具体实施方式

实施例1OSCC细胞系的侵袭迁移能力与miR-302b-3p表达水平的关系

使用真核细胞转染技术，将miR-302b-3p-mimic【正义链:UAAGUGCUUCCAUGUUUUAGUAG(SEQ ID NO.1)；反义链CUACUAAAACAUGGAAGCACUUA(SEQ IDNO.2)】、miR-302b-3p-off【CUACUAAAACAUGGAAGCACUUA(SEQ ID NO.3)】或随机miRNA mimic【即NC-mimic；micrON mimic NC序列正义链:UUUGUACUACACAAAAGUACUG(SEQ ID NO.4)，反义链：CAGUACUUUUGUGUAGUACAAA(SEQ ID NO.5)；micrOFF inhibitor NC序列：CAGUACUUUUGUGUAGUACAA(SEQ ID NO.6)】分别转染OSCC细胞系HSC-3、HSC-4、UM1、UM2。使用Transwell侵袭实验与迁移实验，检测转染前、后的的迁移和侵袭情况。另外抽提细胞RNA，使用qRT-PCR检测miR-302b-3p的表达。

具体操作方法如下：

1.细胞RNA抽提和qRT-PCR。OSCC细胞系HSC-3、HSC-4、UM1、UM2培养至对数生长期，每5～10×10⁶个细胞加入1mL Trizol，用一次性或已消毒的细胞刮刮下，转入新的洁净EP管中，用注射器反复抽吸5～6次，或反复用移液枪捶打或剧烈震荡，以充分裂解细胞。室温下静置5min(除离心外，所有操作尽量在通风橱内进行)。EP管中按照每1mL Trizol加入0.2mL氯仿，观察液体由淡红色清亮转为桃红色浑浊样，盖上EP管，用力震荡15秒，或涡旋。室温下静置2～3min。再离心，参数为12000g，4℃，15min。取上层水相置于新的EP管中，注意避免吸取到中间的白色蛋白。加入0.5mL异丙醇，室温下静置10min，离心，参数为12000g，4℃，10min。弃上清，EP管中加入1mL 75％乙醇进行洗涤，涡旋混合。离心，参数为≤7500g，4℃，5min。弃上清。在通风橱内室温下自然干燥，用约30μL的Rnase-free水溶解RNA，将液体转至PCR管中，55℃或60℃温育10min。用分光光度仪测定RNA浓度。按照Taqman MicroRNA反转录试剂盒产品说明书将RNA反转录为cDNA，并进行荧光定量PCR检测(qRT-PCR)。U6作为内参基因，结果采用相对定量法，公式为2^-△△CT。

2.真核细胞转染技术。①铺六孔板，用有血清培养基培养上述OSCC细胞系至细胞量为70～80％。吸去每孔原培养基，加入新的无血清培养基(即不加胎牛血清的DMEM液)1.5～2ml，置于细胞培养箱备用。②取EP管1个，用Opti-MEM培养基稀释miR-302b-3p-mimic(即miR-302b-3p的miRNA mimics)，比例：Opti：miR-302b-3p-mimic＝250ul：10ul。其中模拟物及对照试剂的10ul用量为锐博生物试剂公司说明书推荐值。同法稀释空白NC-mimic，比例同上。③取EP管1个，用Opti-MEM培养基稀释转染试剂invitrogen lipofectamine 2000，(常规比例为目的待转物：lipo2000＝1：2～3)，因lipo2000预实验中六孔板每孔＞10μL时细胞状态较差，所以本次用Opti:lipo2000＝250ul:10μL，保温5min。④混合稀释的miR-302b-3p-mimic与lipo2000，单个样本量为500ul Opti-MEM+5ul miR+10ul lipo2000，保温20min。同法操作NC组。⑤将混合液加入6孔板中，摇动培养板，轻轻混匀。⑥将六孔板置于细胞培养箱中，37℃，5％的CO2条件下培养6小时后，更换为有血清培养基。

