用于治疗癌症的环状二核苷酸衍生物

文档序号：1776193 发布日期：2019-12-03 浏览：27次 >En<

阅读说明：本技术 用于治疗癌症的环状二核苷酸衍生物 (Cyclic annular dinucleotides derivative for treating cancer ) 是由金大式方家范远藤笃史崔亨旭郝鸣鸿鲍幸峰黄冠群于 2018-02-17 设计创作，主要内容包括：本文提供可用于治疗癌症的化合物。(Provided herein is the compounds that can be used for treating cancer.)

用于治疗癌症的环状二核苷酸衍生物

相关申请的交叉引用

本申请要求以下专利申请的权益：2017年2月17日提交的美国临时专利申请第62/460,562号；2017年3月30日提交的美国临时专利申请第62/479,169号；2017年8月29日提交的美国临时专利申请第62/551,645号；2017年8月29日提交的美国临时专利申请第62/551,647号；以及2017年8月29日提交的美国临时专利申请第62/551,668号。所有这些申请均通过引用并入本文，如同在此完全重写一样。

背景技术

STING(干扰素基因刺激因子)是胞质溶胶中对dsDNA先天反应的信号分子。已报道多种人类癌症中的STING缺失。此外，在黑色素瘤(Xia T等人，"Recurrent Loss of STINGSignaling in Melanoma Correlates with Susceptibility to Viral Oncolysis"Cancer Res.2016)和结肠癌(Xia T等人，"Deregulation of STING Signaling inColorectal Carcinoma Constrains DNA Damage Responses and Correlates WithTumorigenesis"Cell Rep.2016；14:282-97)中也报道了人类癌症中STING信号传导的失调。有趣的是，在这些研究中，基因组分析结果显示STING的表达缺失不是由于基因缺失或突变，而是通过表观遗传变化(Xia,Cancer Res.2016；Xia,Cell Rep.2016)。从小鼠模型研究获得的证据也支持STING的癌症保护活性。STING敲除小鼠显示出肿瘤控制缺陷(Woo SR等人，"STING-dependent cytosolic DNA sensing mediates innate immunerecognition of immunogenic tumors"Immunity 2014；41:830-42)。

此外，STING在保护个体发育中的作用已经在几个小鼠自发模型中得到证实，包括胶质瘤(Ohkuri T等人，"Protective role of STING against gliomagenesis:Rationaluse of STING agonist in anti-glioma immunotherapy"Oncoimmunology.2015；4:e999523)和结肠癌(Zhu Q等人，"Cutting edge:STING mediates protection againstcolorectal tumorigenesis by governing the magnitude of intestinalinflammation"J.Immunol.2014；193:4779-82)。这种抗肿瘤作用可能是由于其对抗NF-kB和STAT3过度激活的能力(Okihuri 2015)。STING途径的激活在临床前小鼠肿瘤模型中也显示出有效的活性(Woo 2014；Chandra D等人，"STING ligand c-di-GMP improves cancervaccination against metastatic breast cancer"Cancer Immunol Res.2014；2:901-10；Corrales L等人，"Direct Activation of STING in the Tumor MicroenvironmentLeads to Potent and Systemic Tumor Regression and Immunity"Cell Rep.2015；11:1018-30；Curran E等人，"STING Pathway Activation Stimulates Potent Immunityagainst Acute Myeloid Leukemia"Cell Rep.2016；15:2357-66；Tang CH等人，"Agonist-Mediated Activation of STING Induces Apoptosis in Malignant B Cells"CancerRes.2016；76:2137-52)。这种抗肿瘤活性可能是由于肿瘤脉管系统的破坏，然后诱导适应性免疫反应(Corrales L等人，"The host STING pathway at the interface of cancerand immunity"J.Clin.Invest.2016；126:2404-11)引起。因此，通过激动剂直接刺激肿瘤微环境中的STING可代表治疗多种癌症类型的新方法。

发明内容

实施方案可提供式I的化合物：

(其中P₁是如上所描绘的左下方的磷，P₂是如上所描绘的右上方的磷)，所述化合物具有如下文71所示的取代基和立体化学，或其药学上可接受的盐。表示单键或双键。

当磷原子具有四个不同的取代基时，该磷原子是立体中心。SpSp/RpRp/SpRp/RpSp指所示的磷立体化学。

表1

实施方案可进一步提供式II的化合物：

所述化合物具有如下文表2中所示的取代基和立体化学，或其药学上可接受的盐。当磷原子具有四个不同的取代基时，该磷原子是立体中心。

表2

化合物编号	R<sub>4a</sub>	几何构型	立体化学构型(P<sub>1</sub>,P<sub>2</sub>)
				13	-OH	反式	S,R
14	-OH	反式	R,R
				15	-F	反式	S,R
16	-F	反式	R,R

实施方案可提供式(III)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中

R_1a选自由以下各项组成的组：-H、卤素、-C_1-6烷基、-N₃、-CH₂R_2a、-NHR_2a或-OR_2a；

R_2a选自由-H、-C_1-6烷基组成的组，或者R_2a和R₃连接在一起代表-CH₂-、-CH₂CH₂-、-CH(CH₂Y₁)-或-CH₂CH(CH₂Y₁)-；

Y₁选自由以下各项组成的组：-H；任选地被-C_1-3烷基取代的-OH；任选地被C_1-3烷基取代的-NH₂；任选地被以下各项取代的烯丙基：(i)-OH，(ii)-OCH₃，(iii)C_1-3烷基，或(iv)卤素；任选地被以下各项取代的乙烯基：(i)-OH，(ii)-OCH₃，(iii)C_1-3烷基，或(iv)卤素；或者任选地被以下各项取代的-CH₃：(i)-OH，(ii)-OCH₃，(iii)C_1-3烷基，或(iv)卤素；

R_1b选自由以下各项组成的组：-H、卤素、-C_1-6烷基、-OR_2b、-NHR_2b，或者与R₁₁形成C_4-6环烷基或C_4-6杂环烷基；

R_2b选自由-H或-C_1-6烷基组成的组；

R₃是-H；-F；任选地被以下各项取代的-C_1-6烷基：(i)C_1-3烷基，(ii)-OH，(iii)卤素，或(iv)-OCH₃；任选地被以下各项取代的-C_2-6烯基：(i)C_1-3烷基，(ii)-OH，(iii)卤素，或(iv)-OCH₃；任选地被以下各项取代的C_2-6炔基：(i)C_1-3烷基，(ii)-OH，(iii)卤素，或(iv)-OCH₃；或者任选地被以下各项取代的-OC_1-6烷基：(i)C_1-3烷基，(ii)-OH，(iii)卤素，或(iv)-OCH₃；或者R₃与R_2a连接；

R_4a选自由以下各项组成的组：-H、卤素、-C_1-6烷基、-N₃、-CH₂R_5a、-NHR_5a或-OR_5a；

R_5a选自由-H、-C_1-6烷基组成的组，或者R_5a和R₆连接在一起代表-CH₂-、-CH₂CH₂-、-CH(CH₂Y₂)-或-CH₂CH(CH₂Y₂)-；

Y₂选自由以下各项组成的组：-H；任选地被-C_1-3烷基取代的-OH；任选地被C_1-3烷基取代的-NH₂；任选地被以下各项取代的烯丙基：(i)-OH，(ii)-OCH₃，(iii)C_1-3烷基，或(iv)卤素；任选地被以下各项取代的乙烯基：(i)-OH，(ii)-OCH₃，(iii)C_1-3烷基，或(iv)卤素；或者任选地被以下各项取代的-CH₃：(i)-OH，(ii)-OCH₃，(iii)C_1-3烷基，或(iv)卤素；

R_4b选自由以下各项组成的组：-H、卤素、-C_1-6烷基、-OR_5b、-NHR_5b，或者与R₁₂形成C_4-6环烷基或C_4-6杂环烷基；

R_5b选自由-H或-C_1-6烷基组成的组；

R₆是-H；-F；任选地被以下各项取代的-C_1-6烷基：(i)C_1-3烷基，(ii)-OH，(iii)卤素，或(iv)-OCH₃；任选地被以下各项取代的-C_2-6烯基：(i)C_1-3烷基，(ii)-OH，(iii)卤素，或(iv)-OCH₃；任选地被以下各项取代的C_2-6炔基：(i)C_1-3烷基，(ii)-OH，(iii)卤素，或(iv)-OCH₃；或者任选地被以下各项取代的-OC_1-6烷基：(i)C_1-3烷基，(ii)-OH，(iii)卤素，或(iv)-OCH₃；或者R₆与R_5a连接；

R₁₁是-H或-C_1-6烷基，或者R₁₁与R_1b形成环；

R₁₂是-H或-C_1-6烷基，或者R₁₂与R_4b形成环；

R₂₅和R₁₈相同或不同，并且独立地选自由以下各项组成的组：-H、C_1-3烷基，其为饱和或不饱和的，并且任选地被C_1-3烷基、-OH、卤素或-OCH₃取代；

Z₁和Z₂相同或不同，并且独立地选自-O-、-NH-、-N(C_1-3烷基)、-CH₂-和-S-；

P₁和P₂各自独立地具有S或R立体化学构型；

X_1a和X_2a相同或不同，并且独立地选自O或S；

X_1b和X_2b相同或不同，并且独立地选自由以下各项组成的组：-OR₁₉、-NR₁₉R₂₀和-SR₁₉-，

其中R₁₉和R₂₀各自独立地选自由以下各项组成的组：-H、-C_1-6烷基、-C(O)R₂₁、-CH₂OC(O)OR₂₁和-CH₂OC(O)NR₂₁R₂₂、-OC(O)OR₂₁和-CH₂OC(O)NR₂₁R₂₂；

其中R₂₁和R₂₂各自独立地选自-H和C_1-6烷基；

X₇和X₈相同或不同，并且独立地选自由以下各项组成的组：-O-、-CH₂-、-CHF-、-CF₂-、-S-和任选地被C_1-3烷基取代的-NH-；并且

L₁的长度为3至6个原子，其包含以下结构：

其中表示单键、双键或三键，并且其中(i)在L₁中出现0或1次表示三键的或者(ii)在L₁中出现0、1或2次表示双键的其中每个双键的几何结构是顺式或反式；和(iii)其中，当在L₁中出现1次表示三键的时，在L₁中出现0次表示双键的和(iv)其中，当在L₁中出现2次表示双键的时，这些双键是相邻键或交替键；

其中X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄和X₁₅独立地选自键；-O-；-NH-；-S-；-C(O)-；-CH-，其任选地被以下各项取代：(i)C₁-C₃烷基，(ii)-OH，或(iii)-OCH₃；以及-CH₂-，其任选地被以下各项取代：(i)C_1-3烷基，(ii)-OH，或(iii)-OCH₃；

并且其中包括X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄和X₁₅的基团的任何两个相邻的成员或三个邻接的成员可任选地与其它原子形成C_3-6环烷基，其任选地被一个或多个以下基团取代：(i)C_1-3烷基，(ii)-OH，或(iii)-OMe；C_5-6环芳基，其任选地被一个或多个以下基团取代：(i)C_1-3烷基，(ii)-OH，或(iii)-OMe；C_5-6杂环烷基，其任选地被一个或多个以下基团取代：(i)C_1-3烷基，(ii)-OH，或(iii)-OMe；或者C_3-6杂环芳基环，其任选地被一个或多个以下基团取代：(i)C_1-3烷基，(ii)-OH，或(iii)-OMe；并且其中

B₁和B₂独立地选自：

其中B₁和B₂上的q和r点处的键连接到式(III)上的q和r点处；

其中X₁₆选自由以下各项组成的组：-CH₂-、-O-、-NH-、-S-和-C(O)-，其任选地被C_1-3烷基、-OH或-OCH₃取代；

其中当存在时，R₁₃、R₁₄、R₁₅、R₁₆和R₁₇独立地选自由以下各项组成的组：-H、-F、-Cl、-I、-Br、-OH、-SH、-NH₂、C_1-3烷基、C_3-6环烷基、-O(C_1-3烷基)、-O(C_3-6环烷基)、-S(C_1-3烷基)、-S(C_3-6环烷基)、-NH(C_1-3烷基)、-NH(C_3-6环烷基)、-N(C_1-3烷基)₂和-N(C_3-6环烷基)₂；并且

其中X₁₇和X₁₈独立地选自由以下各项组成的组：-O-、-CR₂₃R₂₄-、-NR₂₃-和-S-；并且其中

R₂₃和R₂₄相同或不同，并且选自由-H和-C_1-3烷基组成的组。

其它实施方案可提供式(IV)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中

R_1a选自由以下各项组成的组：-H、卤素、-C_1-6烷基、-N₃、-CH₂R_2a、-NHR_2a或-OR_2a；

R_2a选自由-H和-C_1-6烷基组成的组；

R_1b选自由以下各项组成的组：-H、卤素、-C_1-6烷基、-OR_2b、-NHR_2b，或者与R₁₁形成C_4-6环烷基或C_4-6杂环烷基；

R_2b选自由-H或-C_1-6烷基组成的组；

R_4a选自由以下各项组成的组：-H、卤素、-C_1-6烷基、-N₃、-CH₂R_5a、-NHR_5a或-OR_5a；

R_5a选自由-H、-C_1-6烷基组成的组，或者R_5a和R₆连接在一起代表-CH₂-、-CH₂CH₂-、-CH(CH₂Y₂)-或-CH₂CH(CH₂Y₂)-；

R_4b选自由以下各项组成的组：-H、卤素、-C_1-6烷基、-OR_5b、-NHR_5b，或者与R₁₂形成C_4-6环烷基或C_4-6杂环烷基；

R_5b选自由-H或-C_1-6烷基组成的组；

R₁₁是-H或-C_1-6烷基，或者R₁₁与R_1b形成环；

R₁₂是-H或-C_1-6烷基，或者R₁₂与R_4b形成环；

R₂₅和R₁₈相同或不同，并且独立地选自由以下各项组成的组：-H、C_1-3烷基，其为饱和或不饱和的，并且任选地被C_1-3烷基、-OH、卤素或-OCH₃取代；

Z₁和Z₂相同或不同，并且独立地选自-O-、-NH-、-N(C_1-3烷基)、-CH₂-和-S-；

P₁和P₂各自独立地具有S或R立体化学构型；

X_1a和X_2a相同或不同，并且独立地选自O或S；

X_1b和X_2b相同或不同，并且独立地选自由以下各项组成的组：-OR₁₉、-NR₁₉R₂₀和-SR₁₉-，

其中R₂₁和R₂₂各自独立地选自-H和C_1-6烷基；

X₇和X₈相同或不同，并且独立地选自由以下各项组成的组：-O-、-CH₂-、-CHF-、-CF₂-、-S-和任选地被C_1-3烷基取代的-NH-；并且

L₁的长度为3至6个原子，其包含以下结构：

B₁和B₂独立地选自：

其中B₁和B₂上的q和r点处的键连接到式(IV)上的q和r点处；

其中X₁₆选自由以下各项组成的组：-CH₂-、-O-、-NH-、-S-和-C(O)-，其任选地被C_1-3烷基、-OH或-OCH₃取代；

其中X₁₇和X₁₈独立地选自由以下各项组成的组：-O-、-CR₂₃R₂₄-、-NR₂₃-和-S-；并且其中

R₂₃和R₂₄相同或不同，并且选自由-H和-C_1-3烷基组成的组。

其它实施方案可提供式(V)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中

R_1a选自由以下各项组成的组：-H、卤素、-C_1-6烷基、-N₃、-CH₂R_2a、-NHR_2a或-OR_2a；

R_2a选自由-H和-C_1-6烷基组成的组；

R_1b选自由以下各项组成的组：-H、卤素、-C_1-6烷基、-OR_2b、-NHR_2b，或者与R₁₁形成C_4-6环烷基或C_4-6杂环烷基；

R_2b选自由-H或-C_1-6烷基组成的组；

R_4a选自由以下各项组成的组：-H、卤素、-C_1-6烷基、-N₃、-CH₂R_5a、-NHR_5a或-OR_5a；

R_5a选自由-H和-C_1-6烷基组成的组；

R_4b选自由以下各项组成的组：-H、卤素、-C_1-6烷基、-OR_5b和-NHR_5b，或者与R₁₂形成C_4-6环烷基或C_4-6杂环烷基；

R_5b选自由-H或-C_1-6烷基组成的组；

R₁₁是-H或-C_1-6烷基，或者R₁₁与R_1b形成环；

R₁₂是-H或-C_1-6烷基，或者R₁₂与R_4b形成环；

R₂₅和R₁₈相同或不同，并且独立地选自由以下各项组成的组：-H、C_1-3烷基，其为饱和或不饱和的，并且任选地被C_1-3烷基、-OH、卤素或-OCH₃取代；

Z₁和Z₂相同或不同，并且独立地选自-O-、-NH-、-N(C_1-3烷基)、-CH₂-和-S-；

P₁和P₂各自独立地具有S或R立体化学构型；

X_1a和X_2a相同或不同，并且独立地选自O或S；

X_1b和X_2b相同或不同，并且独立地选自由以下各项组成的组：-OR₁₉、-NR₁₉R₂₀和-SR₁₉-，

其中R₂₁和R₂₂各自独立地选自-H和C_1-6烷基；

X₇和X₈相同或不同，并且独立地选自由以下各项组成的组：-O-、-CH₂-、-CHF-、-CF₂-、-S-和任选地被C_1-3烷基取代的-NH-；并且

L₁的长度为3至6个原子，其包含以下结构：

B₁和B₂独立地选自：

其中B₁和B₂上的q和r点处的键连接到式(V)上的q和r点处；

其中X₁₆选自由以下各项组成的组：-CH₂-、-O-、-NH-、-S-和-C(O)-，其任选地被C_1-3烷基、-OH或-OCH₃取代；

其中X₁₇和X₁₈独立地选自由以下各项组成的组：-O-、-CR₂₄R₂₃-、-NR₂₃-和-S-；并且其中

R₂₃和R₂₄相同或不同，并且选自由-H和-C_1-3烷基组成的组。

本说明书通篇描述了与式I至式V相关的实施方案的许多其它方面。例如，在一些实施方案中，药学上可接受的盐是二铵盐。在一些实施方案中，X_1b和X_2b是-SH。在一些实施方案中，R_4a是-F，并且R_4b、R₁₂和R₆是-H。在一些实施方案中，R_4b是-F，并且R_4a、R₁₂和R₆是-H。在其它实施方案中，R₁₂是-F，并且R_4a、R_4b和R₆是-H。在又一些其它实施方案中，R₆是-F，并且R_4a、R_4b和R₁₂是-H。在又一些其它实施方案中，R_1a是-F，并且R₃、R_1b和R₁₁是-H。

在其它实施方案中，R₃是-F，并且R_1a、R_1b和R₁₁是-H。在又一些其它实施方案中，R_1b是-F，并且R_1a、R₃和R₁₁是-H。在其它实施方案中，R₁₁是-F，并且R_1a、R_1b和R₃是-H。在其它实施方案中，X_1a和X_2a均为＝O。在又一些其它实施方案中，B₁和B₂均为

在其它实施方案中，X₇和X₈均为O。在其它实施方案中，L₁是在又一些其它实施方案中，X_1a是S，X_1b是-SH，X_2a是S，并且X_2b是-SH。在再一些其它实施方案中，Z₁和Z₂均为-O-。在其它实施方案中，X₁₇和X₁₈均为-O-。在又一些其它实施方案中，Z₁、Z₂、X₁₇和X₁₈各自为-O-。在又一些其它实施方案中，R₂₅和R₁₈均为-H。

实施方案可提供具有以下中的一种或多种的化合物或药学上可接受的盐：(i)在表达STING HAQ基因变体的细胞报道基因分析中EC₅₀值低于100微摩尔；(ii)在表达人STINGAQ变体的报道细胞中EC₅₀值低于100微摩尔；(iii)在表达人STING WT变体的报道细胞中EC₅₀值低于100微摩尔；以及(iv)在表达人STING REF变体的报道细胞中EC₅₀值低于100微摩尔。

实施方案可提供药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的化合物或药学上可接受的盐以及药学上可接受的赋形剂。实施方案可提供治疗癌症的方法，所述方法包括向患者施用有效量的本文所述的药物组合物。

实施方案可进一步提供本文所述的化合物的混合物，包括这些化合物的立体异构体的混合物。例如，可提供化合物11和化合物12的混合物，或者可提供化合物2和化合物4的混合物。当然，这些不是限制性实例，其它混合物也是可能的。

特定实施方案列于下表3中。

表3

在上表中，化合物8、11和12用相同的结构式绘示，并涉及三种独立的立体异构体。然而，申请人注意到，化合物8的磷手性不一定与标记为“立体异构体1”的其它化合物，例如化合物21的磷手性相同。其它立体异构体也是如此。

在一些实施方案中，本文所述的化合物作为游离酸提供。在一些实施方案中，化合物作为NH₄盐提供。在其它实施方案中，它是双TEA盐。

如上所述，实施方案可提供治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的本文所述的化合物或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，化合物作为游离酸施用。在一些实施方案中，化合物作为二铵盐(NH₄)施用。涵盖包含本文所述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。实施方案可提供式I的化合物，其中n是1；双键的几何结构是反式的；X₁和X₂各自为SH；P₁的立体化学是S；并且P₂的立体化学是R；或其药学上可接受的盐。

实施方案可提供治疗患者癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用本文所述的化合物或其药学上可接受的盐或者药物组合物。本文所述的所治疗的癌症可为转移性癌症。它们可以选自例如黑色素瘤、结肠直肠癌、乳腺癌、急性髓样白血病、结肠癌、肝癌和胶质瘤。还涵盖化合物、盐和药物组合物用于治疗癌症和/或制备用于治疗癌症的药剂的用途。

实施方案可提供治疗癌症的方法，所述方法包括鉴定患有用本文所述的化合物、药学上可接受的盐或药物组合物能治疗的癌症的个体，并向该个体施用化合物、药学上可接受的盐或药物组合物，患者已被鉴定为用该化合物、药学上可接受的盐或药物组合物能治疗。在一些实施方案中，通过患者中人REF STING变异等位基因的存在，个体被鉴定为患有用本文所述的化合物、药学上可接受的盐或药物组合物能治疗的癌症。

实施方案可提供治疗具有REF STING等位基因的患者癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用本文所述的化合物或其药学上可接受的盐或者药物组合物。

实施方案可提供治疗具有WT STING等位基因的患者癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用本文所述的化合物或其药学上可接受的盐或者药物组合物。

实施方案可提供治疗具有AQ STING等位基因的患者癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用本文所述的化合物或其药学上可接受的盐或者药物组合物。

实施方案可提供治疗具有HAQ STING等位基因的患者癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用本文所述的化合物或其药学上可接受的盐或者药物组合物。

实施方案可涉及C₄-C₆连接体，所述C₄-C₆连接体可在任一端共价结合到形成环状二核苷酸的一部分的嘌呤或嘧啶碱基。在一个实施方案中，连接体是在任一端结合到嘌呤碱基的丁烯、戊烯或己烯连接体。在另一个实施方案中，连接体是在任一端结合到嘌呤碱基的丁烯连接体；在另一个实施方案中，连接体是双键位于中心两个碳之间的反式丁烯连接体。

以下编号的实施方案说明了这些C₄-C₆连接体的使用：

1.一种式(X)化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

A₁和A₂是糖部分，并且可相同或不同；

B₃和B₄是嘌呤或嘧啶碱基，它们可相同或不同，并且分别与A₁和A₂形成核苷酸；

L是烷基连接体；

X₁₉和X₂₀相同或不同，并且选自由以下各项组成的组：-0-、-CH-、-NH-和-S-，其中-CH-和-NH-可以是被取代的或未被取代的。

2.根据编号实施方案1所述的化合物或药学上可接受的盐，其中X₁₉和X₂₀的-CH-和-NH-可被C_1-6烷基取代。

3.根据编号实施方案1所述的化合物或药学上可接受的盐，其中L是丁烯、戊烯或己烷。

4.根据编号实施方案3所述的化合物或药学上可接受的盐，其中L是双键位于中心的反式丁烯连接体。

具有编号的实施方案的化合物或药学上可接受的盐可用于例如治疗癌症。A₁、A₂、B₃和B₄可以进一步被例如羟基、卤素或甲氧基取代。式(X)中的每个磷可以被例如-SH、-OH、＝O或＝S取代，直至其化合价得到满足。

可受益于本发明连接体的环状二核苷酸类似物的实例包括但不限于以下文献中鉴定的那些：US 2014/0205653 A1；US 2014/0329889 A1；US 2014/0341976 A1；US 2015/0056224 A1；US 2016/0362441 A1；US 2017/0158724 A1；US 2017/044206 A1；US 5,547,941；US 7,569,555 B2；US 7,592,326 B2；US 7,709,458 B2；US 9,549,944 B2；WO 2009/133560 A1；WO 2015/074145 A1；WO 2015/077354 A1；WO 2015/185565 A1；WO 2016/100261 A1；WO 2016/120305 A1；WO 2016/145102 A1；WO 2017/027645 A1；WO 2017/027646 A1；WO 2017/075477 A1；WO 2017/093933 A1；WO 2017/123657 A1；WO 2017/175156 A1；EP 1740,192 B1；CN 102199183 A；Corrales,L.等人，“Direct Activation ofSTING in the Tumor Microenvironment Leads to Potent and Systemic TumorRegression and Immunity,”Cell Reports,11:1018-1030(2015)；以及Lioux,T.等人，“Design,Synthesis,and Biological Evaluation of Novel Cyclic Adenosine-InosineMonophosphate(cAIMP)Analogs That Activate Stimulator of Interferon Genes(STING),”J.Med.Chem.,59:10253-10267(2016)。所有这些文献，包括其中的化合物通过引用并入本文；如果这些文献中的任何一个的任何组成部分与本说明书中的任何内容相矛盾或与本说明书中的任何内容不一致，则以本说明书为准。

附图说明

图1示出了化合物1a和化合物2a的合成。

图2A和图2B示出了化合物1和化合物1a的替代合成。图2C中也示出了该替代合成。

图3示出了化合物1的¹H NMR光谱图。

图4A、图4B和图4C分别示出了化合物1的不对称晶体、来自不对称晶体的第一分子和来自不对称晶体的第二分子的X射线晶体学结果(ORTEP图)。

图4D示出了化合物2晶体的X射线晶体学结果(ORTEP图)。

图5A和图5B示出了化合物18、19和20的合成途径。

图6示出了WT STING(pLenti-WT人STING-Puro)的表达载体图。

图7和图8伴随实施例108，并且示出了化合物1a在CT26双重肿瘤模型中的治愈活性。

图9伴随实施例109，并且示出了所***的肿瘤体积图和存活曲线。

图10伴随实施例110，并且示出了所***的肿瘤体积图和存活曲线。

图11示出了与化合物1复合的人WT STING的X射线晶体结构的照片。

图12示出了与化合物1复合的人REF STING C末端结构域。

图13示出了化合物38和化合物39的合成实例。

具体实施方式

本文提供可用于治疗癌症的化合物。这些化合物可激活干扰素基因的刺激因子(STING)。

在一些实施方案中，化合物作为游离酸提供。在一些实施方案中，化合物作为例如NH₄盐或TEA盐提供。提及化合物编号后跟“a”表示给定化合物的二铵盐。例如，“化合物1a”指化合物1的二铵盐。

实施方案可提供治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的式I、式II、式III、式IV或式V化合物或者其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，化合物作为游离酸施用。在一些实施方案中，化合物作为例如二铵盐(NH₄)施用。还可提供用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂。

本文所述的实施方案可用于治疗癌症或制备用于治疗癌症的药剂。“癌症”可包括但不限于结肠癌、肝癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、乳腺癌、急性髓样白血病和胶质瘤。

本领域技术人员应认识到，当与磷原子(P₁、P₂)结合的取代基同时具有单键和双键时，它们可能容易发生互变异构。例如，化合物可以在平衡状态下互变异构。下面显示一个实例：

这种互变异构体应被认为在权利要求的范围内。给定化合物的任一互变异构体的结构表示将代表相同的化合物。

在一些实施方案中，选自由本文所述的化合物组成的组的化合物作为游离酸或其药学上可接受的盐提供。在一些实施方案中，选自由本文所述的化合物组成的组的化合物作为NH₄盐提供，其可以是二铵盐。

如本文所用，“C_1-6烷基”或“C₁-C₆”烷基旨在包括C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆直链(线性)饱和脂族烃基以及C₃、C₄、C₅或C₆支化饱和脂族烃基。例如，C_1-6烷基旨在包括C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆烷基。烷基的实例包括具有1至6个碳原子的部分，例如但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、仲戊基或正己基。类似地，“C_1-3烷基”或“C₁-C₃烷基”旨在包括C₁、C₂或C₃直链(线性)饱和脂族烃基以及C₃支化饱和脂族烃基。

如本文所用，术语“C_3-6环烷基”或“C₃-C₆环烷基”是指具有3至6个碳原子(例如，C₃-C₆)的饱和或不饱和的非芳族烃环。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环戊烯基和环己烯基。术语“C_5-6环烷基”或“C₅-C₆环烷基”是指具有5或6个碳原子(例如，C₅-C₆)的饱和或不饱和的非芳族烃环。

除非另有说明，否则术语“C_5-6杂环烷基”或“C₅-C₆杂环烷基”是指具有一个或多个杂原子(例如O、N或S)的饱和或不饱和的非芳族5-6元单环基团。除非另有说明，否则术语“C_4-6杂环烷基”或“C₄-C₆杂环烷基”是指具有一个或多个杂原子(例如O、N或S)的饱和或不饱和的非芳族4-6元单环基团。杂环烷基的实例包括但不限于哌啶基、哌嗪基、吡咯烷基、二噁烷基、四氢呋喃基、异二氢吲哚基、二氢吲哚基、咪唑烷基、吡唑烷基、噁唑烷基、异噁唑烷基、***烷基、环氧乙烷基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、1,2,3,6-四氢吡啶基、四氢吡喃基、四氢噻吩基、二氢吡喃基、吡喃基、吗啉基、1,4-二氮杂环庚烷基、1,4-氧杂氮杂环庚烷基等。

杂环烷基的其它实例包括但不限于吖啶基、吖辛基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并硫代呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并噁唑啉基、苯并噻唑基、苯并***基、苯并四唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑啉基、咔唑基、4aH-咔唑基、咔啉基、色满基、色烯基、噌啉基、十氢喹啉基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、二氢呋喃并[2,3-b]四氢呋喃基、呋喃基、呋呫基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、亚吲哚基(indolenyl)、二氢吲哚基、吲嗪基、吲哚基、3H-吲哚基、靛红酰基(isatinoyl)、异苯并呋喃基、异色满基、异吲唑基、异二氢吲哚基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、亚甲基二氧基苯基、吗啉基、萘啶基、八氢异喹啉基、噁二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、1,2,4-噁二唑5(4H)-酮、噁唑烷基、噁唑基、羟吲哚基、嘧啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁噻基(phenoxathiinyl)、吩噁嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并噁唑、吡啶并咪唑、吡啶并噻唑、吡啶基(pyridinyl)、吡啶基(pyridyl)、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、2H-吡咯基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹喔啉基、奎宁环基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、四唑基、6H-1,2,5-噻二嗪基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、噻嗯基、噻唑基、噻吩基(thienyl)、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、噻吩基(thiophenyl)、三嗪基、1,2,3-***基、1,2,4-***基、1,2,5-***基、1,3,4-***基和氧杂蒽基。

