散在水中，几个月内不会沉淀。
进一步地，将表柔比星负载到上述制得的磁性Fe3O4/GO纳米材料载体上
室温避光条件下将2.5mg磁性Fe3O4/GO纳米粒子浸在10ml不同浓度(分别为2.5、5、10、20和40μg·mL-1)表柔比星磷酸盐缓冲溶液(PBS,PH＝7.4)中，放入37℃的恒温水浴振荡器中，以300r/min的速度振荡72h，静置15min,然后离心提取上清液,即可完成表柔比星的负载。
所述的步骤(4)中，室温避光条件下进行负载可有效避免表柔比星的光解作用。借助于准备阶段绘制的表柔比星浓度-吸光度标准曲线，通过紫外可见光光度计在最大表柔比星吸收波长(480nm)下，测定上清液中的游离表柔比星的浓度。将离心得到的混合物除去上清后，用PBS洗涤收集到的负载产物数次，并于真空下冷冻干燥，通过以下公式计算Fe3O4/GO-EPI的负载量:
(5)Fe3O4/GO-EPI复合样品中EPI的释放
在Fe3O4/GO-EPI应用于临床之前，需对其释放情况进行实验研究。取10mg负载了EPI的Fe3O4/GO复合样品分别分散于5mlPBS(PH＝7.4)和醋酸盐缓冲液(PH＝4.1)中，在不同的预设时间(0.5h、1h、2h、4h、8h)从两份混合物中分别取0.2ml上清液，标记，随后利用紫外可见分光光度计在480nm波长下借助标准曲线对其进行EPI浓度的分析。
所述的步骤(5)中，该实验在恒温37℃培养箱中进行，以模拟人体体温。PBS用于模拟肿瘤旁正常组织环境，醋酸盐溶液用于模拟肿瘤酸性微环境。
所述的步骤(5)中，每次去除0.2ml上清液后立即分别向两份混合物中添加0.2mlPBS和0.2ml醋酸盐缓冲溶液，用于进一步EPI释放实验。在Fe3O4/GO-EPI中释放EPI过程中，加入转速为150r/min的电动磁铁产生的旋转磁场作为外部磁场条件，通过如下公式可计算EPI从Fe3O4/GO-EPI中释放的效率：
本发明的有益效果：
(1)该复合材料中，氧化石墨烯和磁性Fe3O4纳米粒子外部碳层可实现化学键结合，进而增强载体机械稳定性和单位质量石墨烯负载磁性。且经过氧化石墨烯表面改性后，该材料更具有良好的生物相容性。
(2)随后将EPI负载在氧化石墨烯表面，形成复合靶向载体，由此在人体内可以将表柔比星靶向浓聚并释放在到肿瘤部位，同时对机体的其他组织和器官不产生损害，尤其可避免心力衰竭和骨髓抑制等强烈毒副作用。
(3)本复合材料制作工艺简单易操作，生产成本低，符合大规模生产的条件。
附图说明
图1为磁性Fe3O4纳米粒子的SEM(a,b)和TEM(c,d)图像。
图2为不同条件下磁性Fe3O4/GO复合纳米载体在37℃下EPI的释放行为。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
(1)室温下取10ml去离子水与40mlDMF混合，制成DMF溶液，然后将300mg六水合氯化铁和500mg 1,4-苯甲二酸溶于DMF溶液中搅拌10min，随后添加7.5mgKH550，充分搅拌10min，向均匀溶液中以5滴/min滴加尿素并不断用玻璃棒搅拌，直至PH＝8.0时停止滴加，超声处理10min将混合溶液密封到特氟隆衬里的不锈钢高压釜中进行水热处理，并在160℃下保持2h后冷却至室温，离心机以参数1500r/min、5min/次收集制备的沉淀。离心收集的中间体样品分别用DMF和无水乙醇洗涤数次直至中性。然后放置在鼓风干燥箱中，在80℃条件下烘干10h，取出后研磨研细，密封备用。