3.Transwell侵袭实验与迁移实验。①取出成品matri-gel胶，用无血清培养基稀释为1：3浓度备用。使用前置于0℃冰箱中融化为液态，取出时置于冰上备用。避免高温。②在上述无菌操作台中，取出transwell小室，置于六孔板中备用。a.预计进行侵袭试验的小室上层加入35μLmatri-gel胶，避免气泡，加完后，盖好24孔板板盖，做好组别标记，放入37℃细胞培养箱中，静置45min，待matri-gel胶凝固呈果冻状时，在transwell小室下方的24孔板力，按每孔500μL的量加入有血清培养基。b.进行迁移试验的小室内不必加matri-gel胶，在下层的六孔板中置入500μL有血清培养基即可。③铺细胞：收取上述转染成功并培养24小时后的细胞，用无血清培养基重悬至浓度为5×10⁵个/mL，备用。取上述细胞悬液，在加了matri-gel胶的侵袭实验组transwell小室上层加入200μL/孔。将剩余的上述混悬液对稀释为2.5×10⁵个/mL后，在未加matri-gel胶的迁移实验组transwell小室上层加入200μL/孔。24小时后取出transwell小室。④固定、染色及统计：a.用干棉签擦去小室上层的细胞后，将上室置于70％甲醇溶液中固定半小时，用PBS漂洗。b.在24孔板中倒入500μL的4％结晶紫溶液，将transwell小室置于其中染色20min。c.取出小室，PBS洗净后，自然晾干。取下小室并置于载玻片上，中性树胶封片。静置24小时后显微镜下拍照保存后统计。

结果如图1所示：无论是初始状态(图1A、B)，还是转染miR-302b-3p-mimic(图1D)或miR-302b-3p-off(图1C)前后，miR-302b-3p的表达量高的细胞内，侵袭和/或迁移能力越低。

结论：在各OSCC细胞系中，miR-302b-3p的表达量越高，侵袭和/或迁移能力越低。

实施例2裸鼠OSCC颊部移植瘤动物模型转移实验

方法如下：①细胞悬液的制备：a.荧光素酶基因(Luciferase)标记细胞：采用具有体外成瘤能力的高侵袭性HSC-3细胞系，用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞。其中空白组为正常无处理的荧光素酶基因标记HSC-3细胞系，对照组为过表达NC mimic的荧光素酶基因标记HSC-3细胞系，实验组为过表达miR-302b-3p的荧光素酶基因标记HSC-3细胞系。培养至生长状态良好的指数生长期。收取细胞并制备不含血清及抗生素的培养基(即DMEM)重悬细胞液，计数并调整细胞浓度为1×10⁷/mL。②提前将Matri-gel胶置于4度冰箱融化。将上述细胞悬液与Matri-gel胶1：1比例混合，冰上进行。③裸鼠接种：空白组、对照组及实验组各3只，每组按照各自组别，取相应单细胞均匀混悬液100μL，缓慢注射于裸鼠颊黏膜下。注射后用消毒棉签轻压片刻，止血及避免细胞顺针口流出，可见接种处黏膜稍隆起，随后将裸鼠放回饲养笼。待裸鼠颊部接种部位肉眼可见明显的肿瘤结节(本实验为第12天)，结节质地较硬后，空白组、对照组和实验组分别行PBS、NC agomir试剂、miR-302b-3p agomir瘤内注射，每隔2日一次，每次10nmol。肉眼观察并记录裸鼠颊部肿瘤生长情况，并用活体荧光成像检测颊部及内脏情况。

结果如图2所示：注射miR-302b-3p agomir的小鼠OSCC颈部、腋窝淋巴结转移率显著低于对照组。

结论：miR-302b-3p可以抑制OSCC的转移。

实施例3验证靶基因

经软件预测发现，FZD6是miR-302b-3p的靶基因，其靶向识别模式如图3A所示。本实施例的目的是验证该基因是否为靶基因。

1.双荧光素酶报告基因系统验证

方法：将HEK-293T细胞接种于96孔板，使转染细胞密度达1×10⁷/mL。将miR-302b-3p过表达载体和psiCHECK-2-Report-FZD6-3’UTR载体共转染至293T细胞中，共转染miR-302b-3p过表达载体和psiCHECK-2-Report-FZD6-3’UTR mut载体或psiCHECK-2-Report空载体做对照。每组共转染海蜇荧光素酶(PRL-TK)作为内参，转染试剂为invitrogenlipofectamine 2000。转染48小时后，荧光倒置显微镜下观察绿色荧光发光情况，并裂解细胞，按照Promega双荧光素酶试剂盒说明书进行操作，所用仪器为微孔板发光分析仪。