如本文所用，术语“C_5-6芳基”或“C₅-C₆芳基”是指在环结构中不含任何杂原子的具有5至6个碳原子(例如，C₅-C₆)的芳族烃环。

除非另有说明，否则术语“C_3-6杂芳基”或“C₃-C₆杂芳基”是指具有一个或多个杂原子(例如O、N或S)的芳族3-6元单环基团，只是杂芳基环将包含不超过一个氧原子或不超过一个硫原子。

术语“C_2-6烯基”包括具有2、3、4、5或6个碳并且含有至少一个双键的不饱和脂族基团。例如，术语“C_2-6烯基”包括直链烯基(例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基)和支化烯基。在某些实施方案中，直链或支化烯基在其主链中具有6个或更少的碳原子(例如，C₂-C₆直链、C₃-C₆支化链)。术语“C_2-6烯基”包括含有2至6个碳原子的烯基。

术语“C_2-6炔基”包括具有2、3、4、5或6个碳原子并且含有至少一个三键的不饱和脂族基团。例如，“炔基”包括直链炔基(例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基)和支化炔基。在某些实施方案中，直链或支化炔基在其主链中具有6个或更少的碳原子(例如，C₂-C₆直链、C₃-C₆支化链)。术语“C_2-6炔基”包括含有2至6个碳原子的炔基。

治疗方法

实施方案可提供治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的本文所述的化合物或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，所施用的化合物作为游离酸或其药学上可接受的盐提供。在一些实施方案中，所施用的化合物作为NH₄盐、游离酸或其药学上可接受的盐提供。在一些实施方案中，化合物作为NH₄盐提供。

术语“任选地被取代的”是指具有指定取代基的部分，所述取代基替代部分中一个或多个具有氢的原子上的一个或多个氢原子。

被命名或描绘的化学品旨在包括存在于本发明化合物中的原子的所有天然存在的同位素。同位素包括具有相同原子序数但不同质量数的那些原子。作为一般实例并且不具有限制性，¹H氢的同位素包括氚和氘，¹²C碳的同位素包括¹³C和¹⁴C。

剂量

治疗癌症的最佳剂量可以使用已知方法根据经验为每个个体确定，并且将取决于多种因素，包括药剂的活性；个体的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；施用时间和途径；以及个体正在服用的其它药物。可以使用本领域众所周知的常规测试和程序来确定最佳剂量。可以通过任何合适的途径来施用上述化合物。

如本文所用，“药学上可接受的盐”是指本公开中化合物的酸加成盐或碱加成盐。药学上可接受的盐是任何保持母体化合物的活性且在其施用环境中不会对其施用个体产生任何不适当的有害或不良影响的盐。药学上可接受的盐包括但不限于金属络合物以及无机酸和羧酸的盐。药学上可接受的盐还包括金属盐，例如铝盐、钙盐、铁盐、镁盐、锰盐和复盐。此外，药学上可接受的盐包括但不限于酸式盐，例如乙酸盐、天冬氨酸盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、醋氧乙基盐(axetil)、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、丁酸盐、依地酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯苯甲酸盐、柠檬酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯十二烷基硫酸盐(estolic)、乙磺酸盐(esyl)、乙烷磺酸盐(esylic)、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐(gluceptic)、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酸盐、羟乙酰基氨苯胂酸盐(glycolylarsanilic)、环己磺酸盐(hexamic)、己基间苯二酸盐(hexylresorcinoic)、海卓胺酸盐(hydrabamic)、氢溴酸盐、氢氯酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、羟基萘甲酸盐、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、粘康酸盐(muconic)、萘磺酸盐(napsylic)、硝酸盐、草酸盐、对-硝基甲磺酸盐、巴莫酸盐、泛酸盐、磷酸盐、一氢磷酸盐、二氢磷酸盐、苯二甲酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、氨基磺酸盐、对氨基苯磺酸盐、磺酸盐、硫酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐(teoclic)、甲苯磺酸盐等。也可以制备钠盐和钾盐。

实施方案可以是二铵盐。药学上可接受的盐可以衍生自氨基酸，包括但不限于半胱氨酸。制备盐形式化合物的方法是本领域技术人员已知的(例如，参见Stahl等人，Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,Wiley-VCH；Verlag Helvetica Chimica Acta,Zurich,2002；Berge等人，J.Pharm.Sci.66:1,1977)。

治疗剂的“有效量”是与个体或患者中未治疗的癌症相比足以提供可观察到的治疗益处的量。

本文所述的活性剂可以与药学上可接受的载体组合，以提供其药物制剂。载体和制剂的具体选择取决于组合物预期的具体施用途径。

如本文所用，“药学上可接受的载体”是指不会破坏与其一起配制的化合物的药理学活性的无毒的载体、佐剂或媒介物。可用于本发明组合物的药学上可接受的载体、佐剂或媒介物包括但不限于山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙二醇和羊毛脂。

本发明的组合物可适用于肠胃外、口服、吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、口腔、***或植入储库施用等。在一些实施方案中，制剂包含来自天然或非天然来源的成分。在一些实施方案中，制剂或载体可以无菌形式提供。无菌载体的非限制性实例包括无内毒素水或无热原水。

如本文所用，术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内以及颅内注射或输注技术。在特定实施方案中，化合物通过静脉内、口服、皮下或肌内施用来施用。本发明组合物的无菌注射形式可以是水性或油性混悬液。这些混悬液可以根据本领域已知的技术，使用合适的分散剂或湿润剂以及助悬剂来配制。无菌注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或混悬液。可采用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油常用作溶剂或悬浮介质。

为此目的，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂，天然的药学上可接受的油例如橄榄油或蓖麻油也是如此，尤其是聚氧乙烯化形式。这些油溶液或混悬液还可含有长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或通常用于配制药学上可接受的剂型(包括乳液和混悬液)的类似分散剂。其它常用的表面活性剂，例如Tween、Span和常用于制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型的其它乳化剂也可用于配制目的。

对于口服施用，化合物或盐可以可接受的口服剂型提供，包括但不限于胶囊、片剂、水性混悬液或溶液。就口服用片剂而言，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。也可以加入润滑剂，例如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服需要水性混悬液时，活性成分可以与乳化剂和助悬剂组合。如果需要，也可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。此外，还可以加入防腐剂。药学上可接受的防腐剂的合适实例包括但不限于各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如溶剂，例如乙醇、丙二醇、苯甲醇、氯丁醇、季铵盐和对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯等)。

“立即释放”意在包括常规释放，其中药物在施用后立即开始释放。如本文所用，术语“立即释放”包括允许药物溶出在胃肠内容物中，无意延迟或延长药物的溶出或吸收的剂型。目标是药物在施用后迅速释放，例如，在溶出试验中开始溶出后大约30分钟内可释放至少80％的药物。

“持续释放”或“延长释放”包括药物释放时间进程和/或位置特征经选择以实现常规剂型例如溶液或立即释放剂型所没有提供的治疗或便利目的的剂型。

术语“稳态”是指给定活性剂的血浆水平已经达到，并且随后的活性剂剂量保持在等于或高于给定活性剂的最低有效治疗水平且低于给定活性剂的最低毒性血浆水平的水平。

如本文所用，术语“单一制剂”是指配制成向患者递送有效量的两种治疗剂的单一载体或媒介物。单一媒介物被设计成递送有效量的每种药剂以及任何药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，媒介物是片剂、胶囊、丸剂或贴剂。

术语“单位剂量”在本文中用来指以一种剂型向所治疗的患者同时施用两种药剂。在一些实施方案中，单位剂量是单一制剂。在某些实施方案中，单位剂量包括一种或多种媒介物，使得每种媒介物包含有效量的药剂以及药学上可接受的载体和赋形剂。在一些实施方案中，单位剂量是同时向患者施用的一种或多种片剂、胶囊、丸剂或贴剂。

如本文所用，术语“剂量范围”是指指定药剂量的可接受变化的上限和下限。通常，可以向正在接受治疗的患者施用特定范围内任何量的药剂剂量。

术语“治疗”在本文中用来指减轻、减少或缓和个体疾病的至少一种症状。例如，就癌症而言，术语“治疗”可以指阻滞、延迟发作(即疾病或疾病症状的临床表现之前的时期)和/或降低疾病症状发展或恶化的风险。术语“保护”在本文中用来指预防、延迟或治疗(或全部，视情况而定)个体疾病症状的发展或持续或加重。

术语“个体”或“患者”旨在包括能够患癌症或受癌症侵袭的动物。个体或患者的实例包括哺乳动物，例如人、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在某些实施方案中，个体是人，例如患有癌症、具有患癌症风险或潜在地能够患癌症的人。

术语“约”或“近似”通常指给定值或范围的20％以内，更优选10％以内，最优选仍在5％以内。或者，特别是在生物系统中，术语“约”是指近似在对数(即一个数量级)内，优选在给定值的两倍内。

除非本文另外指明或者上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其在下文权利要求书的上下文中)，所用术语“一(a)”和“一(an)”和“所述(the)”以及类似指示物应当理解为涵盖单数与复数二者。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应理解为开放式术语(即，意味着“包括但不限于”)。除非本文另外指明，否则本文叙述的值的范围仅仅打算作为个别地表示此范围内的每一单独值的简化方法，并且每一单独值都被并入本说明书中，就如同其在本文中被个别地叙述一样。

可以使用本文公开的一种或多种化合物治疗的示例性细胞增殖性病症包括但不限于癌症、初癌或癌前病状，以及体内组织和器官中的转移性病变。细胞增殖性病症可包括增生、化生和发育异常。

本文公开的化合物或其药学上可接受的盐可用于治疗或预防细胞增殖性病症，或者在相对于大多数群体患癌症的风险增加的个体中，用于治疗或预防癌症，或者用于为这些目的识别合适的候选者。

药物制剂和施用途径

本文提供用于治疗癌症的包含化合物或其药学上可接受的盐的药物制剂。药物制剂可以另外包含载体或赋形剂、稳定剂、调味剂和/或着色剂。

化合物或其药学上可接受的盐可以使用本领域技术人员已知的多种施用途径施用。施用途径包括口服施用。在某些实施方案中，包含化合物或其药学上可接受的盐的药物制剂可以液体、糖浆、片剂、胶囊、粉末、喷洒剂、咀嚼片或可溶解圆片的形式口服。或者，本发明的药物制剂可以静脉内或透皮施用。本领域技术人员已知其它施用途径(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Gennaro A.R.编辑，第20版，Mack PublishingCo.,Easton,Pa.)。

在一些实施方案中，化合物或药学上可接受的盐被配制成糊剂、胶冻剂或混悬液。例如，药物以药物颗粒、微囊化颗粒或药物-聚合物颗粒的形式溶解、截留或悬浮在凝胶状溶液或半固体中。口服胶冻剂制剂的一个优点是，更容易向吞咽片剂、胶囊或丸剂有困难的患者施用药物。在某些实施方案中，化合物被充分混合并悬浮在合适的介质中以形成糊剂或凝胶。可以任选地混合其它试剂以在口服施用期间提供风味。用覆盆子和甜味剂调味的花生酱或海藻酸盐是许多合适的掩味剂的实例。在各种实施方案中，糊剂或胶冻剂也可以与本领域已知的用于局部施用的合适粘合剂或赋形剂一起配制。

制备片剂、胶囊或丸剂形式的持续释放制剂的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，持续释放制剂通过用聚合物，优选水不溶性聚合物涂覆药物的活性成分来制备。例如，在制药领域用作持续释放包衣剂、肠溶包衣剂或胃溶包衣剂的水不溶性聚合物。水不溶性聚合物可包括例如乙基纤维素、纯化虫胶、白色虫胶、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物RS、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素、羧甲基乙基纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、甲基丙烯酸共聚物L、甲基丙烯酸共聚物LD、甲基丙烯酸共聚物S、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物E或聚乙烯醇缩乙醛二乙基氨基乙酸酯。

水不溶性聚合物的类型、取代度和分子量可取决于活性成分在水或醇中的溶解度、所需的持续释放水平等。水不溶性聚合物可以单独使用，也可以组合使用。还可以掺入氢化油、硬脂酸或十六烷醇作为包衣助剂，以及中链甘油三酯、三醋精、柠檬酸三乙酯或十六烷醇作为增塑剂。

在一些实施方案中，持续释放制剂是基质型片剂或颗粒。活性成分可以涂覆有多达三种不同类型的聚合物。这三种不同类型的聚合物可包括：1)水不溶性聚合物，例如乙基纤维素；2)不依赖于pH的胶凝聚合物，例如羟丙基甲基纤维素；和3)依赖于pH的胶凝聚合物，例如海藻酸钠。这三种不同类型的聚合物可以一起用于降低药物的释放速率。

剂型：释放性质

持续释放制剂可以达到一定程度的持续效果。然而，活性成分的暴露和/或生物利用度可以基于多种因素而变化，例如吸收窗口、制剂中使用的载体或赋形剂、制剂的递送模式和/或活性成分通过患者胃肠道的转运时间。

治疗剂可含有至少一个用于执行持续释放功能的持续释放部分和一个用于执行立即释放功能的立即释放部分。在某些实施方案中，当治疗剂为单一剂型时，它可以呈以下形式：由构成持续释放部分的持续释放颗粒和构成立即释放部分的立即释放颗粒的混合物形成的片剂、通过用持续释放颗粒和立即释放颗粒填充胶囊而获得的胶囊制剂、或者其中构成立即释放部分的外层形成在构成持续释放部分的内核上的压制包衣片剂。然而，对上述实施方案没有限制。

此外，对组合物或立即释放部分或持续释放部分中药物的容纳状态没有特别限制；化合物可以均匀地分散在组合物、立即释放部分或持续释放部分中，或者可以仅包含在组合物、立即释放部分或持续释放部分的一部分中，或者可以包含成具有浓度梯度。

根据本发明的组合物中的持续释放部分可含有至少一种用于控制药物释放的不依赖于pH的聚合物物质或依赖于pH的聚合物物质。

本文所用的不依赖于pH的聚合物物质可包括电荷状态在胃肠道中通常发现的pH条件，特别是pH 1至pH 8下几乎不变的聚合物物质。这意味着例如聚合物物质不具有电荷状态随pH而变化的官能团，例如碱性官能团例如氨基或酸性官能团例如羧酸基团。注意，不依赖于pH的聚合物物质可出于赋予根据本发明的组合物持续释放的功能而包含在内，但是也可以出于另一目的而包含在内。此外，本发明中使用的不依赖于pH的聚合物物质可以是不溶于水的，或者可以在水中溶胀或在水中溶解而形成凝胶。

水不溶性的不依赖于pH的聚合物物质的实例包括但不限于纤维素醚、纤维素酯和甲基丙烯酸-丙烯酸共聚物(商品名Eudragit，由Rohm GmbH&Co.KG,Darmstadt,Germany制造)。实例包括但不限于纤维素烷基醚，例如乙基纤维素(商品名Ethocel，由Dow ChemicalCompany,USA制造)、乙基甲基纤维素、乙基丙基纤维素或异丙基纤维素和丁基纤维素；纤维素芳烷基醚，例如苄基纤维素；纤维素氰烷基醚，例如氰乙基纤维素；纤维素有机酸酯，例如乙酸丁酸纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素或丁酸纤维素，以及乙酸丙酸纤维素；丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸甲酯共聚物(商品名Eudragit NE，由Rohm GmbH&Co.KG,Darmstadt,Germany制造)和甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物RS(商品名Eudragit RL,Eudragit RS)。对用于本发明的水不溶性聚合物的平均粒径没有特别限制，但通常该平均粒径越小，性能越好，平均粒径优选为0.1-100μm，更优选为1-50μm，特别优选为3-15μm，最优选为5-15μm。此外，水溶性或水溶胀性的不依赖于pH的聚合物物质的实例包括但不限于聚环氧乙烷(商品名Polyox，由Dow Chemical Company制造，分子量为100,000至7,000,000)、低取代羟丙基纤维素(商品名L-HPC，由Shin-Etsu Chemical,Japan制造)、羟丙基纤维素(商品名HPC，由NipponSoda,Co.,Ltd,Japan制造)、羟丙基甲基纤维素(商品名Metolose 60SH、65SH、90SH，由Shin-Etsu Chemical,Japan制造)和甲基纤维素(商品名Metolose SM，由Shin-EtsuChemical,Japan制造)。

在一些实施方案中，组合物中可以含有单一的不依赖于pH的聚合物物质，或者可以含有多种不依赖于pH的聚合物物质。如果在本文所述的实施方案中使用，不依赖于pH的聚合物物质可以是水不溶性聚合物物质，更优选乙基纤维素、丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸甲酯共聚物(商品名Eudragit NE)或甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物RS(商品名Eudragit RL,Eudragit RS)。特别优选乙基纤维素和甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物RS中的至少一种。最优选乙基纤维素。对组合物中所含的不依赖于pH的聚合物物质的量没有特别的限制；该量可以根据例如控制药物持续释放的目的适当调整。

可用于本文所述的实施方案中的依赖于pH的聚合物物质可以是电荷状态在胃肠道中通常发现的pH条件，特别是pH 1至pH 8下变化的聚合物物质。这意味着例如聚合物物质具有电荷状态随pH而变化的官能团，例如碱性官能团例如氨基或酸性官能团例如羧酸基团。依赖于pH的聚合物物质的依赖于pH的官能团优选是酸性官能团，依赖于pH的聚合物物质最优选具有羧酸基团。

本发明中使用的依赖于pH的聚合物物质可以是不溶于水的，或者可以在水中溶胀或在水中溶解而形成凝胶。用于本发明的依赖于pH的聚合物物质的实例包括但不限于肠溶性聚合物物质。肠溶性聚合物物质的实例包括但不限于甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物(Eudragit L100、Eudragit S100，由Rohm GmbH&Co.KG,Darmstadt,Germany制造)、甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物(Eudragit L100-55、Eudragit L30D-55，由Rohm GmbH&Co.KG,Darmstadt,Germany制造)、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(HP-55、HP-50，由Shin-EtsuChemical,Japan制造)、乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素(AQOAT，由Shin-Etsu Chemical,Japan制造)、羧甲基乙基纤维素(CMEC，由Freund Corporation,Japan制造)和乙酸邻苯二甲酸纤维素。

在水中溶胀或在水中溶解而形成凝胶的依赖于pH的聚合物物质的实例包括但不限于海藻酸、果胶、羧乙烯基聚合物和羧甲基纤维素。在本发明中，组合物中可以含有单一的依赖于pH的聚合物物质，或者可以含有多种依赖于pH的聚合物物质。用于本发明的依赖于pH的聚合物物质优选为肠溶性聚合物物质，更优选甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物、甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素或乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素，特别优选甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物。

当在根据本发明的组合物的制造过程中使用依赖于pH的聚合物物质时，可以原样使用粉末型或颗粒型的市售产品，或者其中依赖于pH的聚合物物质已经预先分散在溶剂中的悬浮型产品，或者这种市售产品可以分散在水或有机溶剂中使用。依赖于pH的聚合物物质的粒径越小，性能越好，依赖于pH的聚合物物质优选为粉末型。在甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物的情况下，一个实例是Eudragit L100-55。对用于本发明的依赖于pH的聚合物物质的平均粒径没有特别限制，但平均粒径优选为0.05-100μm，更优选为0.05-70μm，最优选为0.05-50μm。此外，对依赖于pH的聚合物物质的量没有特别限制，例如，在肠溶性聚合物物质的情况下，基于100重量份的组合物，该量通常为0.1-90重量份，优选1-70重量份，更优选5-60重量份，特别优选10-50重量份。

根据本文所述的实施方案的治疗剂还可以根据需要含有任何各种添加剂，例如任何各种药理学上可接受的载体，例如稀释剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂，以及防腐剂、着色剂、甜味剂、增塑剂、薄膜包衣剂等。稀释剂的实例包括但不限于乳糖、甘露醇、磷酸氢钙、淀粉、预胶化淀粉、结晶纤维素、轻质硅酸酐、合成硅酸铝、偏硅酸镁铝等。润滑剂的实例包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石、硬脂酰富马酸钠等。粘合剂的实例包括但不限于羟丙基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。崩解剂的实例包括但不限于羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素等。防腐剂的实例包括但不限于对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯甲醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。着色剂的优选实例包括但不限于水不溶性色淀颜料、天然颜料(例如β-胡萝卜素、叶绿素、氧化铁红)、氧化铁黄、氧化铁红、氧化铁黑等。甜味剂的优选实例包括但不限于糖精钠、甘草酸二钾、阿斯巴甜、甜叶菊等。增塑剂的实例包括但不限于甘油脂肪酸酯、柠檬酸三乙酯、丙二醇、聚乙二醇等。薄膜包衣剂的实例包括但不限于羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素等。

制造方法

为了制造本文所述的实施方案，可以使用单一常规方法或常规方法的组合。例如，当制造作为持续释放部分或立即释放部分的含药颗粒时，造粒是主要操作，但该操作可以与其它操作组合，例如混合、干燥、筛分和分类。作为造粒方法，可以使用例如向粉末中加入粘合剂和溶剂并进行造粒的湿造粒方法、压缩粉末并进行造粒的干造粒方法、加入加热熔融的粘合剂并进行加热和造粒的熔融造粒方法等。

此外，根据造粒方法，可以使用诸如以下操作方法：使用行星式混合器、螺杆混合器等的混合造粒方法、使用Henschel混合器、Super混合器等的高速混合造粒方法、使用圆筒式造粒机、旋转造粒机、螺杆挤出造粒机、颗粒磨型造粒机等的挤出造粒方法、湿式高剪切造粒方法、流化床造粒方法、压缩造粒方法、粉碎造粒方法或喷雾造粒方法。造粒后，可以使用干燥器、流化床等进行干燥，粉碎和筛分，以获得供使用的颗粒或细颗粒。此外，当制备根据本发明的组合物时，可以使用造粒溶剂。对这种造粒溶剂没有特别限制，该造粒溶剂可以是水或各种有机溶剂中的任何一种，例如水、低级醇例如甲醇或乙醇、酮例如丙酮或甲基乙基酮、二氯甲烷或其混合物。

对于实施方案中所含的持续释放颗粒，将至少一种药物和至少一种选自不依赖于pH的聚合物物质和依赖于pH的聚合物物质的聚合物物质混合在一起，根据需要加入稀释剂和粘合剂，并进行造粒以获得颗粒物质。使用厢式干燥器、流化床干燥器等干燥获得的颗粒物质，并使用研磨机或振荡器进行筛分，由此可以获得持续释放颗粒。或者，作为本发明中制造持续释放颗粒的方法，可以使用干式压实机例如辊压机或击压压片机(slugtabletting machine)加入至少一种药物、至少一种选自不依赖于pH的聚合物物质和依赖于pH的聚合物物质的聚合物物质，以及根据需要加入稀释剂和粘合剂，并在混合的同时进行压缩成型，然后通过粉碎至合适的尺寸进行造粒。使用这种造粒机制备的颗粒物质可以原样用作根据本发明的颗粒或细颗粒，或者可以使用动力磨、辊式造粒机、高速研磨机(rotor speed mill)等进一步粉碎，并筛分以获得持续释放颗粒。注意，立即释放颗粒也可以如持续释放颗粒这般来制造。

压缩成型产品可以使用单一常规方法或常规方法的组合制造成含药物的持续释放部分或立即释放部分，或本文所述的组合物。例如，使用至少一种药物、至少一种选自不依赖于pH的聚合物物质和依赖于pH的聚合物物质的聚合物物质、稀释剂例如甘露醇或乳糖、粘合剂例如聚乙烯吡咯烷酮或结晶纤维素、崩解剂例如羧甲基纤维素钠或交聚维酮以及润滑剂例如硬脂酸镁或滑石，并使用普通方法进行压片，由此可以获得压缩成型产品。在这种情况下，压片是制造压缩成型产品的方法中的主要操作，但该操作可以与其它操作组合，例如混合、干燥、糖衣形成和包衣。

压片方法的实例包括但不限于直接压缩成型，其中将至少一种药物和药理学上可接受的添加剂混合在一起，然后使用压片机将混合物直接压缩成型成片剂，以及干颗粒压制或湿颗粒压制，其中根据本发明的持续释放颗粒或立即释放颗粒在根据需要加入润滑剂或崩解剂后进行压缩成型。对用于压缩成型的压片机没有特别限制；例如，可以使用单冲头压片机、旋转压片机或压涂压片机(press-coated tabletting machine)。

根据本文实施方案的含药物的持续释放颗粒或立即释放颗粒，或压缩成型产品可以颗粒或片剂的形式作为组合物使用，但也可以进行进一步加工以制造组合物。例如，压缩成型产品或颗粒可以使用膜基材料例如乙基纤维素、酪蛋白、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸共聚物L、乙酸邻苯二甲酸纤维素、虫胶等施加薄膜包衣，或者使用含有蔗糖、糖醇、***树胶粉末、滑石等的糖衣液体施加糖衣，从而制成薄膜包衣片剂或糖衣片剂。该包衣技术中的一种溶剂可以是纯净水，但是也可以使用有机溶剂，例如醇、酮、醚或氯化烃，或者它们的混合物。例如，乙醇、丙酮、二氯甲烷等可以用作有机溶剂。此外，作为涂覆设备，可以使用通常用于制造药物的涂覆技术中的设备，实例包括其中通过喷射涂覆液等进行涂覆的喷雾涂覆设备，以及用于分层的转子流化床造粒机。

在制造胶囊制剂的情况下，胶囊制剂可以通过使用自动胶囊填充机将如上所述的持续释放颗粒或立即释放颗粒或者微型片剂填充到硬明胶胶囊或HPMC胶囊中来制造。或者，在按管施用制剂或在服用时与水等混合使用的干糖浆的情况下，如上所述的持续释放颗粒或立即释放颗粒可以与增稠剂或分散剂混合以分散这些颗粒，然后将混合物制成颗粒或片剂。此外，可以使用水和选自分散剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、pH调节剂、甜味剂、调味剂、芳香剂等的物质制成液体或胶冻剂。然而，关于其它制造方法，对上述内容没有限制。

为了更全面地理解本文所述的实施方案，阐述了以下实施例。应当理解，这些实施例仅用于说明目的，不应被解释为限制。

实施例

在所有实施例中可以使用以下缩写。

All：烯丙基

BOP：(苯并***-1-基氧基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐

DMT：4,4′-二甲氧基三苯甲基

(DMTO-：

Bz：苯甲酰基

ib：异丁酰基

Hunig碱：i-Pr₂NEt(二异丙基乙胺)

AllylOH：烯丙醇

OAll：-OCH₂CHCH₂

ACN：乙腈

All：-CH₂CHCH₂

2-NitroBnBr：2-硝基苄基溴

Bz：苯甲酰基

ib：异丁酰基

i-Pr：异丙基

CE：氰乙基

DEAD：偶氮二甲酸二乙酯

DIAD：偶氮二甲酸二异丙酯

DCM：二氯甲烷

DDTT：N,N-二甲基-N'-(3-硫酮基-3H-1,2,4-二噻唑-5-基)甲脒

DMOCP：2-氯-5,5-二甲基-1,3,2-二氧磷杂环己烷2-氧化物

TBS：叔丁基二甲基甲硅烷基

3H-苯并[c][1,2]二硫醇-3-酮：

实施例1--化合物1a的合成

该合成的完整方案可在图1中获得。

步骤A

在环境温度下，向(2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙基亚磷酰胺(化合物100)(磷非对映异构体的混合物；80.0g，91.332mmol，1当量，ChemGenes公司目录#ANP-9151)、烯丙醇(9.63ml,142mmol,1.55当量)和三苯基膦(38.3g,146mmol,1.60当量)在THF(1.1L)中的混合物中加入DEAD(在甲苯中的40重量％溶液；54.2ml,137mmol,1.5当量)。在环境温度下继续搅拌，并通过LC/MS监测反应。完成后(19小时)，真空浓缩(35℃)混合物，并通过硅胶柱色谱(800g×2个柱，用0.5％三乙胺缓冲的正庚烷中的40-60％EtOAc)对所得混合物进行纯化，得到作为白色泡沫的化合物101(84.2g，定量产率，磷非对映异构体的混合物)。

¹H NMR(磷非对映异构体的3:2混合物，400MHz,CDCl₃)1.14-1.21(m,12H)2.40(t,J＝6.2Hz,1.2H)2.59(t,J＝6.2Hz,0.8H)3.27(d,J＝8.6Hz,1H)3.52-3.66(m,5H)3.78(s2.4H)3.79(s 3.6H)4.28-4.34(m,1H)4.84-4.96(m,0.4H)4.99(d,J＝5.5Hz,2H)4.95-5.10(m,0.6H)5.05(d,J＝10.9Hz,1H)5.22(br d,J＝17.6Hz,1H)5.64(br d,J＝53.2Hz,0.6H)5.70(br d,J＝51.6Hz,0.4H)5.96-6.75(m,1H)6.20(d,J＝16.0Hz,0.6H)6.24(d,J＝17.2Hz,0.4H)6.74-6.79(m,4H)7.02-7.06(m,2H)7.17-7.24(m,8H)7.32-7.34(m,2H)7.41-7.44(m,2H)8.11(s,1H)8.52(s,0.4H)8.54(s,0.6H)。

步骤B

向化合物101(3.00g,3.28mmol,1当量)在乙腈(30ml)中的溶液中加入水(0.118ml,6.55mmol,2.0当量)和吡啶三氟乙酸盐(0.759g,3.93mmol,1.2当量)。在环境温度下搅拌1分钟后，加入叔丁基胺(14.5g,21.0ml,0.20mol,60当量)。氰乙基完全裂解后(通过LC/MS监测)，真空浓缩反应混合物，并与乙腈共沸两次。将粗混合物溶解在DCM(45.0ml)中，并在环境温度下用水(0.118ml,6.55mmol,2.0当量)和NaHSO₄-SiO₂(1.18g,6.55mmol,2当量)处理。DMT基团完全裂解后(通过LC/MS监测，约1小时)，过滤反应混合物，并用DCM/MeOH(9/1,20ml)冲洗两次。将合并的滤液真空浓缩，并用正庚烷/甲苯的1:1混合物(约30ml)处理。通过倾析除去顶层。用正庚烷/甲苯(1/1,30ml)再次重复相同的操作，并将底层与乙腈共沸两次，得到化合物102(假设100％的理论产率)。产物未经进一步纯化即用于下一步骤。

步骤C

向化合物102(1.56g,3.27mmol,1当量)和化合物101(3.00g,3.28mmol,1当量)在乙腈(30ml)中的混合物中加入吡啶三氟乙酸盐(与吡啶共沸干燥；0.760g,3.94mmol,1.25当量)。5分钟后，加入DDTT(0.840g,4.09mmol,1.30当量，ChemGenes公司目录#RN-1588)，并在完全硫化后(通过LC/MS监测)，真空浓缩反应混合物。将残余物溶解在DCM(30ml)中，并在DCM(30ml)中用水(0.57ml,32mmol,10当量)和在DCM中的6％二氯乙酸(1.56ml,18.9mmol,6.0当量)处理。20分钟后，用吡啶(20ml)猝灭反应，并真空浓缩。将残余物与吡啶共沸，得到化合物103(3.22g，假设100％的理论产率)。产物未经进一步纯化即用于下一步骤。

