阅读说明：本技术 改性海藻酸钠水凝胶及其制备的细胞培养基质材料和应用 (Modified sodium alginate hydrogel, cell culture matrix material prepared from same and application of cell culture matrix material ) 是由 不公告发明人 于 2018-05-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种改性海藻酸钠水凝胶,由可结合细胞因子的、且链霉亲和素修饰的纤连蛋白改性生物素偶联的海藻酸钠水凝胶制得；本发明还提供了由其制备的细胞培养基质材料及其制备的细胞培养器,含可溶性胶原蛋白、乳酸、维生素A和2-磷酸-L-抗坏血酸在内的无血清培养添加物,以及在低氧浓度条件下用于培养干细胞的方法。模拟正常干细胞在机体内生长环境,从原代培养开始获得人干细胞,具有更好的增殖活力、生物学特性和体内存活能力。这些改性海藻酸钠水凝胶的细胞培养基质材料、及其细胞培养器和无血清培养添加物,在低氧浓度条件下用于人干细胞原代和传代培养、干细胞的生物制剂,以及治疗疾病的药物组合物。(The invention discloses a modified sodium alginate hydrogel which is prepared from a streptavidin-modified fibronectin-modified biotin-coupled sodium alginate hydrogel which can be combined with cytokines; the invention also provides a cell culture substrate material prepared from the cell culture substrate material, a cell culture device prepared from the cell culture substrate material, a serum-free culture additive containing soluble collagen, lactic acid, vitamin A and 2-phospho-L-ascorbic acid, and a method for culturing stem cells under the condition of low oxygen concentration. The growth environment of normal stem cells in an organism is simulated, the human stem cells are obtained from primary culture, and the human stem cells have better proliferation activity, biological characteristics and in-vivo survival ability. The cell culture substrate material of the modified sodium alginate hydrogel, and the cell culture device and the serum-free culture additive thereof are used for primary and subculture of human stem cells, biological preparations of the stem cells under the condition of low oxygen concentration, and pharmaceutical compositions for treating diseases.)

改性海藻酸钠水凝胶及其制备的细胞培养基质材料和应用

技术领域

本发明涉及一种改性海藻酸钠水凝胶，由可结合细胞因子的、且链霉亲和素修饰的纤连蛋白改性生物素偶联的海藻酸钠水凝胶制得；由其制备的细胞培养基质材料及其制备的细胞培养器，与含可溶性胶原蛋白、乳酸、维生素A和2-磷酸-L-抗坏血酸在内的无血清培养添加物，在低氧浓度条件下用于培养干细胞的方法。特别地，模拟正常干细胞在机体内生长环境，从原代培养开始获得人干细胞，具有更好的增殖活力、生物学特性和体内存活能力。

背景技术

日前，在科研上和生产上干细胞的培养方法多数为简单塑料培养瓶或培养皿或培养板，加入含有细胞因子的培养基进行培养。干细胞多数为贴壁生长，坚硬的塑料瓶底不利于干细胞的生长，而且培养得到的干细胞生物学功能已发生较大的改变。于是人们开始尝试在塑料培养瓶或培养皿或培养板底部加入各种有利于干细胞生长的基质，如Matrigel基质胶、Geltrex基质胶、粘连蛋白、可溶性胶原蛋白、海藻酸钠和壳聚糖等，或者在微球上，利用它们存在的孔径和硬度用于干细胞三维培养，更好地展现出干细胞生物学功能。

还有研究者直接将干细胞包埋在凝胶内，再进行体外培养，尽管这种培养方式增加干细胞的增殖和抑制细胞凋亡，但干细胞扩增和传代培养增添了不少麻烦；不利于获得干细胞。

以上述方式获得三维立体环境，与真正体内细胞外基质的干细胞三维生长方式还相差甚远。细胞外基质除了有网状支架外，还需要网状支架上粘连的各种蛋白和细胞因子，以及生长环境等因素，共同营造干细胞最佳的生长条件。通过这种生长条件，干细胞增殖能力、抗凋亡能力、体内体外存活能力以及生物学功能均达到更好的状态，有助于其在体内发挥着更好的组织器官修复、改善机体微环境和分泌细胞因子的能力，达到真正意义上的治疗疾病的能力。

发明内容

本发明是我们研发团队经过多年的科研工作，模拟正常干细胞在体内生长的条件，包括细胞外基质、营养成分和氧浓度等因素，发明了改性海藻酸钠水凝胶，由可结合细胞因子的、且链霉亲和素修饰的纤连蛋白改性生物素偶联的海藻酸钠水凝胶制得；由其制备的细胞培养基质材料及其制备的细胞培养器，与含可溶性胶原蛋白、乳酸、维生素A和2-磷酸-L-抗坏血酸的无血清培养添加物，在低氧浓度条件下用于培养干细胞的方法。海藻酸钠作为支架，其偶联了生物素，制作成了活性的生物素-海藻酸钠水凝胶；生物素可特异性结合链霉亲和素，而链霉亲和素修饰了纤连蛋白，即形成了细胞外基质的基本框架。

由于纤连蛋白每个亚基具有六个功能区和一个RGD序列，使纤连蛋白能够和多种物质结合发挥强大的功能。纤连蛋白通过黏附细胞和营养物质，为细胞传输细胞代谢、生长、增殖所需的营养物质(比如可溶性胶原蛋白、透明质酸、小分子肽、糖蛋白等)，并调节细胞外的微环境。特别是纤连蛋白具有与抗体相似的结构域，在III型结构域存在可变区，可***单克隆抗体的互补决定区，可与目的蛋白产生抗原抗体反应并特异性结合。利用这一特点，我们在III型纤连蛋白结构域进行基因重组***小鼠抗人细胞因子的单链抗体，从而可以特异性结合细胞因子。同时利用I型和II型纤连蛋白结构域中特异性结合可溶性胶原蛋白的区域，加入可溶性胶原蛋白以特异结合纤连蛋白，形成近似细胞外基质的细胞生长环境。

另外进一步模拟体内细胞生长条件，我们发现体内组织器官中氧浓度基本均在1-10％之间，这一氧浓度条件下细胞生长条件更适宜并存活时间更长。通过我们实验中发现，即使在无任何滋养层的普通培养器中，低氧培养干细胞的增殖速率和生物学功能均更优于正常氧浓度培养的干细胞。而在海藻酸钠凝胶结合含有细胞因子的纤连蛋白的培养器中培养干细胞的增殖速率进一步优于普通培养器培养的干细胞。特别是在含有可溶性胶原蛋白、乳酸、维生素A和2-磷酸-L-抗坏血酸培养条件下，干细胞更好保持其增殖能力和干细胞特征，以及体内存活能力。经我们研究发现可溶性胶原蛋白可结合上纤连蛋白上，形成有助于干细胞生长的细胞外基质微环境；乳酸和维生素A帮助干细胞在缺氧条件下保持更好的增殖能力和是干细胞能量产生有效的底物，以及维生素A和2-磷酸-L-抗坏血酸更好保持干细胞的干性特征，即自我更新和多向分化潜能，这些分子共同构成干细胞生长的微环境，协同地保证干细胞增殖生长和功能发挥，因而，我们在此研究基础上，发现新的干细胞无血清培养添加物。

本发明提供了一种改性海藻酸钠水凝胶，其特征在于，其由可结合细胞因子的、且链霉亲和素修饰的纤连蛋白改性生物素偶联的海藻酸钠水凝胶制得。

优选，所述海藻酸钠水凝胶为生物素修饰的海藻酸钠，即利用海藻酸钠含有羧基，按摩尔数比1∶0.1-0.5标记上生物素分子；再采用与水溶性壳聚糖和戊二醛进行交联反应得到海藻酸钠水凝胶，呈多孔结构，硬度在0.2-50kPa。

优选，所述结合细胞因子的链霉亲和素修饰纤连蛋白为通过对纤连蛋白基因重组，在其III型结构域可变区突变为鼠抗人细胞因子单链抗体(Single chain Fv，scFv)的序列，通过在大肠杆菌宿主中表达，获得可结合细胞因子的纤连蛋白，并进行链霉亲和素修饰，加入细胞因子结合到纤连蛋白上；更优选，亲和常数可达到1×10⁷以上的K_aff值。

优选，所述的获得鼠抗人细胞因子单链抗体为以细胞因子N端结构域作为免疫抗原；更优选，其分子量为2kDa；通过接种小鼠后经效价检测的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，培养后筛选获得高效价和特异性的单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)及其杂交瘤细胞。设计扩增重链和轻链可变区基因的引物，通过DNA聚合酶链式反应(polymerasechain reaction，PCR)和拼接(splice-overlap extension，SOE)PCR获得scFv基因片段，在通过PCR技术将scFv基因片段克隆到纤连蛋白基因3’端可变区，然后诱导表达含鼠抗人细胞因子scFv与纤连蛋白的融合蛋白。含鼠抗人细胞因子scFv的纤连蛋白进行链霉亲和素标记，加入到生物素化海藻酸钠水凝胶，通过生物素与链霉亲和素特异结合，将鼠抗人细胞因子scFv的纤连蛋白结合到海藻酸钠水凝胶上。

本发明还提供了一种制备改性海藻酸钠水凝胶的方法，其特征在于，包含如下步骤：

第一步，海藻酸钠通过羧基按比例标记上生物素，在戊二醛与水溶性壳聚糖交联反应得到了海藻酸钠水凝胶；

第二步，细胞因子N端结构域作为免疫抗原接种小鼠后经效价检测的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，培养后筛选获得高效价和特异性的单克隆抗体及其杂交瘤细胞；通过DNA PCR获得抗人细胞因子的scFv基因片段；

第三步，通过PCR技术将scFv基因片段克隆到纤连蛋白基因3’端可变区，然后诱导表达含鼠抗人细胞因子scFv与纤连蛋白的融合蛋白；链霉亲和素标记含鼠抗人细胞因子scFv的纤连蛋白，得到链霉亲和素化含鼠抗人细胞因子scFv的纤连蛋白；