结果：因为miR-302b-3p对psiCHECK-2-Report-FZD6-3’UTR载体的UTR区进行识别，该载体的荧光素酶表达受到抑制，因此WT-UTR组(即psiCHECK-2-Report-FZD6-3’UTR载体)荧光受到抑制，比内参荧光要弱；而MUT-UTR组(psiCHECK-2-Report-FZD6-3’UTR mut载体)的miRNA识别位点被突变，表达不受miR-302b-3p的抑制，因此其荧光比内参荧光要强，与Vector组(psiCHECK-2-Report空载体)荧光相对强弱趋势一致(图4)。可见miR-302b-3p可识别FZD6的3’UTR区，并下调具备该3’UTR区的基因。

2.RNA pull-down验证

方法：使用lipofectamine 2000转染试剂(美国Invitrogen，美国)，用生物素化的miR-302b-3p探针(序列为：5′-CUACUAAAACAUGGAAGCACUUA-3′(SEQ ID NO.7))及生物素化的NC-mimic探针(序列为：5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAAA-3′(SEQ ID NO.8))(RiboBio，中国广州)将HSC-3细胞转染24小时，然后在冷的全细胞裂解缓冲液中裂解。通过将细胞裂解液与抗生蛋白链菌素包被的磁珠(Thermo Fisher Scientific，美国)在室温下孵育1小时，来完成目标mRNA-miRNA复合物的下拉。用下拉洗涤缓冲液洗涤珠子3次。使用RNeasy MiniKit(QIAGEN，德国)提取总RNA。行RT-qPCR以检测相对的FZD6mRNA含量。

结果：如图3C所示，miR-302b-3p探针可大量结合FZD6的mRNA，结合能力远高于对照组(NC-mimic探针)。

结论：FZD6是miR-302b-3p的靶基因。

实施例4临床样本验证FZD6与OSCC侵袭性和/或迁移性的关系

收集四川大学华西口腔医院就诊、经手术切除后病理确诊为OSCC的组织样本，制备OSCC石蜡切片。观察切片并使用免疫组织化学染色检测FZD6的表达情况；随后考察病人生存率与FZD6表达量高低的关系。

免疫组织化学方法如下：

石蜡切片置于65℃烤箱，2h。过二甲苯后梯度酒精水化。1×TBS洗5min，2次(3min，3次)。EDTA修复液行抗原修复；3％过氧化氢封闭。按稀释比滴加羊抗的FZD6抗体，室温/37℃条件下孵育10-30min，后在4℃下放过夜。次日取出，置于37℃，40min；TBS洗5min，2次。滴加DAKO公司产通用型二抗，37℃下静置40min；DAB显色，苏木素复染；清水冲洗片子后过一遍盐酸酒精液；细水流轻轻冲洗2-5min，去除盐酸酒精。玻片置于氨水中反蓝约10min。洁净水细流冲洗20min。脱水、透明、封片。胶封﹥24h，扫片。光盘刻录图像数据。

结果如图4所示：正常口腔黏膜的FZD6表达量低，而OSCC口腔黏膜以及淋巴结转移组织中FZD6表达量高(图5A、B)；FZD6低表达患者的生存率显著高于FZD6高表达患者生存率。

这进一步证实了FZD6表达量越高，OSCC越严重(发生转移、死亡率高)。

实施例5验证miR-302b-3p、FZD6与口腔鳞癌的侵袭性的关系

本实施例使用慢病毒包装FZD6过表达载体(FZD6-OE)、FZD6小干扰RNA(FZD6-si，序列为5′-UCAGCGGCUUGUAUCUUGU-3′(SEQ ID NO.9))、miR-302b-3p-mimic(302b-3p-m)、随机miRNA mimic(NC-mimic)、miR-302b-3p agomir(302b-3p-ago，序列同302b-3p-m)或随机agomir(NC-ago，序列同NC-mimic)组合侵染口腔鳞癌细胞系HSC-3。其中，在HSC-3细胞的体外实验中，FZD6-si与miR-302b-3p-mimic和NC-mimic均通过脂质体转染，通过实施例1的方法检测其转移细胞和侵袭细胞，并通过免疫组化、Western blot检测相关蛋白的表达。而在动物体内研究部分，首先将HSC-3细胞经脂质体转染miR-302b-3p-mimic，再通过尾静脉注射方式构建裸鼠肺转移瘤模型；再通过尾静脉将miR-302b-3p agomir及NC-agomir直接注射进入各组裸鼠血液循环，被靶细胞摄取。该产品为人工合成的动物专用模拟物，可被活体动物细胞高效吸收并发挥稳定和高效的作用；在没有转染试剂的情况下，也可以高效进入靶细胞中发挥作用，可维持长达数周的效果。