步骤D

在环境温度下，向化合物103(3.22g,3.15mmol,1当量)在吡啶(100ml)中的溶液中加入DMOCP(1.45g,7.88mmol,2.50当量)。完全大环化后(通过LC/MS监测)，加入水(1.7ml,94.5mmol，相对于DMOCP的×10倍)，然后加入3H-苯并[c][1,2]二硫醇-3-酮(0.795g,4.73mmol,1.5当量)。完全硫化后(约40分钟)，将反应混合物部分真空浓缩至约15ml，并倒入饱和NaHCO₃水溶液(50ml)和水(30ml)的混合物中。在环境温度下搅拌10分钟后，用EtOAc/MTBE的1:1混合物(60ml×3次)萃取混合物。合并有机层，用盐水(25ml)洗涤，用Mg₂SO₄干燥，并真空浓缩。通过硅胶柱色谱(在DCM中的0-20％MeOH)对残余物进行纯化，得到作为褐色油状物的化合物104(3.31g,3.20mmol，假设100％的理论产率)。产物未经进一步纯化即用于下一步骤。

步骤E

向化合物104(3.31g,3.20mmol,1当量)在乙腈(66.2ml)中的溶液中加入2-硝基苄基溴(2.42g,11.2mmol,3.50当量)和三乙胺(1.78ml,12.8mmol,4.00当量)。完全反应后(通过LC/MS监测，在环境温度下约20小时)，真空浓缩反应混合物，并通过硅胶柱色谱(60％乙酸乙酯/正庚烷至100％乙酸乙酯)进行纯化，得到0.568g作为磷非对映异构体的混合物的产物。制备型HPLC分离非对映异构体，得到化合物105(SR异构体；0.225g,0.180mmol，自化合物101的总产率为5.6％)和化合物106(RR异构体；0.187g,0.149mmol，自化合物1的总产率为4.7％)。

化合物105(SpRp)¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝8.63(s,1H),δ＝8.61(s,1H),8.04-8.00(m,2H),7.99(s,1H),7.90(s,1H),7.65-7.44(m,8H),7.40-7.31(m,4H),7.25-7.21(m,4H),6.15-5.89(m,5H),5.61(dd,J＝52.0,5.1Hz,1H),5.55(ddd,J＝51.2,4.7,2.7Hz,1H)5.51-5.42(m,1H),5.31-5.22(m,2H),5.11(dd,J＝3.9,9.8Hz,2H),5.04-4.95(m,4H),4.55-4.37(m,7H),4.29-4.12(m,3H)

化合物106(RpRp)¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝8.65(s,2H),8.06(dd,J＝1.4,8.0Hz,2H),7.98(s,2H),7.57-7.52(m,6H),7.47-7.32(m,6H),7.25-7.21(m,4H),6.15(d,J＝18.7Hz,2H),6.09-5.99(m,2H),5.82-5.76(m,2H),5.60(dd,J＝51.8,4.9Hz,2H),5.27(dd,J＝1.2,17.2Hz,2H),5.12(dd,J＝1.0,10.4Hz,2H),5.06-4.96(m,4H),4.55-4.40(m,4H),4.36-4.24(m,4H),4.21-4.02(m,2H)

制备型HPLC条件：

步骤F

向化合物105(519mg,0.414mmol,1当量)在甲苯(519ml)中的加热(90℃)溶液中加入第二代Hoveyda-Grubbs Catalyst^TM((1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基)二氯(邻异丙氧基苯基亚甲基)钌；可以目录号569755获得；CAS301224-40-8；91mg,0.15mmol,0.35当量)和醌(0.102ml,1.243mmol,3.0当量)。将混合物加热至回流，并通过LC/MS监测反应进程。3小时后，加入额外的催化剂(91mg,0.15mmol,0.35当量)，并再继续反应3小时。冷却后，将混合物在环境温度下用DMSO(0.59ml,8.3mmol,20当量)处理15小时，真空浓缩，并通过硅胶柱色谱(SiO₂ 25g，在正庚烷中的66％乙酸乙酯至100％乙酸乙酯)进行纯化，得到作为褐色干泡沫的化合物107(200mg,0.163mmol,39％产率)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝8.19(s,1H),8.12(dd,J＝7.8Hz,1.9Hz,1H),8.10(s,1H),8.02(d,J＝8.2Hz,1H),7.89(s,1H),7.63(br d,J＝7.0Hz,1H),7.53-7.41(m,10H),7.35-7.30(m,2H),7.25-7.20(m,4H),6.23(d,J＝17.6Hz,1H),6.14(d,J＝18.8Hz,1H),5.86-5.75(m,1H),5.75(dt,J＝15.3,5.0Hz,1H),5.67(dt,J＝15.3,4.7Hz,1H),5.60(dd,J＝52.0,3.9Hz,1H),5.48(dd,J＝50.4,3.9Hz,1H),5.50-5.39(m,1H),4.91-4.64(m,4H),4.57-4.25(m,9H),4.15(d,J＝7.03Hz,1H),4.11(d,J＝7.03Hz,1H)。

步骤G

向化合物107(88mg,0.072mmol,1当量)在1,4-二噁烷(1.76ml)中的溶液中加入苯硫酚(0.88mL,8.55mmol,119当量)和三乙胺(0.88mL,6.31mmol,88当量)。在环境温度下搅拌所得混合物。完全反应后(通过LC/MS监测，13小时)，加入甲醇(5.28ml)和28％氢氧化铵(3.52ml)，并将所得混合物加热至50℃。完全反应后(通过LC/MS监测，5小时)，将混合物冷却至环境温度，过滤所得褐色浆液，并用水(15ml)冲洗。再次过滤滤液以除去额外的固体。用甲苯和庚烷的1:1混合物(30ml)萃取最终滤液两次。真空浓缩水层，然后再悬浮于水(6ml)中。滤出所得固体，并对滤液进行制备型HPLC，得到作为白色固体的化合物1二铵盐(也称为化合物1a)(39mg,0.050mmol，70％产率)。

化合物1a(SpRp，反式)¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ＝9.05(s,1H),8.33(s,1H),8.25(s,1H),8.12(s,1H),6.34(br s,2H),5.88(br s,2H),5.66(br d,J＝51.6Hz,1H),5.59(brd,J＝52.2Hz,1H),5.01(br s,2H),4.68-4.34(m,6H),4.07-3.82(m,2H),3.79-3.55(m,2H)；³¹P NMR(162MHz,CD₃OD)δ＝55.48(s,1P),55.16(s,1P)。

化合物1a制备型HPLC条件：

实施例1.1--化合物1a的替代合成

化合物1a的替代合成途径在图2A和图2B以及图2C中列出，并在下面报告。

阶段1

将化合物129(570g,1.53mol,1wt,1vol,1当量)溶解在吡啶(2.85L,35.2mol,4.89wt,5.0vol,23当量)中。将混合物冷却至2.6℃，并用4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(DMTCl；543g,1.60mol,0.953wt,1.05当量)处理。将混合物在0-5℃下搅拌2小时，然后升温至环境温度。通过LC/MS监测反应，并在过夜搅拌后确认完全转化。将反应混合物冷却至5℃以下，并通过用MeOH(124ml,3.05mol,0.172wt,0.217vol,2.0当量)处理15分钟而猝灭。将混合物在真空下与甲苯(2.00L,3.04wt,3.51vol)共蒸发，然后用EtOAc(2.850L,4.5wt,5.0vol)和正庚烷(2.85L,3.42wt,5.0vol)的混合物稀释。用饱和NaHCO₃(9重量％水溶液；2.0L,3.5vol)洗涤有机层。加入额外的EtOAc(2.85L,4.5wt,5.0vol)以完全溶解粗产物。搅拌5分钟后，分离两层。用水(2.0L,3.5wt,3.5vol)洗涤有机层。固体开始慢慢从有机层沉淀出来。分离水层。然后，将有机层浓缩至约1vol。将粗产物用正庚烷(2.00L,2.40wt,3.51vol)和甲苯(0.50L,0.76wt,0.88vol)的混合物制浆。搅拌15分钟后，通过真空过滤来收集浅黄色固体。滤饼依次用以下各项冲洗：(1)正庚烷(0.60L,0.72wt,1.05vol)和甲苯(0.30L,0.46wt,0.53vol)的混合物，然后(2)正庚烷(3.00L,3.6wt,5.26vol)。在不加热下干燥固体30分钟，然后转移至托盘中，在真空烘箱中于50℃下干燥过夜，得到作为浅黄色固体的化合物130(996.7g,1.47mol,1.75wt,97％产率)。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.99(s,1H),8.76(s,1H),8.21(s,1H),8.04-8.00(m,2H),7.64-7.59(m,1H),7.57-7.50(m,2H),7.41-7.36(m,2H),7.32-7.15(m,7H),6.83-6.76(m,4H),6.31(dd,J＝2.5,17.0Hz,1H),5.68(ddd,J＝2.3,4.7,52.7Hz,1H),4.88-4.77(m,1H),4.26-4.21(m,1H),3.77(s,6H),3.57(dd,J＝3.1,10.9Hz,1H),3.43(dd,J＝4.1,10.7Hz,1H),2.60(br s,1H)

阶段1’

将化合物129(430g,1.15mol,1wt,1vol,1当量)和咪唑(118g,1.73mol,0.274wt,1.50当量)溶解在DMF(1.72L,3.78wt,4.0vol)中，并将所得混合物冷却至5℃。加入TBS-Cl(191g,1.27mol,0.444wt,1.10当量)。将混合物在0-11℃下搅拌2小时，使其缓慢升温至环境温度(通过LCMS监测进程)。加入TBS-Cl后6小时反应完成，但允许在环境温度下再搅拌20小时。将混合物冷却至2℃，并用甲醇(93ml,74g,2.3mol,0.17wt,0.22wt,2.0当量)处理10分钟。反应混合物用MTBE(1.72L,1.23kg,2.96wt,4.0vol)和EtOAc(1.72L,1.55kg,3.60wt,4.0vol)的混合物稀释，然后用饱和NH₄Cl(28重量％水溶液；2.15L,5.0vol)稀释。固体开始慢慢从溶液中沉降出来。使混合物升温至24℃，并加入水(1.08L,1.08kg,2.5wt,2.5vol)(内部温度＝22℃)。更多的固体开始从混合物中沉淀出来。向混合物中加入额外的水(1.08L,1.08kg,2.5wt,2.5vol)和MTBE(1.40L,1.04kg,2.4wt,3.3vol)。通过真空过滤来收集灰白色固体。用水(320ml,0.74vol)，然后用MTBE(1.80L,1.33kg,3.10wt,4.19vol)冲洗反应器，以将任何剩余的固体转移至过滤器。滤饼依次用以下各项冲洗：(1)水(1.80L,1.80kg,4.2wt,4.2vol)，(2)水(1.80L,1.80kg,4.2wt,4.2vol)，(3)MTBE(0.90L,0.67kg,1.5wt,2.1vol)和正庚烷(0.90L,0.62kg,1.4wt,2.1vol)的混合物，(4)MTBE(0.90L,0.67kg,1.5wt,2.1vol)和正庚烷(0.90L,0.62kg,1.4wt,2.1vol)的混合物。回收的固体在40℃下真空干燥2天，得到作为白色固体的化合物133(483g,0.991mol,1.12wt,86％产率)。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.97(s,1H),8.82(s,1H),8.36(s,1H),8.04-8.00(m,2H),7.64-7.58(m,1H),7.56-7.51(m,2H),6.40(dd,J＝2.3,16.0Hz,1H),5.45(ddd,J＝2.7,4.3,53.1Hz,1H),4.75-4.66(m,1H),4.22-4.17(m,1H),4.07(dd,J＝2.3,11.7Hz,1H),3.91(dd,J＝2.7,11.7Hz,1H),2.38(dd,J＝2.7,7.0Hz,1H),0.92(s,9H),0.11(s,3H),0.11(s,3H)。

阶段2

将化合物130(993g,1.47mol,1wt,1vol,1当量)和咪唑(150g,2.20mol,0.151wt,1.5当量)溶解在DMF(3.48L,3.28kg,3.3wt,3.5vol)中，并将混合物冷却至5℃。加入TBS-Cl(244g,1.62mol,0.245wt,1.10当量)。将混合物在0-5℃下搅拌2小时，使其缓慢升温至环境温度，并通过LCMS监测。17小时后，加入额外的咪唑(100g,1.47mol,0.10wt,1.0当量)和TBS-Cl(111g,735mmol,0.112wt,0.50当量)，并继续在环境温度下搅拌2小时以及在35℃下搅拌2小时。将所得混合物冷却至13.6℃，并用MeOH(119ml,2.94mol,2当量)处理10分钟。在单独的反应器中加入冰(5kg,5wt)和饱和NH₄Cl(28重量％水溶液；5.0L,5vol)。将反应混合物加入冰/NH₄Cl混合物中。灰白色固体立即开始从溶液中沉淀出来。向混合物中加入额外的2kg冰(2kg,2wt)和水(3.0L,3vol)。用水(0.50L,0.5vol)冲洗反应烧瓶，并将冲洗液加入混合物中。向混合物中加入正庚烷(2.00L,2vol)，并继续搅拌10分钟。通过真空过滤来收集灰白色固体。滤饼用以下各项冲洗：(1)水(4.0L,4.0vol)，(2)水(4.0L,4.0vol)，(3)正庚烷(4.0L,4.0vol)，(4)正庚烷(4.0L,4.0vol)。回收的固体在45℃下真空干燥4天，得到作为灰白色固体的化合物131(1.095kg,1.39mol,1.10wt,94％产率)。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝9.09(s,1H),8.78(s,1H),8.28(s,1H),8.02(d,J＝7.4Hz,2H),7.63-7.59(m,1H),7.55-7.50(m,2H),7.37(d,J＝7.1Hz,2H),7.29-7.17(m,7H),6.79(d,J＝7.9Hz,4H),6.29(dd,J＝2.9,16.2Hz,1H),5.60(ddd,J＝2.7,3.9,53.1Hz,1H),4.78(ddd,J＝4.7,6.4,15.8Hz,1H),4.26-4.22(m,1H),3.77(s,6H),3.58(dd,J＝3.1,10.9Hz,1H),3.26(dd,J＝3.7,10.7Hz,1H),0.85(s,9H),0.10(s,3H),0.02(s,3H)

阶段3

将化合物131(1000g,1.27mol,1wt,1vol,1当量)和反式-2-丁烯-1,4-二醇(烯烃几何结构由¹H-NMR证实；335g,3.80mol,0.335wt,3.0当量)与THF(3.0L,3.0vol)共沸两次。将残余物溶解在THF(10L,10vol)和甲苯(15L,15vol)的混合物中。加入三苯基膦(432g,1.65mol,0.432wt,1.3当量)，然后将反应混合物冷却至-5℃。历时20分钟缓慢加入DIAD(0.320L,1.65mol,333g,0.333wt,0.320vol,1.3当量)，同时保持内部温度低于5℃。将反应在0-5℃下搅拌1小时，并通过LCMS监测。除去冰浴，并使混合物升温至室温。过夜搅拌(17小时)后，加入三苯基膦(83g,0.32mol,0.083wt,0.25当量)和DIAD(62ml,0.32mol,64g,0.064wt,0.062vol,0.25当量)。在室温下另外1小时后，将反应混合物用MTBE(10L,10vol)稀释，用半饱和NaCl(18重量％水溶液；2×4L)洗涤两次，并真空浓缩成浓稠油状物。将混合物重新溶解在MTBE(4.00L,4vol)和正庚烷(0.50L,0.5vol)的混合物中，然后冷却至0℃。向溶液中加入三苯基氧化膦晶种。固体开始慢慢从溶液中沉淀出来，并搅拌过夜。通过真空过滤来收集白色固体，并用MTBE(2L,2vol)冲洗，分离出540g三苯基氧化膦。浓缩滤液并经由Biotage 150L KP-Sil(SiO₂ 5kg；用在Hep/EtOAc中的1％TEA预处理；洗脱液：庚烷/EtOAc(48L 33％EtOAc加1％TEA，24L 50％EtOAc加1％TEA，24L 66％EtOAc加1％TEA)→100％EtOAc加1％TEA)进行纯化。通过TLC(2:1EtOAc/正庚烷)监测柱。合并清洁产物流分并真空浓缩，得到作为浅白色泡沫固体的化合物132(634g，含有14重量％的DIAD衍生副产物，净545g,0.63mol，50％调整产率)。合并混合物流分，并真空浓缩，得到浅黄色泡沫固体(750g)，其通过Biotage 150MHP-Sphere(2.5kg SiO₂；用在Hep/EtOAc中的1％TEA预处理；用甲苯洗脱液加载样品：Hep/EtOAc/1％TEA(12L 50％EtOAc加1％TEA，16L 66％EtOAc加1％TEA)→EtOAc加1％TEA)再纯化。通过TLC(2/1/0.03EtOAc/n-hep/TEA)监测柱。合并清洁产物流分并真空浓缩，得到另外的作为浅白色泡沫固体的化合物132(206g,0.24mol,18％产率)。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.58(s,1H),8.10(s,1H),7.43-7.37(m,2H),7.32-7.28(m,2H),7.24-7.15(m,8H),7.03-6.98(m,2H),6.78-6.73(m,4H),6.18(dd,J＝2.7,17.2Hz,1H),5.88(td,J＝5.5,15.6Hz,1H),5.77(td,J＝5.1,15.6Hz,1H),5.60(ddd,J＝2.7,4.3,53.1Hz,1H),5.03-4.96(m,2H),4.91(ddd,J＝4.5,6.6,16.6Hz,1H),4.18-4.14(m,1H),3.88-3.82(m,2H),3.78(s,6H),3.52(dd,J＝2.7,10.9Hz,1H),3.14(dd,J＝3.5,10.9Hz,1H),0.85(s,9H),0.10(s,3H),0.01(s,3H)。

阶段4

将化合物132(800g,0.930mol,1wt,1vol,1当量)和化合物133(522g,1.07mol,0.652wt,1.15当量)与THF(2×3L,2×3.8vol)共沸干燥，并在室温下重新溶解在THF(9.60L,8.45kg,12.0vol)中。加入三苯基膦(317g,1.21mol,0.396wt,1.30当量)，并将混合物冷却至低于-5℃。加入DIAD(226ml,1.16mol,235g,0.294wt,0.283vol,1.25当量)，内部温度低于7℃。使反应缓慢升温至室温。通过LCMS监测反应。21小时后，将反应混合物真空浓缩成浓稠油状物，与正庚烷(2.00,1.37kg,1.71wt,2.50vol)共沸，然后重新溶解在MTBE(2.40L,1.78kg,2.2wt,3.0vol)和正庚烷(800ml,547g,0.68wt,1.0vol)的混合物中。向溶液中加入三苯基氧化膦晶种，并冷却至5℃，用正庚烷(400ml,274g,0.34wt,0.50vol)稀释，并在5℃下搅拌30分钟。通过真空过滤来收集白色固体沉淀，并用MTBE和正庚烷的2:1(v/v)混合物(1.8L)冲洗，得到三苯基氧化膦(455g)。真空浓缩滤液，并通过Biotage 150L KP-Sil(SiO₂ 5kg；用1％TEA预处理；通过溶解在甲苯洗脱液中加载样品：9:1庚烷/EtOAc(16L)加15TEA，3.6:1(46L)、2:1(20L)加1％TEA，1:1(30L)加1％TEA，以及100％EtOAc(16L)加1％TEA)进行纯化。真空浓缩合并的清洁产物流分，得到作为灰白色固体泡沫的化合物134(662.2g)。合并混合物流分，并真空浓缩(480g)。通过真空过滤来除去在加载至Biotage150L之前通过用甲苯(300ml)稀释形成的白色不溶性固体。可溶于甲苯的物质通过Biotage150M HP-Sphere(SiO₂ 2.5kg(用1％TEA预处理)；用甲苯加载样品；洗脱液：2:1庚烷/EtOAc(26L)w/1％TEA，1:1(25L)w/1％TEA，1:4(34L)w/1％TEA)进行纯化。通过TLC(1:1庚烷/EtOAc)监测柱。真空浓缩合并的清洁产物流分，得到另外的作为灰白色固体泡沫的化合物134(165.5g，总共662.2+165.5g＝827.7g,930mmol,1.03wt,67％产率)。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.47(s,1H),8.39(s,1H),8.20(s,1H),8.01(s,1H),7.38-7.31(m,5H),7.27-7.19(m,6H),7.14-7.06(m,3H),6.93-6.87(m,2H),6.76(d,J＝8.6Hz,4H),6.26(dd,J＝2.0,16.0Hz,1H),6.15(dd,J＝2.7,17.2Hz,1H),5.86(dd,J＝4.7,15.2Hz,1H),5.80(dd,J＝4.7,15.2Hz,1H),5.51(ddd,J＝2.7,4.3,52.8Hz,1H),5.31(ddd,J＝2.0,4.3,52.8Hz,1H),4.87(d,J＝4.7Hz,2H),4.85-4.81(m,1H),4.79(d,J＝4.3Hz,2H),4.71-4.59(m,1H),4.20-4.13(m,2H),4.06(dd,J＝2.7,11.3Hz,1H),3.90(dd,J＝2.7,11.7Hz,1H),3.77(s,6H),3.52(dd,J＝3.1,10.9Hz,1H),3.18(dd,J＝3.9,10.9Hz,1H),0.92(s,9H),0.84(s,9H),0.10(s,3H),0.09(s,6H),0.07(s,3H)

阶段5-6

向化合物134(410.7g,309mmol,1wt,1vol,1当量)在吡啶(1.23L,1.21kg,15.2mol,2.9wt,3.0vol,49当量)中的溶液中加入亚磷酸二苯酯(90ml,109g,0.46mol,0.26wt,0.22vol,1.5当量)。在室温下搅拌反应，并通过LCMS监测。2小时后(80％转化率)，加入额外的亚磷酸二苯酯(29.9ml,36.2g,155mmol,0.088wt,0.073vol,0.50当量)。另外1小时后，加入额外的亚磷酸二苯酯(6.0ml,7.2g,31mmol,0.018wt,0.015vol,0.10当量)，并继续反应另外0.5小时(98％转化率)。将反应混合物加入饱和NaHCO₃(9重量％水溶液；2.1L,5vol)和水(1.0L ml,2.5vol)的混合物中，同时保持内部温度为4.7-12℃。用少量体积的EtOAc冲洗反应器。在室温下继续搅拌30分钟，并通过LCMS监测反应(100％转化率)。用EtOAc和MTBE的1:1混合物(2×8.2L，2×20vol)萃取反应混合物两次。合并的有机层用水(4.1L,10vol)洗涤，真空浓缩，并与甲苯(3×4.1L，3×10vol；连续进料)共沸以除去吡啶，得到化合物135(剩余0.55当量吡啶)。

阶段6-在环境温度下，将粗化合物135溶解在二氯甲烷(3.08L,4.07kg,9.9wt,7.5vol)中。加入水(55.7ml,0.136vol,10当量)，然后加入二氯乙酸(77ml,120g,0.93mol,0.29wt,0.19vol,3.0当量)在DCM(3.08L,7.5vol)中的溶液，同时保持内部温度低于25℃(变成橙色溶液)。30分钟后，加入三乙基硅烷(Et₃SiH；494ml,359g,3.09mol,0.875wt,1.20vol,10.0当量)(内部温度从18.2℃至17℃)，并继续搅拌20分钟。加入三乙胺(431ml,313g,3.09mol,0.762wt,1.05vol,10.0当量)(内部温度从17.8℃至22℃)。将混合物浓缩至1.55kg(3.8wt)，重新溶解在EtOAc(6.2L,5.5kg,14wt,15vol)中，依次用以下各项洗涤：(1)水(1.0L,2.5vol)和饱和NaHCO₃(9重量％水溶液，0.82L,2.0vol)。粗产物EtOAc溶液在-20℃下储存过夜(0.82L,2.0vol)，并在第二天，在25℃下真空浓缩溶液。如此获得的粗混合物(654g)用以下各项研磨：(1)正庚烷(3.01L,7.5vol)，(2)正庚烷(2.46L,6.0vol)和甲苯(0.82L,2.0vol)的混合物。倾倒出溶液部分(上清液)，并将保留在底部的固体溶解在乙腈(4.1L,10vol)中。将混合物在25℃下真空浓缩，并与乙腈共沸两次，得到化合物136。产物未经纯化即用于后续阶段(假设100％的理论产率)。

阶段7

阶段7a在室温下，将化合物136(337g,309mmol,1wt,1vol,1当量)溶解在无水吡啶(13.5L,13.2kg,39wt,40vol)中。加入三乙胺(129ml,927mmol,94g,0.28wt,0.38vol,3.0当量)，然后加入2-氯-5,5-二甲基-1,3,2-二氧磷杂环己烷2-氧化物(DMOCP；103g,556mmol,0.31wt,1.80当量)。将所得混合物在环境温度下搅拌30分钟，并通过LCMS监测(100％转化率)，生成化合物137。

阶段7b将TEA(129ml,927mmol,94g,0.28wt,0.38vol,3.0当量)、水(100ml,5.56mol,0.30wt,0.30wt,18当量)和硫(34.7g,1.08mol,0.10wt,3.5当量)加入化合物137的上述混合物中。90分钟后(100％转化率)，加入NaHCO₃(9重量％水溶液；3.37L,10vol)，同时保持内部温度低于30℃(16.6℃-27℃)。过滤所得混合物以除去盐。真空浓缩滤液混合物，用MTBE(5.1L,15vol)稀释，并用NaCl(30重量％水溶液；2×1.35L，2×4vol)洗涤两次。滤出不溶性固体，真空浓缩滤液，并与甲苯(4.0L,12vol)共沸。通过过滤除去所得固体，并将粗混合物溶解在甲苯中，并通过Biotage150L KP-Sil(SiO₂ 5kg；用Hep/EtOAc/TEA(1.5/1.5/0.03CV)预处理；用以下物质洗脱：EtOAc/TEA(3/0.03CV)、EtOAc/MeOH/TEA(4/0.2/0.04CV)、EtOAC/MeOH/TEA(2/0.2/0.02CV))进行纯化。通过TLC(EtOAC/MeOH/TEA＝9/1/0.1)监测柱。将含有Sp异构体的流分合并，并真空浓缩，得到作为浅粉色泡沫固体的化合物138(Sp异构体；154g,128mmol,0.46wt,41.3％产率)。将含有Rp异构体的流分合并，并真空浓缩，得到作为浅粉色泡沫固体的化合物240(Rp异构体；64g,53mmol,0.19wt,17％产率)。

化合物138(Sp异构体)：

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.51(s,1H),8.50(s,1H),8.22(s,1H),8.14(s,1H),7.49-7.44(m,2H),7.38-7.27(m,4H),7.25-7.21(m,2H),7.14(t,J＝7.1Hz,2H),6.44(dd,J＝2.5,13.9Hz,1H),6.18(d,J＝15.2Hz,1H),5.78(td,J＝6.3,15.6Hz,1H),5.69(td,J＝4.7,15.6Hz,1H),5.56(dd,J＝3.9,50.8Hz,1H),5.20-5.06(m,1H),4.95-4.79(m,4H),4.69(dd,J＝4.3,16.0Hz,1H),4.54-4.38(m,3H),4.35(d,J＝5.5Hz,1H),4.32-4.29(m,1H),4.05(dd,J＝1.6,11.7Hz,1H),3.91(dd,J＝3.1,11.7Hz,1H),3.14-3.06(m,6H),1.30(t,J＝7.4Hz,9H),0.91(s,9H),0.90(s,9H),0.12(s,3H),0.08(s,3H),0.06(s,3H),0.05(s,3H)

化合物240(Rp异构体)：

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.54(s,1H),8.38(s,1H),8.33(s,1H),8.01(s,1H),7.39-7.09(m,10H),6.39(dd,J＝2.3,14.1Hz,1H),6.13(d,J＝17.2Hz,1H),5.72(d,J＝3.1Hz,2H),5.68(dd,J＝4.3,51.2Hz,1H),5.43-5.29(m,1H),5.10-4.96(m,3H),4.90-4.83(m,2H),4.78-4.72(m,1H),4.52(ddd,J＝3.9,6.6,17.2Hz,1H),4.44-4.35(m,2H),4.31-4.26(m,1H),4.20-4.12(m,2H),3.87(dd,J＝3.5,11.7Hz,1H),3.79-3.77(m,1H),3.15-3.09(m,6H),1.33(t,J＝7.4Hz,9H),0.94(s,9H),0.89(s,9H),0.13(s,3H),0.12(s,3H),0.10(s,3H),0.09(s,3H)

阶段8

将化合物138(221g,183mmol,1wt,1vol,1当量)溶解在吡啶(530ml,6.56mol,519g,2.3wt,2.4vol)和TEA(2.65L,19.0mol,1.93kg,8.7wt,12vol,104当量)的混合物中。加入三乙胺三氢氟酸盐(264ml,1.62mol,262g,1.2wt,1.2vol，8.9当量络合物，27当量HF)，并在室温下搅拌混合物，同时通过LCMS监测转化率。3小时后(97％转化率)，加入甲氧基三甲基硅烷(TMSOMe；1.40L,10.2mol,1.06kg,4.8wt,6.3vol,55当量)，并继续搅拌30分钟。粘性固体包覆着反应器。倾倒出溶液部分(上清液)。固体用甲苯研磨两次(2×2.2L，2×10vol；倾倒出上清液)。将保留在反应器中的粗固体溶解在二氯甲烷(2.2L,10vol)中，并用NH₄Cl(28重量％水溶液；2.2L,10vol)洗涤。水层用二氯甲烷(2.2L,10vol)反萃取。合并的有机层用NaCl(36重量％水溶液；1.1L,5vol)和水(1.1L,5vol)的混合物洗涤，然后真空浓缩，得到作为棕色干泡沫的化合物139(152g,155mmol,0.70wt,85％产率)。粗产物未经纯化即进行下一步骤。

阶段9

将化合物139(150g,153mmol,1wt,1vol,1当量)与乙腈(4L,27vol)共沸，然后在室温下重新溶解在乙腈(1.05L,0.83kg,5.5wt,7.0vol)中。在室温下加入2-硝基苄基溴(44.4g,205mmol,0.30wt,1.34当量)，并通过LCMS监测反应。23小时后(100％转化率)，加入EtOAc(1.50L,10vol)、NH₄Cl(28重量％水溶液；300ml,2vol)和水(300ml,2vol)(pH＝6)，并将所得混合物在25℃下部分真空浓缩至1.11kg重量。加入EtOAc(2.25L,15vol)，并将混合物搅拌5分钟。将两层分离。水层用乙酸乙酯(750ml,5vol)萃取。合并的有机层依次用以下各项洗涤：(1)NaCl(36重量％水溶液；300ml,2vol)和水(300ml,2vol)的混合物，以及(2)水(600ml,4vol)。然后真空浓缩有机层，并与正庚烷(1.50L,10vol)共沸。向粗固体中加入MTBE(0.95L,6.3vol)，并在40℃下加热混合物。用EtOAc(300ml,2vol)稀释混合物，并缓慢冷却至0℃。使致密固体沉降，并通过过滤器玻璃料管泵出上清液。固体用MTBE(2×300ml,2×2vol；每次通过过滤器玻璃料管泵出上清液)冲洗两次，并在40℃下真空干燥过夜，得到作为浅黄色固体的化合物140(156g)。真空浓缩滤液，得到褐色油状物(17.8g)，通过Biotage Snap-Ultra 340g(洗脱液：在EtOAc中的0-5％MeOH)进行纯化，得到另外的作为浅黄色固体的化合物140(5.8g)。总共156g+5.8g＝161.8g(净152mmol，95％纯度，99％产率)