第四步，通过生物素与链霉亲和素特异结合，将鼠抗人细胞因子scFv的纤连蛋白结合到海藻酸钠水凝胶上，制备成所述改性海藻酸钠水凝胶。

任选地，海藻酸钠水凝胶结合鼠抗人细胞因子scFv的纤连蛋白加入细胞因子，可特异结合到纤连蛋白上的鼠抗人细胞因子scFv，制备成海藻酸钠水凝胶结合含细胞因子的纤连蛋白的细胞培养基质材料。

优选，本发明提供的海藻酸钠修饰的生物素，与纤连蛋白修饰的链霉亲和素具有特异性的结合，在培养器支架上含有细胞因子和纤连蛋白在内形成了良好的细胞外基质。

本发明还提供了一种细胞培养基质材料，将所述的改性海藻酸钠水凝胶加入细胞因子，所述细胞因子可特异结合到改性海藻酸钠水凝胶，从而制备得到所述细胞培养基质材料；优选，所述细胞因子可特异结合到改性海藻酸钠水凝胶中纤连蛋白上的鼠抗人细胞因子scFv。

优选，所述可结合到重组纤连蛋白的细胞因子，包括表皮生长因子(epithelialgrowth factor，EGF)、碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、肝细胞因子(hepatocytegrowth factor，HGF)、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)、胰岛素、***(insulin like growth factor，IGF)、神经生长因子(nervegrowth factor，NGF)、角细胞因子(Keratinocye Growth Factor，KGF)和干细胞因子(Stemcell growth factor，SCF)等；优选地，干细胞培养常用的细胞因子，即EGF和bFGF。

本发明还提供了一种细胞培养器，其中，所述细胞培养器为将细胞培养基质材料加入到细胞培养器中铺底；优选连续均匀在细胞培养器表面形成0.5-5mm薄膜；制备成包被细胞培养基质材料的细胞培养器；

本发明还提供了一种干细胞培养的无血清培养添加物，其中，所述无血清培养添加物包括含可溶性胶原蛋白、乳酸、维生素A、2-磷酸-L-抗坏血酸在内，以及重组人血白蛋白、重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、葡萄糖、碳酸氢钠和缓冲液HEPES。

所述无血清培养添加物为1倍的使用浓度，即可溶性胶原蛋白0.5-1000ng/mL、乳酸0.1-200mmol/L、维生素A 0.1-500μmol/L、2-磷酸-L-抗坏血酸0.5-500ng/mL，以及重组人血白蛋白0.5-200μg/mL、重组人胰岛素0.5-200μg/mL、重组人转铁蛋白0.1-500ng/mL、葡萄糖0.1-10％(质量体积比，g/mL)、碳酸氢钠3mM和HEPES缓冲液5mM。1倍浓度的无血清培养添加物为干细胞培养最终浓度，为了更好的保存和添加到培养基中，优选地为10-200倍的保存浓度。高浓度储存更有利于保持其成分的活性。

优选地，无血清培养添加物溶液放置冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得到无血清培养添加物冻干粉，压盖密封后，放置2-8℃冰箱保存，便于储运和运输并有效期更长。

所述无血清培养添加物中含有可溶性胶原蛋白、活性蛋白和糖类，均可与I型和II型纤连蛋白结构域特异性结合，形成一个完整的细胞外基质环境，更有助于干细胞生长和生物学功能保持。

本发明还提供了一种细胞培养基质材料联合上述无血清培养添加物在低氧浓度条件协同培养干细胞的方法，其中，所述方法为从人组织中分离纯化得到的单细胞悬液，用40μm细胞筛过滤；所获得的细胞悬液1000转每分钟离心10分钟，细胞沉淀用1×PBS(pH7.4)洗涤1次，加入含1倍无血清培养添加物的细胞培养液重悬，苔盘兰染色计数后按1-10×10⁶细胞/mL加入到包被所述细胞培养基质材料的细胞培养器中；或者组织经眼科剪剪碎至1mm³左右，用1×PBS(pH 7.4)重悬后1000转每分钟离心10分钟，弃上清，组织沉淀含1倍无血清培养添加物的细胞培养液重悬，加入到包被所述细胞培养基质材料的细胞培养器中，于37℃，5％CO₂和低氧浓度1-10％的三气培养箱中生长48小时；

培养48小时后对干细胞换液，用5mL移液管吸弃培养液，加入含1倍无血清培养添加物的细胞培养液，在包被上述细胞培养基质材料的细胞培养器中继续放置37℃，5％CO₂和低氧浓度1-10％的三气培养箱中继续培养，间隔2天用新鲜培养液进行换液1次；

干细胞在细胞培养器中生长融合达到80％以上，用5mL移液管吸弃培养液，取1×PBS(pH 7.4)洗涤一次培养瓶底，加入质量体积比为0.25％胰酶(含质量体积比0.02％EDTA)到培养瓶中，放置37℃，5％CO₂培养箱中消化2-3分钟；消化后加入胎牛血清终止消化，再加入生理盐水，用5mL移液管吹打，吸至15mL离心管中，再用生理盐水洗涤一次，加入到同一个15mL离心管中，1000转每分钟离心5分钟收集干细胞；离心后用新鲜培养液重悬，计数，用5mL移液管加入新鲜的含1倍无血清培养添加物的细胞培养液，加入到1个新的包被所述细胞培养基质材料的细胞培养器中继续在37℃，5％CO₂和低氧浓度1-10％的三气培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜的含1倍无血清培养添加物的细胞培养液；待干细胞生长融合达到80％以上时，按上述经胰酶消化收集干细胞连续传代10代培养，获得10¹¹数量级以上的干细胞，用生理盐水重悬，苔盘兰染色计数，即获得干细胞，放置冰箱4℃存放备用；

部分干细胞用40％干细胞培养液、10％二甲基亚砜和50％胎牛血清组成的冻存液，储存在-196℃液氮罐中，以备今后复苏后使用。

所述人组织包括废弃脐带、脐血、胎盘、羊膜、脂肪、骨髓、皮肤、经血、牙齿、滑液、滑膜、宫内膜、脑组织、肝组织、胰腺和视网膜等，在其相应硬度的海藻酸钠水凝胶基质的培养器培养，制备得到相对应的干细胞，即脐带间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)、脐血间充质干细胞、胎盘亚全能干细胞、羊膜干细胞、脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞、骨髓内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)、表皮干细胞、皮肤成纤维干细胞、经血宫内膜祖细胞(Menstrual blood stem cells，MenSC)、牙髓干细胞、滑液间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、宫内膜干细胞、神经干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞和视网膜祖细胞等。

所述低氧培养条件为低氧浓度1-10％；优选地，选择低氧浓度1-5％。

所述传代培养30代后制备的干细胞，与低氧浓度条件下培养的第10代干细胞相比，具有更强细胞增殖速率和更高的克隆集落形成率，还保持干细胞良好的细胞形态、细胞表型，以及可分化相应的成体细胞；优选地，制备的干细胞在动物体内存活时间更长，具有很好干细胞特性。

本发明提供的一种基于改性海藻酸钠的细胞培养基质材料和无血清培养添加物，在低氧浓度条件下培养制备的干细胞，包括所述的细胞培养基质材料、无血清培养添加物的细胞培养液，在低氧浓度培养条件下培养的干细胞，可以制备成生物制品，用于疾病治疗的药物组合物。特别是在神经系统疾病、心脑血管疾病、骨科疾病、自身免疫疾病、糖尿病、肾病和医学整形等制备成细胞治疗产品，用于临床治疗。

附图说明

图1为实施例1制备的生物素修饰海藻酸钠水凝胶的细胞培养器扫描电子显微镜表面形貌图

图2为实施例3制备的抗人EGF和bFGF单链抗体与纤连蛋白融合蛋白蛋白印迹图

图3为生物素修饰的海藻酸钠水凝胶结合含细胞因子的纤连蛋白的细胞培养器示意图

图4为在实施例5制备的海藻酸钠水凝胶结合含EGF和bFGF的纤连蛋白的细胞培养器中在低氧浓度条件培养第10代、第20代和第30代间充质干细胞图

图5为在实施例5制备的海藻酸钠水凝胶结合含VEGF、IGF-1和EGF的纤连蛋白的细胞培养器中在低氧浓度条件培养第10代、第20代和第30代内皮祖细胞图

图6为在实施例5制备的海藻酸钠水凝胶结合含胰岛素和bFGF的纤连蛋白的细胞培养器中在低氧浓度条件培养第10代、第20代和第30代宫内膜干细胞图

图7为实施例7制备的第30代MSC和对照组制备的第10代MSC相比的细胞增殖曲线图

图8为实施例8制备的第30代EPC和对照组制备的第10代EPC相比的细胞增殖曲线图

图9为实施例9制备的第30代MenSC和对照组制备的第10代MenSC相比的细胞增殖曲线图

图10为实施例7制备的第30代间充质干细胞流式检测结果图

图11为倒置显微镜下观察的实施例7制备的第30代MSC成骨诱导3周细胞ALP染色图(A)，实施例8制备的第30代EPC形成网状结构图(B)，实施例9制备的第30代MenSC向软骨分化阿新蓝显阳性图(C)

图12为实施例7制备的P30-MSC与对照组P10-MSC移植后第4周空洞面积变化曲线图

图13为实施例7制备的P30-MSC与对照组P10-MSC移植后第4周倒置荧光显微镜下观察到的绿色荧光图

具体实施方式

如本文所用，术语“海藻酸钠”是从海带、马尾藻等褐海藻中分离得到的一种天然多聚糖，属于阴离子型共聚物，具有很好的生物相容性与低毒性，而且有很强的成凝胶能力。海藻酸钠与壳聚糖可迅速发生交联反应，生成凝胶。利用这种性质，海藻酸钠与壳聚糖形成的凝胶具有热不可逆性，凝胶性能不受温度影响，可进行加热灭菌和微波炉等处理。

