阅读说明：本技术 用于从液体样本中分离生物标记物的流体密封流量系统 (For separating the Fluid Sealing flow system of biomarker from liquid sample ) 是由 R·穆勒 S·比彻 J·穆勒-科恩 于 2018-04-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开主题提供了流体密封流量系统；从液体样本中分离生物标记细胞的方法；从血浆中提取cfDNA、ctDNA或外切体的方法；从血液中提取cfDNA、ctDNA或外切体的方法；捕获从生物标记细胞释放的DNA或RNA的方法；扩增核苷酸序列的方法；核苷酸序列测序的方法；检测染色体异常的方法；以及分析蛋白质的方法。(The present invention discloses theme and provides Fluid Sealing flow system；The method of biomarker cell is separated from liquid sample；The method of cfDNA, ctDNA or circumscribed body is extracted from blood plasma；The method of cfDNA, ctDNA or circumscribed body is extracted from blood；The method for capturing the DNA or RNA that discharge from biomarker cell；The method of amplification of nucleotide acid sequence；The method of nucleotide sequence sequencing；The method for detecting chromosome abnormality；And the method for analysis protein.)

用于从液体样本中分离生物标记物的流体密封流量系统

相关申请的交叉引用

本申请要求了2017年4月20日提交的美国临时专利申请号62/487,690的优先权，其内容在此通过引用全部并入本文。

技术领域

本发明大体上涉及新型的流体密封(fluid-tight)流量系统以及具有实时反馈控制的新型的流体密封流量系统。

背景技术

传统的液体处理系统被用于运输和处理大量液体。举例来说，可以在液体处理系统中的容器(例如，微孔盘或小瓶)中提供一或多种液体样本。液体处理系统可以包含一或多个用于从容器取出(例如通过抽吸)部分样本和/或将材料添加(例如，通过分配)到容器中的样本的移液器。标准移液系统一次仅使用一个移液管来分配或收集样本。

液体处理器可以用于将样本直接从移液器注射到与单独的泵系统(比如HamiltonPSD3Servo注射泵)连接的大规模流体系统(比如流式细胞分析仪；美国专利号7,858,040)，以便控制流体流量。关于微流体芯片，通常将毛细管连接器与注射泵或单独的压力供应装置结合使用，以将患者液体样本递送到微流体芯片(如同在Elveflow微流体流量控制系统中一样)。

具体实施方式

虽然本发明可以以许多不同方式体现，但应理解，本发明应视为提供本发明原理的实例并且这些实例并不旨在将本发明限制于本文所描述和/或本文所说明的优选实施例，本文正是在这种情况下对多个说明性实施例进行了描述。所要求保护的主题也可以以其它方式体现，以便结合其它当前或未来技术包含与本文档中所描述的步骤和元件不同或类似的步骤和元件。此外，尽管术语“步骤”在本文中可以用于表示所采用方法的不同方面，但所述术语不应被解释为暗示本文中所公开的各种步骤之间的任何特定顺序，除非明确描述了各个步骤的顺序。

现在将参考附图在下文更全面地描述本发明的实施例，附图中示出了部分而非全部本发明实施例。事实上，本发明可以以许多不同形式体现并且不应被解释为受限制于本文所述实施例；而是提供这些实施例以使得本发明满足适用法律要求。相似数字适用于全文的元件。本领域的技术人员将根据附图显而易知本发明的实施例的其它细节。尽管已基于这些优选实施例来描述本发明，但对于本领域技术人员来说，符合本发明的精神和范围之内的某些修改、变化和替代构造是显而易见的。

现在更详细地描述本发明主题。图1是根据本发明的实施例的实例流体密封流量系统以及根据本发明的实施例的额外实时反馈控制组件的示意图。图1示出实例流体密封流量系统，其包括控制器100，包含两个自动移液通道312和313的移液仪器001，以及微流体芯片400。微流体芯片400包含入口402、出口403和捕获床406(如图2c中所示)。第一自动移液通道312包含泵308(如图2a中所示)和含有液体样本(未示出)并耦接到入口402的移液管尖端316。第二自动移液通道313包含泵309(如图2a中所示)和耦接到出口403的移液管尖端317。在一个实施例中，移液管尖端316和317分别同时耦接到入口402和出口403。在一个实施例中，移液管尖端316和317为一次性移液管尖端。两个自动移液通道312和313配置为且可操作以控制来自移液管尖端316并经入口402、捕获床406和出口403通过微流体芯片400的液体样本的流体流量。液体样本可以流过微流体芯片进入第二自动移液管313的移液管尖端317或样本容器(未示出)。