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.46(s,1H),8.15(s,1H),8.10(s,1H),8.09-8.06(m,1H),7.89(s,1H),7.54-7.51(m,1H),7.49-7.45(m,4H),7.37-7.28(m,3H),7.24-7.19(m,3H),7.16-7.11(m,2H),6.22(d,J＝16.8Hz,1H),6.14(dd,J＝2.7,17.2Hz,1H),5.83-5.61(m,3H),5.60-5.48(m,1H),5.07(dd,J＝3.5,51.6Hz,1H),5.06-4.96(m,1H),4.79(dd,J＝4.9,15.8Hz,1H),4.69(d,J＝5.9Hz,2H),4.67-4.56(m,1H),4.48-4.40(m,3H),4.37-4.30(m,1H),4.27(d,J＝5.9Hz,2H),4.19-4.13(m,1H),3.93-3.85(m,1H),3.85-3.78(m,1H)

阶段10-11

阶段10将化合物140(纯度95％，净73.2g,72.3mmol,1wt,1vol,1当量)和N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺2-氰乙酯(25.3ml,79.5mmol,0.33wt,0.35vol,1.10当量)与无水乙腈共沸三次(3×2L)，重新溶解在二氯甲烷(0.73L,10vol)中，并冷却至0-5℃。加入二异丙基铵四氮唑(6.19g,36.1mmol,0.085wt,0.50当量)。将所得反应混合物在0℃下搅拌10小时，历时2小时升温至10℃，在10℃下保持10小时，并历时2小时升温至室温。通过LCMS和TLC(EtOAc加0.5％TEA)监测反应。18小时后，加入无水乙腈(0.73L,10vol)，并将混合物在-20℃下储存3天。

阶段11a使来自阶段10的混合物升温至环境温度，并通过滴液漏斗分批(每30分钟100mL，历时9小时)加入吡啶三氟乙酸盐(预先与吡啶共沸两次；41.9g,217mmol,0.57wt,3.0当量)和乙腈(5.85L,80vol)的混合物中。通过LCMS监测反应。13小时后，历时4小时加入N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺2-氰乙酯(5.8mL,18mmol,0.25当量)在乙腈(24mL)中的溶液。附加试剂的量基于剩余化合物140(基于LCMS约30％)来确定。6小时后观察到更多的二醇转化。

阶段11b加入((二甲基氨基亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑啉-3-硫酮(DDTT；20.8g,101mmol,0.28wt,1.4当量)，并继续搅拌1小时。将反应混合物部分浓缩至约800mL，并用MTBE(1.46L,20vol)、NaHCO₃(9重量％水溶液；1.1L,15vol)和水(0.37L,5vol)稀释。pH＝8。分离各层，水层用MTBE(1.46L,20vol)和EtOAc(1.10L,15vol)的混合物萃取。合并的有机层用30％NaCl水溶液(2×0.73L,2×10vol)洗涤两次，在35℃下真空浓缩，并与甲苯(1.46L,20vol)共沸。LCMS和TLC(EtOAc)显示化合物143(SpRp，所需):化合物241(SpSp)＝5:1

通过Biotage 150M KP-Sil(SiO₂ 2.5kg；洗脱液：EtOAc/Hep：2:1(4CV)、3:1(2.5CV)、4:1(2.5CV)、100％EA(3CV)、在EA中的5-10％MeOH4CV)对粗产物进行纯化，得到化合物143(36g,31.5mmol，44％产率)。

化合物143(SpRp)：¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.59(s,1H),8.10(s,1H),8.03-7.99(m,1H),7.91(s,1H),7.56-7.53(m,2H),7.49-7.40(m,5H),7.35-7.28(m,2H),7.24-7.16(m,4H),6.92(s,1H),6.29(d,J＝14.9Hz,1H),6.08(d,J＝20.7Hz,1H),5.97-5.83(m,1H),5.76(td,J＝4.7,15.6Hz,1H),5.61-5.51(m,2H),5.40(d,J＝4.3Hz,1H),5.29-5.17(m,1H),4.91(dd,J＝7.4,14.9Hz,1H),4.86-4.75(m,3H),4.63(dd,J＝3.7,9.2Hz,1H),4.58-4.43(m,5H),4.34-4.19(m,4H),2.79(td,J＝5.9,16.8Hz,1H),2.66(td,J＝6.3,16.8Hz,1H)。

化合物241(SpSp)¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.11(s,1H),8.03(d,J＝8.2Hz,1H),7.94(s,1H),7.90(s,1H),7.61(s,1H),7.56-7.40(m,7H),7.33-7.28(m,2H),7.23-7.17(m,4H),6.22(d,J＝17.6Hz,1H),6.15(d,J＝18.8Hz,1H),5.85(dd,J＝3.5,51.2Hz,1H),5.75-5.45(m,5H),4.95-4.23(m,14H),2.82(t,J＝6.1Hz,2H)。

阶段12

将化合物143(71.6g,62.6mmol,1wt,1vol,1当量)溶解在1,4-二噁烷(0.43L,6vol)中。加入苯硫酚(215ml,2.09mol,230g,3.2wt,3vol,>30当量)，然后加入三乙胺(215ml,1.54mol,156g,2.2wt,3vol)。观察到一些放热(内部温度升高约7℃)，因此，使用水/冰浴来冷却并将内部温度控制在27℃以下。通过LCMS监测反应。2小时后，加入MeOH(0.57L,8vol)和NH₄OH(28重量％；15mol,0.57L,8vol,>200当量)。将所得混合物在50℃下加热5小时，冷却至室温，并搅拌过夜。14小时后，加入水(0.72L,10vol)(未观察到固体)，并将混合物用正庚烷和甲苯的1:1(v/v)混合物(3×0.86L，3×12vol)萃取三次，然后用甲苯(0.57L,8vol)萃取。水层在40-50℃下真空浓缩，并用水(1.07L,15vol)稀释。将所得浆液在室温下保持过夜。滤出所得固体，用水(0.36L,5vol)冲洗。滤液仍然混浊，通过硅藻土和Kuno过滤器进行过滤。混浊仍然存在。历时1小时加入HCl(1.0M水溶液；132ml,132mmol,2.1当量)，并检查pH(pH<2)。在室温下继续搅拌1小时，并过滤混合物。滤饼用水(8×0.20L)冲洗，在35℃的真空烘箱中干燥2天，并在不加热下干燥1天，得到作为浅橙色固体的化合物1(44.88g,60.1mmol,0.63wt,96％产率)。

阶段13

向游离酸化合物1(22.42g,30.03mmol,1wt,1vol,1当量)中加入氨(2.0M在MeOH中的溶液；220ml,440mmol,10vol,15当量)。加入EtOH(55ml,2.5vol)，并将所得溶液通过Kuno过滤器(0.45微米；PTFE)过滤，用MeOH和EtOH的1:1(v/v)混合物(90mL,4vol)冲洗。滤液在30℃下真空浓缩，得到灰白色固体，在室温下干燥过夜，用刮刀研磨(容易破碎)，并在室温下进一步真空干燥。然后，将分离的固体悬浮在甲苯(250ml)中，并在室温下搅拌30分钟。然后通过真空过滤收集固体，并用甲苯冲洗两次(2×50ml)。然后在真空烘箱中真空干燥固体，得到22.4g化合物1a(化合物1的二铵盐)。

重结晶：将化合物1a(22.14g,28.36mmol,1wt,1vol,1当量)溶解在水(664ml,30vol)和氢氧化铵(28重量％；2.5ml,18mmol,0.63当量)的混合物中(pH＝9-10)，并用甲苯(3×300ml,3×14vol)萃取三次，用EtOAc(3×200ml,3×9vol)萃取三次，用甲苯(3×300ml,3×14vol)萃取三次。将所得水层用HCl(1.0M水溶液；90ml,90mmol,3.2当量)处理3.5小时(pH≤2)。将混合物搅拌30分钟，然后通过真空过滤收集固体沉淀。滤饼用水洗涤三次(3×200ml，3×9vol)，并真空干燥过夜。向固体中加入氨(2.0M在MeOH中的溶液；250ml,500mmol,17.6当量)和乙醇(100ml)，真空浓缩所得混合物，直至出现晶体(约100ml)，此时停止浓缩，并将混合物搅拌20分钟。加入乙醇(45mL)，并部分浓缩混合物(除去45mL)。同样的操作再重复两次，然后将混合物冷却至0℃，并搅拌3.5小时。通过真空过滤收集白色固体，用冷乙醇(20ml)洗涤，然后用乙酸乙酯(2×50mL)洗涤。白色固体在室温下真空干燥3天，得到作为白色固体的化合物1a(16.6g,21.3mmol,0.75wt,75％产率)。真空浓缩滤液，并在室温下真空干燥3天，得到作为灰白色固体的化合物1a(4.16g,5.3mmol,18％产率)。

实施例1.2-化合物1的¹H NMR分析

化合物1a的¹H NMR光谱图示于图3中。所得光谱是：

¹H-NMR光谱(400MHz,DMSO-d₆,δ_H 2.49ppm,80℃)

δ(ppm)：3.05-3.13(4H,m),3.70(1H,dd,J＝13,5Hz),3.78(1H,dd,J＝12,4Hz),4.21-4.24(2H,m),4.28(1H,m),4.38(1H,m),4.53-4.68(2H,m),5.22(1H,m),5.76(2H,s),5.78(1H,m),6.26(1H,m),6.29(1H,m),8.13(1H,s),8.14(1H,s),8.36(1H,brs),8.59(1H,brs)。

实施例1.3-化合物1的X射线分析

将约2mg化合物1溶解在600uL水中。将120uL该溶液放入另一玻璃小瓶中，然后将该小瓶在室温下在具有3mL MeCN的固定容器中储存1周。这是样品制备的H₂O/MeCN蒸气扩散方法。

将在结晶溶液中发现的无色块状单晶(0.1×0.1×0.1mm)分散在液体Parabar10312中，并安装在Dual-Thickness MicroMounts^TM(MiTeGen)上。在-160℃下，采用ω轴振荡法，使用多层反射镜单色Cu-Kα辐射，在XtaLAB PRO P200MM007HF(Rigaku)上采集衍射数据。

图4A示出了不对称单元中的化合物1分子以及许多无序水分子的ORTEP图。图4B示出了来自图4A的一个化合物1分子的晶体结构。图4C示出了图4A中所示的另一化合物1分子的晶体结构。

化合物1的晶体结构以0.1354的最终R因子进行解析。Flack参数接近于零(0.083(17))，表明化合物1的绝对构型为(R,S)。晶体结构分析还表明，化合物1的大通道中存在许多水分子，这表明水分子能够容易地从通道中滑出来。分析还证实不对称单元中两个结晶学独立分子的构象几乎相同。

X射线分析的其它参数示于下文：

实施例2-化合物2的合成

通过实施例1步骤F和实施例1步骤G单独处理从实施例1步骤E获得的化合物106(化合物105的RpRp异构体)，得到化合物2a(化合物1a的RR异构体)：

化合物108(RpRp)¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝8.12(dd,J＝8.2,0.8Hz,2H),7.99(s,2H),7.96(s,2H),7.65-7.48(m,10H),7.38-7.33(m,2H),7.26-7.24(m,4H),6.22(d,J＝17.6Hz,2H),5.95-5.84(m,2H),5.71(dd,J＝50.8,3.9Hz,2H)5.73-5.71(m,2H),,4.88-4.77(m,4H),4.59-4.38(m,8H),4.19(m,2H)。

化合物2a(RpRp，反式)¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ＝8.70(s,1H),8.49(s,1H),8.23(s,1H),8.09(s,1H),6.34(br s,2H),5.83(br s,2H),5.73-5.53(m,2H),5.38-5.01(m,2H),4.76-4.32(m,6H),3.95(br s,2H),3.69-3.64(m,2H)；³¹P NMR(162MHz,CD₃OD)δ＝55.57(s,1P),55.32(s,1P)。

实施例2.1-化合物2的X射线分析

称取化合物2(0.5mg)，并溶解在乙腈/28％氨溶液中。然后，将该溶液在室温下在盖子松散固定下储存。2周后出现棒状晶体。

图4D示出了化合物2分子的ORTEP图。

该X射线分析的其它参数示于下文：

实施例3-化合物3的合成

通过实施例1步骤F和实施例1步骤G单独处理从实施例1步骤E获得的化合物109(化合物105的SpSp异构体)，得到化合物3a(化合物1a的SS异构体)：

化合物109(化合物105的SpSp异构体)：¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.52(s,2H),7.99(d,J＝8.2Hz,2H),7.91(s,2H),7.63-7.40(m,10H),7.35-7.28(m,2H),7.23-7.16(m,4H),6.10-5.93(m,4H),5.92-5.75(m,2H),5.62-5.50(m,2H),5.26-5.16(m,2H),5.09-5.03(m,2H),4.98-4.91(m,4H),4.61-4.25(m,10H)

化合物3a(SpSp，反式)：¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ＝8.97(br s,1H),8.84(br s,1H),8.21(br s,2H),6.31(br s,2H),6.08(br d,J＝53.5Hz,1H),5.89(br s,2H),5.63(brd,J＝52.4Hz,1H),5.13-4.96(m,2H),4.72-4.32(m,6H),4.01(br d,J＝9.8Hz,2H),3.67(br s,2H)。

实施例4--化合物4a的合成

通过实施例1步骤G单独处理从实施例2步骤F获得的化合物107，得到化合物4a，化合物107通过硅胶色谱分离为仅顺式异构体。

化合物107：¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.13(s,2H),8.12-8.08(m,2H),7.91(s,2H),7.65-7.55(m,4H),7.54-7.45(m,6H),7.33-7.27(m,2H),7.23-7.16(m,4H),6.14(d,J＝17.6Hz,2H),5.88(dd,J＝3.9,50.8Hz,2H),5.76-5.61(m,4H),5.21-4.99(m,4H),4.60-4.46(m,4H),4.45-4.37(m,2H),4.30-4.13(m,4H),3.49(d,J＝5.1Hz,2H)

化合物4a(RpRp，顺式1a，化合物4a)：¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝8.48(br s,2H),8.02(br s,2H),6.29(d,J＝14.8Hz,2H),5.99(br s,2H),5.43(d,J＝51.2Hz,2H),5.03-4.88(m,2H),4.43(br d,J＝11.7Hz,2H),4.32(br d,J＝9.4Hz,2H),4.27-4.17(m,2H),4.21-4.02(m,2H),3.97(brdd,J＝6.1,12.3Hz,2H)。

实施例5--化合物5的合成

通过实施例1步骤G单独处理从实施例1步骤F获得的顺式异构体，得到化合物5a。

化合物111(化合物107的顺式异构体)：¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.48(s,1H),8.15-8.09(m,1H),8.03(d,J＝8.2Hz,1H),7.94(s,1H),7.75(s,1H),7.65-7.06(m,11H),6.07(d,J＝17.2Hz,1H),5.98(d,J＝20.3Hz,1H),5.97-5.79(m,1H),5.84(dd,J＝3.5,51.2Hz,1H),5.54-5.47(m,1H),5.50(dd,J＝3.9,52.0Hz,1H),5.38-5.21(m,2H),5.18-5.02(m,2H),5.02-4.95(m,1H),4.78-4.69(m,1H),4.60-4.16(m,10H)

化合物5a(SpRp，1a顺式)：¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝8.88(brs,1H),8.51(br s,1H),8.16(s,1H),8.05(s,1H),6.38(d,J＝15.6Hz,1H),6.33(d,J＝14.1Hz,1H),6.14-6.09(m,2H),6.01(d,J＝49.2Hz,1H),5.42(d,J＝49.6Hz,1H),5.02-4.87(m,2H),4.76-3.92(m,8H),3.75-3.56(m,2H)

实施例6--化合物6a(SpRp)的合成

在环境温度下，向化合物1a(1.5mg,2.0μmol)在MeOH/H₂O(0.6/0.5ml)中的溶液中加入碳载氢氧化钯(20重量％干基，2mg)。所得混合物用氢气(气球)处理，同时通过LCMS监测反应。原材料完全消耗后，将混合物过滤，并用甲醇冲洗，直至所有产物清除。真空浓缩滤液，并将残余物溶解在水(1ml)中。RHPLC纯化提供化合物6a(0.9mg)。

LCMS(MS m/z 749.2[M+H]⁺)

实施例7--化合物9的合成

向107(3.7mg,3.02μmol)在EtOH(1.5mL)中的溶液中加入氢氧化铵(1mL)。将所得混合物在50℃下加热8小时，并冷却至环境温度。减压除去溶剂。用2mL水处理残余物，并滤出所得固体。对滤液进行制备型HPLC，得到化合物9a(2.5mg)。

化合物9a：¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝8.67(br s,1H),8.50(br s,1H),8.25(brs,1H),8.12(br s,1H),6.47-6.28(m,2H),5.92-5.79(m,2H),5.74(d,J＝50.8Hz,1H),5.32(d,J＝52.4Hz,1H),5.16-4.95(m,2H),4.71-4.25(m,6H),4.17-3.97(m,2H),3.83-3.61(m,2H)。

LCMS：MS m/z 715.2[M+H]⁺。

实施例8--化合物8a、11a和12a的合成途径

以化合物112和化合物102作为原材料，通过与实施例1中所述相同的反应顺序来制备化合物8、11和12。

流分A和B的制备型HPLC条件

化合物8a：流分A继续进行实施例1步骤G，得到两种异构体，通过HPLC分离所述异构体。化合物8a是运行较快的异构体(保留时间：4.1分钟)，而化合物37a(保留时间：4.5分钟)是运行较慢的异构体。

¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝9.01(s,1H),8.61(s,1H),8.22(s,1H),8.20(s,1H),6.34(d,J＝10.2Hz,1H),6.31(d,J＝10.9Hz,1H),5.92(dd,J＝2.7,51.2Hz,1H),5.85-5.71(m,2H),5.37(d,J＝51.6Hz,1H),4.81-4.56(m,6H),4.52(br d,J＝12.1Hz,1H),4.42(brd,J＝9.4Hz,3H),4.05(dd,J＝4.1,11.9Hz,1H),3.95(br dd,J＝4.3,12.1Hz,1H),3.94-3.84(m,1H),3.62(br dd,J＝4.9,15.4Hz,1H),2.71-2.58(m,1H),2.46-2.33(m,1H)

³¹P NMR(162MHz，甲醇-d₄)δ＝55.36(s,1P),55.18(s,1P)

LCMS：MS m/z 761.2[M+H]⁺

化合物37a：¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝8.95(s,1H),8.40(s,1H),8.18(s,1H),8.15(br s,1H),6.34(d,J＝5.5Hz,1H),6.31(d,J＝6.6Hz,1H),5.96-5.68(m,3H),5.40(dd,J＝2.7,51.6Hz,1H),4.85(s,3H),4.58(br d,J＝12.1Hz,1H),4.49(br d,J＝12.1Hz,1H),4.43-4.33(m,3H),4.29(dd,J＝8.6,14.1Hz,1H),4.05(dd,J＝4.5,11.9Hz,1H),3.95(dd,J＝4.9,12.3Hz,1H),3.94-3.86(m,1H),2.67-2.55(m,1H),2.52-2.40(m,1H)。

化合物8a/37a制备型HPLC条件：

流分B继续进行实施例1步骤G，得到两种异构体，通过下述制备型HPLC分离所述两种异构体。化合物11a是运行较快的异构体(保留时间：11.2分钟)，而化合物12a是运行较慢的异构体(保留时间：12.1分钟)。

化合物11a：¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝8.63(br s,2H),8.18(br s,1H),8.17(brs,1H),6.34(d,J＝13.3Hz,1H),6.32(d,J＝12.9Hz,1H),5.86-5.65(m,2H),5.48(d,J＝48.5Hz,1H),5.35(d,J＝43.8Hz,1H),4.84-4.53(m,6H),4.47-4.36(m,2H),4.05-3.91(m,2H),3.96-3.85(m,1H),3.70-3.54(m,1H),2.66-2.54(m,1H),2.43-2.30(m,1H)

化合物12a：¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝8.56(br s,1H),8.41(s,1H),8.17(s,1H),7.95(br s,1H),6.35(d,J＝14.8Hz,1H),6.31(d,J＝15.2Hz,1H),5.82-5.65(m,2H),5.50(d,J＝51.2Hz,1H),5.36(d,J＝53.9Hz,1H),4.74-4.33(m,8H),4.26-4.16(m,1H),4.07-3.93(m,3H),2.64-2.44(m,2H)。

化合物11a/12a制备型HPLC条件：

实施例9--化合物13和14的合成途径

以化合物114和化合物115作为原材料，通过与实施例1中所述相同的反应顺序加上TBS脱保护步骤来制备化合物13和14。

化合物116：¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝9.36(s,1H),9.18(s,1H),8.77(s,1H),8.76(s,2H),8.07(br dd,J＝1.8,7.6Hz,3H),8.05-8.00(m,2H),7.99(s,1H),7.87-7.82(m,1H),7.70-7.65(m,1H),7.63-7.55(m,3H),7.55-7.41(m,6H),7.39-7.35(m,1H),7.30-7.26(m,1H),6.37(d,J＝8.6Hz,1H),5.89(d,J＝4.7Hz,1H),5.36-5.27(m,2H),5.15(ddd,J＝3.7,8.4,11.7Hz,1H),4.64-4.43(m,4H),4.43-4.38(m,1H),4.37-4.30(m,1H),4.23-4.13(m,2H),4.11-3.98(m,2H),3.97-3.86(m,1H),0.97(s,9H),0.83(s,9H),0.25(s,3H),0.18(s,3H),0.16(s,3H),-0.13(s,3H)。

化合物13a：¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝8.78(br s,1H),8.47(brs,1H),8.21(brs,1H),8.08(br s,1H),6.44-6.21(m,1H),6.19-6.03(m,1H),6.01-5.78(m,2H),5.38-4.95(m,2H),4.67-4.45(m,5H),4.45-4.35(m,1H),4.34-4.29(m,1H),4.25(br d,J＝11.3Hz,1H),4.18-3.89(m,2H),3.88-3.54(m,2H)。

³¹P NMR(162MHz，甲醇-d₄)δ＝56.89(br s,1P),56.37(br s,1P)

化合物117(化合物116的Rp₁Rp₂异构体)：¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝9.36(br s,1H),9.11(br s,1H),8.98(s,1H),8.87(s,1H),8.78(s,1H),8.14-7.96(m,6H),7.72-7.27(m,13H),6.44(d,J＝8.6Hz,1H),5.84(d,J＝6.6Hz,1H),5.59-5.50(m,1H),5.48-5.44(m,1H),5.33-5.24(m,1H),4.75-3.85(m,11H),0.90(s,9H),0.79(s,9H),0.20(s,3H),0.11(s,3H),0.07(s,3H),-0.21(s,3H)

化合物14a(化合物13a的Rp₁Rp₂异构体)

LCMS：MS m/z 743.17[M+H]⁺

实施例10--化合物15和16的合成途径

向化合物A(2.63g,2.46mmol)在MeCN(26.3ml)中的溶液中加入叔丁基胺(13.15ml,124.1mmol)。在环境温度下搅拌1小时后，真空浓缩反应混合物，并与MeCN共沸。将残余物溶解在MeCN(52.6ml)中，并用1-(溴甲基)-2-硝基苯(1.064g,4.925mmol)和三乙胺(0.755ml,5.42mmol)处理。完全反应后(通过LC/MS监测)，真空浓缩反应混合物，并通过硅胶柱色谱(66％乙酸乙酯/正庚烷至100％乙酸乙酯)进行纯化，得到0.226g化合物118。将分离的产物溶解在DMF(5mL)中，并加入烯丙基溴(0.046ml,0.528mmol)和碳酸钾(0.073g,0.528mmol)。在环境温度下搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测进程。19小时后，加入MTBE/EtOAc的1/1混合物(12/12mL)、饱和NH₄Cl水溶液(15ml)和水(10mL)。分离出有机层，用盐水(5mL)洗涤两次，用MgSO₄干燥，并真空浓缩。通过硅胶柱色谱(50％乙酸乙酯/正庚烷至100％乙酸乙酯)对残余物进行纯化，得到37mg双烯丙基化产物。将分离的产物(37mg,0.027mmol)溶解在甲苯(55mL)中，并加热至温和回流(120-125℃油浴)。加入第二代Hoveyda-Grubbs催化剂((1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基)二氯(邻异丙氧基苯基亚甲基)钌；可以目录号569755获得；CAS 301224-40-8；8.5mg,0.014mmol)和醌(5.9mg,0.054mmol)在甲苯(10mL)中的溶液。将混合物加热至回流，并通过LC/MS监测反应进程。原材料完全消耗后，将混合物冷却至环境温度，并用DMSO(0.059ml,0.81mmol)处理15小时。真空浓缩所得混合物，并通过硅胶柱色谱(SiO₂ 10g，在正庚烷中的66％乙酸乙酯至100％乙酸乙酯)进行纯化，得到化合物119(2.2mg)。

化合物119：¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.49(s,1H),8.12(d,J＝7.8Hz,1H),8.05-8.02(m,1H),8.02(s,1H),7.82(s,1H),7.70-7.10(m,17H),6.27(d,J＝16.8Hz,1H),6.15-6.05(m,1H),5.97(d,J＝8.2Hz,1H),5.94-5.72(m,3H),4.94(br s,2H),4.86-4.69(m,2H),4.67-4.60(m,1H),4.60-4.44(m,4H),4.39-4.33(m,1H),4.31-4.10(m,6H),0.96(s,9H),0.25(s,3H),0.19(s,3H)

化合物119继续进行实施例1中的步骤G，随后用TEA 3HF进行TBS脱保护，得到化合物15a。

化合物15a：¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝8.76(br s,1H),8.44(brs,1H),8.24(brs,1H),8.07(br s,1H),6.45-6.19(m,2H),6.12-5.75(m,2H),5.54(br d,J＝51.6Hz,1H),5.67-5.06(m,2H),4.66-4.37(m,3H),4.47-4.37(m,1H),4.36-4.22(m,2H),4.17-3.94(m,2H),3.94-3.80(m,1H)3.80-3.59(m,2H)

化合物16通过与化合物15中所述相同的顺序从化合物B(化合物A的RR异构体)获得。

化合物120(化合物119的Rp₁Rp₂异构体)：¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.89(s,1H),8.10(d,J＝8.2Hz,1H),8.01(d,J＝8.2Hz,1H),7.85-7.74(m,4H),7.69-7.61(m,2H),7.58(s,1H),7.55-7.48(m,1H),7.45-7.30(m,6H),7.22-7.15(m,1H),7.13-7.04(m,3H),6.76-6.68(m,1H),6.31-6.22(m,1H),6.22(d,J＝16.0Hz,1H),6.12-5.99(m,2H),5.94(d,J＝8.2Hz,1H),5.92-5.81(m,1H),5.67(dd,J＝3.5,51.2Hz,1H),5.08-4.93(m,2H),4.87-4.77(m,1H),4.60-4.22(m,8H),4.21-4.16(m,1H),4.11-4.02(m,1H),3.94(br d,J＝11.7Hz,1H),3.66(dd,J＝4.7,11.3Hz,1H),0.90(s,9H),0.09(s,3H),0.08(s,3H)

化合物16a：¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝8.54(br s,1H),8.24(brs,1H),8.17(brs,1H),8.08(br s,1H),6.44-6.23(m,2H),6.07-5.68(m,2H),5.43(d,J＝50.4Hz,1H),5.31-5.05(m,2H),4.69-4.26(m,6H),4.19-3.90(m,2H),3.90-3.57(m,3H)

实施例11--化合物腺嘌呤/鸟嘌呤(A/G)类似物-化合物21、化合物22和化合物23的合成途径

以化合物121和化合物101作为原材料，通过与实施例1中所述相同的反应顺序来制备腺嘌呤/鸟嘌呤类似物。

用于分离化合物C、D和E的制备型HPLC条件

化合物D：¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.60(s,1H),8.27(s,1H),8.04-8.01(m,1H),8.01(s,1H),7.99-7.95(m,1H),7.80(s,1H),7.63-7.51(m,5H),7.46-7.41(m,1H),7.39-7.30(m,3H),7.25-7.20(m,2H),6.96-6.84(m,1H),6.19-5.99(m,4H),5.67(dd,J＝4.3,52.3Hz,1H),5.47(dd,J＝1.4,17.4Hz,1H),5.36-5.24(m,4H),5.14-5.09(m,1H),5.08(d,J＝5.5Hz,2H),5.04-4.98(m,2H),4.51-4.30(m,10H),4.21-4.13(m,1H),2.83-2.67(m,1H),1.16(d,J＝7.0Hz,3H),1.14(d,J＝6.6Hz,3H)

化合物D继续进行实施例1的步骤F和G，得到化合物22。

化合物22：LCMS：MS m/z 763.07[M+H]⁺

化合物C：¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝9.08(s,1H),8.60(s,1H),8.07-8.02(m,2H),8.02(s,1H),7.80(s,1H),7.55-7.30(m,9H),7.24-7.19(m,2H),6.58-6.45(m,1H),6.23-5.97(m,4H),5.97-5.86(m,1H),5.63-5.57(m,1H),5.54-5.47(m,1H),5.48-5.44(m,1H),5.35-5.30(m,1H),5.29-5.22(m,1H),5.18-5.13(m,2H),5.11-5.07(m,1H),5.02-4.97(m,2H),4.51-4.22(m,9H),4.14-4.07(m,1H),2.99-2.85(m,1H),1.20(d,J＝6.6Hz,3H),1.17(d,J＝7.0Hz,3H)

化合物C继续进行实施例1中的步骤F和G，得到化合物21。

化合物21：LCMS：MS m/z 763.13[M+H]⁺

化合物E：¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.99(s,1H),8.57(s,1H),8.02-7.94(m,2H),7.93(s,1H),7.82(s,1H),7.68-7.63(m,1H),7.60-7.55(m,1H),7.54-7.49(m,2H),7.45-7.31(m,5H),7.25-7.21(m,2H),6.22-5.94(m,6H),5.56(br dd,J＝5.1,51.5Hz,1H),5.54-5.46(m,1H),5.34-5.29(m,1H),5.29-5.22(m,2H),5.16-5.08(m,3H),5.02-4.96(m,2H),4.62-4.54(m,1H),4.52-4.26(m,9H),2.93-2.81(m,1H),1.21(d,J＝2.3Hz,3H),1.20(d,J＝2.0Hz,3H)

化合物E继续进行实施例1中的步骤F和G，得到化合物23。

化合物23：LCMS：MS m/z 763.18[M+H]⁺

实施例12--化合物24的合成

化合物24a通过与实施例1中所述相同的反应顺序用化合物F来制备。

化合物24：¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝8.95(br s,1H),8.29(br s,1H),8.23(brs,1H),8.08(br s,1H),6.31(br d,J＝12.9Hz,2H),6.23-6.07(m,1H),6.04-5.84(m,2H),5.71(br d,J＝50.8Hz,1H),5.27-4.32(m,7H),4.27-4.16(m,1H),4.12(dd,J＝5.7,11.9Hz,1H),4.07-3.98(m,1H),3.78-3.62(m,2H),1.40(d,J＝7.0Hz,3H)