海藻酸钠作为一种线性高分子，有三个链段通过糖苷键连接而成，分子每个结构单元中有两个仲羟基，这些仲羟基都具有醇羟基的反应性能。本发明中通过羧基按1∶0.1-0.5摩尔比标记上生物素，在戊二醛作用下与水溶性壳聚糖可以发生交联反应形成水凝胶。

所述海藻酸钠水凝胶为生物素修饰的海藻酸钠，采用与水溶性壳聚糖和戊二醛进行交联反应得到海藻酸钠水凝胶，呈多孔结构，硬度在0.2-50kPa，连续均匀在细胞培养器表面形成0.5-5mm薄膜。制备成海藻酸钠水凝胶细胞培养器，可用于适宜在特定硬度下生长的不同干细胞，如在0.1-1kPa硬度下适宜培养脂肪、肝、肺、胚胎、脂肪、神经部位的干细胞；在2-12kPa硬度下适宜培养肌肉、心脏部位的干细胞。

如本文所用，术语“纤连蛋白”是一个高分子量糖蛋白，其亚单位相对分子质量为22万-25万。各亚单位在C端形成二硫键交联，形成二聚体或者多聚体，即纤连蛋白的每个亚单位由数个结构域构成，具有与细胞表面受体、胶原、纤维蛋白和硫酸蛋白多糖高亲和性的结合部位等的六个功能区，发现这一结构域中RGD三肽序列是细胞识别的最小结构单位。

特别是纤连蛋白具有与抗体相似的结构域，在III型结构域存在可变区，可***抗体互补决定区，可与目的蛋白产生抗原抗体反应并特异性结合。利用这一特点，我们在III型纤连蛋白结构域进行基因重组***鼠抗人细胞因子scFv，从而可以特异性结合细胞因子。同时利用I型和II型纤连蛋白结构域中特异性结合可溶性胶原蛋白的区域，加入可溶性胶原蛋白以特异结合纤连蛋白，形成近似细胞外基质的细胞生长环境。

所述结合细胞因子的链霉亲和素修饰纤连蛋白为通过对纤连蛋白基因重组，在其III型结构域可变区基因重组***为鼠抗人细胞因子scFv的序列，通过在大肠杆菌宿主中表达，获得可结合细胞因子蛋白的纤连蛋白，并进行链霉亲和素修饰，加入细胞因子结合到纤连蛋白上，亲和常数可达到5×10⁷以上的K_aff值。

以细胞因子N端结构域作为免疫抗原，弗氏完全佐剂与抗原乳化后Balb/c小鼠腹腔加皮内多点注射，2周后断尾采血测抗体效价，选择酶联免疫吸附测定(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)血清抗体效价检测，选择ELISA血清抗体效价检测达1∶10⁴以上的Balb/c小鼠用于融合，融合前3d，不加佐剂抗原腹腔加强免疫注射1次，50μg/只，然后分离纯化得到免疫脾细胞。以正常Balb/c小鼠脾细胞为饲养细胞(2×10⁵/孔)，取对数生长期的骨髓瘤细胞株SP2/0 1×10⁷个细胞与免疫脾细胞1×10⁸个细胞按常规方法用500mL/LPEG进行融合，用间接ELISA法检测培养上清液，选择强阳性克隆，再经抗体纯化并鉴定抗体特异性和亲和力后，获得特异性的单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)及其杂交瘤细胞。该技术流程属本领域技术人员均熟知的。

据小鼠抗体V区及CHl区序列，参照Orland等小鼠抗体家族设计引物，并根据VH不同的亚类分别设计扩增重链可变区引物和轻链可变区引物各1对，提取筛选得到的特异性杂交瘤细胞总RNA并逆转录互补DNA后，通过聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction，PCR)分别扩增获得重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)基因片段。同时也可以设计引物将重链和轻链的可变区PCR技术重组在一起，形成单链抗体基因片段(V_H-Linker-V_L)。获得的可变区或单链抗体基因片段再通过PCR技术重组到纤连蛋白III型结构域可变区，然后克隆到质粒中，测序验证基因序列正确后，在大肠杆菌中进行重组蛋白表达。经蛋白纯化后获得纤连蛋白与鼠抗人细胞因子scFv的融合蛋白，并采用链霉亲和素标记试剂盒进行链霉亲和素修饰，最终得到链霉亲和素标记的含鼠抗人细胞因子scFv的纤连蛋白。

在生物素修饰的海藻酸钠水凝胶中，加入摩尔数比1∶1-5的上述链霉亲和素标记的含鼠抗人细胞因子scFv的纤连蛋白，利用生物素与链霉亲和素具有特异性的结合，因而海藻酸钠凝胶表面特异结合了含鼠抗人细胞因子scFv的纤连蛋白。

本发明还提供了一种制备改性海藻酸钠水凝胶的方法，其特征在于，包含如下步骤：

第一步，海藻酸钠通过羧基按比例标记上生物素，在戊二醛与水溶性壳聚糖交联反应得到了海藻酸钠水凝胶；

第二步，细胞因子N端结构域作为免疫抗原接种小鼠后经效价检测的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，培养后筛选获得高效价和特异性的单克隆抗体及其杂交瘤细胞；通过DNA聚合酶链式反应获得抗人细胞因子的scFv基因片段；

第三步，通过PCR技术将scFv基因片段克隆到纤连蛋白基因3’端可变区，然后诱导表达含鼠抗人细胞因子scFv的纤连蛋白融合蛋白；链霉亲和素标记含鼠抗人细胞因子scFv的纤连蛋白，得到链霉亲和素化含鼠抗人细胞因子scFv的纤连蛋白；

第四步，通过生物素与链霉亲和素特异结合，将鼠抗人细胞因子scFv的纤连蛋白结合到海藻酸钠水凝胶上，制备成所述改性海藻酸钠水凝胶。

如本文所用，术语“细胞培养基质”是由天然高分子材料如壳聚糖、丝素蛋白和胶原蛋白等制备成细胞生长材料，具有异体抗原性弱、生物相容性好、可生物降解且能促进细胞粘附、生长和增殖等。任选地，当加入与含鼠抗人细胞因子scFv的纤连蛋白等摩尔数的细胞因子，在冰箱4℃结合过夜后，弃溶液，在无菌环境下充分晾干，即含抗细胞因子scFv的纤连蛋白特异结合了该细胞因子，制备成海藻酸钠水凝胶结合含细胞因子的纤连蛋白的细胞培养基质材料。

所述可结合到重组纤连蛋白的细胞因子，包括表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子、肝细胞因子、血小板衍生生长因子、胰岛素、***、神经生长因子、角细胞因子和干细胞因子等，优选地，干细胞培养常用的细胞因子，即表皮生长因子和碱性成纤维生长因子。

如本文所用，术语“细胞培养器”是由高分子材料制成的细胞培养器材，主要材质为聚苯乙烯、聚氯乙烯材质和聚乙烯等。本发明还提供了一种细胞培养器，将所述的改性海藻酸钠水凝胶放入细胞培养器，连续均匀在细胞培养器表面形成0.5-5mm薄膜，然后加入细胞因子，所述细胞因子可特异结合到改性海藻酸钠水凝胶，从而制备得到所述细胞培养基质材料；优选，所述细胞因子可特异结合到改性海藻酸钠水凝胶中纤连蛋白上的鼠抗人细胞因子scFv。

所述细胞培养器采用各种直径的细胞培养皿(如35mm、60mm、90mm、100mm、150mm和245mm方形的等)、各种规格的细胞培养瓶(如25cm²、75cm²、150cm²、175cm²和225cm²的等)、各种大小的细胞培养板(如96孔、24孔、12孔、6孔和4孔等)、多层细胞培养瓶(如2层、3层、4层和5层等)以及多层细胞培养器(如1层式、2层式、5层式、10层式和40层式等)，均使用有助于干细胞生长的聚苯乙烯材质。

所述细胞培养器真空密封后，可放置在2-8℃、-10℃、-20℃、-56℃和-86℃等保存，优选地，放置在-20℃保存，有限期为6个月。

如本文所用，术语“无血清培养添加物”是一种不添加任何动物血清，提供营养物质，例如氨基酸、维生素、脂类、胆固醇、葡萄糖和/或生长因子，帮助细胞生长的营养成分。本发明所述无血清培养添加物中含有可溶性胶原蛋白、活性蛋白和糖类，均可与I型和II型纤连蛋白结构域特异性结合，形成一个完整的细胞外基质环境，更有助于干细胞生长和生物学功能保持。

本发明提供了一种干细胞培养的无血清培养添加物，其中，所述无血清培养添加物为1倍浓度，其包括含如下成分：

1)可溶性胶原蛋白：0.5-1000ng/mL；

2)乳酸：0.1-200mmol/L；

3)维生素A：0.1-500μmol/L；

4)2-磷酸-L-抗坏血酸：0.5-500ng/mL；

5)重组人血白蛋白：0.5-200μg/mL；

6)重组人胰岛素：0.5-200μg/mL；

7)重组人转铁蛋白：0.1-500ng/mL；

8)葡萄糖：0.1-10％(质量体积比)；

9)碳酸氢钠：3mM；

10)HEPES缓冲液：5mM。

优选地为10-200倍浓度，所述无血清培养添加物使用玻璃瓶或塑料瓶灌装，根据不同规格要求灌装体积5-100mL，拧盖和密封后，可放置在2-8℃、-10℃、-20℃、-56℃和-86℃等保存，优选地，放置在-86℃保存，有限期为12个月。

优选地，灌装的西林瓶或塑料瓶放置冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得到无血清培养添加物冻干粉，压盖密封后，放置2-8℃冰箱保存，便于储运和运输并有效期更长。