移液仪器001可以是自动液体处理系统，比如来自克曼库尔特公司(Beckman-Coulter,Inc.)(加利福尼亚州布雷亚贝(Brea,Calif.))的Biomek^TM FX、来自帝肯集团有限公司(Tecan Group,Ltd.)(瑞士)的Freedom EVO^TM和来自汉密尔顿公司(HamiltonCompany)(内华达州里诺)的STAR Line^TM。在一个实施例中，移液仪器001包含与控制器100、仪器电机(例如移液器臂电机，比如X驱动电机和Y驱动电机；移液通道Z驱动电机；和移液驱动电机310和311)以及仪器传感器(例如压力传感器315和315、尖端传感器、电容传感器)通信的仪器主板301。仪器主板301包括通信装置、处理装置和用于存储程序的存储装置，所述程序控制各种移液仪器001组件的功能。移液仪器001还可以包含用于支撑微流体芯片400、移液管尖端、样本、试剂、用于样本处理的工作站的仪器平台350。

控制器100与仪器主板301、仪器电机(例如移液器臂电机，比如X驱动电机和Y驱动电机；移液通道Z驱动电机；和移液驱动电机310和311)以及仪器传感器(例如压力传感器315和315、尖端传感器、电容传感器)通信。在一个实施例中，控制器100集成到移液仪器001中或与仪器主板301集成在一起。控制器100通常包括通信装置、处理装置和存储装置。处理装置可操作地耦接到通信装置和存储装置。处理装置使用通信装置与仪器主板301通信，且因而通信装置通常包含调制解调器、服务器或其它用于与仪器主板301通信的装置。控制器100可以包含非暂时性计算机可读介质，其存储在存储装置中且编程为命令第一自动移液通道的第一泵和第二自动移液通道的第二泵以控制通过微流体芯片的液体样本的流量。控制器100可以体现在一或多个计算机、微处理器或微型计算机、微控制器、可编程逻辑控制器、现场可编程门阵列或其它可适当配置或编程的硬件组件中。控制器100可以包含控制软件、固件、硬件或其它编程指令集，其编程为接收用户输入并控制仪器电机(例如移液器臂驱动电机，比如X驱动电机和Y驱动电机；移液通道Z驱动电机；以及移液驱动电机310和311)，且根据本发明的实施例提供实时反馈控制。

控制器100可以包含非暂时性计算机可读介质，其存储在存储装置中，且编程为实时地从第一压力传感器接收数据并实时地从第二压力传感器接收数据，且使用基于来自第一压力传感器和第二压力传感器的所述数据的实时反馈调节对至少第一自动移液通道的第一泵或第二自动移液通道的第二泵的命令，以调节微流体芯片内的流速。控制器100可以包含控制软件、固件、硬件或其它编程指令集，其编程为从仪器传感器(例如压力传感器314和315)接收数据、接收用户输入、基于压力数据进行分析并调节对自动移液通道的泵的控制。

控制器100可以控制移液仪器001的参数，比如仪器臂302和303的移动定时和X、Y、Z轴位置，移液驱动电机310和311的定时和控制，以控制通过微流体芯片的液体样本的流体流速。控制器100可以经由通信技术将控制信号或其它指令传输到电气或机电系统组件(例如电机或驱动器、伺服机构、致动器、齿条与齿轮、齿轮机构以及其它互连或啮合动态部件)，以启用数据通信(例如串行连接或以太网连接、通用串行总线(USB)、电气与电子工程师学会(IEEE)标准1394(即“火线(FireWire)”)连接、比如BLUETOOTH^TM等无线数据通信技术或其它基于红外线(IR)或射频(RF)信号的形式)。

图2a中，左侧是根据本发明的实施例的移液通道312和313以及微流体芯片400的透视图，其中移液管尖端316和317分别耦接到微流体芯片400的入口402和出口403；且右侧是根据本发明的实施例的移液通道和微流体芯片的垂直剖面图。因此，分别包含移液管尖端316和317的移液通道312和313与微流体芯片的通道流体连通。移液管尖端316和317经由摩擦配合耦接到微流体芯片400的入口402和出口403，从而形成气密(或不透气)密封以及无泄漏密封。如本文中所使用的，“流体密封(fluid-tight)”意味着不透气且无泄漏。在一个实施例中，自动移液通道的泵为与移液驱动电机310和311以及压力传感器314和315连通的活塞或柱塞308和309。在一个实施例中，压力传感器314和315集成到移液通道312和313中。