实施例13-化合物18、化合物19和化合物20的合成

该合成途径示于图3中。

在20℃下，向9-((2R,3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-醇(100mg,0.37mmol)和Hunig碱(0.129ml,0.74mmol)在DMF(1ml)中的溶液中加入BOP(327mg,0.74mmol)。将混合物在20℃下搅拌过夜。UPLC-MS表明反应已经完成。在高真空旋转蒸发仪上除去溶剂。将残余物溶解在DCM中，并使用Biotage(24g硅胶柱，在庚烷中的EtOAc＝0-100％，10vol,100％,10vol)进行纯化，以73％的产率得到105mg BOP加合物。

¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δppm 3.74-3.84(m,1H)3.92-4.00(m,1H)4.12-4.19(m,1H)4.62-4.74(m,1H)5.37-5.57(m,1H)6.41-6.52(m,1H)7.47-7.55(m,1H)7.57-7.64(m,2H)8.03-8.14(m,1H)8.36-8.46(m,1H)8.86(s,1H)

在20℃下，向(2R,3R,4R,5R)-5-(6-((1H-苯并[d][1,2,3]***-1-基)氧基)-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-2-(羟基甲基)四氢呋喃-3-醇(135mg,0.349mmol)在烯丙醇(3ml)中的溶液中加入碳酸铯(500mg,1.535mmol)。将混合物在20℃下搅拌1小时。UPLC-MS表明反应已经完成。将反应用饱和NaHCO₃/盐水处理，并用EtOAc/Hept萃取。有机层用Na₂SO₄干燥并过滤。在旋转蒸发仪上除去滤液中的溶剂和挥发性有机物。使用Biotage(12g硅胶柱，在庚烷中的EtOAc＝0-100％,10vol,100％,10vol)对残余物进行纯化，以92％的产率得到100mg所需烯丙基加合物。

¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δppm 8.56(s,1H)8.47(s,1H)6.29-6.41(m,1H)6.06-6.21(m,1H)5.33-5.53(m,2H)5.22-5.31(m,1H)5.02-5.14(m,2H)4.56-4.71(m,1H)4.10-4.18(m,1H)3.88-3.96(m,1H)3.70-3.79(m,1H)

在20℃下，向二异丙基亚磷酰胺(150mg,0.164mmol)和(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(烯丙氧基)-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-2-(羟基甲基)四氢呋喃-3-醇(76mg,0.246mmol)在乙腈(1069μl,20.47mmol)中的溶液中加入分子筛(3A,150mg)。将混合物在20℃下搅拌1小时，然后在室温下加入1H-咪唑-4,5-二甲腈(38.7mg,0.328mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时。UPLC-MS表明反应已经完成。加入(E)-N,N-二甲基-N'-(3-硫酮基-3H-1,2,4-二噻唑-5-基)甲脒(37.0mg,0.18mmol)。UPLC-MS表明硫化在30分钟内完成。将反应用饱和NaHCO₃/盐水处理，并用EtOAc/Hept萃取。有机层用Na₂SO₄干燥并过滤。在旋转蒸发仪上除去滤液中的溶剂和挥发性有机物。使用Biotage(25g硅胶柱，在庚烷中的EtOAc＝0-100％,15vol,100％,10vol)对残余物进行纯化。

¹H NMR(500MHz，甲醇-d₄，两种非对映异构体约1:1)δppm 8.62-8.63(m,1H)8.57-8.58(m,1H)8.48-8.50(m,1H)8.44-8.46(m,1H)8.40-8.41(m,1H)8.38-8.39(m,1H)8.33-8.35(m,1H)8.25-8.27(m,1H)7.22-7.33(m,11H)7.11-7.20(m,17H)7.05-7.11(m,4H)6.83-6.92(m,6H)6.65-6.77(m,11H)6.28-6.41(m,5H)6.23-6.28(m,2H)6.10-6.22(m,5H)6.00-6.10(m,4H)5.89-6.00(m,5H)5.52-5.57(m,2H)5.45-5.52(m,3H)5.41-5.45(m,1H)5.24-5.34(m,4H)5.13-5.17(m,3H)5.07-5.12(m,5H)4.93-4.98(m,4H)4.88-4.93(m,5H)4.73-4.82(m,3H)4.50-4.59(m,2H)4.36-4.48(m,4H)4.27-4.36(m,5H)4.16-4.27(m,5H)3.83-4.04(m,5H)3.73-3.78(m,13H)3.64-3.73(m,4H)3.52-3.58(m,1H)3.45-3.51(m,2H)3.35-3.41(m,2H)3.16-3.23(m,2H)3.08-3.15(m,2H)2.84-2.93(m,2H)2.79-2.83(m,2H)2.70-2.77(m,2H)2.61-2.69(m,3H)

在20℃下，向O-((2R,3R,4R,5R)-5-(6-(N-烯丙基苯甲酰胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟四氢呋喃-3-基)O-(((2R,3R,4R,5R)-5-(6-(烯丙氧基)-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-(2-氰乙基)硫代磷酸酯(120mg,0.104mmol)在乙腈(4171μl,79.852mmol)中的溶液中加入分子筛(3A,1wt)。将混合物在20℃下搅拌1小时，然后加入三吡咯烷膦(71.6μl,0.311mmol)。然后以2分钟间隔分7份加入在ACN中的0.45M四唑(253μl,0.114mmol)。TLC(EtOAc/Hept＝2:1,RfSM＝0.7,RfProd＝0.0-0.6)显示不完全反应。加入2X磷酸化试剂和四唑。将反应混合物在室温下搅拌10分钟。无论是UPLC-MS还是TLC都没有显示任何SM残留。将反应混合物转移至含有乙腈(20.8ml)、水(104μl,5.776mmol)和吡啶三氟乙酸盐(421mg,2.178mmol)的烧瓶中。将混合物搅拌10分钟。UPLC-MS表明所需产物已经形成。将反应混合物与EtOAc混合，并用HCl[0.1N]/盐水洗涤，然后用饱和NaHCO₃/盐水洗涤，以防止DMT脱保护。水层用EtOAc(1X)反萃取。合并的有机层用Na2SO4干燥，然后过滤。在旋转蒸发仪上除去滤液中的溶剂和挥发物，得到粗产物，其未经进一步纯化即用于下一步骤。

将粗膦酸氢酯中间体溶解在DCM(2635μl,40.946mmol)和水(29.5μl,1.638mmol)中，然后在20℃下加入在DCM(2635μl,40.946mmol)中的二氯乙酸(135μl,1.638mmol)。将混合物在20℃下搅拌5分钟。UPLC-MS表明反应已经完成。用吡啶(510μl,6.308mmol)中和反应。在旋转蒸发仪上，然后在高真空旋转蒸发仪上除去挥发物。在用于环化之前，将残余物与吡啶再共沸一次。

将粗DMT脱保护的膦酸氢酯(80mg,0.087mmol)溶解在吡啶(1831μl,22.639mmol)中，然后在室温下加入2-氯-5,5-二甲基-1,3,2-二氧磷杂环己烷2-氧化物(48.2mg,0.261mmol)。将混合物在室温下搅拌10分钟。UPLC在2.1分钟时没有显示SM峰。通过加入水(47.1μl,2.612mmol)猝灭反应，然后立即加入3H-苯并[c][1,2]二硫醇-3-酮(21.97mg,0.131mmol)。10分钟后，UPLC显示没有原材料残留。将反应在室温下搅拌1小时。在UPLC-MS上没有发现变化。反应混合物用EtOAc稀释，并用饱和NaHCO₃和盐水洗涤。有机层用Na₂SO₄干燥，然后过滤。将溶剂蒸发后的残余物溶解在MeOH中，然后加入NH₃-H₂O。将混合物搅拌5分钟，然后在旋转蒸发仪和高真空旋转蒸发仪上除去所有溶剂和挥发物。

将CDN中间体溶解在乙腈(1484μl,28.417mmol)和1,4-二噁烷(496μl,5.797mmol)中，然后在20℃下加入TEA(39.6μl,0.284mmol)和1-(溴甲基)-2-硝基苯(49.1mg,0.227mmol)。将混合物在20℃下搅拌16小时。UPLC-MS表明反应未完成。无论是TLC(EtOAc)还是HPLC都没有显示任何邻硝基苄基溴残留。加入1-(溴甲基)-2-硝基苯(49.1mg,0.227mmol)和TEA(39.6μl,0.284mmol)。将反应搅拌5小时。将反应用饱和NaHCO₃/盐水处理，并用EtOAc/Hept萃取。有机层用Na₂SO₄干燥并过滤。在旋转蒸发仪上除去滤液中的溶剂和挥发性有机物。使用Biotage(12g硅胶柱，在庚烷中的EtOAc＝0-100％,15vol,100％,10vol，在EtOAc中的10％MeOH,6vol)对残余物进行纯化。将含有所需产物的流分合并。蒸发溶剂得到所需产物。使用Prep-TLC(EtOAc)来分离极性最强的异构体，得到最终产物化合物18。使用prep-TLC(EtOAc/DCM＝1:1，运行3次)来分离另外两种异构体。极性较强的异构体转化为化合物19，极性较弱的异构体转化为化合物20。

来自第一次p-TLC(EtOAc)的极性最强的产物命名为化合物128-1：¹H NMR(500MHz，氯仿-d)δppm 8.62(s,1H)8.55(s,1H)8.00-8.07(m,2H)7.99(s,1H)7.96(s,1H)7.56-7.64(m,2H)7.48-7.56(m,3H)7.42-7.48(m,1H)7.34-7.42(m,2H)7.29-7.34(m,1H)7.18-7.25(m,2H)6.09-6.21(m,3H)5.98-6.09(m,2H)5.63-5.75(m,1H)5.52-5.63(m,1H)5.42-5.51(m,2H)5.32(dd,J＝10.27,0.98Hz,1H)5.27(dd,J＝17.12,1.47Hz,1H)5.13(d,J＝5.87Hz,2H)5.09-5.12(m,1H)4.95-5.05(m,2H)4.36-4.54(m,7H)4.23-4.31(m,2H)4.15-4.21(m,1H)

来自第二次p-TLC的极性较强的产物命名为化合物128-2(EtOAc/DCM＝1:1,3X)¹HNMR(400MHz，甲醇-d₄)δppm 8.75(s,1H)8.59(s,1H)8.43(s,1H)8.39(s,1H)8.01-8.07(m,2H)7.38-7.56(m,7H)7.27-7.35(m,1H)7.15-7.26(m,3H)6.45(d,J＝19.91Hz,1H)6.38(d,J＝19.52Hz,1H)5.95-6.26(m,4H)5.83(dd,J＝51.54,4.69Hz,1H)5.73(dd,J＝51.54,4.69Hz,1H)5.46-5.57(m,1H)5.28-5.36(m,1H)5.19-5.28(m,1H)5.16(dt,J＝5.56,1.51Hz,2H)5.03-5.10(m,1H)4.95(br d,J＝5.50Hz,2H)4.41-4.62(m,4H)4.28-4.40(m,2H)4.12-4.27(m,4H)

来自第二次p-TLC的极性较弱的产物命名为化合物128-3(EtOAc/DCM＝1:1,3X)¹HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm 8.53(s,1H)8.36(s,1H)7.95-8.02(m,2H)7.95(s,1H)7.89(s,1H)7.53-7.61(m,2H)7.44-7.53(m,4H)7.36-7.44(m,2H)7.25-7.31(m,1H)7.12-7.20(m,2H)5.91-6.18(m,4H)5.85-5.91(m,1H)5.72-5.79(m,1H)5.61-5.72(m,1H)5.47-5.57(m,1H)5.40-5.47(m,1H)5.25-5.32(m,1H)5.15-5.23(m,1H)4.99-5.14(m,3H)4.92(d,J＝5.47Hz,2H)4.52-4.60(m,2H)4.37-4.52(m,4H)4.35(d,J＝3.13Hz,1H)4.30(d,J＝5.47Hz,1H)4.25(d,J＝2.74Hz,1H)4.20(d,J＝4.69Hz,1H)

向2-硝基苄基保护的CDN(10mg,8.696μmol)在甲苯(20ml,187.761mmol)中的回流溶液中加入第二代Hoveyda-Grubbs催化剂((1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基)二氯(邻异丙氧基苯基亚甲基)钌；可以目录号569755获得；CAS301224-40-8；2.73mg,4.348μmol)和苯醌(2.350mg,0.022mmol)在甲苯(2ml)中的溶液。将所得溶液回流4小时(油浴温度为120-125℃)。TLC(EtOAc,Rfsm＝0.8,RfProd＝0.3)和UPLC-MS表明反应不完全。加入1ml Ru催化剂溶液。将反应再回流2小时。仍然有许多未反应的SM残留。加入另外1ml Ru催化剂溶液。将反应再回流2小时。反相HPLC未检测到SM。将反应混合物冷却至室温，并用DMSO(0.019ml,0.261mmol)猝灭。蒸发溶剂得到粗产物，在硅胶柱(10g硅胶柱，洗脱液：50-100％，15vol，100％，10vol)上进行纯化。将含有具有所需MS的产物的流分合并，并旋转蒸发。在Prep-TLC(EtOAc)上再次纯化残余物。

在20℃下，向在1,4-二噁烷(0.5ml,5.845mmol)中的pTLC纯化的桥锁CDN(2.5mg,2.228μmol)(反式异构体)中加入苯硫酚(0.25ml,2.428mmol)和TEA(0.25ml,1.794mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时。UPLC表明转化已经完成。

加入甲醇(1.5ml)，然后加入在H₂O中的29％NH₃(1.0ml)。将所得混合物在50℃下加热6小时，并冷却至室温。

过滤反应混合物的悬浮液，并用水(25mL)冲洗。水冲洗后在滤液中形成沉淀。再次过滤滤液以除去一些固体。

所得滤液用tol/Hep混合物(3X,1/1，各25ml)萃取。真空浓缩水层，然后溶解在水(6mL)中。再次过滤沉淀。UPLC表明所需产物已经形成。用反相HPLC，使用与纯化其它基于锁定CDN的类似物相同的方法来纯化产物。

对于化合物18，LCMS：MS m/z 748.11[M+H]⁺746.15[M-H]^-

对于化合物19，LCMS：MS m/z 748.06[M+H]⁺746.17[M-H]^-

对于化合物20，LCMS：MS m/z 748.09[M+H]⁺746.21[M-H]^-

实施例13--化合物26的合成

化合物151

在0℃下，向化合物150(0.70g,2.256mmol)在吡啶(10.5ml)中的溶液中加入4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(0.803g,2.369mmol)。将所得溶液搅拌过夜，同时升温至环境温度。完成后(通过LCMS监测)，加入饱和NH₄Cl溶液(10ml)和MTBE(20mL)。分离各层，水层用MTBE/EtOAc(3/1,12mL)萃取。合并的有机层用30％NaCl水溶液(5ml)洗涤，用MgSO₄干燥，过滤，并真空浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO₂ 25g，在正庚烷中的50％-70％EtOAc)对粗产物进行纯化，得到0.942g化合物151。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.47(s,1H),8.11(s,1H),7.43-7.35(m,2H),7.30-7.26(m,4H),7.25-7.17(m,3H),6.82-6.75(m,4H),6.28(dd,J＝2.3,17.6Hz,1H),6.22-6.10(m,1H),5.63(ddd,J＝2.7,4.7,53.1Hz,1H),5.47(qd,J＝1.4,17.3Hz,1H),5.31(dd,J＝1.2,10.6Hz,1H),5.13(t,J＝1.4Hz,1H),5.12(t,J＝1.2Hz,1H),4.89-4.76(m,1H),4.21(td,J＝3.2,6.8Hz,1H),3.78(s,6H),3.55(dd,J＝2.7,10.9Hz,1H),3.44(dd,J＝4.3,10.9Hz,1H),2.29-2.21(m,1H)。

化合物152

在环境温度下，向化合物151(0.942g,1.538mmol)在DMF(7.5mL)中的溶液中加入3-((双(二异丙基氨基)膦基)氧基)丙腈(0.927g,3.075mmol)、0.45M 1,2,3,4-四唑(2.8mL,1.2mmol)和1-甲基咪唑(30μl,0.38mmol)。将所得溶液在环境温度下搅拌4小时。完成后(通过LCMS监测)，加入TEA(0.50ml,3.6mmol)、DMF(11.3mL)和水(1.9mL)。所得混合物用正庚烷萃取三次(每次3mL)。DMF层用水(4ml)稀释，并用甲苯/正庚烷混合物(1/1,10mL)萃取。合并的有机层用30％NaCl水溶液洗涤两次(每次3mL)，用MgSO₄干燥，过滤，并真空浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO₂ 50g，在正庚烷中的33％-40％EtOAc加1％TEA)对残余物进行纯化，得到1.115g作为白色泡沫固体的化合物152(3:2非对映异构体混合物)。

化合物153

将化合物152(1.115g,1.372mmol)和化合物158(0.650g,2.095mmol)的混合物与MeCN(每次20mL)共沸两次。向所得残余物中加入MeCN(20.0ml)和1H-咪唑-4,5-二甲腈(0.243g,2.058mmol)。完全反应后(通过LCMS监测)，用(E)-N,N-二甲基-N'-(3-硫酮基-3H-1,2,4-二噻唑-5-基)甲脒(0.422g,2.058mmol)处理反应混合物。完全硫化后，加入饱和NaHCO₃溶液(20mL)和MTBE(30mL)。分离各层，水层用MTBE/EtOAc混合物(15/15mL)萃取。合并的有机层用30％NaCl水溶液(10mL)洗涤，用MgSO₄干燥，过滤，并真空浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO₂ 50g，在正庚烷中的33％-100％EtOAc加1％TEA)对残余物进行纯化，得到0.88g化合物153。

LC/MS(ESI)m/z 1076.48[M+Na]⁺。

化合物154

在环境温度下，向化合物153(0.880g,0.835mmol)在吡啶(8.8ml)中的溶液中加入亚磷酸二苯酯(0.323ml,1.67mmol)。将反应混合物搅拌1小时，并通过LCMS监测。完成后，将混合物加入饱和NaHCO₃水溶液(13.2ml)和水(4.4ml)的混合物中，同时保持内部温度低于30℃，用EtOAc(8.8ml)冲洗。在环境温度下搅拌所得混合物，并通过LCMS监测水解。完成后，用EtOAc/MTBE混合物(1/1,26mL)萃取混合物两次。合并的有机层用30％NaCl水溶液(3ml)洗涤，用MgSO₄干燥，过滤，并真空浓缩。将残余物与甲苯(每次7mL)共沸两次。将粗产物溶解在二氯甲烷(6.6ml)中，并在环境温度下用水(0.15ml,8.35mmol)和在二氯甲烷(6.6ml)中6％的二氯乙酸(0.41ml,5.0mmol)处理。完成DMT脱保护后(通过LCMS监测)，加入三乙基硅烷(2.7ml,17mmol)。搅拌10分钟后，用吡啶(4.4ml)和TEA(1ml)处理所得混合物，并真空浓缩。残余物用正庚烷研磨三次(每次8.8ml)，并与MeCN共沸两次。粗产物(化合物154)未经进一步纯化即用于下一步骤。

LC/MS(ESI)m/z 814.29[M-H]^-。

化合物155

在环境温度下，向化合物154(0.681g,0.835mmol)在吡啶(68ml)中的溶液中加入2-氯-5,5-二甲基-1,3,2-二氧磷杂环己烷2-氧化物(0.462g,2.505mmol)。将所得溶液在环境温度下搅拌1小时，并通过LCMS监测。完成后，加入水(0.45ml,25mmol)(10当量DMOCP)和硫(0.134g,4.175mmol)。完全硫化后(通过LCMS监测)，用饱和NaHCO₃水溶液(13.6ml)处理反应混合物，并真空浓缩。残余物用EtOAc(27ml)和水(13.6ml)处理。分离各层，水层用EtOAc/MTBE混合物(1/1,27mL)萃取。合并的有机层用30％NaCl水溶液(13.6ml)洗涤，用MgSO₄干燥，过滤，并真空浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO₂ 25g，在EtOAc中的0％-10％MeOH)对残余物进行纯化，得到0.693g(理论产率)化合物155。

LC/MS(ESI)m/z 830.23[M+H]⁺。

化合物156

在环境温度下，向化合物155(0.693g,0.835mmol)在乙腈(14ml)中的溶液中加入叔丁基胺(14ml,131mmol)。将所得溶液搅拌10分钟，并通过LCMS监测。完成后，真空浓缩反应混合物，并与MeCN共沸两次。向残余物中加入乙腈(14ml)和2-硝基苄基溴(0.541g,2.51mmol)。搅拌过夜后，真空浓缩反应混合物，并通过硅胶柱色谱(SiO₂ 100g，在正庚烷中的75％-100％EtOAc以及在EtOAc中的0％-10％MeOH)进行纯化，得到0.103g化合物156。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.59(s,2H),8.05(br d,J＝8.2Hz,2H),8.03(s,2H),7.58(d,J＝7.4Hz,2H),7.48(t,J＝7.4Hz,2H),7.45-7.37(m,2H),6.20(br d,J＝18.8Hz,2H),6.21-6.08(m,2H),5.98-5.83(m,2H),5.69(dd,J＝4.7,52.0Hz,1H),5.47(br d,J＝17.2Hz,2H),5.31(br d,J＝10.6Hz,2H),5.14(br d,J＝5.5Hz,4H),4.54-4.46(m,2H),4.45-4.40(m,2H),4.37-4.26(m,4H),4.21-4.11(m,2H)。

基于合成方法学、NMR数据(对称)和HPLC保留时间(最慢洗脱异构体)，申请人认为化合物156具有RR磷立体化学。该立体化学指定通过X射线晶体学进行确认。

化合物157

向化合物156(0.103g,0.098mmol)在甲苯(103ml)中的回流溶液中加入第二代Hoveyda-Grubbs催化剂((1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基)二氯(邻异丙氧基苯基亚甲基)钌；可以目录号569755获得；CAS 301224-40-8；31mg,0.049mmol)和醌(32mg,0.295mmol)在甲苯(10mL)中的溶液。将混合物回流搅拌2小时，并加入额外的催化剂(16mg,0.025mmol)。完成后，将反应混合物冷却至环境温度，并用DMSO(0.14ml,2.0mmol)处理过夜。真空浓缩所得混合物，并通过硅胶柱色谱(SiO₂ 10g，在EtOAc中的0％-10％甲醇)进行纯化，得到所需产物，该产物通过pre TLC(EtOAc)进一步纯化，得到3.6mg化合物157。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.11(dd,J＝1.2,8.2Hz,2H),8.09(s,2H),7.68(s,2H),7.67-7.58(m,4H),7.52-7.48(m,2H),6.26(d,J＝17.6Hz,2H),6.02-5.97(m,2H),5.97-5.88(m,2H),5.68(dd,J＝3.9,50.8Hz,2H),5.15(br d,J＝10.9Hz,2H),4.99(br d,J＝10.9Hz,2H),4.56-4.44(m,8H),4.25(br t,J＝6.1Hz,2H)。

化合物26

向化合物157(3.6mg,3.5μmol)中加入1,4-二噁烷(0.11mL)、苯硫酚(0.045mL,0.44mmol)和TEA(0.054mL,0.39mmol)。在环境温度下搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测反应。完全转化后，加入水(0.5mL)。所得混合物用正庚烷/甲苯混合物(1/1，每次0.4mL)萃取三次，然后用甲苯(0.3mL)萃取。真空浓缩水层，并用水(0.5mL)处理。滤出所得固体，用水(0.5mL)冲洗。冷冻干燥合并的滤液，得到2.0mg作为白色泡沫固体的双TEA盐化合物26。

¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝8.67(s,2H),8.18(s,2H),6.41(d,J＝14.8Hz,2H),6.07-6.01(m,2H),5.56(dd,J＝3.1,51.2Hz,2H),5.48-5.41(m,2H),5.08(br d,J＝12.1Hz,2H),4.99-4.88(m,2H),4.52(br d,J＝12.5Hz,2H),4.40(br d,J＝9.8Hz,2H),3.98(dd,J＝5.7,12.3Hz,2H),3.14(q,J＝7.4Hz,12H),1.27(t,J＝7.4Hz,18H)。

实施例15--化合物27的合成

化合物27由化合物159制备，化合物159是图2B中所示化合物1途径的阶段11b的副产物。

向化合物159(2.0g,1.75mmol)在甲醇(24ml)中的溶液中加入28％氢氧化铵(12ml)。将所得混合物在50℃下搅拌5小时，并冷却至环境温度。完成后(通过LCMS监测)，将反应混合物冷却至环境温度，用水(20ml)处理，并用甲苯/EtOAc混合物(1/1，每次24mL)萃取三次。水层用1.0M盐酸(3.5ml,3.5mmol)酸化，在环境温度下搅拌30分钟，在0℃下搅拌30分钟。过滤所得浆液，用水(20mL)冲洗。滤饼在真空烘箱中于35℃下干燥过夜，并用28％NH₄OH(2mL)和MeOH(20mL)的混合物溶解。真空浓缩所得溶液，并用EtOH(4ml)处理制成浆液。通过过滤收集所得固体并真空干燥。获得70mg作为白色固体的化合物27。

¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝9.03(br s,1H),8.31(br s,1H),8.26(br s,1H),8.13(br s,1H),6.43-6.24(m,2H),5.97-5.83(m,2H),5.71(br d,J＝51.6Hz,1H),5.64(brd,J＝50.0Hz,1H),5.12-4.99(m,1H),4.96-4.90(m,1H),4.68-4.32(m,6H),4.14-3.97(m,2H),3.77-3.62(m,2H)。

实施例16--化合物28的合成

化合物28使用与化合物27相同的方法，由化合物160制备，化合物160是图2B中所示化合物1途径的阶段11的产物。

¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝8.70(br s,1H),8.49(br s,1H),8.24(br s,1H),8.10(br s,1H),6.52-6.26(m,2H),5.94-5.78(m,2H),5.69(br d,J＝54.7Hz,1H),5.48-5.26(m,1H),5.14(br d,J＝53.1Hz,2H),5.06-4.94(m,1H),4.74-4.19(m,4H),4.10-3.93(m,2H),3.76-3.58(m,2H)

实施例17--化合物29的合成

化合物162

将化合物161(5.0g,6.329mmol)和丁-2-炔-1,4-二醇(1.907g,22.153mmol)与THF共沸两次。将残余物溶解在THF(50.0ml)和甲苯(75ml)中。加入三苯基膦(2.158g,8.228mmol)，并将所得溶液冷却至低于5℃。滴加DIAD(1.60ml,8.23mmol)，同时保持内部温度低于10℃。在0-5℃下搅拌所得溶液，同时通过LCMS监测进程。完成后，真空浓缩反应混合物，以除去大部分THF。残余物用MTBE(50.0ml)稀释，并用30％NaCl水溶液(每次40.0ml)洗涤两次，用水(每次25ml)洗涤两次。真空浓缩有机溶液，并通过硅胶柱色谱(SiO₂ 100g，用1％TEA缓冲的正庚烷中的50％-70％EtOAc)进行纯化，得到4.671g化合物162。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.61(s,1H),8.14(s,1H),7.43(d,J＝7.2Hz,2H),7.33-7.27(m,3H),7.24-7.18(m,8H),7.05-7.01(m,2H),6.76(d,J＝8.6Hz,4H),6.20(dd,J＝2.7,17.2Hz,1H),5.59(td,J＝3.1,53.1Hz,1H),5.19(br d,J＝2.3Hz,2H),4.93-4.83(m,1H),4.18-4.15(m,1H),4.01(br d,J＝6.3Hz,2H),3.78(s,6H),3.53(dd,J＝2.7,10.9Hz,1H),3.17(dd,J＝3.7,11.1Hz,1H),0.85(s,9H),0.10(s,3H),0.02(s,3H)。

化合物164

将化合物162(4.671g,5.444mmol)、化合物163(3.32g,6.805mmol)和三苯基膦(1.856g,7.077mmol)溶解在THF(56.1ml)中，并冷却至低于5℃。向所得溶液中加入DIAD(1.3ml,6.8mmol)，同时保持内部温度低于10℃。化合物162完全消耗后(通过LCMS监测)，真空浓缩反应混合物，并通过硅胶柱色谱(SiO₂ 340g，用1％TEA缓冲的正庚烷中的55％-70％EtOAc)进行纯化，得到3.879g作为白色泡沫固体的化合物164。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.51(s,1H),8.45(s,1H),8.20(s,1H),8.05(s,1H),7.41(d,J＝7.1Hz,2H),7.36-7.32(m,4H),7.28-7.13(m,8H),6.98(t,J＝7.8Hz,2H),6.79-6.74(m,4H),6.29(dd,J＝2.0,16.4Hz,1H),6.19(dd,J＝2.7,17.2Hz,1H),5.53(ddd,J＝2.7,4.7,53.1Hz,1H),5.33(ddd,J＝2.0,3.9,53.1Hz,1H),5.23-5.21(m,1H),5.05-5.01(m,2H),4.99-4.94(m,2H),4.81(ddd,J＝4.3,6.7,16.7Hz,1H),4.71-4.60(m,1H),4.21-4.14(m,2H),4.08-4.03(m,1H),3.89(dd,J＝3.1,11.7Hz,1H),3.77(s,6H),0.91(s,9H),0.84(s,9H),0.09(s,3H),0.08(s,6H),0.00(s,3H)。

化合物165

在环境温度下，向化合物164(1.5g,1.13mmol)在吡啶(12.0ml)中的溶液中加入亚磷酸二苯酯(0.35ml,1.8mmol)。在环境温度下搅拌所得溶液，同时通过LCMS监测。完成后，将反应混合物加入饱和NaHCO₃水溶液(22.5ml)和水(7.5ml)的混合物中，同时保持内部温度低于30℃。水解完成后(通过LCMS监测)，用EtOAc/MTBE混合物(30.0/30.0ml)萃取所得混合物两次。合并的有机层用30％NaCl水溶液(15.0ml)洗涤，用MgSO₄干燥，过滤，并真空浓缩。将残余物与甲苯共沸三次，并溶解在二氯甲烷(11ml)中。在环境温度下在水(0.20ml,11mmol)和在二氯甲烷(11ml)中的6％二氯乙酸(0.57ml,6.9mmol)处理。完全除去DMT基团后(通过LCMS监测)，加入三乙基硅烷(1.8ml,11mmol)。搅拌10分钟后，加入TEA(1.6ml,11mmol)，并真空浓缩所得混合物。将残余物溶解在EtOAc(22.5ml)中，用水(3.8ml)和饱和NaHCO₃水溶液(8％)(3.0ml)洗涤，用MgSO₄干燥，过滤，并真空浓缩。将粗产物用正庚烷(33.8ml)以及正庚烷(9.0ml)和甲苯(3.0ml)的混合物研磨两次。倾倒出上清液，并将保留在底部的固体溶解在乙腈中。将所得溶液真空浓缩，并与乙腈共沸两次。粗产物化合物165未经纯化即用于下一阶段(假设100％的理论产率)。

LC/MS(ESI)m/z 1089.74[M+H]⁺。

化合物166

在环境温度下，向化合物165(1.231g,1.13mmol)在吡啶(100mL)中的溶液中加入TEA(0.47ml,3.4mmol)和DMOCP(0.375mg,2.03mml)。在环境温度下搅拌所得溶液，同时通过LCMS监测。完成后，加入水(0.41mL,22.6mmol)，然后加入硫(0.181g,5.651mmol)。完全硫化后(通过LCMS监测)，加入饱和NaHCO₃水溶液(8％)(24.6ml)和水(10mL)。将所得混合物真空浓缩至约50mL，并用MTBE/EtOAc混合物(每次31/31ml)萃取两次。合并的有机层用30％NaCl水溶液(25ml)洗涤，用MgSO₄干燥，过滤，真空浓缩，并通过硅胶柱色谱(SiO₂ 100g，用1％TEA缓冲的乙酸乙酯中的0-10％甲醇)进行纯化，得到化合物166(0.484g)。