根据上述发明内容，本发明还提供了一种上述细胞培养基质材料在低氧浓度条件培养干细胞的方法，其中，所述方法为从人组织中分离纯化得到的单细胞悬液，用40μm细胞筛过滤；所获得的细胞悬液1000转每分钟离心10分钟，细胞沉淀用1×PBS(pH 7.4)洗涤1次，加入含1倍无血清培养添加物的细胞培养液重悬，苔盘兰染色计数后按1-10×10⁶细胞/mL加入到包被所述细胞培养基质材料的细胞培养器中；或者组织经眼科剪剪碎至1mm³左右，用1×PBS(pH 7.4)重悬后1000转每分钟离心10分钟，弃上清，组织沉淀含1倍无血清培养添加物的细胞培养液重悬，加入到包被所述细胞培养基质材料的细胞培养器中，于37℃，5％CO₂和低氧浓度1-10％的三气培养箱中生长48小时；

培养48小时后对干细胞换液，用5mL移液管吸弃培养液，加入含1倍无血清培养添加物的细胞培养液，在包被上述细胞培养基质材料的细胞培养器中继续放置37℃，5％CO₂和低氧浓度1-10％的三气培养箱中继续培养，间隔2天用新鲜培养液进行换液1次；

干细胞在细胞培养器中生长融合达到80％以上，用5mL移液管吸弃培养液，取1×PBS(pH 7.4)洗涤一次培养瓶底，加入质量体积比为0.25％胰酶(含质量体积比0.02％EDTA)到培养瓶中，放置37℃，5％CO₂培养箱中消化2-3分钟；消化后加入胎牛血清终止消化，再加入生理盐水，用5mL移液管吹打，吸至15mL离心管中，再用生理盐水洗涤一次，加入到同一个15mL离心管中，1000转每分钟离心5分钟收集干细胞；离心后用新鲜培养液重悬，计数，用5mL移液管加入新鲜的含1倍无血清培养添加物的细胞培养液，加入到1个新的包被所述细胞培养基质材料的细胞培养器中继续在37℃，5％CO₂和低氧浓度1-10％的三气培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜的含1倍无血清培养添加物的细胞培养液；待干细胞生长融合达到80％以上时，按上述经胰酶消化收集干细胞连续传代10代培养，获得10¹¹数量级以上的干细胞，用生理盐水重悬，苔盘兰染色计数，即获得干细胞，放置冰箱4℃存放备用。

部分干细胞用40％干细胞培养液、10％二甲基亚砜和50％胎牛血清组成的冻存液，储存在-196℃液氮罐中，以备今后复苏后使用。

所述人组织包括废弃脐带、脐血、胎盘、羊膜、脂肪、骨髓、皮肤、经血、牙齿、滑液、滑膜、宫内膜、脑组织、肝组织、胰腺和视网膜等，在其相应硬度的海藻酸钠水凝胶基质的培养器培养，制备得到相对应的干细胞，即脐带间充质干细胞、脐血间充质干细胞、胎盘亚全能干细胞、羊膜干细胞、脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞、骨髓内皮祖细胞、表皮干细胞、皮肤成纤维干细胞、经血宫内膜祖细胞、牙髓干细胞、滑液间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、宫内膜干细胞、神经干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞和视网膜祖细胞等。

所述低氧培养条件为低氧浓度1-10％；优选地，选择低氧浓度1-5％。所述传代培养30代后制备的干细胞，与低氧浓度条件下培养的第10代干细胞相比，在本发明条件培养间充质干细胞倒置显微镜观察具有很好的细胞形态，流式细胞仪检测细胞表型符合要求；体外增殖能力分析表明其更好的增殖活性；干细胞集落形成实验形成了明显的干细胞克隆集落；体外分化能力分析也表明其能分化为相应的成体细胞；优选，干细胞治疗脊髓损伤动物模型的体内实验中，脊髓损伤行为学评分显著提高，促进脊髓损伤大鼠运动功能恢复，更有助于大鼠脊髓损伤空洞修复，而且绿色荧光蛋白转染干细胞在动物体内实验中发现其存活时间更长。

所述的细胞培养液为商业上可购买到的，包括Gibco公司MEM alpha与DMEM/F12(1∶1)培养基、Lonza公司EBM-2 Basal Medium-2与UltraCULTURE^TM无血清培养基、Gibco公司Neurobasal^TM培养基、BIOWIT公司无血清培养基、Irvine公司CHANG培养基、Cyagen Biosciences公司OriCell^TM无血清培养基、R&D公司StemXVivo无血清培养基和Thermo Fisher公司无血清培养基等。

本发明提供的一种改性海藻酸钠水凝胶，由可结合细胞因子的、且链霉亲和素修饰的纤连蛋白改性生物素偶联的海藻酸钠水凝胶制得；由其制备的细胞培养基质材料及其制备的细胞培养器，含可溶性胶原蛋白、乳酸、维生素A和2-磷酸-L-抗坏血酸在内的无血清培养添加物，以及在低氧浓度条件下用于培养干细胞的方法。特别地，模拟正常干细胞在机体内生长环境，从原代培养开始获得人干细胞，可以制备成生物制品，用于疾病治疗的药物组合物。特别是在神经系统疾病、心脑血管疾病、骨科疾病、自身免疫疾病、糖尿病、肾病和医学整形等制备成细胞治疗产品，用于临床治疗。

以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。

实施例1

生物素修饰的海藻酸钠的制备

取30g高粘度海藻酸钠(Sodium alginate，NaAlg，美国Sigma公司购买)溶解于100mL的BuphTm磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数；用含50mM NaCl的浓度为50mM的K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液(pH 7.5)将Sulfo-NHS-Biotin水溶性的生物素化试剂(美国ApexBio公司购买)溶解成100mM的溶液。取7.5mL Sulfo-NHS-Biotin溶液加入到海藻酸钠溶液中，磁力搅拌下室温中反应2h，溶液中的海藻酸钠被生物素化(NaAlg-Biotin)。生物素修饰海藻酸钠溶液可通过上海东富龙公司的冷冻干燥机-20℃下冷冻干燥，得到粉末，在2-8℃冰箱保存备用。

取上述生物素修饰海藻酸钠粉末1-10g，加入200mL去离子超纯水，在70℃恒温磁力搅拌直至粉末完全溶解；加入100g/L戊二醛至质量体积比为0.1-3％，70℃温度下混匀后，向混合液中加入质量体积比为0.1-5％水溶性壳聚糖溶液200mL，70℃恒温磁力搅拌混匀后，加入到平皿中，冷却后在底部形成水凝胶。

取制备好的水凝胶，其大小为3cm×2cm×0.3cm，经-70℃下冷冻干燥后，贴在金属台上，对其喷金，采用TM 3000型扫描电子显微镜(日本日立公司)观察表面形貌，见图1。图1A为硬度为0.54kPa凝胶的扫描电子显微镜表面形貌图，B为硬度为3.20kPa凝胶的扫描电子显微镜表面形貌图，C为硬度为8.10kPa凝胶的扫描电子显微镜表面形貌图。

质构仪(QTS-25 Texture Analyser，英国Stable Micro System公司)上的圆柱形探头(直径为6mm)以15mm/min的速度下降，当从水凝胶表面向下压6mm时，测得生物素修饰海藻酸钠水凝胶的硬度。样品测试3次，取其平均值。不同浓度的生物素修饰海藻酸钠、戊二醛和水溶性壳聚糖交联后形成不同的水凝胶硬度，结果见表1。

表1

实施例2

细胞因子单克隆抗体制备及其杂交瘤细胞获得

以细胞因子EGF和bFGF为例，将基因克隆表达得到的1mg人细胞因子N端片段(约2kD)，溶于1mL生理盐水中，与等体积的弗氏完全佐剂混匀，经小鼠腹腔加皮内多点注射免疫Balb/c小鼠，抗原用量为每只0.03mL，经3次免疫后，2周后断尾采血测抗体效价，选择ELISA检测血清抗体效价。OD值大于或等于阴性对照(小鼠免疫前血清1∶10倍稀释)的2.1倍时视为抗细胞因子抗体阳性，呈抗体阳性的最大稀释倍数即为抗体效价，如血清效价达1∶10⁴，即可准备细胞融合。融合前3d，不加佐剂抗原腹腔加强免疫注射1次，50μg/只，然后取免疫小鼠的脾脏，分离纯化得到免疫脾细胞。

取对数生长期的骨髓瘤细胞株SP2/0 1×10⁷个细胞与获得的免疫脾细胞1×10⁸个细胞，按1∶1.8在50％PEG(MW2000)0.7mL中融合。用显微挑选法进行克隆化，选择单细胞克隆的上清，按间接ELISA筛选阳性克隆(以0.01mol/L pH9.6的磷酸盐缓冲液包被重组人EGF或bFGF，每孔5ug/mL的免疫小鼠血清为阳性对照，未被免疫的小鼠血清为阴性对照。OD值高于2-10倍者为阳性杂交瘤)。经2-3次克隆化且连续3次均为阳性者为阳性杂交瘤细胞株，这样我们获得小鼠抗人EGF mAb的杂交瘤细胞株3株(anti-EGF-A2、anti-EGF-B1和anti-EGF-D7)，以及小鼠抗人bFGFmAb的杂交瘤细胞株4株(anti-bFGF-A2、anti-bFGF-B2、anti-bFGF-C3和anti-bFGF-C8)，