图2b是根据本发明的实施例的移液管尖端316和317的横截面视图，移液管尖端316和317分别耦接到微流体芯片400的入口402和出口403。在一个实施例中，入口402或出口403具有锥形形状。在一个实施例中，入口402和出口403具有锥形形状并且因此配置成容纳并耦合到尺寸不同的移液管尖端。

图2c是根据本发明的实施例的微流体芯片的基底芯片的俯视图(未示出盖板)。微流体芯片400包括入口402、进给通道408、捕获床406、出口通道408和出口403；其中捕获床406包含多个分离通道，进给通道与分离通道相交，且出口通道与分离通道相交。在一个实施例中，捕获床包含配置成分离循环肿瘤细胞、循环白血病细胞、cfDNA或外切体的多个分离通道。

图3是根据本发明的一个实施例的用于准备Hamilton Microlab STAR线性液体处理器的固件命令的后端软件架构。

图4a是包括根据本发明的实施例的示例性方法的流程图。所述方法可以由与本发明系统的其它组件通信的控制器100实施；例如，通过经由仪器主板301发送命令并接收数据来实施，所述仪器主板301与仪器电机或仪器传感器通信。根据一些实施例，计算机可读介质可以编码有用于控制通过微流体芯片的液体样本的流量的数据和指令；比如用于以下操作的数据和指令：命令移液器臂的X驱动电机和Y驱动电机，将各包括一个移液管尖端的移液通道1和2定位在微流体芯片的入口和出口上方(步骤520)，命令z驱动电机将移液通道1和2向下移动，以使移液管尖端分别与微流体芯片的入口和出口啮合(步骤522)，命令移液通道1和2的压力传感器启动(步骤524)，优选地以规律的时间间隔收集来自压力传感器的数据(步骤526)，以及命令a)移液通道1的移液驱动电机以限定速度向下或向上移动柱塞(步骤600)和b)移液通道2的移液驱动电机以限定速度向上或向下移动柱塞(步骤602)，并且协调这些命令以控制通过微流体芯片并进入移液通道2的移液管尖端的液体样本的流量并命令移液通道的z驱动电机向z-最大处(z-max)移动(步骤544)。对移液通道的移液驱动电机以限定速度向下或向上移动柱塞的命令包括用于使柱塞停止移动的限定速度零。图4b是根据本发明的实施例的协调命令和固件参数(用于控制移液通道1和2的z驱动电机和移液驱动电机)，以控制从移液通道1的移液管尖端通过微流体芯片并进入移液通道2的移液管尖端的流量。

本文公开的系统和方法是新型的并且在罕见生物标记物的分离方面具有独特优点。首先，通过使用包含耦合到微流体芯片的入口和出口的移液管尖端的自动移液通道、去除如毛细管连接器的额外组件并将液体样本直接引入到微流体芯片中以供分离，流体密封流量系统减少了生物材料的损耗。其次，包含耦接到微流体芯片入口和出口的移液管尖端的自动移液通道形成了流体密封流量系统，其能够以新型方式协调移液通道的使用，以控制从一个移液管尖端通过微流体芯片进入另一个移液管尖端，从而收集液体样本的液体样本流动。通常，自动移液通道的活塞或柱塞配置成在移液管尖端接触液体样本时进行抽吸或分配。本文描述的流体密封流量系统能够将移液通道用作同步泵来控制通过微流体芯片的液体样本的流量，包括使用移液通道来抽吸或抽拉未与移液管尖端接触的液体样本，或分配或推送不再与移液管尖端接触的液体样本(即，当液体样本完全进入微流体芯片时)。再次，本文公开的系统和方法能够将通过微流体芯片的流速控制为较低至极低流速；由此提供捕获和分离罕见生物标记物(例如，DNA、RNA、外切体)的优点。