LC/MS(ESI)m/z 1103.65[M+H]⁺。

化合物167

在环境温度下，向化合物166(0.484g,0.402mmol)在吡啶(1.2ml)和TEA(5.8ml)中的溶液中加入Et₃N 3HF(0.581ml,3.563mmol)。在环境温度下搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测。完全转化后，加入甲氧基三甲基硅烷(3.9ml,28mmol)。在环境温度下搅拌20分钟后，倾倒出上清液。向残余物中加入甲苯(5mL)，并在搅拌10分钟后，倾倒出甲苯层。同样的操作再重复一次。将所得粗产物溶解在二氯甲烷(10mL)中，用饱和NH₄Cl水溶液(27重量％)(5ml)和30％NaCl水溶液(2.4ml)洗涤，并用MgSO₄干燥。过滤后浓缩所得有机层，得到0.386g浅褐色固体，将其与MeCN共沸两次。将所得粗产物溶解在MeCN(4.6ml)中，并在环境温度下用2-硝基苄基溴(0.103g,0.475mmol)处理。烷基化完成后(通过LCMS监测)，真空浓缩反应混合物，并通过硅胶柱色谱(SiO₂ 25g，在EtOAc中的0-5％MeOH)进行纯化，得到0.251g作为白色固体的化合物167。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.42(br s,1H),8.31(br s,1H),8.22(brs,1H),8.10-8.04(m,1H),7.93(s,1H),7.53-7.37(m,8H),7.32-7.27(m,3H),7.24-7.16(m,2H),6.18(br d,J＝16.8Hz,1H),6.26-6.14(m,1H),5.56(d,J＝53.1Hz,1H),5.48-5.37(m,1H),5.31(br s,1H),5.15(br d,J＝17.6Hz,1H),4.92(d,J＝17.6Hz,1H),4.82(d,J＝17.2Hz,1H),4.88-4.77(m,1H),4.76-4.66(m,1H),4.58-4.33(m,3H),4.29(br d,J＝5.9Hz,1H),4.21(br s,1H),4.13-4.06(m,1H),3.93-3.79(m,2H)。

化合物168

将化合物167(0.224g,0.222mmol)和3-(双(二异丙基氨基)膦氧基)丙腈(0.081ml,0.255mmol)溶解在MeCN(5mL)中，并浓缩。同样的操作再重复两次。将所得混合物溶解在二氯甲烷(2.2ml)中，冷却至0℃，并用二异丙基铵四氮唑(0.019g,0.111mmol)处理。使反应混合物升至环境温度，过夜，并用MeCN(2.2mL)稀释。将所得溶液通过注射泵历时10小时加入吡啶三氟乙酸盐(0.129g,0.665mmol)在MeCN(18ml)中的溶液中。额外搅拌1小时后，历时4小时加入在MeCN(1mL)中的3-(双(二异丙基氨基)膦氧基)丙腈(0.04mL,0.12mmol)。加入(E)-N,N-二甲基-N'-(3-硫酮基-3H-1,2,4-二噻唑-5-基)甲脒(0.064g,0.311mmol)。完全硫化后(通过LCMS监测)，真空浓缩反应混合物，并用MTBE(4.5ml)溶解所得残余物。所得有机溶液用饱和NaHCO₃水溶液(8％)(4ml)和水(2ml)洗涤。合并的水层用MTBE/EtOAc混合物(4/4mL)反萃取。合并的有机层用30％NaCl水溶液(每次2mL)洗涤两次，用MgSO₄干燥，过滤，真空浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO₂ 25g，在正庚烷中的50％-100％EtOAc)对残余物进行纯化，得到64mg化合物168。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.57(s,1H),8.18(s,1H),8.06-8.01(m,1H),7.91(s,1H),7.62-7.56(m,2H),7.55-7.50(m,2H),7.49-7.43(m,3H),7.42-7.34(m,2H),7.30-7.18(m,5H),6.33(d,J＝15.2Hz,1H),6.10(d,J＝20.7Hz,1H),5.95-5.77(m,1H),5.54(dd,J＝4.3,52.8Hz,1H),5.46(dd,J＝3.9,50.8Hz,1H),5.32-5.18(m,1H),5.10(d,J＝17.6Hz,1H),4.89(d,J＝17.6Hz,1H),4.85-4.81(m,2H),4.78(br d,J＝12.1Hz,1H),4.64(br dd,J＝4.1,9.2Hz,1H),4.55(dd,J＝2.7,12.1Hz,1H),4.52-4.44(m,3H),4.38-4.20(m,4H),2.75(td,J＝6.3,17.6Hz,1H),2.58(td,J＝5.9,17.2Hz,1H)。

化合物29

向化合物168(40mg,0.035mmol)在1,4-二噁烷(0.5mL)中的溶液中加入苯硫酚(0.24ml,2.3mmol)和TEA(0.24ml,1.7mmol)。在环境温度下搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测反应。完成后，加入甲醇(0.64ml)和28％氢氧化铵(0.64ml)。将所得混合物加热至50℃，搅拌5小时，并冷却至环境温度。完全脱保护后(通过LCMS监测)，将所得混合物用水(0.80ml)处理，并用正庚烷/甲苯混合物(1/1，每次0.5mL)萃取三次，然后用甲苯(0.3ml)萃取。水层在40-50℃下真空浓缩，并用水(1mL)处理。滤出所得固体，用水(0.3ml)冲洗。合并的滤液用1.0M HCl(0.07ml,0.07mmol)处理。过滤所得浆液，并用水(1mL)冲洗。滤饼用在MeOH中的2.0M氨溶液(1.0ml,2.0mmol)溶解。将所得溶液真空浓缩至0.5mL，并用EtOH(0.5ml)处理。同样的操作再重复两次。向所得溶液中滴加EtOAc(0.9mL)。出现沉淀。通过过滤收集所得固体，用EtOAc/EtOH的4/1混合物(0.4mL)冲洗，并在环境温度下真空干燥过夜。获得12mg化合物29。

¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝8.88(br s,1H),8.50(br s,1H),8.20(br s,1H),8.12(br s,1H),6.42-6.17(m,2H),5.84-5.54(m,1H),5.52(d,J＝51.6Hz,1H),5.06-4.78(m,2H),4.77-4.55(m,3H),4.49(br d,J＝10.2Hz,1H),4.42(br s,2H),4.09-3.77(m,4H)。

实施例18--化合物25的合成

化合物170

向第二代Hoveyda-Grubbs催化剂(0.996g,1.585mmol)在二氯甲烷(40.0ml)中的回流溶液中加入丙-2-烯-d5-1-醇(10.0g,158mmol)。1小时后，加入另外1mol％的第二代Hoveyda-Grubbs催化剂(0.996g,1.585mmol)。将所得溶液回流搅拌过夜，冷却至环境温度，并真空浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO₂ 340g，在EtOAc中的0％-10％MeOH)对残余物进行纯化，得到4.2g作为褐色油状物的化合物170。

¹³C NMR(101MHz，甲醇-d₄)δ＝130.87(t,J＝23.8Hz,2C),62.22(quin,J＝21.9Hz,2C)。

化合物171

以化合物170作为原材料，通过与图2A和图2B中化合物1的合成途径中所述相同的反应顺序(阶段1-11)来制备化合物171。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.59(s,1H),8.10(s,1H),8.02-7.96(m,1H),7.93(s,1H),7.58-7.50(m,2H),7.48-7.37(m,5H),7.34-7.27(m,2H),7.24-7.14(m,4H),6.90(s,1H),6.28(d,J＝14.8Hz,1H),6.14-6.03(m,1H),5.97-5.81(m,1H),5.49(dd,J＝4.7,52.3Hz,2H),5.43(dd,J＝3.9,50.8Hz,1H),5.30-5.15(m,1H),4.75(br d,J＝12.1Hz,1H),4.61(br dd,J＝4.3,9.4Hz,1H),4.53(dd,J＝2.9,11.9Hz,1H),4.47-4.41(m,3H),4.32-4.18(m,4H),2.79(td,J＝7.0,17.2Hz,1H),2.66(td,J＝6.3,16.8Hz,1H)

化合物25

以化合物171作为原材料，通过与图2A和图2B中所述相同的反应顺序(阶段12-13)来制备化合物25。

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ＝9.03(br s,1H),8.30(br s,1H),8.24(br s,1H),8.10(br s,1H),6.44-6.13(m,2H),0.00(d,J＝52.4Hz,1H),0.00(d,J＝51.2Hz,1H),4.71-4.32(m,6H),4.09-3.98(m,1H),3.97-3.87(m,1H)。

实施例19--化合物31(RpRp或SpSp)的合成

化合物173

将(E)-丁-2-烯-1,4-二醇(0.10g,1.135mmol)和化合物172(2.52g,2.55mmol)的混合物与THF共沸两次，并溶解在THF(5.0ml)和甲苯(7.5ml)中。向所得溶液中加入三苯基膦(0.714g,2.724mmol)。将所得溶液冷却至低于5℃，并用DIAD(0.53ml,2.72mmol)处理，同时保持内部温度低于10℃。将所得反应混合物搅拌过夜，同时升温至环境温度。完全反应后(通过LCMS监测)，真空浓缩反应混合物，并通过硅胶柱色谱(SiO₂ 50g，用在正庚烷/EtOAc(1/1)中的1％TEA预处理，在正庚烷中的50％-66％EtOAc)进行纯化，得到2.46g作为白色泡沫固体的化合物173。该材料未经进一步纯化即用于下一步骤。

化合物174

在环境温度下，向化合物173(2.387g,1.177mmol)在乙腈(28.6ml)中的溶液中加入水(0.085ml,4.7mmol)、吡啶三氟乙酸盐(0.500g,2.589mmol)。1分钟后，加入2-氨基-2-甲基丙烷(19.1ml,182mmol)。在环境温度下搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测反应。完成后，真空浓缩反应混合物，并与MeCN共沸。将残余物溶解在二氯甲烷(24mL)中，并用水(0.42ml)和在二氯甲烷(24ml)中的6％二氯乙酸(1.2ml,14mmol)处理。完全DMT脱保护后(通过LCMS监测)，用吡啶(12ml)猝灭反应，并真空浓缩反应混合物。用正庚烷/甲苯混合物(15/15ml)处理所得残余物，并倾倒出顶层。同样的操作再重复一次。真空干燥剩余的残余物，得到化合物174，其未经进一步纯化即用于下一步骤。

LC/MS(ESI)m/z 1151.64[M+H]⁺。

化合物175

在环境温度下，向化合物174(1.355g,1.177mmol)在吡啶(271ml)中的溶液中加入TEA(0.98ml,7.1mmol)和2-氯-5,5-二甲基-1,3,2-二氧磷杂环己烷2-氧化物(0.869g,4.708mmol)。在环境温度下搅拌所得溶液，直至所有原材料消耗殆尽(通过LCMS监测)。完全反应后，加入水(0.85ml,47mmol)(10当量DMOCP)，然后加入硫(0.377g,11.77mmol)。在环境温度下搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测反应。完全硫化后，用饱和NaHCO₃水溶液(27ml)和水(10mL)处理反应混合物，并真空浓缩。向所得残余物中加入MTBE/EtOAc混合物(34/34ml)、饱和NaHCO₃水溶液(27ml)和水(20mL)。分离各层，水层用EtOAc/MTBE混合物(34/34mL)萃取。合并的有机层用30％NaCl水溶液(7ml)洗涤，用MgSO₄干燥，过滤，并真空浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO₂ 50g，在EtOAc中的0％-20％MeOH加1％TEA)对残余物进行纯化，得到56mg化合物175(基于NMR对称；RpRp或SpSp异构体)。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝9.09(s,2H),8.46(s,2H),7.56-7.05(m,10H),6.37(d,J＝8.2Hz,2H),6.28-6.22(m,2H),5.29(ddd,J＝4.7,7.8,11.7Hz,2H),5.00(br d,J＝13.7Hz,2H),4.84(d,J＝4.3Hz,2H),4.76(br d,J＝13.3Hz,2H),4.31(br s,2H),4.28-4.20(m,2H),4.16-4.08(m,2H),3.00-2.77(m,12H),1.12-0.99(m,18H),0.96(s,18H),0.34(s,6H),0.25(s,6H)。

化合物31

向化合物175(56mg,0.0405mmol)在甲醇(1.1mL)中的溶液中加入28％氢氧化铵(0.22mL)。将所得混合物在50℃下搅拌5小时，冷却至环境温度，真空浓缩，并与MeCN共沸两次。向所得残余物中加入吡啶(0.22mL)、TEA(0.11mL)和TEA 3HF(0.11ml,0.69mmol)。将所得混合物在50℃下搅拌5小时，冷却至环境温度，用甲氧基三甲基硅烷(0.90mL,6.50mmol)处理30分钟。真空浓缩所得混合物，并溶解在水(5mL)中。所得水溶液用甲苯(每次5mL)萃取三次，并真空浓缩。将粗产物溶解在1mL水中，通过注射器式过滤器过滤，并用1N HCl酸化使其pH<3。所得混合物在冰箱(5℃)中保存2天，通过过滤收集所得固体。将固体溶解在2M NH₃在MeOH中的溶液(1.5ml)中，真空浓缩，得到2.8mg化合物31，其为NH₃和TEA盐的混合物。将产物溶解在EtOH(1mL)中，用0.1ml TEA处理，浓缩至0.5mL，并在冰箱(-20℃)中保存过夜。除去上清液，剩余的固体在真空中进一步干燥，得到0.8mg双TEA盐化合物31(通过NMR测定为对称；RpRp或SpSp异构体)。

¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝8.26-7.83(m,4H),6.37(br s,2H),5.89(br s,2H),5.36-5.07(m,2H),4.95(br d,J＝3.5Hz,2H),4.58(br dd,J＝6.3,10.6Hz,2H),4.43(brs,2H),4.12-4.00(m,4H),3.89-3.70(m,2H),3.19(q,J＝7.2Hz,12H),1.30(t,J＝7.4Hz,18H)

实施例20--化合物32的合成

化合物178

向化合物177(2.0g,2.532mmol)和(+)-2,3-O-亚异丙基-L-苏糖醇(化合物176)(1.232g,7.595mmol)在THF(20.0ml)和甲苯(30.0ml)中的溶液中加入三苯基膦(0.930g,3.544mmol)。将所得溶液冷却至低于5℃，并用DIAD(0.64ml,3.3mmol)处理。将反应混合物升温至环境温度。在环境温度下搅拌8小时后，加入额外的DIAD(0.64mL)和PPh₃(0.93g)。在环境温度下搅拌过夜后，将反应混合物在40℃下搅拌2天，并真空浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO₂ 100g，用在正庚烷/EtOAc(1/1)中的1％TEA预处理，在正庚烷中的50％-70％EtOAc)对残余物进行纯化，得到0.524g作为白色泡沫固体的化合物178。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.62(s,1H),8.09(s,1H),7.40-7.09(m,12H),7.01-6.92(m,2H),6.80-6.73(m,4H),6.16(dd,J＝2.7,16.8Hz,1H),5.49(ddd,J＝3.1,4.3,53.1Hz,1H),4.85-4.75(m,2H),4.63(dd,J＝3.9,14.8Hz,1H),4.30-4.19(m,2H),4.18-4.12(m,1H),3.94(tt,J＝3.5,8.2Hz,1H),3.84(td,J＝5.5,12.1Hz,1H),3.78(s,6H),3.53(dd,J＝2.7,10.9Hz,1H),3.17(dd,J＝3.5,10.9Hz,1H),2.94(br t,J＝5.5Hz,1H),0.89(s,6H),0.83(s,9H),0.08(s,3H),-0.01(s,3H)

化合物180

向化合物178(0.409g,0.84mmol)在THF(6mL)中的溶液中加入三苯基膦(0.191g,0.728mmol)和DIAD(0.142ml,0.728mmol)。在环境温度下搅拌40小时后，真空浓缩反应混合物，并通过柱色谱(SiO₂ 50g，用在正庚烷/EtOAc(1/1)中的1％TEA预处理，在正庚烷中的50％-66％EtOAc)进行纯化，得到0.533g化合物180。

LC/MS：LRMS(ESI)m/z 1403.86[M+H]⁺。

化合物181

以化合物180作为原材料，通过与图2A和图2B中所述相同的反应顺序(阶段5-11)来制备化合物181。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.72(s,1H),8.14-8.06(m,1H),7.93(s,1H),7.69(s,1H),7.62-7.53(m,6H),7.53-7.45(m,1H),7.43-7.33(m,2H),7.30-7.24(m,3H),7.19-7.12(m,2H),6.11(d,J＝16.8Hz,1H),6.05(d,J＝19.5Hz,1H),5.89(dd,J＝3.5,52.3Hz,1H),5.57-5.46(m,1H),5.41(dd,J＝3.5,53.1Hz,1H),5.18-5.04(m,1H),4.83(dd,J＝4.7,14.4Hz,1H),4.78-4.73(m,1H),4.70(br d,J＝12.1Hz,1H),4.64-4.48(m,4H),4.46-4.35(m,4H),4.33-4.27(m,2H),4.16-4.06(m,2H),4.05-3.96(m,1H),2.55(t,J＝6.1Hz,2H),1.26(s,6H)。

化合物182

向化合物181(3.2mg,2.629μmol)在二氯甲烷(0.5ml)中的溶液中加入叔丁基胺(0.5ml,4.7mmol)。搅拌30分钟后，真空浓缩反应溶液，并与MeCN共沸两次。将残余物溶解在乙腈(1ml)中，并用1-(溴甲基)-2-硝基苯(1.7mg,7.9μmol)处理。完全烷基化后(通过LCMS监测)，在氮气吹扫下浓缩反应混合物。通过硅胶柱色谱(SiO₂ 4g，在正庚烷中的80％-100％EtOAc)对残余物进行纯化，得到2mg化合物182。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.12(dd,J＝1.4,8.0Hz,1H),8.03-8.00(m,1H),8.00(s,1H),7.93(s,1H),7.70(s,1H),7.70-7.29(m,13H),7.21(dt,J＝2.7,7.6Hz,4H),6.07(d,J＝19.9Hz,1H),5.94(d,J＝21.1Hz,1H),5.91-5.77(m,1H),5.81(dd,J＝4.3,51.5Hz,1H),5.62-5.49(m,1H),5.54(dd,J＝3.1,52.7Hz,2H),4.83(q,J＝5.9Hz,1H),4.72-4.63(m,2H),4.61-4.28(m,13H),1.42(s,3H),1.28(s,3H)。

化合物32

向化合物182(2.0mg,1.5μmol)中加入乙酸(0.8ml)和水(0.2ml)。将所得混合物在环境温度下搅拌14小时，在45-50℃下搅拌24小时，真空浓缩，并与甲苯共沸两次。向残余物中加入1,4-二噁烷(0.12mL)、苯硫酚(60μl)，然后加入TEA(60μl)。在环境温度下搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测反应。完成后，加入甲醇(160μl)和28％氢氧化铵(160μl)。在50℃下搅拌所得混合物，直至脱苯甲酰化完成(通过LCMS监测)。完成后，加入水(0.3ml)。滤出所得固体，用水(0.2mL)冲洗。滤液用甲苯(每次0.5mL)萃取两次，并在40-50℃下真空浓缩。用水(0.5mL)处理残余物，滤出所得固体，用水(0.1mL)冲洗。在下述条件下对合并的水层进行HPLC纯化，得到1.5mg化合物32。

LC/MS：LRMS(ESI)m/z 781.23[M+H]⁺。

化合物32的制备型HPLC条件：

实施例21--化合物33和化合物34的合成

在0℃下，向9-((2R,3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)-1,9-二氢-6H-嘌呤-6-酮，即化合物183(5.00g,18.5mmol)在吡啶(75ml)中的溶液中加入Ac₂O(7.0ml,74mmol)和DMAP(0.565g,4.626mmol)。将所得混合物升温至环境温度并搅拌，同时通过LCMS监测反应。完成后，真空浓缩反应混合物，并用EtOAc(200mL)和水(50ml)处理。出现沉淀。通过过滤收集所得固体，并用MTBE冲洗。在40℃下真空干燥过夜，得到5.81g作为白色固体的化合物193。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ＝12.53(br s,1H),8.33(s,1H),8.15(d,J＝4.3Hz,1H),6.37(dd,J＝2.7,19.1Hz,1H),5.86(ddd,J＝2.7,5.1,51.6Hz,1H),5.62(ddd,J＝5.5,7.0,16.0Hz,1H),4.49-4.38(m,2H),4.26(dd,J＝4.7,12.1Hz,1H),2.19(s,3H),2.04(s,3H)。

化合物184

在0℃下，向化合物193在二氯甲烷(40.0ml)中的溶液中缓慢加入DMF(1.3ml,16.9mmol)和亚硫酰氯(1.28ml,17.5mmol)。将所得混合物加热至回流并搅拌，直至所有原材料消耗殆尽(通过LCMS监测)。完成后，将反应混合物冷却至环境温度，并用饱和NaHCO₃水溶液(40mL)处理。分离各层，水层用二氯甲烷(每次30mL)萃取两次。合并的有机层用MgSO₄干燥，过滤，并真空浓缩，得到2.81g作为浅褐色油状物的化合物184。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.79(s,1H),8.30(s,1H),6.29(dd,J＝2.0,18.0Hz,1H),5.79(ddd,J＝1.6,4.7,51.6Hz,1H),5.53(ddd,J＝5.1,7.6,17.8Hz,1H),4.58-4.48(m,2H),4.33(dd,J＝3.9,12.5Hz,1H),2.20(s,3H),2.07(s,3H)。

化合物194

在环境温度下，向化合物184(0.22g,0.59mmol)在THF(7.7ml)和NMP(0.77ml)的混合物中的溶液中加入乙酰丙酮铁(III)(0.021g,0.059mmol)和在THF中的0.5M 3-丁烯基溴化镁(1.77ml,0.885mmol)。完全反应后(通过LCMS监测)，加入MTBE(10mL)和0.1N HCl(10mL)。将所得混合物在环境温度下搅拌10分钟。分离各层，水层用EtOAc/MTBE混合物(1/1,10ml)萃取。合并的有机层用30％NaCl水溶液(5mL)洗涤，用MgSO₄干燥，并真空浓缩。粗产物未经进一步纯化即用于下一步骤。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.90(s,1H),8.16(s,1H),6.26(dd,J＝2.0,18.4Hz,1H),5.98-5.85(m,1H),5.90-5.73(m,1H),5.63(ddd,J＝4.9,7.5,17.7Hz,1H),5.12-5.05(m,1H),4.98(dd,J＝1.6,10.2Hz,1H),4.54-4.50(m,2H),4.31(dd,J＝5.1,12.9Hz,1H),3.30(t,J＝7.4Hz,2H),2.70-2.64(m,2H),2.19(s,3H),2.05(s,3H)。

化合物185

将粗产物化合物194(0.232g，理论上0.590mmol)溶解在甲醇(1.5ml)中，并在环境温度下用2.0M氨在MeOH中的溶液(1.5ml,3.0mmol)处理。完全脱乙酰后，真空浓缩反应混合物，并通过硅胶柱色谱(SiO₂ 10g，在EtOAc中的0％-5％MeOH)进行纯化，得到0.17g化合物185。

LCMS：MS(ESI)m/z 309.20[M+H]⁺

化合物195

在0℃下，向化合物185(1.22g,2.928mmol)在吡啶(9.0ml)中的溶液中加入4,4'-(氯(苯基)亚甲基)双(甲氧基苯)(1.042g,3.075mmol)。将反应混合物升温至环境温度，同时通过LCMS监测反应。完成后，加入MTBE(18mL)和饱和NaHCO₃水溶液(9.0ml)。搅拌10分钟后，分离各层，水层用MTBE(18.0ml)萃取。合并的有机层用30％NaCl水溶液(10ml)洗涤，过滤，并真空浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO₂ 50g，在庚烷中的50％-100％乙酸乙酯加1％TEA)进行纯化，得到1.53g作为橙色固体的化合物195。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.86-8.78(m,1H),8.21(s,1H),7.40-7.36(m,2H),7.31-7.18(m,7H),6.79(d,J＝8.6Hz,4H),6.29(dd,J＝2.3,17.2Hz,1H),5.92(tdd,J＝6.4,10.4,17.0Hz,1H),5.70(ddd,J＝2.7,4.7,52.8Hz,1H),5.09(dd,J＝1.6,17.2Hz,1H),4.97(dd,J＝1.6,10.2Hz,1H),4.90-4.77(m,1H),4.26-4.19(m,1H),3.78(s,6H),3.56(dd,J＝3.1,10.9Hz,1H),3.43(dd,J＝4.3,10.9Hz,1H),3.33-3.28(m,2H),2.70-2.64(m,2H),2.20(dd,J＝2.5,7.2Hz,1H)。

化合物186

在环境温度下，向化合物195(1.530g,2.505mmol)在二氯甲烷(23ml)中的溶液中加入3-(双(二异丙基氨基)膦氧基)丙腈(1.20ml,3.76mmol)和二异丙基铵四氮唑(0.493g,2.881mmol)。在环境温度下搅拌反应混合物，同时通过LCMS监测进程。完成后，真空浓缩反应混合物，并通过硅胶柱色谱(SiO₂ 50g，在正庚烷中的40％-66％EtOAc加1％TEA)进行纯化，得到1.80g作为浅橙色泡沫固体的化合物186。

化合物196和197

将化合物186(1.8g,2.22mmol)和化合物185(1.110g,2.664mmol)溶解在乙腈(21.6ml)中，并真空浓缩。同样的操作再重复一次。将所得混合物溶解在乙腈(21.6ml)中，并在环境温度下用三氟乙酸吡啶鎓(0.514g,2.664mmol)处理。完全反应后(通过LCMS监测)，加入((二甲基氨基-亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑啉-3-硫酮(0.911g,4.439mmol)，并在环境温度下搅拌所得混合物。完全硫化后(通过LCMS监测)，加入饱和NaHCO₃水溶液(30ml)，并用MTBE(每次30mL)萃取所得混合物三次。合并的有机层用30％NaCl水溶液(20ml)洗涤，用MgSO₄干燥，过滤，并真空浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO₂ 100g，在EtOAc中的0％-10％MeOH加1％TEA)进行纯化，得到0.481g化合物196和1.315g化合物197。

化合物196：LCMS：MS(ESI)m/z 1073.25[M+Na]⁺

化合物197：LCMS：MS(ESI)m/z 995.23[M-H]^-

化合物188

环境温度下，向TEA盐化合物197(1.315g,1.197mmol)在MeCN(20ml)中的溶液中加入2-硝基苄基溴(0.388g,1.796mmol)。在环境温度下搅拌所得溶液，同时通过LCMS监测反应。完成后，真空浓缩反应混合物，并通过硅胶柱色谱(SiO₂ 100g，在EtOAc中的0％-5％MeOH)进行纯化，得到0.90g化合物188。

LCMS：MS(ESI)m/z 1154.29[M+Na]⁺

化合物198

向化合物188(1.35g,1.192mmol)在甲苯(540ml)中的温和回流(内部温度为110-112℃)溶液中加入第二代Hoveyda-Grubbs催化剂(0.187g,0.298mmol)和醌(0.322g,2.981mmol)在甲苯(20mL)中的溶液。在110-112℃下搅拌所得溶液，同时通过LCMS监测反应。4小时后，加入额外的催化剂(0.10g,0.16mmol)，并继续回流搅拌。完成后，将反应混合物冷却至环境温度，并用DMSO(2.54ml,35.8mmol)处理。搅拌3小时后，真空浓缩反应混合物，并通过硅胶柱色谱(SiO₂ 50g，在EtOAC中的0％-15％MeOH)进行纯化，得到化合物198和化合物199的混合物。将混合物溶解在二氯甲烷(2mL)中，并用水(0.021ml,1.2mmol)和在二氯甲烷(2mL)中的6％二氯乙酸(0.098ml,1.2mmol)处理。10分钟后，用吡啶(1ml)猝灭反应，并真空浓缩。将残余物溶解在二氯甲烷(50mL)中，用30％NaCl水溶液(每次15mL)洗涤两次，并用MgSO₄干燥。通过硅胶柱色谱(SiO₂50g，在DCM中的5％-10％MeOH)对粗产物进行纯化，得到0.25g化合物198。

化合物199：LCMS：MS(ESI)m/z 1104.31[M+H]⁺

化合物198：LCMS：MS(ESI)m/z 802.16[M+H]⁺

化合物190

将化合物198(0.233g,0.291mmol)和3-(双(二异丙基氨基)膦氧基)丙腈(0.111ml,0.349mmol)溶解在MeCN(10mL)中，并真空浓缩。同样的操作再重复两次。将所得混合物溶解在二氯甲烷(2.3ml)中，冷却至0-5℃，并用二异丙基铵四氮唑(0.025g,0.145mmol)处理。将反应混合物升温至环境温度，过夜，然后用乙腈(2.3ml)稀释。将所得溶液通过注射泵历时7小时加入吡啶三氟乙酸盐(0.168g,0.872mmol)在MeCN(18.6ml)中的溶液中。然后历时2小时加入在MeCN(2mL)中的3-(双(二异丙基氨基)膦氧基)丙腈(40mg,0.133mmol)。搅拌1小时后，加入(E)-N,N-二甲基-N'-(3-硫酮基-3H-1,2,4-二噻唑-5-基)甲脒(0.119g,0.581mmol)，搅拌反应溶液，直至硫化完成(通过LCMS监测)。完成后，真空浓缩混合物，溶解在MTBE(5ml)中，并用饱和NaHCO₃水溶液(3.50ml)和水(1.2ml)处理。分离各层，水层用MTBE/EtOAc混合物(5/3ml)萃取。合并的有机层用30％NaCl水溶液(2.3ml)洗涤两次，用MgSO₄干燥，过滤，并真空浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO₂ 25g，在EtOAc中的0％-20％MeOH)对粗产物进行纯化，得到119mg化合物190(58mg快速洗脱异构体和61mg慢速洗脱异构体)。

化合物191(SpRp异构体)

向化合物190的快速洗脱异构体(58mg,0.062mmol)在二氯甲烷(1.8mL)中的溶液中加入叔丁基胺(1.2ml,11mmol)。在环境温度下搅拌所得溶液，直至所有原材料消耗殆尽(通过LCMS监测)。完成后，真空浓缩反应混合物，与乙腈共沸两次，并溶解在乙腈(1.7ml)中。向所得溶液中加入1-(溴甲基)-2-硝基苯(40.3mg,0.187mmol)。在环境温度下搅拌反应混合物，同时通过LCMS监测反应。完全烷基化后，真空浓缩反应混合物，并通过硅胶柱色谱(SiO₂ 10g，在EtOAc中的0％-5％MeOH)进行纯化，得到19mg化合物191(SpRp异构体)。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.42(s,1H),8.27(s,1H),8.13(dd,J＝1.2,8.2Hz,1H),8.05(s,1H),7.98(d,J＝7.8Hz,1H),7.69-7.67(m,1H),7.61-7.34(m,5H),6.33(d,J＝17.2Hz,1H),6.19(d,J＝19.9Hz,1H),6.09-5.93(m,1H),5.82-5.66(m,2H),5.67(dd,J＝3.5,50.8Hz,1H),5.35-5.32(m,2H),4.62-4.29(m,11H),3.35-3.28(m,1H),3.18-3.14(m,2H),3.01-2.91(m,1H),2.84-2.78(m,1H),2.60-2.49(m,3H)。