(2)室温称取1.0g石墨粉末和0.5g硝酸钾并混合均匀，搅拌下加入到23ml已冷却至0℃的98％浓硫酸溶液中，随后在搅拌和冷却下逐渐加入3.0g高锰酸钾，过程中将混合物的温度保持在0℃，持续搅拌10h。随后将混合物的温度升至35℃，再次加入23ml98％浓硫酸和3.9g高锰酸钾到混合物中。搅拌24h后，将混合物倒入冷冻的300ml10％H2O2溶液中以终止反应。加入与混合物相同体积10％盐酸溶液并搅拌均匀。反复以8000r/min，5min/次进行离心，用蒸馏水洗涤，直到不能用氯化钡溶液测试到硫酸盐，在上清液中获得脱落的GO。
(3)取100mlGO悬浮液超声处理1h,随后将0.5g磁性Fe3O4纳米粒子加入悬浮液中，并将混合物进一步超声处理1h。机械搅拌下于60℃反应1h后，通过磁分离获得Fe3O4/GO复合材料。
(4)室温避光条件下将2.5mg磁性Fe3O4/GO纳米粒子浸在10ml不同浓度(分别为2.5、5、10、20和40μg·mL-1)表柔比星磷酸盐缓冲溶液(PBS,PH＝7.4)中，放入37℃的恒温水浴振荡器中，以300r/min的速度振荡72h，静置15min,然后离心提取上清液,完成表柔比星的负载。
(5)取10mg负载了EPI的Fe3O4/GO复合样品分别分散于5mlPBS(PH＝7.4)和醋酸盐缓冲液(PH＝4.1)中，在不同的预设时间(0.5h、1h、2h、4h、8h)从两份混合物中分别取0.2ml上清液，标记，随后利用紫外可见分光光度计在480nm波长下借助标准曲线对其进行EPI浓度的分析。经测试，磁性Fe3O4/GO纳米粒子比表面积为110.0m2/g,最高药物负载量为80.9％，PH＝4.1及150r/min的电动磁铁产生的旋转磁场条件下，4h时EPI的释放效率可达82.0％。
实施例2
(1)室温下取10ml去离子水与40mlDMF混合，制成DMF溶液，然后将330mg六水合氯化铁和550mg 1,4-苯甲二酸溶于DMF溶液中搅拌10min，随后添加10mgKH550，充分搅拌10min，向均匀溶液中以10滴/min滴加尿素并不断用玻璃棒搅拌，直至PH＝8.5时停止滴加，超声处理10min将混合溶液密封到特氟隆衬里的不锈钢高压釜中进行水热处理，并在160℃下保持5h后冷却至室温，离心机以参数2000r/min、5min/次收集制备的沉淀。离心收集的中间体样品分别用DMF和无水乙醇洗涤数次直至中性。然后放置在鼓风干燥箱中，在80℃条件下烘干10h，取出后研磨研细，密封备用。
(2)室温称取1.0g石墨粉末和0.5g硝酸钾并混合均匀，搅拌下加入到40ml已冷却至0℃的98％浓硫酸溶液中，随后在搅拌和冷却下逐渐加入3.0g高锰酸钾，过程中将混合物的温度保持在5℃，持续搅拌10h。随后将混合物的温度升至35℃，再次加入40ml98％浓硫酸和4.0g高锰酸钾到混合物中。搅拌24h后，将混合物倒入冷冻的300ml10％H2O2溶液中以终止反应。加入与混合物相同体积10％盐酸溶液并搅拌均匀。反复以8000r/min，5min/次进行离心，用蒸馏水洗涤，直到不能用氯化钡溶液测试到硫酸盐，在上清液中获得脱落的GO。
(3)取100mlGO悬浮液超声处理1h,随后将0.5g磁性Fe3O4纳米粒子加入悬浮液中，并将混合物进一步超声处理1h。机械搅拌下于60℃反应1h后，通过磁分离获得Fe3O4/GO复合材料。
(4)室温避光条件下将2.5mg磁性Fe3O4/GO纳米粒子浸在10ml不同浓度(分别为2.5、5、10、20和40μg·mL-1)表柔比星磷酸盐缓冲溶液(PBS,PH＝7.4)中，放入37℃的恒温水浴振荡器中，以300r/min的速度振荡72h，静置15min,然后离心提取上清液，完成表柔比星的负载。