图4c是包括根据本发明的实施例的示例性方法的流程图。该方法可以由与本发明系统的其它组件通信的控制器100实施；例如通过经由仪器主板301发送命令和接收数据来实施，所述仪器主板301与仪器电机或仪器传感器通信。根据一些实施例，计算机可读介质可以编码有用于控制通过微流体芯片的液体样本流量的数据和指令；比如用于以下操作的数据和指令：命令移液器臂的X驱动电机和Y驱动电机，将各包括一个移液管尖端的移液通道1和2定位在微流体芯片的入口和出口上方(步骤520)，命令z驱动电机将移液通道1和2向下移动，以使移液管尖端分别与微流体芯片的入口和出口啮合(步骤522)，命令移液通道1和2的压力传感器启动(步骤524)，优选地以规律的时间间隔收集来自压力传感器的数据(步骤526)，命令a)移液通道1的移液驱动电机以限定速度向下或向上移动柱塞(步骤700)和b)移液通道2的移液驱动电机以限定速度向上或向下移动柱塞(步骤702)，并且协调这些命令以控制通过微流体芯片(并最终进入移液通道2的移液管尖端)的液体样本的流量，对来自压力传感器的数据进行分析(步骤704)并调节步骤700和702中的命令(由虚线表示)，以及命令移液通道的z驱动电机向z-最大处移动(步骤544)。对移液通道的移液驱动电机以限定速度向下或向上移动柱塞的命令包括用于使柱塞停止移动的限定速度零。

通常，压力传感器监测移液通道中液体样本与柱塞之间的气隙中的压力。因此，且不说任何流体系统，具有压力传感器的当前液体处理移液系统(例如动态装置实时闭环移液系统)的任何实时反馈受限于检测与移液管尖端功能相关的错误(例如，移液管尖端堵塞、抽吸到移液管尖端中的流速、从移液管尖端进行分配的流速、分配或抽吸的液体的容量监测)，因此需要独立的压力传感器来监测流体系统中的压力。可以使柱塞的压力数据和移动相关，以计算表示将液体样本抽吸到移液管尖端中或从移液管尖端分配液体样本的标准曲线(压力对时间)。举例来说，当移液管尖端与样本液体接触时并随着活塞或柱塞向上移动，尖端中的压力降低，并且液体样本被大气压力推送到移液管尖端中。与该标准曲线的偏差可以检测与移液管尖端功能相关的错误，比如基于凝块的压力阈值判断的在抽吸期间的尖端堵塞以及基于由于移液管尖端中的液体不足的压力阈值判断的液体样本不完全抽吸到移液管尖端中。

本文公开的包括实时反馈控制的系统和方法是新型的，并且在控制微流体芯片中的流量方面具有独特优点。包含压力传感器和耦接到微流体芯片入口和出口的移液管尖端的自动移液通道形成流体密封流量系统，其能够监测流体系统中的压力并确定流速而无需额外传感器组件，并且能够用实时反馈控制调节流速。本文公开的系统中基于压力数据的实时反馈包含检测到微流体芯片中的堵塞、检测到等于或大于压力阈值的压力水平以避免微流体芯片超压及检测到等于或大于液体样本的流速阈值的流速。

图4d是包括根据本发明的实施例的对来自压力传感器的数据进行分析的示例性方法的流程图。如图4d中所示，对来自压力传感器的数据进行分析的步骤(步骤704)可以包括以下步骤，并且计算机可读介质可以进一步编码有用于以下操作的数据和指令：优选地以规律的时间间隔确定微流体芯片的通道中的压力(步骤10)，监测微流体芯片的通道中的压力(步骤11)，以及检测等于、大于或低于压力阈值的微流体芯片的通道中的压力(步骤12)。可以通过以下确定与检测微流体芯片中的堵塞相关的压力阈值：1)比较基于压力数据和柱塞移动的表示液体样本成功流经微流体芯片的标准曲线(压力对时间)与基于压力数据和柱塞移动的表示微流体芯片堵塞的曲线(压力对时间)；以及2)选择压力水平作为压力阈值。可以通过以下确定与微流体芯片中的最大压力相关的压力阈值：1)比较基于压力数据和柱塞移动的表示液体样本成功流经微流体芯片的标准曲线(压力对时间)与基于压力数据和柱塞移动的表示微流体芯片中达到最大压力的曲线(压力对时间)；以及2)选择压力水平作为压力阈值，例如以避免微流体芯片超压。计算机可读介质可以进一步编码有用于接收压力阈值用户输入或用于确定任何前述压力阈值的数据和指令。

计算机可读介质可以进一步编码有重复步骤700和702中的命令中的调节以及分析(步骤704)以使用实时反馈控制通过微流体芯片的液体样本的流量的数据和指令。图4e是根据本发明的实施例的用于避免微流体芯片超压的示例性实时反馈控制参数的图表。如该图表中示意性所示，由于调节了通过微流体芯片的流体流量，步骤10-12(关于与微流体芯片中的最大压力相关的压力阈值)、700和702随时间重复。用于避免微流体芯片超压的压力阈值可以由用户限定，或计算机可读介质可以进一步编码有用于确定压力阈值以避免微流体芯片超压的数据和指令。