化合物192(RpRp异构体)

化合物190的慢速洗脱异构体(60mg)通过与化合物191中所述相同的反应顺序进行处理，得到14mg化合物192和7mg化合物191。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.18(s,2H),8.10(s,2H),8.10(dd,J＝1.0,8.0Hz,2H),7.66-7.57(m,4H),7.53-7.46(m,2H),6.31(d,J＝17.6Hz,2H),6.19-6.05(m,2H),5.84(dd,J＝4.3,50.8Hz,2H),5.39-5.30(m,2H),4.58-4.46(m,6H),4.45-4.39(m,2H),4.19(ddd,J＝3.1,6.3,10.2Hz,2H),3.32(td,J＝3.5,15.6Hz,2H),3.06(td,J＝6.3,15.2Hz,2H),2.67-2.57(m,4H)。

基于衍生自化合物192的化合物34的合成方法学、NMR数据(对称)、HPLC保留时间(最慢洗脱异构体)和生物活性，申请人认为化合物192具有RR磷立体化学。该立体化学指定通过X射线晶体学进行确认。

化合物33

向化合物192(26mg,0.026mmol)在1,4-二噁烷(0.52ml)中的溶液中加入苯硫酚(0.26ml,2.5mmol)，然后加入TEA(0.26ml,1.9mmol)。在环境温度下搅拌所得混合物，直至脱保护完成(通过LCMS监测)。完成后，加入水(2mL)。所得混合物用甲苯(每次2mL)萃取三次。水层在40-50℃下真空浓缩，并溶解在水(2mL)中。所得混合物用EtOAc/MTBE混合物(每次1/1mL)萃取四次。真空浓缩水层，得到化合物33的双TEA盐。

¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝9.06(s,1H),8.73(s,1H),8.56(s,1H),8.47(s,1H),6.43(d,J＝14.4Hz,1H),6.38(d,J＝15.2Hz,1H),6.27(dd,J＝3.5,51.1Hz,1H),5.63(dd,J＝2.7,51.5Hz,1H),5.30-5.14(m,2H),5.06-4.91(m,2H),4.58(br d,J＝12.5Hz,1H),4.52-4.39(m,3H),4.07(dd,J＝4.7,11.7Hz,1H),3.98(dd,J＝5.1,12.5Hz,1H),3.43-3.34(m,2H),3.22(q,J＝7.2Hz,12H),2.98-2.86(m,2H),2.79-2.45(m,4H),1.32(t,J＝7.4Hz,18H)

化合物34

以化合物192作为原材料，通过与化合物33中所述相同的反应顺序来制备化合物34。

¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝8.77(s,2H),8.49(s,2H),6.39(d,J＝15.2Hz,2H),5.71(dd,J＝3.1,51.2Hz,2H),5.24-5.13(m,2H),5.02(dtd,J＝3.1,9.0,25.4Hz,2H),4.54(br d,J＝12.1Hz,2H),4.42(br d,J＝9.8Hz,2H),3.99(dd,J＝5.9,12.1Hz,2H),3.20(q,J＝7.3Hz,12H),2.90(ddd,J＝3.5,10.2,14.1Hz,2H),2.81-2.70(m,2H),2.55-2.43(m,2H),1.30(t,J＝7.4Hz,18H)。

实施例22--化合物35和化合物36的合成

化合物201

向化合物200的二钠盐(0.10g,0.126mmol)中加入2-硝基苄基溴(0.068g,0.316mmol)和MeCN(2.0ml)。在环境温度下搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测反应。完成后，真空浓缩反应混合物，并通过硅胶柱色谱(SiO₂ 10g，在DCM中的0％-5％MeOH)进行纯化，得到115mg化合物201。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.13(dd,J＝0.8,8.2Hz,1H),8.06(s,1H),8.03(dd,J＝1.0,8.0Hz,1H),7.80(br s,1H),7.75(s,1H),7.70-7.65(m,1H),7.62-7.54(m,2H),7.53-7.47(m,2H),7.45-7.39(m,1H),7.34-7.27(m,1H),6.23(br d,J＝16.8Hz,1H),6.14(br d,J＝18.8Hz,1H),5.95(br s,2H),5.77(td,J＝5.1,15.2Hz,2H),5.71(td,J＝5.1,15.6Hz,1H),5.63-5.55(m,1H),5.47(br d,J＝11.7Hz,1H),4.58-4.27(m,11H),4.18-4.10(m,1H),4.05-3.71(m,2H)

化合物202

向化合物201(77mg,0.076mmol)在2,2,2-三氟乙醇(2ml)中的溶液中一次性加入O-(2,4-二硝基苯基)羟胺(36.5mg,0.183mmol)和双[铑(α,α,α′,α′-四甲基-1,3-苯二丙酸)](5.74mg,0.015mmol)。将混合物在环境温度下搅拌过夜，用DCM(10mL)稀释，并用饱和NaHCO₃水溶液(10mL)处理。分离各层，水层用DCM(每次10mL)萃取两次。合并的有机层用MgSO₄干燥，并通过硅胶柱色谱(SiO₂ 10g，在EtOAc中的0％-15％MeOH)进行纯化，得到3.3mg化合物202。

LCMS：MS m/z 1032.07[M+H]⁺

化合物35和化合物36

向化合物202(3.3mg,3.2μmol)在1,4-二噁烷(0.40ml)中的溶液中加入苯硫酚(0.2ml,1.9mmol)和TEA(0.2ml,1.4mmol)。在环境温度下搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测反应。完成后，将反应混合物用水(2mL)处理，并用甲苯(每次2mL)萃取三次。水层在40-50℃下真空浓缩，并溶解在水(1.5ml)中。滤出所得固体，用水(0.5mL)冲洗。在下述条件下对合并的滤液进行HPLC分离，得到化合物35(保留时间：8.4分钟)和化合物36(保留时间：8.9分钟)

化合物35

LCMS：MS m/z 762.08[M+H]⁺

化合物36

LCMS：MS m/z 762.22[M+H]⁺

化合物35/化合物36制备型HPLC条件：

实施例23--化合物38和化合物39的合成

图13示出了化合物38和化合物39的合成实例。

步骤1

在0℃下，向化合物203(5.82g,9.314mmol)和烯丙醇(0.95ml,14mmol)在THF(50mL)中的溶液中加入DIAD(2.4ml,11.6mmol)和三苯基膦(2.93g,11.2mmol)在甲苯(25ml)中的溶液，同时保持内部温度低于10℃。将所得溶液升温至环境温度并搅拌，同时通过LCMS监测反应。完成后(5小时)，真空浓缩混合物，并通过硅胶柱色谱(100g，在正庚烷中的20％-60％EtOAc)进行纯化，得到4.56g作为粉红色油状物的化合物204。

化合物204：¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.55(s,1H),8.24(s,1H),7.46(d,J＝8.2Hz,2H),7.31-7.23(m,1H),7.20-7.10(m,2H),6.02(d,J＝5.1Hz,1H),6.07-5.95(m,1H),5.21(dd,J＝1.6,17.2Hz,1H),5.05(dd,J＝1.4,10.4Hz,1H),5.00(d,J＝5.5Hz,2H),4.82(t,J＝4.9Hz,1H),4.22-4.16(m,1H),4.05-4.00(m,2H),3.82(dd,J＝2.5,11.5Hz,1H),0.95(s,9H),0.81(s,9H),0.14(s,3H),0.13(s,3H),0.00(s,3H),-0.23(s,3H)。

步骤2

向化合物204(4.56g,6.858mmol)中加入乙酸(80ml)和水(20ml)。将所得混合物在环境温度下搅拌过夜，并在35℃下搅拌1天。真空浓缩所得混合物，并通过硅胶柱色谱(SiO₂，50g，在正庚烷中的33％-60％EtOAc)进行纯化，得到3.22g作为白色泡沫固体的化合物205。

化合物205：¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.56(s,1H),7.88(s,1H),7.51-7.47(m,2H),7.32-7.27(m,1H),7.20-7.16(m,2H),6.06-5.95(m,1H),5.72(d,J＝7.8Hz,1H),5.26(dd,J＝5.5,7.8Hz,1H),5.20(dd,J＝1.6,17.2Hz,1H),5.06(dd,J＝1.6,10.2Hz,1H),5.03-4.98(m,2H),4.23(d,J＝5.5Hz,1H),4.14(s,1H),3.92(dd,J＝1.6,12.9Hz,1H),3.68(br d,J＝12.9Hz,1H),0.75(s,9H),-0.14(s,3H),-0.62(s,3H)。

步骤3

在环境温度下，向化合物205(3.22g,5.847mmol)在THF(120mL)中的溶液中加入水(30ml)和三苯基膦(2.454g,9.355mmol)。在环境温度下搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测反应。完成后(18小时)，真空浓缩反应混合物，并与MeCN共沸三次。通过硅胶柱色谱(SiO₂(NH)55g，在正庚烷中的20％-100％EtOAc)对残余物进行纯化，得到4.82g化合物206(假设纯度为63％)。产物未经进一步纯化即用于下一步骤。

化合物206：¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.56(s,1H),7.92(s,1H),7.54(qd,J＝1.6,7.6Hz,2H),7.31-7.27(m,1H),7.19-7.15(m,2H),6.07-5.94(m,1H),5.84(d,J＝6.6Hz,1H),5.50(br d,J＝10.6Hz,1H),5.20(dd,J＝1.6,17.2Hz,1H),5.05(dd,J＝1.4,10.4Hz,1H),5.02-4.98(m,2H),4.95-4.91(m,1H),4.16-4.08(m,2H),3.96(dd,J＝1.6,12.9Hz,1H),3.73(dd,J＝2.0,5.5Hz,1H),3.73-3.67(m,1H),0.78(s,9H),-0.20(s,3H),-0.46(s,3H)。

步骤4

在环境温度下，向化合物206(4.82g，63％纯度，5.72mmol)在吡啶(39.0ml)中的溶液中加入TEA(1.3ml,8.6mmol)和三苯甲基-Cl(1.753g,6.289mmol)。完全反应后(通过LC/MS监测)，加入饱和NaHCO₃溶液(60mL)。所得混合物用MTBE/EtOAc混合物(1/1，每次70mL)萃取三次。合并的有机层用30％NaCl水溶液(30mL)洗涤，用MgSO₄干燥，过滤，并真空浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO₂ 50g，用在EtOAc/正庚烷中的1％TEA预处理，在正庚烷中的20％-100％EtOAc加1％TEA)对残余物进行纯化，得到1.484g作为白色固体的化合物207。

化合物207：¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.49(s,1H),8.10(s,1H),7.50-7.46(m,8H),7.31-7.22(m,7H),7.20-7.14(m,5H),6.11(d,J＝6.3Hz,1H),6.07-5.94(m,1H),5.20(dd,J＝1.2,17.2Hz,1H),5.06(dd,J＝1.4,10.4Hz,1H),5.03-4.98(m,2H),4.84(dd,J＝3.1,10.6Hz,1H),4.52(t,J＝5.7Hz,1H),3.78(d,J＝1.6Hz,1H),3.64-3.57(m,1H),3.26-3.16(m,3H),0.77(s,9H),-0.18(s,3H),-0.63(s,3H)。

步骤5

在环境温度下，向化合物207(0.50g,0.652mmol)在MeCN(6mL)中的溶液中加入3-((双(二异丙基氨基)膦基)氧基)丙腈(0.393g,1.304mmol)和吡啶鎓三氟乙酸盐(0.113g,0.587mmol)。在环境温度下搅拌所得溶液，同时通过LCMS监测。完成后(1小时)，将所得溶液用硫化氢气体(鼓泡)处理1分钟，然后用吡啶鎓三氟乙酸盐(0.252g,1.304mmol)处理。在环境温度下搅拌所得溶液，同时通过LCMS监测。完成后(1小时)，用MTBE(60mL)稀释所得混合物。所得溶液用水(每次15mL)洗涤两次，并用30％NaCl水溶液(15ml)洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤，并真空浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO₂ 25g，在正庚烷中的25％-40％EtOAc)对残余物进行纯化，得到0.411g作为白色泡沫固体的化合物208(1:1P非对映异构体混合物)。

化合物208(1:1P非对映异构体混合物)¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.49(s,1H),8.49(s,1H),8.11(s,1H),8.06(s,1H),7.54-7.47(m,4H),7.46-7.38(m,14H),7.32-7.27(m,2H),7.23-7.04(m,20H),6.11-5.99(m,2H),5.98(d,J＝2.0Hz,1H),5.91(d,J＝1.6Hz,1H),5.27(dd,J＝1.6,6.3Hz,1H),5.23(dd,J＝1.6,6.3Hz,1H),5.12(dd,J＝1.6,6.3Hz,1H),5.09(dd,J＝1.2,6.3Hz,1H),5.02(br d,J＝5.5Hz,4H),4.57-4.45(m,2H),4.43-4.34(m,1H),4.32-4.04(m,8H),3.23-3.19(m,1H),3.10(br s,2H),3.06-2.99(m,1H),2.96-2.89(m,2H),2.73(dt,J＝1.4,6.4Hz,2H),2.65(t,J＝6.3Hz,2H),0.85(s,9H),0.83(s,9H),0.01(s,3H),-0.09(s,6H),-0.11(s,3H)。

步骤6

在环境温度下，向化合物208(0.411g,0.457mmol)和化合物206(0.293g,0.502mmol)在乙腈(5ml)中的溶液中加入DIEA(0.16ml,0.91mmol)和CCl₄(0.18ml,1.8mmol)。在环境温度下搅拌反应混合物，同时通过LCMS监测。完成后(1小时)，真空浓缩所得混合物，并通过硅胶柱色谱(SiO₂ 25g，在正庚烷中的33％-100％EtOAc)进行纯化，得到0.461g作为白色泡沫固体的化合物210(1:1P非对映异构体混合物)。

化合物210：¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.52(s,1H),8.51(s,1H),8.49(s,1H),8.49(s,1H),8.24(s,1H),8.19(s,1H),8.13(s,1H),8.01(s,1H),7.55-7.37(m,20H),7.33-6.99(m,30H),6.09-5.97(m,4H),5.96(d,J＝2.7Hz,1H),5.87(d,J＝1.2Hz,1H),5.82(d,J＝4.7Hz,1H),5.80(d,J＝3.9Hz,1H),5.28-5.17(m,4H),5.11-5.04(m,4H),5.03-4.96(m,8H),4.75(t,J＝5.1Hz,1H),4.70(t,J＝4.5Hz,1H),4.46-4.33(m,3H),4.31-4.18(m,5H),4.12-3.96(m,8H),3.89(br d,J＝11.7Hz,1H),3.78-3.67(m,3H),3.57(dd,J＝2.9,4.1Hz,1H),3.56-3.44(m,2H),3.08-3.01(m,2H),2.99-2.93(m,1H),2.91(d,J＝8.6Hz,1H),2.77-2.73(m,1H),2.72-2.53(m,4H),0.84(s,9H),0.84(s,9H),0.84(s,9H),0.82(s,9H),0.00(s,3H),-0.05(s,6H),-0.08(s,3H),-0.12(s,3H),-0.15(s,3H),-0.18(s,3H),-0.18(s,3H)。

步骤7

在环境温度下，向化合物210(0.461g,0.324mmol)在MeCN(5.5ml)中的溶液中加入3-((双(二异丙基氨基)膦基)氧基)丙腈(0.195g,0.648mmol)和吡啶鎓三氟乙酸盐(0.050g,0.259mmol)。在环境温度下搅拌所得溶液，同时通过LCMS监测。完成后(40分钟)，将所得溶液用硫化氢气体鼓泡1分钟，然后用吡啶鎓三氟乙酸盐(0.138g,0.713mmol)处理。完成后(通过LCMS监测)，所得溶液用MTBE(30mL)稀释，用水(每次10mL)洗涤两次，并用30％NaCl水溶液(10ml)洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤，并真空浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO₂ 25g，在正庚烷中的33％-60％EtOAc)对残余物进行纯化，得到0.329g作为白色泡沫固体的化合物211。

化合物211：LC/MS(ESI)m/z 1555.48[M+H]⁺。

步骤8

在环境温度下，向化合物211(0.329g,0.211mmol)在二氯甲烷(7.2ml)中的溶液中加入水(0.032ml,1.8mmol)和二氯乙酸(0.29ml,3.6mmol)。在环境温度下搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测。完成后(30分钟)，用饱和NaHCO₃溶液(25mL)处理反应混合物。所得混合物用DCM(每次30mL)萃取两次。合并的有机层用30％NaCl水溶液(20mL)洗涤，用MgSO₄干燥，过滤，并真空浓缩。粗产物化合物212(0.278g理论产率)未经进一步纯化即用于下一步骤。

化合物212：LC/MS(ESI)m/z 1313.40[M+H]⁺。

步骤9

在环境温度下，向化合物212(0.278g,0.212mmol)在MeCN(55.6ml)中的溶液中加入三乙胺(1.0ml,7.2mmol)和CCl₄(1.0ml,10mmol)。在环境温度下搅拌所得溶液，同时通过LCMS监测。完成后(30分钟)，将反应混合物真空浓缩至约20mL，并用MTBE(30mL)稀释。所得混合物用水(10ml)洗涤，并用30％NaCl水溶液(每次10mL)洗涤两次，用MgSO₄干燥，过滤，并真空浓缩。通过硅胶柱色谱(SiO₂ 25g，在正庚烷中的20％-75％EtOAc)对残余物进行纯化，得到71mg化合物213(SpRp异构体)、43mg化合物214(RpRp或SpSp异构体，在TLC(SiO₂)上较高的rf)和24mg化合物215(RpRp或SpSp异构体，在TLC(SiO₂)上较低的rf)。

化合物213(SpRp异构体)¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.58(s,1H),8.44(s,1H),8.42(s,1H),8.12(s,1H),7.46(dd,J＝7.2,15.4Hz,4H),7.36-7.27(m,2H),7.18(q,J＝7.6Hz,4H),6.09(s,1H),5.98(s,1H),6.06-5.95(m,2H),5.25(d,J＝11.3Hz,1H),5.21(dd,J＝1.4,10.4Hz,1H),5.12-5.03(m,3H),5.00-4.92(m,3H),4.87(d,J＝4.7Hz,1H),4.60(brd,J＝11.7Hz,1H),4.55(d,J＝3.9Hz,1H),4.44(br d,J＝11.3Hz,1H),4.39-4.32(m,2H),4.26-4.08(m,8H),3.75(dd,J＝11.3,16.0Hz,1H),3.49(dd,J＝8.2,10.6Hz,1H),2.82-2.72(m,3H),2.61(td,J＝5.9,17.2Hz,1H),0.99(s,9H),0.96(s,9H),0.32(s,3H),0.23(s,6H),0.22(s,3H)。

化合物214(RpRp或SpSp异构体，在TLC(SiO₂)上较高rf的异构体)：¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.60(s,2H),8.18(s,2H),7.50(d,J＝7.0Hz,4H),7.37-7.31(m,2H),7.25-7.21(m,4H),6.05-5.93(m,4H),5.22(dd,J＝1.6,17.2Hz,2H),5.09(dd,J＝1.0,10.4Hz,2H),5.00-4.83(m,6H),4.61(dd,J＝1.2,11.7Hz,2H),4.25(dq,J＝4.3,10.8Hz,2H),4.09(brdd,J＝3.7,10.4Hz,2H),4.04(td,J＝5.5,10.9Hz,2H),3.99-3.88(m,4H),3.70(dd,J＝11.9,15.0Hz,2H),2.71(td,J＝5.5,17.1Hz,2H),2.49-2.37(m,2H),0.98(s,18H),0.25(s,6H),0.24(s,6H)。

化合物215(RpRp或SpSp异构体，在TLC(SiO₂)上较低rf的异构体)：¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.54(s,2H),8.06(s,2H),7.47-7.44(m,4H),7.32-7.27(m,2H),7.20-7.15(m,4H),6.06-5.95(m,2H),5.92(d,J＝3.5Hz,2H),5.22(dd,J＝1.2,17.2Hz,2H),5.07(dd,J＝1.4,10.4Hz,2H),5.04-4.94(m,6H),4.62-4.52(m,2H),4.46-4.40(m,2H),4.40-4.22(m,8H),3.81(dd,J＝6.6,12.1Hz,2H),2.89-2.71(m,4H),0.88(s,18H),0.08(s,6H),-0.07(s,6H)。

步骤10

向化合物213(71mg,0.054mmol)在甲苯(28.4ml)中的回流溶液中加入第二代Hoveyda-Grubbs催化剂(17.0mg,0.027mmol)和对苯醌(11.70mg,0.108mmol)在甲苯(8mL)中的溶液。将混合物加热至回流，并通过LC/MS监测反应进程。3小时后，加入在甲苯(2.5mL)中的额外催化剂(8.5mg,0.0135mmol)，并再继续反应2.5小时。冷却后，真空浓缩混合物，并通过硅胶柱色谱(SiO₂10g，在正庚烷中的33％-66％乙酸乙酯)进行纯化，得到17mg作为褐色干泡沫的化合物216(反式/顺式＝5/1)。

化合物216：¹H NMR(仅反式异构体，400MHz，氯仿-d)δ＝8.37(s,1H),8.34(s,1H),8.24(s,1H),8.20(s,1H),7.41(d,J＝7.1Hz,2H),7.36-7.27(m,3H),7.24-7.13(m,5H),5.97(d,J＝5.9Hz,2H),5.75(td,J＝5.5,15.2Hz,1H),5.69(td,J＝5.5,15.6Hz,1H),5.07(d,J＝3.9Hz,1H),5.03(dd,J＝5.1,15.2Hz,1H),4.94(t,J＝5.5Hz,2H),4.85(dd,J＝5.1,15.2Hz,1H),4.74(d,J＝3.9Hz,1H),4.67(br d,J＝12.1Hz,1H),4.45(br d,J＝10.2Hz,1H),4.42-4.34(m,2H),4.28-4.19(m,2H),4.19-4.06(m,4H),3.96-3.84(m,1H),3.82-3.68(m,1H),3.56(br dd,J＝12.1,14.5Hz,1H),3.33(dd,J＝9.0,10.9Hz,1H),2.83-2.78(m,2H),2.72(td,J＝5.6,16.6Hz,1H),2.39(td,J＝6.3,17.2Hz,1H),1.00(s,18H),0.42(s,3H),0.40(s,3H),0.34(s,3H),0.30(s,3H)。

化合物217

通过步骤10单独处理从步骤9获得的化合物214，得到化合物217(反式/顺式异构体的5/1混合物)。

¹H NMR(仅反式异构体，400MHz，氯仿-d)δ＝8.47(s,2H),8.14(s,2H),7.43-7.38(m,4H),7.36-7.29(m,2H),7.22(t,J＝7.0Hz,4H),5.83(s,2H),5.77(t,J＝3.3Hz,2H),5.17(d,J＝3.5Hz,2H),5.11-5.04(m,2H),4.70(br dd,J＝3.5,16.4Hz,2H),4.62(br d,J＝12.1Hz,2H),4.16-4.08(m,6H),3.93(br dd,J＝3.7,11.9Hz,2H),3.74-3.64(m,2H),3.49(t,J＝12.9Hz,2H),2.42(td,J＝5.9,18.4Hz,2H),2.13(ddd,J＝5.5,7.8,16.8Hz,2H),1.00(s,18H),0.40(s,6H),0.34(s,6H)。

化合物218

通过步骤10单独处理从步骤9获得的化合物215，得到化合物218。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.14(s,2H),8.12(s,2H),7.49-7.43(m,2H),7.36-7.27(m,4H),7.19-7.12(m,4H),5.96(s,2H),5.67-5.54(m,2H),4.95-4.82(m,4H),4.69(d,J＝4.3Hz,2H),4.60-4.09(m,12H),3.63(dd,J＝8.8,16.2Hz,2H),2.93(td,J＝5.9,17.2Hz,2H),2.82-2.72(m,2H),0.99(s,18H),0.30(s,6H),0.27(s,6H)。

步骤11

在环境温度下，向化合物216(反式/顺式＝5/1,17mg,0.013mmol)中加入甲胺溶液(2ml)(33％，在EtOH中)。在环境温度下搅拌所得溶液，同时通过LCMS监测。完成后(1小时)，真空浓缩反应混合物。向残余物中加入吡啶(0.9ml)、TEA(0.45ml)和三乙胺三氢氟酸盐(0.36ml,2.2mmol)。将所得混合物在50-60℃下搅拌4小时，并冷却至环境温度。在完全TBS脱保护后(通过LCMS监测)，用甲氧基三甲基硅烷(1.5ml,12mmol)处理反应混合物，并搅拌1小时。加入水(3mL)，将所得混合物用甲苯(每次3ml)萃取两次，用EtOAc(每次2mL)萃取两次。水层通过注射器式过滤器过滤，并对滤液进行制备型HPLC，得到5.3mg化合物38和1.1mg化合物220。

化合物38(SpRp，反式)：¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝9.27(br s,1H),8.47(br s,1H),8.21(br s,1H),8.09(br s,1H),6.19-5.96(m,2H),5.94-5.71(m,2H),5.13-4.68(m,2H),4.55-4.39(m,2H),4.38-4.23(m,1H),4.20-3.91(m,5H),3.75-3.50(m,4H)。

化合物220(SpRp，顺式)：¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝9.08(s,1H),8.72(br s,1H),8.55(s,1H),8.24(s,1H),8.18(s,1H),6.22-6.14(m,2H),6.10(d,J＝1.6Hz,2H),5.01(d,J＝3.9Hz,1H),4.41(br d,J＝9.8Hz,1H),4.34-4.25(m,3H),4.24-4.18(m,1H),4.15(dd,J＝6.1,11.5Hz,1H),4.08-3.99(m,4H),3.71-3.57(m,3H)。

化合物39和化合物222

通过步骤11单独处理化合物217，得到化合物39和化合物222。

化合物39(反式异构体)：¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝8.83(br s,1H),8.43(br s,1H),8.17(br s,1H),8.11(br s,1H),6.17-5.95(m,2H),5.93-5.63(m,2H),5.10-4.78(m,2H),4.69-4.53(m,1H),4.52-4.35(m,2H),4.12-3.92(m,5H),3.76-3.44(m,4H)。

化合物222(顺式异构体)：¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝8.71(br s,2H),8.18(s,2H),6.17-6.06(m,4H),4.37(br d,J＝9.8Hz,2H),4.33(d,J＝3.9Hz,2H),4.27(br dd,J＝7.0,13.7Hz,2H),4.06(dd,J＝7.0,11.3Hz,2H),4.19-4.03(m,2H),4.01(br d,J＝9.8Hz,2H),3.74(ddd,J＝3.9,6.4,10.5Hz,2H)。

化合物40

通过步骤11单独处理化合物218，得到化合物40：¹H NMR(400MHz，甲醇-d₄)δ＝9.34-8.88(m,2H),8.73(br s,1H),8.34-8.02(m,2H),6.20-5.96(m,2H),5.89(br s,2H),5.25-4.95(m,2H),4.76-4.64(m,1H),4.47-4.22(m,2H),4.20-4.07(m,2H),4.07-3.93(m,2H),3.82-3.55(m,3H),3.54-3.38(m,2H)

实施例24-化合物30的合成

在环境温度下，将化合物2(1.1mg,1.4μmol)加入碳酸碘甲酯异丙酯(13.75mg,0.056mmol)在丙酮/水(0.4/0.10ml)中的溶液中。在环境温度下在黑暗中搅拌所得混合物，同时通过LCMS监测反应。完成后(2小时)，用水(0.4ml)稀释反应混合物，并用正庚烷(每次0.5mL)萃取三次。水层中粗产物的纯化提供0.5mg化合物30。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.92(s,2H),7.72(br s,2H),6.22(d,J＝17.2Hz,2H),6.19-6.03(m,2H),5.98(br t,J＝6.3Hz,2H),5.82-5.77(m,2H),5.68(dd,J＝2.3,51.6Hz,1H),5.54(dd,J＝10.9,13.7Hz,2H),5.48(dd,J＝10.9,12.9Hz,2H),4.94(quin,J＝6.2Hz,2H),4.71-4.63(m,2H),4.63-4.56(m,2H),4.50-4.43(m,2H),4.22-4.12(m,2H),4.05-3.90(m,2H),1.33(d,J＝4.3Hz,6H),1.32(d,J＝4.3Hz,6H)。

实施例103-HAQ STING激动剂活性报道基因分析

THP1-Dual^TM细胞(InvivoGen,Cat#thpd-nfis)用于EC₅₀测定。供应商Invivogen(Insight 201402-1)已鉴定THP1Dual^TM细胞携带HAQ STING基因型。细胞在制造商推荐的条件下生长和维持。遵循制造商手册中描述的干扰素调节因子(IRF)途径诱导进行EC₅₀测定。简而言之，接种细胞并用不同浓度的化合物处理20小时，同时在37℃、5％CO₂下孵育。使细胞再悬浮，并加入QUANTI-Luc^TM溶液(Cat.#:rep-qlc1)。由光度计(Envision,PerkinElmer)测量产生的光发射。绘制获得的信号，并用GraphPad Prism7软件计算EC₅₀。

EC₅₀值报告于下表4-8中。EC₅₀值可以来自一次检测或为多次检测的平均值。在每个表的前面是用于查看该表的结构。

表4

*表示在实验浓度范围内活性无法测量。

“N/E”表示“未评估”。

使用表4中每种化合物的铵盐形式来测量人STING EC50(μM)。表5

*表示在实验浓度范围内活性无法测量。

**化合物7是化合物11和化合物12的1:1混合物。

“N/E”表示“不可用”。“N.D.”表示“未测定”。

使用表5中列出的每种化合物的铵盐形式来测量人STING EC50(μM)。

表6

*表示在实验浓度范围内活性无法测量。

“N/E”表示“未评估”。“N.D.”表示“未测定”。

除了化合物26、化合物31、化合物33和化合物34之外，使用表6中列出的每种化合物的铵盐形式来测量人STING EC50(μM)，所有这些化合物都作为双TEA盐进行测试。

表7

*表示在实验浓度范围内活性无法测量。

使用表7中每种化合物的铵盐形式来测量人STING EC50(μM)。

表8

*表示在实验浓度范围内活性无法测量。

使用表8中每种化合物的铵盐形式来测量人STING EC50(μM)。

实施例104-STING变体特异性报道基因分析

人STING具有4种主要变体，包括WT、HAQ、REF和AQ变体。例如，REF-STING，也称为R232H，出现在约14％的人口中。与野生型等位基因相比，R232H对细菌和后生动物环状二核苷酸的反应降低。Yi G等人，“Single nucleotide polymorphisms of human STING canaffect innate immune response to cyclic dinucleotides”PLoS One 2013；8:e77846报道了这4种主要变体以及其它罕见变体的细节。STING变体特异性报道细胞系是通过使用THP1-Dual^TM KO-STING细胞(InvivoGen,Cat#thpd-kostg)和三种STING变体蛋白表达载体建立的。WT STING的表达载体图示于图6中。对于另外两种表达载体，在载体中使用不同的STING变体序列，其中WT STING被适当的核苷酸序列取代。

