阅读说明：本技术 Gmfb作为糖尿病骨质疏松症的生物标记物的应用 (Application of GMFB (GMFB) as biomarker of diabetic osteoporosis ) 是由 吕立夏 徐国彤 施思 朱彤 高芙蓉 张介平 王娟 田海滨 金彩霞 徐晶莹 于 2019-03-26 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种GMFB作为糖尿病骨质疏松症的生物标记物的应用。本发明实验发现：GMFB在糖尿病大鼠的骨髓间充质干细胞中表达,而在正常大鼠的骨髓间充质干细胞中不表达。相比正常STZ诱导4周的TIDM大鼠,GMFB敲除的STZ诱导4周的T1DM大鼠的胫骨骨矿物质密度(BMD)显著上升。说明敲除GMFB能有效增加糖尿病大鼠的骨量,提高糖尿病大鼠骨密度,改善糖尿病骨质疏松。(The invention provides application of GMFB as a biomarker of diabetic osteoporosis. The experiment of the invention finds that: GMFB is expressed in bone marrow mesenchymal stem cells of diabetic rats, but not in bone marrow mesenchymal stem cells of normal rats. GMFB knockout STZ induced a significant increase in tibial Bone Mineral Density (BMD) in T1DM rats at 4 weeks compared to TIDM rats at 4 weeks of normal STZ induction. Therefore, the GMFB knockout can effectively increase the bone mass of the diabetic rat, improve the bone density of the diabetic rat and improve the osteoporosis of the diabetic bone.)

GMFB作为糖尿病骨质疏松症的生物标记物的应用

技术领域

本发明属于生物检测及生物医药技术领域，具体涉及GMFB作为糖尿病骨质疏松症的生物标记物的应用。

背景技术

随着我国经济的高速发展和老龄化进程的加速，糖尿病(diabetes milletus，DM)的患病率呈快速上升趋势，成为继心脑血管疾病、肿瘤之后另一个严重危害人民健康的重要慢性非传染性疾病。世界卫生组织推测，在2025年中国糖尿病患者将达到3亿。科学研究表明，I型糖尿病(T1DM)患者骨量减少和骨质疏松症患病率高达48％～72％。T2DM患者也逐步被证实是导致骨质疏松的危险因素，美国国家骨质疏松症基金会在2014年版的指南中也提到了相关的观点。约有0.1％～0.4％的糖尿病患者合并有骨关节病，年龄分布从20岁以前直至79岁，高发的年龄段为50～59岁，该年龄段的患者占全组的1/3。糖尿病骨关节病的发生率随糖尿病病程延长而增加，无性别差异，已报告的病例中有73％的糖尿病患者病程超过10年。大多数患者属1型糖尿病，只有10％左右的患者为2型糖尿病。其病因主要是骨代谢的紊乱，即糖尿病患者由于胰岛素缺乏、钙、磷、镁代谢障碍。糖尿病控制不良时，常伴有肝性营养不良和肾脏病变，1-2羟化酶活性降低，致使活性维生素D减少，钙吸收不良，骨质缺钙，骨质合成减少导致糖尿病骨量的丢失，易发生骨质疏松症。

国内公开发表的文献中表明糖尿病所致的体内高糖状态增加促炎相关因子，如TNF-α，IL-6的表达会增加破骨细胞的凋亡，导致骨质疏松；糖基化终末产物(AGEs)与细胞表面受体结合，促进单核/巨噬细胞产生多种炎性因子如IL-1、IL-6、TNF、脂联素等，促进了破骨细胞的活性，加速骨吸收，对骨质疏松的发展起到了推动作用；对T2DM骨质疏松病人静脉血样检测发现，MCP-1，hs-CRP，TNF-α显著高于非骨质疏松组。

胶质细胞成熟因子beta(glia maturation factorbeta,GMFB)最早是从牛脑分离纯化的17kd酸性胞浆蛋白，进化上高度保守，在中枢神经系统主要由星形胶质细胞产生，对脑组织生长、分化和再生有重要的作用，其表达在发育期上调，成年明显降低。新近研究显示GMFB是一种促炎因子，与人中枢神经系统退行性疾病密切相关，如阿茨海默病和帕金森病；GMFB基因敲除小鼠能够抵抗实验性自身免疫性脑炎和MPTP的毒性。