实验操作参考：

1.慢病毒包装和侵染。转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，用含10％血清的培养基调整细胞密度为约5×10⁶个/15ml，重新接种于10cm细胞培养皿，37℃、5％CO₂培养箱内培养。24h待细胞密度达70％～80％时即可用于转染；转染前2h更换为无血清培养基；向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(GV载体质粒20μg、pHelper1.0载体质粒15μg、pHelper 2.0载体质粒10μg)，不相应体积的吉凯转染试剂混合均匀，调整总体积为1ml，在室温下温育15min；混合液缓慢滴加至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养；培养6h后弃去含有转染混合物的培养基，加入10ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混合物后倒弃；缓慢加入含10％血清的细胞培养基20ml，于37℃、含5％CO₂培养箱内继续培养48-72h。根据细胞状态，收集转染后48h的293T细胞上清液。于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片，以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中。分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内,设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃。离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液(可用PBS或细胞培养基替代)，轻轻反复吹打重悬。经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清按要求分装。运用倍比稀释原则对病毒进行滴度测定，感染口腔鳞状细胞癌细胞系HSC-3。感染24～48h后观察荧光标记基因的表达情况，荧光率大于80％，拍完荧光后补加500μL正常培养基，待长满后收集细胞用于FZD6基因的RNA提取或FZD6蛋白质检测验证。

2.Western blot技术。培养生长状态良好的空白组及处理组细胞至对数生长期。按照常规方法提取细胞总蛋白并进行BCA定量。通过SDS-PAGE分离，半干转至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭1小时，加入相应稀释比例的羊抗的FZD6抗体(1:1000)，4℃过夜。TBST洗膜后，加入辣根过氧化酶(HRP)标记的对应二抗(兔抗山羊IgG，1:5000)孵育1小时，充分洗膜后用ECL化学发光法进行暗室曝光。

3·免疫组织化学染色。方法同实施例4。结果：

本领域公知的，小干扰RNA可特异性识别靶基因的DNA或mRNA序列，在转录水平或转录后水平抑制靶基因表达。图5A～C表明，FZD6的过表达可导致OSCC侵袭、迁移能力增强；而FZD6的小干扰RNA能够通过抑制FZD6的表达，进而减弱OSCC侵袭、迁移能力。而使用miR-302b-3p也能明显减弱OSCC侵袭、迁移能力，效果与小干扰RNA类似。

由图5D可知，FZD6的小干扰RNA能够显著降低侵袭迁移关键蛋白RhoA、ROCK2、Vimentin的表达水平，过表达FZD6能够显著提高RhoA、ROCK2、Vimentin的表达水平，而过表达miR-302b-3p后，FZD6蛋白表达水平显著下降，且侵袭迁移关键蛋白RhoA、ROCK2、Vimentin的表达水平同样地显著下调。

由图5F可知，过表达FZD6可提高OSCC裸鼠肺转移模型中的肺转移数，这一结果可被miR-302b-3p逆转。

结论：miR-302b-3p通过抑制FZD6的表达，减弱OSCC侵袭、迁移能力。

综上，miR-302b-3p表达量与OSCC侵袭能力、迁移能力负相关；miR-302b-3p通过下调FZD6表达，减弱OSCC侵袭能力、迁移能力，延缓OSCC病程。因此，检测miR-302b-3p的试剂可以用于筛查OSCC的侵袭性和/或迁移性；且miR-302b-3p(及其前体)能够作为延缓OSCC侵袭和/或迁移的药物中的活性成分。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120> miR-302b-3p在作为口腔鳞状细胞癌抗肿瘤标志物中的用途

<130> GYKH1622-2020P019729CC

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

uaagugcuuc cauguuuuag uag 23

<210> 2

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

cuacuaaaac auggaagcac uua 23

<210> 3

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

cuacuaaaac auggaagcac uua 23

<210> 4

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<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

uuuguacuac acaaaaguac ug 22

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<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

caguacuuuu guguaguaca aa 22

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<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

caguacuuuu guguaguaca a 21

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<211> 23

<212> RNA

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<400> 7

cuacuaaaac auggaagcac uua 23

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<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

caguacuuuu guguaguaca aa 22

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<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

ucagcggcuu guaucuugu 19