制备用于WT-STING、REF-STING和AQ-STING的STING变体表达载体，并稳定转染到THP1-Dual^TM KO-STING细胞中，以分别制备用于WT-STING、REF-STING和AQ-STING的STING变体特异性报道基因分析。EC₅₀值如上文实施例103中关于HAQ STING激动剂活性报道基因分析所述来测定。结果示于下表9中。用于这些STING变体的DNA序列示于SEQ ID NO:1(WT人STING的核苷酸序列)、SEQ ID NO:2(REF人STING的核苷酸序列)和SEQ ID NO:3(AQ人STING的核苷酸序列)中。

WT人STING：

atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcccagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctgcgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctgccccctccgccgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgcccttcacttggatgcttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggccccagctgagatctctgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcggatatctgcggctgatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctacggggtgcagtgagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctgaccccaacattcgcttcctggataaactgccccagcagaccggtgaccgggctggcatcaaggatcgggtttacagcaacagcatctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccacccccttgcagactttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggccaaactcttctgccggacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcctaccaggaacctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggaggaaaaggaagaggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagcctgagctcctcatcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga(SEQ ID NO:1)

REF人STING：

atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcccagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctgcgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctgccccctccgccgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgcccttcacttggatgcttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggccccagctgagatctctgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcggatatctgcggctgatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctacggggtgcagtgagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctgaccccaacattcgcttcctggataaactgccccagcagaccggtgaccatgctggcatcaaggatcgggtttacagcaacagcatctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccacccccttgcagactttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggccaaactcttctgccggacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcctaccaggaacctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggaggaaaaggaagaggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagcctgagctcctcatcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga(SEQ ID NO:2)

AQ人STING：

atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcccagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctgcgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctgccccctccgccgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgcccttcacttggatgcttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggccccagctgagatctctgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcggatatctgcggctgatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctacggggtgcagtgagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctgaccccaacattcgcttcctggataaactgccccagcagaccgctgaccgagctggcatcaaggatcgggtttacagcaacagcatctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccacccccttgcagactttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggccaaactcttctgccagacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcctaccaggaacctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggaggaaaaggaagaggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagcctgagctcctcatcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga(SEQ ID NO:3)

实施例105-小鼠STING激动剂活性报道基因分析

RAW-Lucia^TM ISG细胞(InvivoGen,Cat#rawl-isg)用于小鼠STING激动剂报道基因分析。EC₅₀值如上文实施例103中在HAQ STING激动剂活性报道基因分析中所述来测定。结果示于下表9中。

实施例106--差示扫描荧光测定法(DSF)分析

采用DSF分析来测量化合物和重组STING蛋白之间的物理相互作用。如下所述，将截短的重组STING蛋白(a.a.155-341)(SEQ ID NO:4)在大肠杆菌中表达，并分离用于分析。在384孔板中制备分析基质，最终体积为每孔10μL，其由1μM重组STING蛋白(a.a.155-341)(SEQ ID NO:4)、100mM PBS pH 7.4(补充以100mM KCl)、5X SYPRO橙色染料和50μM化合物(最终DMSO浓度为0-1％)组成。在QuantStudio 12K Flex实时PCR系统上使用以0.05℃/分钟的速率的25℃至95℃的温度梯度，并使用分别为470 nm和586 nm的激发滤光片和发射滤光片进行分析。根据Applied蛋白热位移软件(算法版本1.3.)指定的荧光导数曲线，计算未结合的和配体结合的重组STING蛋白的热熔温度(Tm)以及热熔温度差(dTmD)。

通常，ΔTm值大于0的化合物被认为与测试蛋白质具有物理相互作用，并且ΔTm值与化合物的结合亲和力呈正相关。这里，化合物1a显示出17.6的ΔTm(表9)，表明与STING蛋白的物理相互作用。

表9化合物1a的体外表征

实施例107--离体人PBMC刺激分析

使用10.0 mL BD Vacutainer肝素钠管(cat#367874)收集5名健康供体的人血。外周血单核细胞(PBMC)的分离使用SIGMA ACCUSPIN 50 ml管(cat#A2055)和sigma ACCUSPINSystem-HISTOPAQUE-1077(cat#A7054)，使用制造商提供的方案进行。按照Sigma的建议，收获PBMC层，并用1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。对PBMC进行计数，最后以1×10e6/ml悬浮在补充以10％胎牛血清(FBS)(Gibco cat#20140.79)的RPMI(corning cat#10-041-CV)中。将1 ml细胞(1×10e6个)转移至Falcon 5 mL圆底聚丙烯试管(cat#352063)中，并在37℃的5％CO2孵育箱中用不同浓度(0 uM、0.1 uM、1 uM、10 uM)刺激24小时。

孵育24小时后，将试管以1400rpm离心5分钟，并收获上清液。将上清液在-80℃下储存，用于后续IFNβ测量。IFNβ测量使用人IFN-β基础试剂盒(Meso Scale Diagnosticscat#K151ADA)进行，并使用制造商提供的方案。IFN-β估计通过读取MESO SECTOR Imager2400的分析板并使用MSD Discovery Workbench 4.0程序完成。24小时后分析IFNβ蛋白。结果表明，化合物1a能够以剂量依赖性方式诱导原代人PBMC IFNβ蛋白产生。

表10中显示的结果反映了使用五种不同供体进行的测量的平均值。

表10离体人PBMC刺激分析

为定量IFNβmRNA，根据制造商的方案，使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen,Germany)来分离总RNA。通过qPCR分析来定量IFNβmRNA。简而言之，将总RNA(400ng至1000ng)在60μl的反应体积中使用SuperScript VILO MasterMix(Life Technologies,USA)转化为cDNA。获得的cDNA(10ng)随后使用Applied Biosystems TaqMan表达分析，使用IFNB1(Hs01077958_s1)和GAPDH(Hs99999905_m1)的RNA特异性引物进行扩增。qPCR分析在Applied Biosystems Quantstudio 12K Flex实时PCR系统上，用TaqMan Fast AdvancedMaster Mix(Life Technologies,USA)进行，首先在50℃下进行2min，随后在95℃下进行2s，以及进行40个循环的95℃持续1s和60℃持续20s。相对基因表达在相对于参考基因GAPDH归一化后使用2-ΔΔCT方法进行计算。使用Applied Biosystems Quantstudio 12KFlex软件v1.2.2进行计算。表11总结了IFNβmRNA相对于媒介物处理样品的倍数变化。结果表明，化合物1a能够以剂量和时间依赖性方式在原代PBMC中诱导IFNβmRNA。表11显示了从五个不同供体计算的平均值。

表11--离体人PBMC 3小时和24小时刺激分析(mRNA)

实施例108--化合物1a对CT26双重肿瘤模型的抗癌作用

在CT26双重肿瘤模型中测试化合物1a的抗癌活性，CT26双重肿瘤模型是小鼠结肠癌模型。给5-6周龄雌性Balb/cJ小鼠(Jackson Labs,Bar Harbor,Maine)在每只动物的两侧皮下植入CT26肿瘤细胞，每侧10⁵个细胞。对于研究A，在肿瘤植入后5天开始治疗(1.25mg/kg、2.5mg/kg和5mg/kg)，此时平均肿瘤达到约100mm³。对于研究B，在肿瘤植入后8天开始治疗(0.6mg/kg和10mg/kg)，此时平均肿瘤达到约120mm³。治疗方案描述于表12和表13中。

表12研究A的给药方案

*I.T.是肿瘤内。

表13研究B的给药方案

*I.T.是肿瘤内。

研究中的所有小鼠都具有两个皮下CT26肿瘤。“治疗的肿瘤”表示直接施用化合物的肿瘤，而“未治疗的肿瘤”表示未直接施用化合物的肿瘤。在整个实验中跟踪肿瘤体积。开始治疗后，每周测量两次肿瘤体积。肿瘤负荷通过长椭球体的体积公式(L×W²)/2由卡尺测量值计算，其中L和W分别是正交的长度和宽度测量值(mm)。

化合物1a在CT26双重肿瘤模型中显示出有效的治疗活性(图7和图8)。对于治疗的肿瘤，即使在研究中测试的最低剂量下，也检测到20％的治愈率(图8，0.6mg/kg剂量)。同时，在研究结束时，最高剂量(10mg/kg)治愈了100％的肿瘤动物。对于未治疗的肿瘤，剂量依赖性抗肿瘤作用也是明显的。最高剂量组(10mg/kg)显示80％的疗效；所有较低剂量也显示出肿瘤生长抑制活性。因此，观察到化合物1a的治疗窗为0.6mg/kg至10mg/kg，基于在非注射远端肿瘤部位的作用，不仅局部而且全身可见抗肿瘤活性。总之，这些结果表明局部施用化合物1a可诱导局部和全身(远端)抗癌活性。

实施例109--化合物1a对CT26肝转移模型的抗癌作用

在CT26肝转移模型中测试化合物1a的抗癌活性。给麻醉的5-6周龄雌性BALB/cJ小鼠(Jackson Labs,Bar Harbor,Maine)脾内植入表达荧光素酶的CT26肿瘤细胞(每只小鼠5×10⁵个细胞)。随后的十分钟等待期允许肿瘤细胞循环至动物肝脏中。然后切除脾脏，缝合动物并让其恢复。三天后，再次植入CT26肿瘤细胞(每只小鼠10⁵个细胞)，这次是在右前肢部位皮下(sc)植入，以形成用于施用化合物的肿瘤块。脾内注射后9天，将化合物(10mg/kg)一次性肿瘤内施用至sc肿瘤中。

化合物的局部抗癌作用是通过其对sc肿瘤的作用来测量的，而化合物的远端作用是基于每只小鼠肝脏中生长的肿瘤块的有害作用，通过与媒介物治疗的对照小鼠相比治疗小鼠的总体存活率来评估的。化合物1a在10只接受治疗的动物中的9只中显示出对局部sc肿瘤的有效活性和治疗性全身活性(图9)。这些结果表明，局部施用化合物1a可诱导局部和全身(远端)抗癌活性，包括深部病变，例如在肝脏中。

实施例110--化合物1a对GL261脑原位模型的抗癌作用

在GL261脑原位模型中测试化合物1a的抗癌活性。GL261是鼠类胶质瘤细胞系。将表达荧光素酶的GL261小鼠胶质瘤细胞(2×10⁴个细胞/小鼠)颅内植入5-6周龄雌性B6白化小鼠(Jackson Labs,Bar Harbor,Maine)中。3-4天后，在右前肢部位下皮下植入GL261细胞(10⁶个细胞/小鼠)，以形成用于施用化合物的肿瘤块。颅内肿瘤细胞植入后10天，将化合物(10mg/kg)一次性肿瘤内施用至sc肿瘤中。化合物的局部抗癌作用是通过其对sc肿瘤的作用来测量的，而化合物的远端作用是基于每只小鼠脑中生长的肿瘤块的有害作用，通过与媒介物治疗的对照小鼠相比治疗小鼠的总体存活率来评估的。化合物1a显示出对局部sc肿瘤的有效活性和在8只接受治疗的动物中的5只中治疗性全身活性(图10)。这些结果表明，局部施用化合物1a可诱导局部和全身(远端)抗癌活性，包括深部病变，例如在脑中。

实施例111–X射线结构确认与WT STING复合

为了进一步了解新化合物的靶结合机制，测定与化合物复合的WTSTING的X射线晶体结构。

A.WT STING C端结构域(残基155-341)的表达和纯化

将编码人WT STING蛋白的氨基酸155-341的DNA序列(SEQ ID NO:4)克隆到pET21b载体中，在其N端带有His-TEV-Sumo标签(SEQ ID NO:5)。pET21b的序列已经存放在addgene中，可在此获得：addgene.org/vector-database/2550/；该序列通过引用并入本文。

用该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)密码子加细胞，并用0.1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达。通过Ni-NTA亲和色谱从细胞裂解物的可溶性部分纯化蛋白质。用sumo蛋白酶除去His-TEV-Sumo标签，并使用另一Ni-NTA亲和柱与无标签的WT STING155-341分离。蛋白质通过阴离子交换和尺寸排阻色谱进一步纯化，并储存在含有20mM Tris·HCl(pH 7.5)和150mM NaCl(浓度为35mg/ml)的缓冲液中。

B.与化合物1复合的WT STING C端结构域的结晶和结构测定

为了使WT STING 155-341与化合物1共结晶，使用储存缓冲液(20mM Tris·HClpH 7.5和150mM NaCl)将WT STING蛋白稀释至10mg/ml，并与化合物1(100mM在DMSO中的储备溶液)以摩尔比1:5混合。将混合物在4℃下孵育4小时，并以13,000rpm离心20分钟，然后结晶。使用悬滴蒸气扩散法在18℃下装配结晶筛盘。通过将1μL WT STING/化合物1溶液与等体积的孔溶液混合来生长晶体，孔溶液含有100mM HEPES pH 7.5、200mM CaCl2和15％(wt/vol)PEG 8000。当晶体在液氮中快速冷冻时，使用20％(wt/vol)PEG 400作为冷冻保护剂。衍射数据集在SSRF BL19U1光束线用Pilatus检测器采集，并用HKL3000和CCP4软件套件中的SCALEPACK2MTZ程序处理。

与化合物1结合的WT STING 155-341的结构通过以PDB ID 4F9E作为初始搜索模型，使用程序PHASER(最大似然分子替换)进行分子替换来确定。在用模型阶段计算的Fo-Fc差异图中，证实了WT STING的二聚体界面之间存在化合物1。该模型是用Coot程序手动构建和完成的，并用CCP4软件套件中的Refmac5程序进行了精修。据报道，在空间群P212121中，最终的精修结构的分辨率为其晶胞的测量值为a＝33.820，b＝78.110，c＝132.212，α＝90.00，β＝90.00，γ＝90.00。在每个在二聚体界面与化合物1的一个分子结合的不对称单元中鉴定出两个WT STING 155-341的拷贝。

C.在X射线晶体结构中观察到的化合物1与WT STING的相互作用

图11示出了与化合物1复合的人WT STING的X射线晶体结构的照片。检测了与化合物1复合的人WT STING的X射线晶体结构，化合物1是从化合物1a的样品中共结晶的。该化合物在由WT STING蛋白的二聚体形成的界面袋处结合。该化合物的腺嘌呤碱基的两个面分别与Tyr240和Arg238的胍基形成π-π堆积相互作用。反式烯烃连接体与Arg238的侧链的脂族部分形成范德华相互作用。化合物核糖基团C2'位置的氟取代基嵌套在由Thr263、Pro264和Tyr163限定的疏水孔中。该化合物的带负电荷的硫代磷酸酯基团与Arg238形成盐桥，与Ser162和Thr267分别形成氢键相互作用。此外，硫代磷酸酯基团还与Arg 232的胍基形成静电相互作用。WT STING的由残基226至243组成的LID环区域环绕两个碱基和反式烯烃连接体。

实施例112-与化合物1复合的REF STING的X射线晶体结构的测定

A.REF STING C端结构域(残基155-341，SEQ ID NO:6)的表达和纯化

将编码人REF STING蛋白的氨基酸155-341的DNA序列(SEQ ID NO:6)克隆到pET21b载体中，在其N端带有His-TEV-Sumo标签(SEQ ID NO:7)。pET21b的序列已经存放在addgene中，可在此获得：addgene.org/vector-database/2550/；该序列通过引用并入本文。

用该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)密码子加细胞，并用0.1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达。通过Ni-NTA亲和色谱从细胞裂解物的可溶性部分纯化蛋白质。用sumo蛋白酶除去His-TEV-Sumo标签，并使用另一Ni-NTA亲和柱与无标签的REF STING_155-341分离。蛋白质通过阴离子交换和尺寸排阻色谱进一步纯化，并储存在含有20mM Tris·HCl(pH 7.5)和150mM NaCl(浓度为24mg/ml)的缓冲液中。

B.与化合物1复合的REF STING C端结构域的结晶和结构测定

为了使REF STING_155-341与化合物1共结晶，使用储存缓冲液(20mM Tris·HClpH 7.5和150mM NaCl)将REF STING蛋白稀释至10mg/ml，并与化合物1(100mM在DMSO中的储备溶液)以摩尔比1:5混合。将混合物在4℃下孵育4小时，并以13,000rpm离心20分钟，然后结晶。使用悬滴蒸气扩散法在18℃下装配结晶筛盘。通过将1μL REF STING/化合物1溶液与等体积的孔溶液混合来生长晶体，孔溶液含有100mM HEPES pH 7.5、200mM CaCl2和15％(wt/vol)PEG 8000。当晶体在液氮中快速冷冻时，使用20％(wt/vol)PEG 400作为冷冻保护剂。衍射数据集在SSRF BL18U1光束线用Pilatus检测器采集，并用HKL3000和CCP4软件套件中的SCALEPACK2MTZ程序处理。该结构示于图12中。

与化合物1结合的REF STING_155-341的结构通过使用先前测定的WT STING 155-341的结构(如上所述)作为初始搜索模型，使用程序PHASER(最大似然分子替换)进行分子替换来确定。在用模型阶段计算的Fo-Fc差异图中，证实了REF STING的二聚体界面之间存在化合物1。该模型是用Coot程序手动构建和完成的，并用CCP4软件套件中的Refmac5程序进行了精修。据报道，在空间群P212121中，最终的精修结构的分辨率为其晶胞的测量值为a＝33.733，b＝77.831，c＝131.689，α＝90.00，β＝90.00，γ＝90.00。在每个在二聚体界面与化合物1的一个分子结合的不对称单元中鉴定出两个REF STING 155-341的拷贝。

C.在X射线晶体结构中观察到的化合物1与REF STING的相互作用

图12示出了与化合物1复合的人REF STING的X射线晶体结构，化合物1是从化合物1a的样品中共结晶的。该化合物在由STING蛋白的二聚体形成的界面袋处结合。该化合物的腺嘌呤碱基的两个面分别与Tyr240和Arg238的胍基形成π-π堆积相互作用。反式烯烃连接体与Arg238的侧链的脂族部分形成范德华相互作用，而Arg238的侧链的胍部分从外部与His232的侧链的咪唑基团形成π-π堆积相互作用。烯烃连接体与Arg238和His232的相互作用的一对侧链接触。化合物核糖基团C2'位置的氟取代基嵌套在由Thr263、Pro264和Tyr163限定的疏水孔中。该化合物的带负电荷的硫代磷酸酯基团与Arg238形成盐桥，与Ser162和Thr267分别形成氢键相互作用。REF STING的由残基226至243组成的LID环区域环绕两个碱基和反式烯烃连接体。

实施例113-比较

如Corrales等人，“Direct Activation of STING in the TumorMicroenvironment Leads to Potent and Systemic Tumor Regression and Immunity,”Cell Reports(2015)11:1018-1030(通过引用并入本文)中所报道的，在使用本公开的化合物1a、天然STING配体(2’3’cGAMP)和据称的STING激动剂ML RR-S2 CDA的头对头比较中，计算WT STING、HAQ STING、AQ STING和REF STING的人STING分析的EC50值。如上述实施例中所述进行分析。请注意，表14中报告的分析值仅限于在头对头比较中进行的分析，可能不反映表5或其它地方报告的更多试验中测定的平均值。

表14

表14还报告了通过等温滴定量热法(ITC)测量的人WT STING与三种测试化合物中的每一种结合的解离结合常数(Kd)。ITC是测量与分子间相互作用相关的热力学性质的微量热滴定技术。基于这些测试，在测试化合物中，化合物1a似乎与WT STING形成最强的键。

材料

重组人野生型STING(aa,139-379,H232R)蛋白是通过在大肠杆菌中表达编码包含氨基酸139-379的人WT STING的胞质结构域的构建体而产生的。

试剂

该研究中使用的试剂来源如下所示：

蛋白质缓冲液制备

STING蛋白在-60℃下分别以3.0mg/mL和20mg/mL的浓度在90μL和100μL等分试样中储存在含有5％甘油的PBS(pH 7.5)中。在分析当天，将蛋白质等分试样解冻，稀释至400uL，并使用Amicon Ultra离心过滤器装置(10k MW截止值，0.5mL)用Eppendorf微量离心机进行至少4次10分钟的14000×g离心缓冲液交换至PBS中，然后用1×PBS最终稀释至20μM至30μM(取决于实验)。使用Nanodrop 2000分光光度计和22140(M^-1cm^-1)的蛋白质消光系数来测定蛋白质浓度。

样品制备

通过1.5mL微量离心管提供200μL化合物1a、2’3’cGAMP和MLRR-S2CDA的1mM储备溶液。在每次实验之前，将样品稀释至200uM至500uM的浓度(取决于实验)。

方法

在配备有ITC清洁附件(TA Instruments no 601800.901)的Affinity ITC装置(TA Instruments no.609003.901)上进行分析。将约400μL STING蛋白溶液(含20μM-30μMSTING蛋白)吸移至185μL量热仪池中，允许一些可接受的过载。参比池含有等量的Milli-Q水。孵育在25℃下进行，进样20×2.5μL的100μM-300μM化合物。控制软件ITC RunVer.3.3.0.0(TAInstruments)用于获得由代表每次进样时的热速率的多个原始热峰(μcal/sec)组成的热分析图。分析软件Nano Analyze Ver.3.70(TA Instruments)用于基线校正，校正空白或样品稀释热(饱和时)，并整合热速率峰，从而生成图形化的“Q”值。所得等温线与独立的模型相拟合，以导出热力学参数。

导出并报告Kd和n值(曲线拐点处的摩尔比)。蛋白质和配体浓度的最佳条件来自初步实验。

结果

确定了测试化合物与重组人野生型STING(aa,139-379,H232R)结合的热速率热分析图及其所得等温线。每种化合物与STING的结合都是吸热的，表现为负热速率和放热(正向)稀释热(在化合物达到蛋白质饱和后观察到)。已显示2’,3’cGAMP对各种STING变体产生类似的吸热反应。化合物1a的Kd最低，为0.04μM，其后是2’3’cGAMP，Kd为0.07μM，然后是MLRR-S2CDA，Kd为0.40μM。所有化合物的n值均接近0.5，表明STING蛋白以二聚体形式存在，每2mol STING结合1mol化合物。

实施例114-潜在代谢物的鉴定

将化合物1a在CD-1小鼠、Sprague Dawley大鼠、比格犬、食蟹猴和人的肝细胞中孵育，以评估主要代谢物的形成。

材料

冷冻保存的混合肝细胞购自ThermoFisher Scientific(Waltham,MA)、Xenotech,LLC(Kansas City,KS)和In Vitro ADMET Laboratories(Columbia,MD)，而合适的培养基购自In Vitro ADMET Laboratories(Columbia,MD)和Life Technologies(Carlsbad,CA)。AOPI染色溶液和磷酸盐缓冲液分别从Corning Life Sciences(Tewksbury,MA)和NexcelomBioscience(Lawrence,MA)获得。分析中使用的所有化学品、试剂和溶剂均为分析级或HPLC级。

实验设计和程序

肝细胞孵育

称取化合物1a并溶解在含有0.12％甲酸PBS的HPLC-水中，以达到1020mmol/L。然后用含有0.1％人血清白蛋白和2mmol/L L-谷氨酰胺的Williams’E培养基，将溶液分别稀释2.5倍至4mmol/L，然后进一步稀释21000倍，以制成浓度为20μmol/L的工作储备溶液。

孵育前，将冷冻保存的肝细胞在37℃水浴中解冻。将一管冷冻保存的肝细胞添加至从In Vitro ADMET Laboratories(Columbia,Md)获得的每个50mL冷冻保存肝细胞回收培养基(UCRM)锥形管中。将细胞在具有GH 3.8转子的Beckman离心机(Brea,CA)中在室温4℃下以740rpm旋转10分钟。除去上清液，并将细胞重新悬浮于平板培养基中进行计数。将细胞重新悬浮于平板培养基中后，转移20μL重新悬浮液，并与20μLAOPI染色溶液混合。轻轻混合溶液，并使用Cellometer(Nexcelom,Lawrence,MA)对细胞计数。计数后，将细胞以100万或200万个活细胞/mL重新悬浮在含有2mmol/L L-谷氨酰胺的Williams’E培养基(pH 7.4)中。

将肝细胞悬浮液(50μL/孔)加入48孔板中。加入50微升含有化合物1a(20μmol/L)的工作储备溶液以开始反应。将板放入组织培养孵育箱(5％CO₂/95％空气加湿气氛和37℃)中，并在5、30、60、120、180和240分钟时用200μL终止溶液来终止反应，所述终止溶液由100％甲醇/乙腈(1/1,v/v)与2010ng/mL呋塞米(furosemide)和0.2μmol/L(R)-***(propranolol)组成。将混合物离心并过滤，收集上清液用于分析。冷冻保存的肝细胞的最终浓度为1×10⁶个细胞/mL。化合物1a的最终孵育浓度为10μmol/L。

用于代谢物鉴定的LC-MS/MS条件

LC-MS/MS系统由Shimadzu HPLC和AB-SCIEX TripleTOF 5600混合四极杆与TOF质谱仪(Framingham,MA)组成。Shimadzu HPLC(Kyoto,Japan)由通信总线模块(CBM-20A)、自动进样器(SIL-30AC)以及附加的换架器(Rack Changer II)、两个泵(LC-30AD)和柱烘箱(CTO-30A)组成。质谱仪使用AB-SCIEX APCI正负校准溶液(Framingham,MA)进行校准。在正负扫描模式下分析从与肝细胞孵育获得的样品。基本分析方法和仪器条件总结如下。光谱仪设置的修改取决于分析物的必要性。

LC-MS/MS条件：

活性数据的数据分析

质谱数据使用AB-Sciex Analyst TF(1.5.1版；Framingham,MA)获取。色谱图和光谱使用AB-Sciex PeakView(2.2.0.1版；Framingham,MA)获得。提取的离子色谱图的相对峰面积的比较基于每种目标分析物的预期精确质荷比(m/z)的±0.0002Da。

结果

与肝细胞孵育未检测到代谢物。在所呈现的分析条件下，化合物1a显示出大约7.8分钟的保留时间。在负扫描模式下，化合物1a显示去质子化的分子离子m/z 745(C₂₄H₂₅F₂N₁₀O₈P₂S₂ ^-)和双去质子化的分子离子m/z 372(C₂₄H₂₄F₂N₁₀O₈P₂S₂ ^2-)。观察到m/z 533(C₁₉H₁₉FN₁₀O₄PS^-)和m/z 186(C₉H₈N₅ ^-)的主要MS/MS产物离子。在正扫描模式下，化合物1a显示质子化的分子离子m/z 747(C₂₄H₂₇F₂N₁₀O₈P₂S₂ ⁺)以及m/z 651(C₂₄H₂₆F₂N₁₀O₆PS⁺)、m/z 252(C₁₀H₁₁FN₅O₂ ⁺)和m/z 188(C₉H₁₀N₅ ⁺)的主要MS/MS产物离子。MS和MS/MS数据证实了化合物1a的结构。

化合物1a在与小鼠、大鼠、狗、猴和人的肝细胞的孵育中是稳定的。在该研究中没有发现化合物1a的明显代谢物。在通过与肝细胞孵育获得的样品中，只有化合物1a本身可以通过串联质谱(MS/MS)的片段进行检测和确认。

本公开中引用的所有文件均通过引用并入本文，但是如果任何并入的文件与本书面说明书相矛盾，则应以本书面说明书为准。本领域技术人员将认识到，可以对本文提供的材料进行各种改变和修改，并且该材料在本公开的范围和精神内。

序列表

SEQ ID NO:1(WT人STING)：

SEQ ID NO:2(REF人STING)：

atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcccagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctgcgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctgccccctccgccgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgcccttcacttggatgcttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggccccagctgagatctctgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcggatatctgcggctgatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctacggggtgcagtgagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctgaccccaacattcgcttcctggataaactgccccagcagaccggtgaccatgctggcatcaaggatcgggtttacagcaacagcatctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccacccccttgcagactttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggccaaactcttctgccggacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcctaccaggaacctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggaggaaaaggaagaggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagcctgagctcctcatcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga

SEQ ID NO:3(AQ人STING)：

atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcccagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctgcgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctgccccctccgccgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgcccttcacttggatgcttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggccccagctgagatctctgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcggatatctgcggctgatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctacggggtgcagtgagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctgaccccaacattcgcttcctggataaactgccccagcagaccgctgaccgagctggcatcaaggatcgggtttacagcaacagcatctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccacccccttgcagactttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggccaaactcttctgccagacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcctaccaggaacctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggaggaaaaggaagaggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagcctgagctcctcatcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga

SEQ ID NO：4(WT STING残基155-341)：

VAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDRAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEV

SEQ ID NO:5(His-TEV-Sumo-WT STING 155-341)

MHHHHHHSSGVDLGTENLYFQSNAMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGGSVAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDRAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEV

SEQ ID NO:6(REF STING残基155-341)：

VAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEV

SEQ ID NO:7(His-TEV-Sumo-REF STING 155-341)

MHHHHHHSSGVDLGTENLYFQSNAMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGGSVAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEV

序列表

<110> 卫材 R&D 管理有限公司.

金大式

方家范

远藤笃史

崔亨旭

郝鸣鸿

鲍幸峰

黄冠群

<120> 用于治疗癌症的环状二核苷酸衍生物

<130> 0080171-000378

<150> 62/460562

<151> 2017-02-17

<150> 62/479169

<151> 2017-03-30

<150> 62/551645

<151> 2017-08-29

<150> 62/551647

<151> 2017-08-29

<150> 62/551668

<151> 2017-08-29

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1140

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

atgccccact ccagcctgca tccatccatc ccgtgtccca ggggtcacgg ggcccagaag 60

gcagccttgg ttctgctgag tgcctgcctg gtgacccttt gggggctagg agagccacca 120

gagcacactc tccggtacct ggtgctccac ctagcctccc tgcagctggg actgctgtta 180

aacggggtct gcagcctggc tgaggagctg cgccacatcc actccaggta ccggggcagc 240

tactggagga ctgtgcgggc ctgcctgggc tgccccctcc gccgtggggc cctgttgctg 300

ctgtccatct atttctacta ctccctccca aatgcggtcg gcccgccctt cacttggatg 360

cttgccctcc tgggcctctc gcaggcactg aacatcctcc tgggcctcaa gggcctggcc 420

ccagctgaga tctctgcagt gtgtgaaaaa gggaatttca acgtggccca tgggctggca 480

tggtcatatt acatcggata tctgcggctg atcctgccag agctccaggc ccggattcga 540

acttacaatc agcattacaa caacctgcta cggggtgcag tgagccagcg gctgtatatt 600

ctcctcccat tggactgtgg ggtgcctgat aacctgagta tggctgaccc caacattcgc 660

ttcctggata aactgcccca gcagaccggt gaccgggctg gcatcaagga tcgggtttac 720

agcaacagca tctatgagct tctggagaac gggcagcggg cgggcacctg tgtcctggag 780

tacgccaccc ccttgcagac tttgtttgcc atgtcacaat acagtcaagc tggctttagc 840

cgggaggata ggcttgagca ggccaaactc ttctgccgga cacttgagga catcctggca 900

gatgcccctg agtctcagaa caactgccgc ctcattgcct accaggaacc tgcagatgac 960

agcagcttct cgctgtccca ggaggttctc cggcacctgc ggcaggagga aaaggaagag 1020

gttactgtgg gcagcttgaa gacctcagcg gtgcccagta cctccacgat gtcccaagag 1080

cctgagctcc tcatcagtgg aatggaaaag cccctccctc tccgcacgga tttctcttga 1140

<210> 2

<211> 1140

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2