发明内容

有鉴于背景技术中的技术现状，本发明的目的在于提供一种GMFB作为糖尿病骨质疏松症的生物标记物的应用。

本发明提供了一种GMFB作为糖尿病骨质疏松症的生物标记物的应用。

本发明提供了GMFB作为生物标记物在制备糖尿病骨质疏松症早期诊断及病程进展的试剂或试剂盒中的应用。

本发明提供了检测GMFB表达量的试剂在制备糖尿病骨质疏松症早期诊断及病程进展的试剂或试剂盒中的应用。

本发明提供了GMFB干扰剂在制备预防、改善或治疗糖尿病骨质疏松症的药物中的应用，所述GMFB干扰剂为干扰GMFB活性或下调GMFB表达的物质。

优选的，所述GMFB干扰剂为化学合成的shGMFB或包含shGMFB的载体，所述shGMFB为小发卡GMFB寡核苷酸。

优选的，所述小发卡GMFB寡核苷酸的序列如SEQ ID No.1所示。

有益效果：本发明提供了GMFB作为糖尿病骨质疏松症的生物标记物的应用。本发明研究发现：GMFB在糖尿病大鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs)中表达，而在正常大鼠的骨髓间充质干细胞中不表达。相比正常STZ诱导4周的TIDM大鼠，GMFB敲除的STZ诱导4周的T1DM大鼠的胫骨骨矿物质密度(BMD)显著上升。在糖尿病大鼠的骨髓中，脂肪细胞数量增加，而GMFB敲除的糖尿病大鼠组脂肪细胞数量有所下降。说明敲除GMFB能有效增加糖尿病大鼠的骨量，提高糖尿病大鼠骨密度，改善糖尿病骨质疏松。

附图说明

图1为本发明实施例1所述实验方案中正常大鼠、STZ-诱导4周的糖尿病大鼠以及GMFB敲除的STZ-诱导4周的糖尿病大鼠的胫骨近端的Micro-CT扫描结果图；

图2为本发明实施例1所述CTan对图1所示Micro-CT扫描结果进行量化分析的结果图；

图3为本发明实施例2所述HE染色后的电镜结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种GMFB作为糖尿病骨质疏松症的生物标记物的应用。优选的，所述应用包括以GMFB作为生物标记物制备糖尿病骨质疏松症早期诊断及病程进展的试剂或试剂盒。

本发明通过Westernblot方法检测STZ-诱导DM大鼠来源的间充质干细胞中GMFB的含量，发现GMFB在DM大鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs)中表达，而在正常大鼠来源的间充质干细胞中不表达。GMFB作为炎症因子，BMSCs在糖尿病状态下表达GMFB(而正常情况不表达，或表达量极低)，说明GMFB在糖尿病状态下的BMSCs中发挥作用，可能抑制BMSCs的成骨分化能力。

本发明对原代骨髓间充质干细胞进行成骨诱导，发现敲除GMFB后的糖尿病大鼠的成骨分化能力相比糖尿病大鼠有所上调。

本发明通过HE染色检测大鼠胫骨近端骨髓内脂肪细胞数量，敲除后的糖尿病大鼠骨髓内脂肪细胞较糖尿病组明显减少。敲除GMFB后可使糖尿病骨髓中脂肪细胞数量明显降低，说明GMFB的缺失可能抑制BMSCs的成脂分化能力。

本发明通过micro-CT检测STZ-诱导DM大鼠胫骨近端骨密度，结果表明：相比正常STZ诱导4周的TIDM大鼠，GMFB敲除的STZ诱导4周的T1DM大鼠的胫骨骨矿物质密度(BMD)显著上升。这说明GMFB可作为糖尿病骨质疏松的治疗靶点，早期干预GMFB可能对糖尿病骨质疏松起预防作用。敲除GMFB后可显著改善糖尿病大鼠的骨密度，说明干扰GMFB可能改善糖尿病性骨质疏松的进程，帮助患者提高生活质量，缓解病情。

