阅读说明：本技术 T细胞治疗的病毒方法 (Viral methods of T cell therapy ) 是由 托马斯·亨利 艾瑞克·罗德兹 莫达希尔·乔杜里 布兰登·莫里亚提 博·韦伯 史蒂文·A·罗 于 2017-10-26 设计创作，主要内容包括：本文公开了使用病毒或非病毒载体产生遗传修饰细胞群体的方法。还公开了用于产生遗传修饰细胞群体和/或用于治疗癌症的修饰病毒。(Disclosed herein are methods of generating a population of genetically modified cells using viral or non-viral vectors. Also disclosed are modified viruses for producing a population of genetically modified cells and/or for treating cancer.)

T细胞治疗的病毒方法

交叉引用

本申请要求于2016年10月27日提交的第62/413,814号美国临时申请和2017年1月30日提交的第62/452,081号美国临时申请的权益，以上每件申请均通过引用而整体并入本文以用于所有目的。

背景技术

尽管癌症治疗在过去50年中取得了显著进步，但仍存在许多对于化学疗法、放射疗法或生物疗法为顽固性的肿瘤类型，特别是在通过手术技术无法解决的晚期。近来，在用来体内识别肿瘤上的分子靶标的淋巴细胞遗传工程方面取得了显著进步，从而导致了引入注目的靶向肿瘤缓解病例。然而，这些成功在很大程度上局限于血液系统肿瘤，而针对实体瘤的更广泛应用受限于缺乏由特定肿瘤中的细胞表达的可鉴别分子以及缺乏可用来特异性结合肿瘤靶标以便介导肿瘤破坏的分子。一些近期进展关注对在一些情况下触发抗肿瘤T细胞应答的肿瘤特异性突变的鉴别。例如，可使用全外显子组测序方法来鉴别这些内源性突变。Tran E等人,“Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+T cellsin a patient with epithelial cancer,”Science 344:641-644(2014)。

援引并入

本文中的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入，其程度犹如特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。在本文中的术语与所并入的参考文献中的术语之间存在冲突的情况下，以本文中的术语为准。

发明内容

本文公开了一种产生遗传修饰细胞群体的方法，其包括：提供来自人类受试者的细胞群体；通过使用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统在细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中引入断裂来离体修饰所述细胞群体中的至少一个细胞；以及将包含至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因的腺相关病毒(AAV)载体引入到所述细胞群体中的至少一个细胞中，以将所述外源转基因在所述断裂处整合到所述至少一个细胞的基因组中；其中与使用微环载体在可比细胞中整合所述至少一种外源转基因相比，使用所述AAV载体整合所述至少一种外源转基因降低细胞毒性。

本文公开了产生遗传修饰细胞群体的方法，其包括：提供来自人类受试者的细胞群体；通过使用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统在细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中引入断裂来离体修饰所述细胞群体中的至少一个细胞；以及将包含至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因的腺相关病毒(AAV)载体引入到所述细胞群体中的至少一个细胞中，以将所述外源转基因在所述断裂处整合到所述至少一个细胞的基因组中；其中在引入所述AAV载体后约4天，如通过荧光激活细胞分选(FACS)所测量的，所述细胞群体包含至少约90％的活细胞。

本文公开了产生遗传修饰细胞群体的方法，其包括：提供来自人类受试者的细胞群体；向所述细胞群体引入包含指导多核酸的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统，其中所述指导多核酸与所述细胞群体内多个细胞中的细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因特异性结合，并且所述CRISPR系统在所述CISH基因中引入断裂，从而抑制所述多个细胞中的CISH蛋白质功能；以及向所述多个细胞中引入腺相关病毒(AAV)载体，其中所述AAV载体将至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因在所述断裂处整合到所述多个细胞的基因组中，从而产生遗传修饰细胞群体；其中所述遗传修饰细胞群体中至少约10％的细胞表达所述至少一种外源转基因。

本文公开了一种治疗人类受试者的癌症的方法，其包括：施用治疗有效量的离体遗传修饰细胞群体，其中至少一个所述离体遗传修饰细胞包含细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中的基因组改变，该基因组改变导致所述至少一个离体遗传修饰细胞中的CISH蛋白质功能的抑制，其中所述基因组改变是通过成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统引入的；并且其中所述至少一个离体遗传修饰细胞进一步包含编码T细胞受体(TCR)的外源转基因，其中所述外源转基因通过腺相关病毒(AAV)载体被引入到所述至少一个遗传修饰细胞的基因组的所述CISH基因中；并且其中所述施用在所述人类受试者中治疗癌症或改善癌症的至少一种症状。