每只小鼠腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞，腹腔注射1ml/只制备腹水，10-12天后小鼠腹部膨大用12号无菌针头腹部穿刺挤压放出腹水，收集至无菌离心管。隔天穿刺一次直至小鼠死亡。腹水先用饱和硫酸铵初纯化后，再用Protein A-Sepharose柱(美国BioVision公司购买)纯化抗体。采用蛋白印迹(Western blotting)方法鉴定抗体特异性，即将购买的重组人EGF或bFGF(美国R&D公司)和5×上样缓冲液按5∶1混合，煮沸5min。配制5％积沉胶，12％分离胶，每孔上样量约为10ng。电泳：80V恒压50分钟，120V恒压电泳至溴酚蓝刚出胶底部止；PVDF膜甲醇预处理3-5秒，放至转印液浸润半小时。取出凝胶，将其放至滤纸上，形成凝胶转印堆积层并去除气泡。冰浴低温条件下，100V恒压转膜60～120分钟。取出杂交膜，TBST漂洗5分钟，三次；5％脱脂奶粉溶液室温封闭1小时；TBST洗膜5min，三次。加入按照1000倍稀释的一抗(anti-EGF-A2、anti-EGF-B1和anti-EGF-D7，以及anti-bFGF-A4、anti-bFGF-B2、anti-bFGF-C3和anti-bFGF-C8)，4℃过夜。TBST洗膜5min，三次；二抗稀释液37℃孵育1h；TBST洗膜5min，三次；蒸馏水漂洗膜2min，弃去液体。共洗三次。将杂交膜置于一个透明塑料板上，用干净移液器将化学荧光发光底物均匀地加到膜的表面，并使反应持续5min。用滤纸吸去膜表面多余的ECL发光液，通过美国Bio-Rad公司的ChemiDoc MP全能型凝胶成像分析进行曝光成像。结果显示小鼠抗人EGF的3株杂交瘤分泌的mAb均能与相对6.2kDa的EGF条带显色，即anti-EGF-A2、anti-EGF-B1和anti-EGF-D7；小鼠抗人bFGF的3株杂交瘤分泌的mAb能与相对17kDa的bFGF条带显色，即anti-bFGF-A2、anti-bFGF-B2和anti-bFGF-C3。

采用间接ELISA法测定，将1、0.5μg/mL抗原分别以100μL包被96孔板，加入倍比稀释的mAb 100μL/孔，37℃水浴30min，洗涤4遍，空干；再加入辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase，HRP)标记羊抗小鼠抗体IgG(1∶20000稀释)100μL/孔，37℃水浴30min，洗涤4遍，空干；加底物显色液100μL/孔，室温避光5-10min；终止液100μL/孔，立即在酶标仪上显色测OD492nm值，以抗体浓度的对数为横坐标，以OD492nm值为纵坐标，每种mAb得出两条反应曲线，以每条曲线上部平坦段作为100％，在曲线上找出50％OD492nm值时相对应的抗体浓度，按推导公式计算亲和常数，推导公式如下：K_aff＝(n-1)/2(n[ab’]t-[ab]t)。检测结果见表2。

表2

由上表可见，筛选得到亲和常数合适的小鼠抗人EGF杂交瘤细胞为anti-EGF-A2和anti-EGF-B1；小鼠抗人bFGF杂交瘤细胞为anti-bFGF-A2、anti-bFGF-B2和anti-bFGF-C3。

实施例3

含抗细胞因子scFv的纤连蛋白重组基因构建与融合蛋白表达

选择anti-EGF-A2或anti-bFGF-B2杂交瘤细胞在RPMI-1640(含20％胎牛血清、1倍双抗和2mM L-谷氨酰胺)进行增殖培养，将获得5×10⁶的杂交瘤细胞采用RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司购买)提取杂交瘤细胞总RNA。用cDNA第一链合成试剂盒(美国Promega公司)合成cDNA第一链，-86℃冰箱保存，备用。

据鼠抗体V区及CHl区序列，参照Orland等鼠抗体家族设计引物，并根据V_H不同的亚类分别设计扩增重链可变区引物和轻链可变区引物各1对(由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成)。

重链可变区上游引物(V_H1)：

5’-GGAATTC AGATCT CAG GTY CAG CTY GAG CAR TC-3’，5’端画线处引入了BglII酶切位点；

重链可变区下游引物(V_H2)：5′-A CCG CCG GAT CCA CCG CCA CCG AGC CCA CCG CCA CCT AGG AGA CGG TGA CCG TGG-3′。

轻链可变区上游引物(V_L1)：5’-GGC TCG GGC GGT GGT GGT TCG GGT GGC GGC GGA TCT GAC ATT GTG ATG ACC CAG WT-3’。

轻链可变区下游引物(V_L2)：5’-ATAAGAAT TTCGAA GTG CAC TGG TGC AGC CACAGT CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT C-3’，5’端画线处引入了Hind III酶切位点。

以上述合成的cDNA为模板，分别以重链可变区和轻链可变区上下游引物，进行V_H和V_L基因扩增。再采用重叠延伸拼接(splice-overlap extension，SOE)PCR方法构建scFv。先以linker和V_L2为引物，纯化回收的V_L基因片段为模板，PCR扩增得到V_L-linker片段。反应体系为：引物浓度均为20μmol，各加入1μL，质粒模板1μL，ddH₂O 12.75μL，Hot Start Taq酶0.25μL，总体积20μL。再以V_H1和V_L2为引物，纯化回收的V_H基因片段和V_L-linker片段为模板，SOE PCR扩增得到V_H-linker-V_L结构基因片段。反应体系为：引物浓度均为20μmol，各加入2μL，质粒模板各加人3μL，10×PCR缓冲液5μL，10mM dNTP混合物0.5μL，ddH2O 29.5μL，Hot Start Taq酶0.5μL，总体积50μL。反应条件为：95℃5min，95℃60sec，49℃，50sec，72℃60sec，5个循环后再进行95℃5min，95℃60sec，67℃，50sec，72℃60sec，25个循环后再延伸10min。PCR产物经琼脂糖电泳后切胶，用天根生化科技(北京)有限公司凝胶回收试剂盒回收DNA片段。

将纯化回收后的scFv基因片段***pLNCX2(美国Biovector公司)中。将两者使用Bgl II和Hind III(美国Thermo Fisher公司)各2U，16℃进行双酶切3h后，T4 DNA连接酶进行连接，反应体系(10μL)：pLNCX2 3μL，scFv 4μL，10×连接缓冲液1μL，T4 DNA连接酶(大连TAKARA公司)1μL，ddH₂O 1μL，混匀并离心，置室温连接1h；转入50μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，经蓝白筛选、氨苄青霉素筛选后挑选克隆进行PCR鉴定和双酶切鉴定。鉴定正确的克隆(scFv-pLNCX2)在LB培养基中摇菌，将鉴定正确的菌液送上海生工测序。

测序结果显示抗EGF的V_L基因片段为330bp，编码110个氨基酸；V_H基因片段为351bp，编码117个氨基酸；组装EGF-scFv基因片段大小为726bp。抗bFGF的V_L基因片段为333bp，编码111个氨基酸；V_H基因片段为342bp，编码114个氨基酸；与已知抗体的V_H、V_L基因相符，组装bFGF-scFv基因片段大小为720bp。

设计全长纤连蛋白(fibronectin，FN)一对引物(由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成)，即FN1正链引物：5’-GC GGATCC TAC GAA TCC CCA GGC C-3’，5’端画线处引入了BamH I酶切位点。

FN2反链引物：5’-GGC TTCGAA G TTA GCA GAC CCA GCT-3’，5’端画线处引入了Hind III酶切位点。

人细胞系Hs578T(美国ATCC生物资源中心)，依据上述方法提取总RNA和逆转录为cDNA第一链，以FN1和FN2为引物，cDNA为模板，PCR扩增得到FN全长基因片段。反应体系为：引物浓度均为20μmol，各加入1μL，质粒模板1μL，10×PCR缓冲液2.5μL，10mM dNTP混合物0.2μL ddH₂O 12.75μL，Hot Start Taq酶0.25μL，总体积20μL；反应条件为：95℃5min，95℃60sec，49℃，50sec，72℃60sec，5个循环后再进行95℃5min，95℃60sec，67℃，50sec，72℃60sec，25个循环后再延伸10min。PCR产物经琼脂糖电泳后切胶，用天根生化科技(北京)有限公司凝胶回收试剂盒回收DNA片段。

FN基因片段和pLNCX2载体使用BamH I和Hind III(美国Thermo Fisher公司)各2U，16℃进行双酶切3h后；消化后的片段通过T4 DNA连接酶连接。反应体系(10μL)：pLNCX23μL，FN 4μL，10×连接缓冲液1μL，T4 DNA连接酶1μL，ddH₂O 1μL，混匀并离心，置室温连接1h。转入50μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，经蓝白筛选、氨苄青霉素筛选后挑选克隆进行PCR鉴定和双酶切鉴定。鉴定正确的克隆(FN-pLNCX2)在LB培养基中摇菌，将鉴定正确的菌液送上海生工测序。

测序结果显示FN基因片段为6972bp，编码2324个氨基酸，与已知抗体的FN基因相符。

将scFv-pLNCX2和FN-pLNCX2使用Bgl II和Hind III各2U，16℃进行双酶切3h后，酶切后产物经0.8％(质量体积比)琼脂糖电泳后切胶，用天根生化科技(北京)有限公司凝胶回收试剂盒回收scFv和酶切掉3’端可变区的FN-pLNCX2 DNA片段，将纯化的两者采用T4DNA连接酶进行连接，反应体系(10μL)：pLNCX2 3μL，scFv 4μL，10×连接缓冲液1μL，T4 DNA连接酶1μL，ddH₂O 1μL，混匀并离心，置室温连接1h；转入50μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，经蓝白筛选、氨苄青霉素筛选后挑选克隆进行PCR鉴定和双酶切鉴定。鉴定正确的克隆(FN(scFv)-pLNCX2)在LB培养基中摇菌，将鉴定正确的菌液送上海生工测序。

测序结果显示FN(EGF-scFv)基因片段约为6612bp左右，编码2204个氨基酸；FN(bFGF-scFv)基因片段约为6606bp左右，编码2202个氢基酸。