本发明提供了检测GMFB表达量的试剂在制备糖尿病骨质疏松症早期诊断及病程进展的试剂或试剂盒中的应用。在本发明中，所述检测GMFB表达量的试剂优选包括本领域常规的qPCR试剂或WB试剂。鉴于GMFB表达量与糖尿病骨质疏松症早期诊断及病程进展的关系，将检测GMFB表达量的试剂应用于糖尿病骨质疏松症早期诊断及病程进展的试剂或试剂盒的制备具有良好的应用前景。

本发明还提供了GMFB干扰剂在制备预防、改善或治疗糖尿病骨质疏松症的药物中的应用。在本发明中，所述GMFB干扰剂为干扰GMFB活性或下调GMFB表达的物质，优选为化学合成的shGMFB或包含shGMFB的载体。在本发明中，所述shGMFB为小发卡GMFB寡核苷酸，所述小发卡GMFB寡核苷酸优选如SEQ ID No.1所示。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

在以下实施例中，骨髓间充质干细胞均为原代培养，培养基为低糖DMEM，含10％血清和1％P/S。培养环境为37℃，5％CO₂和95％空气。Micro-CT结果图与数据由上海第六人民医院micro-CT分析室进行分析。

实施例1

(1)糖尿病大鼠制备：采用雄性SD大鼠和GMFB敲除SD大鼠，160-180g。实验前先将大鼠饥饿24小时。单次腹腔内注射STZ(60mg/kg体重)来诱发DM，正常对照组腹腔注射等体积的柠檬酸溶液；24小时后断尾取血测血糖，血糖值低于250mg/dL的大鼠补充注射STZ。连续3天测血糖。将血糖连续3天超过250mg/dL的大鼠确定为DM大鼠(血糖低于250mg/dL的大鼠将被排除)。

(2)各组大鼠胫骨组织留存并进行Micro-CT检测：将SD大鼠脱颈处死后，胸腹部T字切口，用手向下撕至大腿下，暴露大腿和膝关节。在膝关节下剪断胫骨，取大鼠股骨远端1cm，胫骨近端2cm左右(包含膝关节)的骨组织，用4％多聚甲醛固定24h。Micro-CT以18μm的空间分辨率对胫骨进行检测，用CTan软件对骨密度、骨体积分数值等体像数据进行可视化分析。结果见图1和图2。其中，图1为正常大鼠、STZ-诱导4周的糖尿病大鼠以及GMFB敲除的STZ-诱导4周的糖尿病大鼠的胫骨近端的Micro-CT扫描结果图；图2为CTan对图1所示Micro-CT扫描结果进行量化分析的结果图。图1和图2表明：GMFB敲除后可显著增加糖尿病大鼠的骨小梁密度，增加骨量。

实施例2

(1)石蜡切片：将SD大鼠脱颈处死后，胸腹部T字切口，用手向下撕至大腿下，暴露大腿和膝关节。在膝关节下剪断胫骨，取大鼠胫骨近端5mm左右骨组织用4％多聚甲醛固定24h，用EDTA脱钙液37℃脱钙21天，直至骨组织具有一定韧性，可弯曲。对骨组织进行漂洗、脱水、透明后浸蜡进行包埋，将蜡块切成4μm的蜡带，贴于载玻片上置40℃烘箱中烘干。

(2)HE染色：

①浸入二甲苯15min/次，重复1次；

②依次浸入100％、95％、75％、50％酒精；

③用流水冲净后浸入蒸馏水；

④用伊红溶液浸润1分钟；

⑤依次浸入75％、95％、100％酒精；

⑥浸入二甲苯，重复1次；

⑦用加拿大树胶封片

染色后的电镜结果见图3。图3表明：GMFB敲除后，糖尿病大鼠骨髓中脂肪细胞明显减少。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 同济大学

<120> GMFB作为糖尿病骨质疏松症的生物标记物的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gccgagcuaa cuaagguau 19