图4f是包括根据本发明的实施例的对来自压力传感器的数据进行分析的示例性方法的流程图。如图4f所示，对来自压力传感器的数据进行分析的步骤(步骤704)可以包括以下步骤，并且计算机可读介质可以进一步编码有用于以下操作的数据和指令：优选地以规律的时间间隔确定微流体芯片的通道中的液体样本的流速(步骤20)，监测微流体芯片的通道中的液体样本的流速(步骤21)，以及检测等于、高于或低于流速阈值的微流体芯片的通道中的流速(步骤22)。可以通过以下确定与分离给定生物标记物的最佳流量相关的流速阈值：1)比较基于压力数据和柱塞移动的表示液体样本成功流经微流体芯片的标准曲线(流速对时间)与基于压力数据和柱塞移动的表示通过微流体芯片的一类液体样本的最佳流速的曲线(流速对时间)；以及2)选择流速作为流速阈值。计算机可读介质可以进一步编码有用于接收流速阈值用户输入或用于确定流速阈值的数据和指令。计算机可读介质可以进一步编码有用于重复步骤700和702中的命令调节以及分析(步骤704)以便使用实时反馈控制通过微流体芯片的液体样本的流量的数据和指令。

如图1所示，控制器100包含决策引擎102和流量控制规则服务器104。如本文所描述，计算机可读介质可以编码有用于以下操作的数据和指令：命令a)移液通道1的移液驱动电机以限定速度向下或向上移动柱塞(步骤700)，和b)移液通道2的移液驱动电机以限定速度向上或向下移动柱塞(步骤702)，并且协调这些命令以控制通过微流体芯片(并最终进入移液通道2的移液管尖端)的液体样本的流量。流量控制规则服务器104包含规则，所述规则用于协调对移液通道的移液驱动电机的命令，以控制通过微流体芯片的液体样本的流量。

示例性规则列举在表1中：

流量控制规则服务器104可以包括用于确定压力阈值的规则。流量控制规则服务器104可以包括用于确定流速阈值的规则。决策引擎102配置为确定将流量控制规则服务器的哪些规则应用于协调对移液通道的移液驱动电机的命令，以控制通过微流体芯片的液体样本的流量。在一个实施例中，决策引擎102配置为响应于检测到等于、高于或低于压力阈值的压力而确定应用流量控制规则服务器的哪些规则。在一个实施例中，决策引擎102配置为响应于检测到等于、高于或低于流速阈值的流速而确定应用流量控制规则服务器的哪些规则。

本文描述的各种技术可以用硬件或软件，或在适当时用两者的组合来实施。举例来说，图1中所示的控制器装置100可以包括配置为实施本文所描述的各种技术的合适硬件、软件或其组合。所公开实施例的方法和系统或其某些方面或部分可以采取程序码(即指令)的形式，所述程序码体现在有形介质中，比如软盘、CD-ROM、硬盘驱动器或任何其它机器可读存储介质中，其中当程序码加载到机器(比如计算机)中并由机器执行时，机器变为用于实践本发明主题的设备。就可编程计算机上的程序码执行来说，计算机将通常包括处理器、处理器可读的存储介质(包括易失性和非易失性存储器和/或存储元件)、至少一个输入装置和至少一个输出装置。一或多个程序优选地以高阶程序编程语言或面向对象的编程语言实施以与计算机系统通信。然而，这些程序在需要时可以用汇编或机器语言实施。在任何情况下，所述语言可以是编译或解译语言，并且与硬件实施结合。

描述的方法和系统组件还可以以程序码形式体现，所述程序码通过某一传输介质传输，例如通过电线或电缆、通过光纤或经由任何其它形式的传输，其中当程序码接收并加载到机器(比如EPROM、门阵列、可编程逻辑装置(PLD)、客户端计算机、录像机等)中且由机器执行时，所述机器变成用于实践本发明主题的设备。当实施于通用处理器上时，程序码与处理器接合提供一种独特的设备，其操作执行本发明主题的处理。

虽然结合各图的优选实施例描述了实施例，但应理解，可以使用其它类似实施例，或可以在不偏离其来源的情况下对用于执行相同功能的所描述实施例进行修改和补充。因此，所公开实施例不应受限于任何单个实施例，而是应根据所附的权利要求书在广度和范围方面进行解释。