将鉴定正确的重组克隆FN(scFv)-pLNCX2接种于含氨苄青霉素100g/L的2×YT培养基中，37℃过夜250r/min振荡培养10h，按1：100接种于2×YTA培养基中，30℃培养至A600值至1.0左右，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，30℃诱导培养。将诱导后菌液转移至离心管中，室温下4000r/min离心20min，收集菌体，将菌体沉淀重悬于预冷的50mmol/L Tris-HCl(pH7.0)、100mmol/L NaCl及1mmol/L EDTA中，经超声破碎细胞后，以13000r/min于4℃离心30min。取沉淀用3mol/L尿素、50mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)洗涤后，同上离心收集包涵体。将包涵体溶解于6mol/L盐酸胍和0.1mol/L Tris-HCl(pH 7.0)中，于4℃摇动过夜。13000r/min于4℃离心30min后，收集上清，通过用TALON metal affinity resin亲和层析柱(美国Pall公司)纯化目的蛋白。将纯化蛋白对TEA缓冲液(0.4mol/L精氨酸、0.1mol/L Tris-HCl(pH7.0)及2mmol/L EDTA)透析复性24h后，再继续对1×PBS(pH 7.4)透析24h。通过超滤浓缩样品至适当体积后，用BCA蛋白定量试剂盒(美国Bio-Rad公司)测定蛋白含量，获得融合蛋白分别为重组小鼠抗人EGF单链抗体的纤连蛋白FN(EGF-scFv)或重组小鼠抗人bFGF单链抗体的纤连蛋白FN(bFGF-scFv)，蛋白定量后分装到无菌西林瓶或塑料瓶中，置-80℃保存；或者将分装好的无菌西林瓶或塑料瓶在冷冻干燥机中-20℃下冷冻干燥，得到粉末，在-20℃冰箱保存备用。

采用SDS-PAGE蛋白凝胶电泳进行鉴定重组表达产物分子量大小，具体实验步骤见实施例2，考马斯亮蓝R250染色，结果显示，与蛋白分子量标志物(艾美捷科技有限公司购买)相比，重组表达产物FN(EGF-scFv)或FN(bFGF-scFv)对应的分子量为24kDa左右，与预测的蛋白分子量相一致。

采用蛋白印迹(Western blotting)方法鉴定抗体特异性，具体实验步骤见实施例2。图2结果显示FN(EGF-scFv)能与相对6.2kDa的EGF条带显色；FN(bFGF-scFv)能与相对17kDa的bFGF条带显色，泳道1为购买的EGF或bFGF单克隆抗体(美国Abcam公司购买)作为对照，泳道2、3和4为不同稀释倍数的FN(EGF-scFv)或FN(bFGF-scFv)，即4000倍、2000倍和500倍，表明制备的FN(EGF-scFv)或FN(bFGF-scFv)均具有特异结合相应的细胞因子。

采用间接ELISA法测定FN(EGF-scFv)或FN(bFGF-scFv)亲和特性，使用辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记羊抗小鼠FN抗体进行标记和显色反应，具体实验步骤参见实施例2，按推导公式计算亲和常数，推导公式如下：K_aff＝(n-1)/2(n[ab’]t-[ab]t)。检测结果见表3。

表3

由上表可见，基因重组表达的FN(EGF-scFv)或FN(bFGF-scFv)分别与EGF或bFGF具有很好的亲和性，能与EGF或bFGF特异结合。

使用链霉亲和素(streptavidin，SA)偶联试剂盒(美国Abcam公司购买)进行标记重组单链抗体的纤连蛋白的氨基，即5mg/mL FN(EGF-scFv)或FN(bFGF-scFv)先用0.6mmol/L四氢呋喃和0.5mmol/L醋酸，于25℃反应1h，进行羧基保护。根据链霉亲和素偶联试剂盒使用说明书，将1μL调节剂加入到FN(EGF-scFv)或FN(bFGF-scFv)液体，轻轻混匀；打开链霉亲和素混合液的瓶盖，并将FN(EGF-scFv)或FN(bFGF-scFv)液体直接滴到冻干材料上，用1个枪头吸取和吹打1-2次，轻轻重悬；盖上瓶盖后室温下静置3h，偶联后每10μL液体加入1μL淬灭剂，轻轻混匀后静置30min；再使用1mmol/L三氟化硼反应4h，脱去酯保护基。将链霉亲和素偶联的FN(EGF-scFv)或FN(bFGF-scFv)，即SA-FN(EGF-scFv)或SA-FN(bFGF-scFv)使用1×PBS(pH＝7.4)在透析袋中透析过夜；过夜后用BCA蛋白定量试剂盒(美国Bio-Rad公司)确定蛋白含量，用1×PBS(pH＝7.4)按照2mg/mL浓度稀释，并分装分装到无菌西林瓶或塑料瓶中，置-80℃保存；或者将分装好的无菌西林瓶或塑料瓶在冷冻干燥机中-20℃下冷冻干燥，得到冻干粉，在-20℃冰箱保存备用。

实施例4

细胞培养基质材料的制备

根据实施例1制备硬度为0.5kPa左右的生物素修饰的海藻酸钠水凝胶，1cm²水凝胶，生物素修饰的海藻酸钠摩尔数分别为0.5μmol加入制备好的0.03mmol/mL SA-FN(EGF-scFv)、SA-FN(bFGF-scFv)16μl、或SA-FN(EGF-scFv)和SA-FN(bFGF-scFv)各8μl，再加入用含1×免疫促进剂(日本Wako公司购买)的1×PBS(pH＝7.4)分别稀释的0.03mmol/mL重组人EGF或0.03mmol/mL重组人bFGF 16μL，或等体积的两者；密封后先放置37℃培养箱中孵育1h，然后放置4℃冰箱中孵育过夜；第二天吸弃上清，使用1×PBS(pH＝7.4)洗涤3次，每次5min，最后超净台中室温充分晾干，真空包装后即制备成生物素修饰海藻酸钠含细胞因子的纤连蛋白的细胞培养基质材料。

实施例5

生物素修饰海藻酸钠结合含细胞因子的纤连蛋白的细胞培养皿和培养瓶的制备

根据实施例1制备硬度为0.5kPa左右的生物素修饰的海藻酸钠加入到细胞培养器，每cm²加入20μL，左右上下摇动，使得混合液在底面均匀铺满，室温静置60min后在细胞培养器底面形成约1mm左右的水凝胶。

如常用的100mm细胞培养皿、75cm²细胞培养瓶和6孔板等(均购买美国Corning公司)，其生长面积分别为55cm²、75cm²和9.6cm²/孔，使用生物素修饰的海藻酸钠摩尔数分别为0.017mmol、0.023mmol和0.003mmol/孔，用1×PBS(pH＝7.4)分别稀释SA-FN(EGF-scFv)或SA-FN(bFGF-scFv)至0.03mmol/mL，向培养器中分别加入850μL、1150μL和155μL/孔，或者0.03mmol/mL SA-FN(EGF-scFv)和0.03mmol/mL SA-FN(bFGF-scFv)等体积加入到培养器中，密封后先放置室温中反应2h，使用1×PBS(pH＝7.4)洗涤3次，每次5min，最后37℃充分晾干，细胞培养器密封后经伽马射线照射灭菌，真空包装后即制备成生物素修饰海藻酸钠含抗细胞因子scFv的纤连蛋白的细胞培养器(NaAlg-Biotin-SA-FN(EGF-scFv)、NaAlg-Biotin-SA-FN(bFGF-scFv)或NaAlg-Biotin-SA-FN(EGF-scFv)/FN(bFGF-scFv))，放置室温避光下保存，备用。

制备好的NaAlg-Biotin-SA-FN(EGF-scFv)、NaAlg-Biotin-SA-FN(bFGF-scFv)或NaAlg-Biotin-SA-FN(EGF-scFv)/FN(bFGF-scFV)细胞培养器，加入用含1×免疫促进剂(日本Wako公司购买)的1×PBS(pH＝7.4)分别稀释的0.03mmol/mL重组人EGF或0.03mmol/mL重组人bFGF，分别为850μL、1150μL和155μL/孔，或等体积的两者；密封后先放置37℃培养箱中孵育1h，然后放置4℃冰箱中孵育过夜；第二天吸弃上清，使用1×PBS(pH＝7.4)洗涤3次，每次5min，最后超净台中室温充分晾干，真空包装后即制备成生物素修饰海藻酸钠含细胞因子的纤连蛋白的细胞培养器(NaAlg-Biotin-SA-FN(EGF)、NaAlg-Biotin-SA-FN(bFGF)或NaAlg-Biotin-SA-FN(EGF)/FN(bFGF))，放置2-8℃避光下保存，备用。

采用制备的NaAlg-Biotin-SA-FN(EGF-scFv)或NaAlg-Biotin-SA-FN(bFGF-scFv)96孔板通过夹心法ELISA法测定其亲和特性，加入倍比稀释的重组人EGF或bFGF 100μL/孔，37℃培养箱孵育30min，洗涤4遍，空干；再加入小鼠抗人EGF或bFGF抗体(1∶5000稀释)100μL/孔，37℃培养箱孵育60min，洗涤4遍，空干；再加入辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase，HRP)标记羊抗鼠IgG(1∶20000稀释)100μL/孔，37℃水浴30min，洗涤4遍，空干，加底物显色液100μL/孔，室温避光5-10min；终止液100μL/孔，立即在酶标仪上显色测OD492nm值，以抗原浓度的对数为横坐标，以OD492nm值为纵坐标，每种EGF或bFGF得出两条反应曲线，以每条曲线上部平坦段作为100％，在曲线上找出50％OD492nm值时相对应的抗原浓度，按推导公式计算亲和常数，推导公式如下：K_aff＝(n-1)/2(n[ab’]t-[ab]t)。检测结果见表4。