(5)取10mg负载了EPI的Fe3O4/GO复合样品分别分散于5mlPBS(PH＝7.4)和醋酸盐缓冲液(PH＝4.1)中，在不同的预设时间(0.5h、1h、2h、4h、8h)从两份混合物中分别取0.2ml上清液，标记，随后利用紫外可见分光光度计在480nm波长下借助标准曲线对其进行EPI浓度的分析。经测试，磁性Fe3O4/GO纳米粒子比表面积为118.2m2/g,最高药物负载量为85.2％，PH＝4.1及150r/min的电动磁铁产生的旋转磁场条件下，4h时EPI的释放效率可达85.5％。
实施例3
(1)室温下取10ml去离子水与50mlDMF混合，制成DMF溶液，然后将300mg六水合氯化铁和600mg 1,4-苯甲二酸溶于DMF溶液中搅拌10min，随后添加10.5mgKH550，充分搅拌10min，向均匀溶液中以10滴/min滴加尿素并不断用玻璃棒搅拌，直至PH＝9.0时停止滴加，超声处理10min将混合溶液密封到特氟隆衬里的不锈钢高压釜中进行水热处理，并在160℃下保持4h后冷却至室温，离心机以参数3000r/min、5min/次收集制备的沉淀。离心收集的中间体样品分别用DMF和无水乙醇洗涤数次直至中性。然后放置在鼓风干燥箱中，在80℃条件下烘干10h，取出后研磨研细，密封备用。
(2)室温称取2.0g石墨粉末和1.0g硝酸钾并混合均匀，搅拌下加入到50ml已冷却至0℃的98％浓硫酸溶液中，随后在搅拌和冷却下逐渐加入6.0g高锰酸钾，过程中将混合物的温度保持在5℃，持续搅拌10h。随后将混合物的温度升至35℃，再次加入50ml98％浓硫酸和8.0g高锰酸钾到混合物中。搅拌24h后，将混合物倒入冷冻的400ml10％H2O2溶液中以终止反应。加入与混合物相同体积10％盐酸溶液并搅拌均匀。反复以8000r/min，5min/次进行离心，用蒸馏水洗涤，直到不能用氯化钡溶液测试到硫酸盐，在上清液中获得脱落的GO。
(3)取100mlGO悬浮液超声处理1h，随后将0.5g磁性Fe3O4纳米粒子加入悬浮液中，并将混合物进一步超声处理1h。机械搅拌下于60℃反应1h后，通过磁分离获得Fe3O4/GO复合材料。
(4)室温避光条件下将2.5mg磁性Fe3O4/GO纳米粒子浸在10ml不同浓度(分别为2.5、5、10、20和40μg·mL-1)表柔比星磷酸盐缓冲溶液(PBS,PH＝7.4)中，放入37℃的恒温水浴振荡器中，以300r/min的速度振荡72h，静置15min,然后离心提取上清液,完成表柔比星的负载。
(5)取10mg负载了EPI的Fe3O4/GO复合样品分别分散于5mlPBS(PH＝7.4)和醋酸盐缓冲液(PH＝4.1)中，在不同的预设时间(0.5h、1h、2h、4h、8h)从两份混合物中分别取0.2ml上清液，标记，随后利用紫外可见分光光度计在480nm波长下借助标准曲线对其进行EPI浓度的分析。经测试，磁性Fe3O4/GO纳米粒子比表面积为119.3m2/g,最高药物负载量为85.8％，PH＝4.1及150r/min的电动磁铁产生的旋转磁场条件下，4h时EPI的释放效率可达85.9％。
由图2所示，不同条件下磁性Fe3O4/GO复合纳米载体在37℃下EPI的释放行为：(1)pH 7.4，无旋转磁场；(2)pH值7.4，用旋转磁场；(3)pH为4.1，无旋转磁场；(4)pH值4.1，具有旋转磁场。