表4

由上表可见，基因重组表达的FN(EGF-scFv)或FN(bFGF-scFv)分别与EGF或bFGF具有很好的亲和性，能与EGF或bFGF特异结合。

图3为生物素修饰的海藻酸钠水凝胶细胞培养器，通过生物素结合链霉亲和素修饰的在C端可变区***鼠抗人细胞因子的单链抗体的纤连蛋白，并特异结合了细胞因子的细胞培养器示意图。

实施例6

干细胞用无血清培养添加物的制备

购买生物试剂按照50倍配制无血清培养添加物，具体配制方法：分别称取可溶性胶原蛋白(美国Sigma公司)、乳酸(美国Sigma公司)、维生素A(美国Sigma公司)、2-磷酸-L-抗坏血酸(美国Sigma公司)、重组人血白蛋白(美国Amresco公司)、重组人胰岛素(美国Amresco公司)、重组人转铁蛋白(美国Sigma公司)、葡萄糖(北京双鹭药业)、碳酸氢钠(北京鼎国生物)和HEPES(北京鼎国生物)，加入ddH₂O溶解，磁力搅拌下4℃层析柜中溶解30min，调节pH值为7.0-7.8，配制的溶液通过真空0.22μm过滤器抽滤除菌，然后进行无菌灌装到西林瓶或塑料瓶中，每瓶为10mL，并压盖密封后，放置-86℃超低温冰箱保存。

或者灌装的10mL西林瓶或塑料瓶放置冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得到无血清培养添加物冻干粉，压盖密封后，放置2-8℃冰箱保存。

50倍无血清培养添加物各组分浓度如下：

1)可溶性胶原蛋白：25ng-50μg/mL；

2)乳酸：5-1000mmol/L；

3)维生素A：5μmol-2.5mmol/L；

4)2-磷酸-L-抗坏血酸：25ng-2.5μg/mL；

5)重组人血白蛋白：25-1000μg/mL；

6)重组人胰岛素：25-1000μg/mL；

7)重组人转铁蛋白：5ng-2.5μg/mL；

8)葡萄糖：0.1-10％(质量体积比)；

9)碳酸氢钠：150mM；

10)HEPES缓冲液：250mM。

西林瓶或塑料瓶贴上标签并装入包装盒中，并放入使用说明书，塑封后生产成产品。

实施例7

海藻酸钠水凝胶结合含细胞因子纤连蛋白的细胞培养器在低氧浓度条件培养间充质干细胞

将人废弃脐带或胎盘，用75％酒精浸泡3-5min后放置2mL含2倍双抗的1×PBS(pH7.4)中，洗涤三次，用眼科剪剪碎至1mm³左右，吸取到50mL离心管中1000转每分钟离心10分钟，弃上清，细胞沉淀用1×PBS(pH7.4)洗涤1次，加入含实施例5制备的1倍无血清培养添加物的UltraCULTURE^TM无血清培养基重悬，苔盘兰染色计数后按1-10×10⁶细胞/mL加入到实施例5制备的海藻酸钠水凝胶结合含细胞因子纤连蛋白的100mm细胞培养皿中，于37℃，5％CO₂和低氧浓度1-5％的三气培养箱中生长48小时；或者加入含实施例6制备的1倍无血清培养添加物、20ng/mL重组人EGF和/或20ng/mL重组人bFGF的UltraCULTURE^TM无血清培养基重悬，在实施例5制备的海藻酸钠水凝胶结合含细胞因子scFv纤连蛋白的100mm细胞培养皿中进行培养。

培养48小时后对间充质干细胞换液，用5mL移液管吸弃培养液，加入上述的UltraCULTURE^TM无血清培养基，在上述的100mm细胞培养皿中继续放置37℃，5％CO₂和低氧浓度1-5％的三气培养箱中继续培养，间隔2天用新鲜培养液进行换液1次；

间充质干细胞在细胞培养器中生长融合达到80％以上，用5mL移液管吸弃培养液，取5mL1×PBS洗涤一次培养瓶底，加入0.5mL、质量体积比为0.25％胰酶到培养瓶中，放置37℃，5％CO₂培养箱中消化2-3分钟；消化后加入200μL胎牛血清终止消化，再加入5mL的生理盐水，用5mL移液管吹打，吸至15mL离心管中，再用5mL的生理盐水洗涤一次，加入到同一个15mL离心管中，1000转每分钟离心5分钟收集间充质干细胞；离心后用1mL新鲜培养液重悬，计数，用5mL移液管加入10mL新鲜的上述的细胞培养液，加入到1瓶新的海藻酸钠水凝胶结合含细胞因子纤连蛋白的或海藻酸钠水凝胶结合含细胞因子scFv纤连蛋白的75cm²的细胞培养瓶中继续在37℃，5％CO₂和低氧浓度1-5％的三气培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜的含1倍无血清培养添加物的细胞培养液；待干细胞生长融合达到80％以上时，按上述经胰酶消化收集干细胞，连续传代培养到第10代、第20代和第30代，获得的间充质干细胞用生理盐水重悬，苔盘兰染色计数，即获得干细胞，放置冰箱4℃存放备用。图4为在海藻酸钠水凝胶结合含细胞因子纤连蛋白的细胞培养器中在低氧浓度条件培养第10、20和30代间充质干细胞倒置显微镜观察的形态图，细胞低倍镜下(4倍镜)观察均呈小突起圆形生长。

实施例8

海藻酸钠凝胶结合含细胞因子纤连蛋白基质在低氧浓度条件培养内皮祖细胞

将人废弃脐带血或骨髓，加入两倍体积的1×PBS(pH7.4)进行稀释，充分混匀后使用人淋巴细胞分离液进行分离纯化，即取20mL稀释的脐带血或骨髓缓慢加入到20mL人淋巴细胞分离液中，1500rpm离心20min后吸取中间层白细胞，加入等体积1×PBS(pH7.4)进行洗涤1次，1000转每分钟离心10分钟，弃上清，细胞沉淀用1×PBS(pH7.4)洗涤2次，使用Lonza公司EBM-2 Basal Medium-2进行培养，具体步骤参见实施例6进行培养内皮祖细胞。图5为在海藻酸钠水凝胶结合含VEGF、IGF-1和EGF的纤连蛋白的细胞培养器中在低氧浓度条件培养内第10代、第20代和第30代皮祖细胞倒置显微镜观察的形态图，细胞低倍镜下(4倍镜)观察均呈鹅卵石状生长。

实施例9

海藻酸钠凝胶结合含细胞因子纤连蛋白基质在低氧浓度条件培养经血来源宫内膜干细胞

将人废弃经血加入两倍体积的1×PBS(pH7.4)进行稀释，充分混匀后使用人淋巴细胞分离液进行分离纯化，即取20mL稀释的脐带血或骨髓缓慢加入到20mL人淋巴细胞分离液中，1500rpm离心20min后吸取中间层白细胞，加入等体积1×PBS(pH7.4)进行洗涤1次，1000转每分钟离心10分钟，弃上清，细胞沉淀用1×PBS(pH7.4)洗涤2次，使用Irvine公司CHANG培养基进行培养，具体步骤参见实施例6进行培养宫内膜干细胞。图6为在海藻酸钠水凝胶结合含胰岛素和bFGF的纤连蛋白的细胞培养器中在低氧浓度条件培养第10代、第20代和第30代宫内膜干细胞倒置显微镜观察的形态图。细胞低倍镜下(4倍镜)观察均呈小梭性生长。

实施例10

干细胞体外增殖能力和细胞表型分析

取实施例7、8和9中分别培养的第30代间充质干细胞MSC、内皮祖细胞EPC与宫内膜干细胞MenSC以及通过对照组制备的第10代干细胞进行增殖活性分析。对比例依据DaiMurabayashi等2017年7月在人类细胞杂志上发表的在低氧条件下无血清和含血清培养条件处理人牙周膜干细胞的实用性方法(Murabayashi D，Mochizuki M，Tamaki Y，NakaharaT.Practical methods for handling human periodontal ligament stem cells inserum-free and serum-containing culture conditions under hypoxia：implicationsfor regenerative medicine.Hum Cell.2017Jul 4；30(3)：169-180.)

取5.0×10³细胞/孔接种到6孔板中，每孔3mL培养体系，平行3个复孔，分别在本发明培养条件下和对照组培养条件下培养1天、2天、3天、4天和5天，每天分别通过美国Bio-Rad细胞计数仪进行计数，检测细胞增殖活性。从图7、8和9中可以知道，本发明制备的第30代MSC、EPC与MenSC和对照组制备的第10代相比，细胞增殖速度均明显增强，两者之间并具有显著的差异(**P＝0.009、0.002、0.013)，表明本发明制备的第30代干细胞具有更好的增殖活性。

取实施例7和9中制备的3×10⁶第30代MSC和MenSC，分三组，第1组为同型对照，分别添加到有20μL FITC标记鼠IgG1、20μL PE标记鼠IgG1和20μL PerCP标记鼠IgG1；第2组分别添加到有20μL FITC标记鼠抗人CD90单抗、20μLPE标记鼠抗人CD73单抗和20μL Percp标记鼠抗人CD34单抗；第3组分别添加到有20μL FITC标记鼠抗人CD45单抗、20μL PE标记鼠抗人CD44单抗和20μL Percp标记鼠抗人CD14单抗。

取实施例8中制备的3×10⁶第30代EPC，分三组，第1组为同型对照，分别添加到有20μL FITC标记鼠IgG1、20μL PE标记鼠IgG1和20μL PerCP标记鼠IgG1；第2组分别添加到有20μL FITC标记鼠抗人CD133单抗、20μL PE标记鼠抗人CD31单抗和20μL Percp标记鼠抗人CD34单抗；第3组分别添加到有20μL FITC标记鼠抗人CD90单抗、20μL PE标记鼠抗人VEGF-A单抗和20μL Percp标记鼠抗人HLA-DR单抗。

将样本置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×PBS(pH7.4)洗涤3次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FCS Calibur流式细胞仪检测(美国BD公司)，图10为第30代间充质干细胞流式检测结果图，具体检测结果见表5。

表5

表中结果表明所述人MSC和MenSC均高表达CD90、CD73和CD44，而低表达CD34、CD45和CD14，以及EPC均高表达CD133、CD31、CD90和VEGF-A，而低表达CD34和HLA-DR，表明MSC、EPC和MenSC连续培养到第30代，仍符合三者细胞表型标志物要求。

实施例11

干细胞集落形成检测和分化功能分析

实施例7、8和9分别制备第30代的MSC、EPC与MenSC以400个活细胞/孔、200个活细胞/孔，100个活细胞/孔和50个活细胞/孔的密度接种于预铺了I型鼠尾胶原的6孔板(美国Nunc公司)中，每孔2mL，每3d换液，37℃，5％CO₂和低氧浓度1-10％的三气培养箱中培养7天，以及对照组培养的第10代的MSC、EPC与MenSC在其条件下培养7天，结晶紫染色集落，相差显微镜下计集落数，超过50个细胞计为一个集落。每组实验设3个平行样本。按下面公式计算集落形成率：

集落形成率(Colony-forming efficiency，CFE)(％)＝(集落数/接种细胞数)×100％

倒置显微镜下进行计数并分析数据，具体结果见表6。

表6不同密度克隆干细胞集落(个)/孔，

从上表中可以发现在本发明培养方法进行培养第30代的MSC、EPC和MenSC均比对照组培养的第10代干细胞还具有显著差异，形成的干细胞克隆集落明显更多，特别是在低密度接种更为明显，*P＜0.05，**P＜0.01。而且等渗结晶紫染色细胞集落，可见本发明培养方法组细胞的集落尺寸较对照培养组大。

取实施例7制备的第30代MSC以5×10³/孔密度接种于24孔培养板中，含10％FBS的α-MEM中培养24h后换用诱导培养基。成骨诱导体系为：含10％FBS的高糖DMEM中添加***(0.1μmol/L)、维生素C(50μmol/L)和β-磷酸甘油(10mmol/L)。每3天更换新鲜培养基，诱导至2～3周时，以碱性磷酸酶(ALP)试剂盒鉴定成骨。图11A倒置显微镜下(10倍镜)观察对成骨诱导3周细胞ALP染色图，可检测到ALP阳性早期成骨细胞的形成，表明培养到第30代MSC可诱导分化成骨细胞。

将Matrigel(美国BD公司)置于冰盒中，放入4℃冰箱，使胶能过夜缓慢融化，向血管生成载玻片(德国ibidi公司)每孔中加入10μl Matrigel；将血管生成载玻片放入培养皿湿盒中，盖上培养皿盖，放入培养箱中，静置30分钟左右，等待胶凝结；将胶已经凝固的血管生成载玻片从湿盒中取出，每孔加入50μL的实施例8制备的第30代EPCs悬液(2*10⁵个细胞/mL)；加入EPC细胞培养基，使上孔液体正好加满。盖上盖，静置，一段时间后，所有细胞都会沉下去落在Matrigel的表面。37℃，5％CO₂培养箱中培养12h，倒置显微镜下观察血管生成情况。体外血管生成实验的形态学评分标准，具体标准是：0分，细胞呈单个存在；1分，细胞开始迁移并自我排列；2分，可以见到毛细管，但是尚无出芽；3分，可见到新毛细管出芽；4分，开始闭合形成多边形；5分，形成网状结构。图11B倒置显微镜下(10倍镜)观察EPC呈血管生成12h后形成网状结构图，图中看到其形成了很好的网状，表明培养到第30代的EPC仍具有成血管形成的能力。

取实施例9制备的第30代MenSC按3×10⁵个细胞接种于15ml塑料尖底试管中，220×g低速离心8min，使细胞形成微团。软骨诱导培养基为高糖DMEM中添加维生素C(50μg/ml)、***(0.2μmol/L)、1×胰岛素-转铁蛋白-硒酸钠、丙酮酸钠(1mmol/L)、青/链霉素和TGF-β3(10ng/ml)，每4天更换培养基，形成的微团在上述体系内培养3～4周后行阿新蓝染色分析软骨形态。图11C为倒置显微镜下(10倍镜)观察阿新蓝染色图，图中显示MenSC向软骨分化阿新蓝显阳性，均可见胞浆成蓝色质，表明培养到第30代的MenSC可向软骨细胞分化。

实施例12

间充质干细胞治疗脊髓损伤动物模型及体内存活实验

取实施例7制备的第30代MSC和对照组制备的第10代MSC在各个培养条件下培养至细胞密度达60％～70％后，加入10μL预制的滴度为1.5×10⁹pfu/L携带GFP基因腺病毒表达载体的病毒悬液(上海吉凯基因购买)和5mL的培养液，培养24h后开始用相差显微镜和荧光显微镜分别观察MSC生长和GFP转染情况。

选取4～6周龄雄性SD大鼠40只，随机数字表法分为本发明P30-MSC移植A组、对照组P10-MSC移植B组和安慰剂C组，每组20只，分别用0.3％戊巴比妥(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，俯卧固定，剪开背部皮肤，暴露背部脊柱两侧半棘肌和肌腱，由于L1以下两侧半棘肌以肌腱附着于中线，依次为标志往上数到T11～12，在T11～12椎间隙的中点做一标记，用一手中指从腹部尽量向上平托标记位置，使椎间隙增大，同时用拇指和食指固定好头尾部。用有齿镊夹持T10和L1椎体固定胸腰椎，用纹式血管钳咬除T11～12脊椎棘突和1/2椎板显露T13～L1节段脊髓；用冠状动脉手术刀尖刺入暴露脊髓中央管切断一侧的1/2，相对应的后肢抽搐后瘫痪即为脊髓半切损伤模型，术后注射抗生素。

调整经基因标记的MSC密度为5×10¹⁰L^-1，以备移植，于大鼠脊髓损伤后1周，无菌条件下移植组利用微量注射器和微电极推进器，向头侧斜行进针，深度约为3mm，将移植组注入带有GFP标记基因的MSC悬液10μL(2.5×10¹⁰L^-1)，安慰剂组注入10μL PBS；移植前把明胶海绵剪成1mm×1mm×1mm大小作为填充支架，细胞移植后覆盖伤口，以防止细胞悬液溢出。经GFP基因转染的MSC在损伤脊髓组织局部生长良好，荧光显微镜下表达较强的荧光；移植后1周时细胞大多集中在脊髓损伤部位，基本没有向周围迁移；随着时间的延长脊髓损伤部位标记细胞有所减少。

根据Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)脊髓损伤的行为学评分，对移植后第1天、1周、2周、4周和6周，对大鼠进行行为学检查：将大鼠置于空旷的地面上，待其适应环境后，由双人独立观察5min，取其均值作为评分结果。由熟悉该评分标准的实验人员进行盲法评分。不同时间点各组大鼠运动功能恢复情况的BBB评分见表7。

表7移植后不同时间点各组大鼠的BBB评分，

损伤对照组大鼠在实验过程中BBB评分始终为21分。表7中结果发现本发明P30-MSC移植A组、对照组P10-MSC移植B组和安慰剂C组大鼠在移植后随着时间延长，双后肢运动功能逐渐恢复，至实验结束时三组大鼠行为学评分均不同程度提高，但都未达到满分。MSC移植组大鼠1周后双后肢运动功能开始恢复，2～6周时恢复最快，此后恢复减慢趋于平稳。MSC移植组大鼠从移植后2周起BBB评分较移植对照组明显增高，差异具有显著性意义(P＜0.05)，且比安慰剂组恢复更明显，具有显著性差异(^#P＜0.05)。而且移植后第4周和6周本发明P30-MSC移植A组比对照组P10-MSC移植B组对脊髓损伤恢复更为显著，具有显著性意义(^*P＜0.05)；表明本发明制备的P30代MSC同样具有促进脊髓损伤大鼠运动功能恢复，并比对照组P10代MSC移植的效果更明显。

取移植后第1周、2周、4周和6周的大鼠进行空洞面积计算，对脊髓组织进行常规苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，行横切片，厚度为4μm，每隔1mm切片1张，共9张。采用Image-ProPlus Version6.0软件(日本奥林巴斯公司购买)统计计算每张切片空洞面积及正常脊髓面积百分比，取9张切片的平均值为一只大鼠的空洞面积百分比。移植后第1周HE染色可见脊髓出血、神经细胞变性、炎性细胞浸润、小血管增生和空洞形成。图12结果显示移植后第4周MSC移植组与安慰剂组两组间差异有显著性(^*P＜0.05)，而且本发明P30-MSC移植组与对照组P10-MSC移植组相比，空洞面积缩小更为显著(^*P＜0.05)，表明其更有助于大鼠脊髓损伤空洞修复。

利用移植细胞自身能发出荧光的特点于术后不同时段观察移植细胞在MSCs组动物脑内成活及迁移的情况。每次从MSCs组动物中随机选出2只大鼠，分别于移植后的第1周、2周、4周、8周及16周在腹腔麻醉下灌注，取出胸腰段脊髓，快速冰冻切片，将细胞移植组切片置100倍倒置荧光显微镜下观察并予以摄片记录。GFP转基因小鼠MSCs自身可发出荧光，观察到的荧光细胞即为植入后存活的细胞。图13结果显示在MSC移植后第4周倒置荧光显微镜下观察到的绿色荧光，表明细胞在体内存活状况，通过计数明显可以看到本发明制备的P30-MSC移植组细胞存活数量高于对照组培养的P10-MSC移植组；移植后第8周和16周MSC移植组均观察到绿色荧光逐渐减少，但对照组P10-MSC移植组减少更为显著，在第16周时其已几乎看不到了，而本发明P30-MSC移植组仍有活细胞存在；表明本发明制备的P30-MSC体内移植具有更好地存活能力。