本文公开了一种治疗人类受试者的胃肠癌的方法，其包括：施用治疗有效量的离体遗传修饰细胞群体，其中至少一个所述离体遗传修饰细胞包含细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中的基因组改变，该基因组改变导致所述至少一个离体遗传修饰细胞中的CISH蛋白质功能的抑制，其中所述基因组改变是通过成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统引入的；并且其中所述至少一个离体遗传修饰细胞进一步包含编码T细胞受体(TCR)的外源转基因，其中所述外源转基因通过腺相关病毒(AAV)载体被引入到所述至少一个遗传修饰细胞的基因组的所述CISH基因中；并且其中所述施用在所述人类受试者中治疗癌症或改善癌症的至少一种症状。

本文公开了治疗人类受试者的癌症的方法，其包括：施用治疗有效量的离体遗传修饰细胞群体，其中至少一个所述离体遗传修饰细胞包含T细胞受体(TCR)基因中的导致所述至少一个离体遗传修饰细胞中TCR蛋白质功能抑制的基因组改变，以及细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中的导致所述至少一个离体遗传修饰细胞中CISH蛋白质功能抑制的基因组改变，其中所述基因组改变是通过成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统引入的；并且其中所述至少一个离体遗传修饰细胞进一步包含编码T细胞受体(TCR)的外源转基因，其中所述外源转基因通过腺相关病毒(AAV)载体被引入到所述至少一个遗传修饰细胞的基因组的所述CISH基因中；并且其中所述施用在所述人类受试者中治疗癌症或改善癌症的至少一种症状。

本文公开了一种遗传修饰细胞离体群体，其包含：细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中的外源基因组改变，以及腺相关病毒(AAV)载体，该外源基因组改变抑制至少一个遗传修饰细胞中的CISH蛋白质功能，该AAV载体包含至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因，以供***到所述至少一个遗传修饰细胞的基因组的所述CISH基因中。

本文公开了一种遗传修饰细胞离体群体，其包含：细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中的外源基因组改变，以及腺相关病毒(AAV)载体，该外源基因组改变抑制所述遗传修饰细胞离体群体的至少一个遗传修饰细胞中的CISH蛋白质功能，该AAV载体包含至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因，以供***到所述遗传修饰细胞离体群体的至少一个遗传修饰细胞的基因组的所述CISH基因中。

本文公开了一种遗传修饰细胞离体群体，其包含：细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中抑制至少一个遗传修饰细胞中的CISH蛋白质功能的外源基因组改变，和T细胞受体(TCR)基因中抑制至少一个遗传修饰细胞中的TCR蛋白质功能的外源基因组改变，以及腺相关病毒(AAV)载体，该AAV载体包含至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因，以供***到所述至少一个遗传修饰细胞的基因组的所述CISH基因中。

本文公开了一种用于将至少一种外源转基因引入到细胞中的系统，所述系统包含核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸，以及腺相关病毒(AAV)载体，其中所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸在至少一个细胞的细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中引入双链断裂，并且其中所述AAV载体在所述断裂处向所述细胞的基因组中引入至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因；其中与包含微环和所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸的类似系统(其中所述微环向所述基因组中引入所述至少一种外源转基因)相比，所述系统具有更高的向所述基因组中引入所述转基因的效率，并且导致更低的细胞毒性。

本文公开了一种用于将至少一种外源转基因引入到细胞中的系统，所述系统包含核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸，以及腺相关病毒(AAV)载体，其中所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸在至少一个细胞的细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中和T细胞受体(TCR)基因中引入双链断裂，并且其中所述AAV载体在所述断裂处向所述细胞的基因组中引入至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因；其中与包含微环和所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸的类似系统(其中所述微环向所述基因组中引入所述至少一种外源转基因)相比，所述系统具有更高的向所述基因组中引入所述转基因的效率，并且导致更低的细胞毒性。

本文公开了一种治疗癌症的方法，其包括：使用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统离体修饰来自人类受试者的细胞群体中的细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因，其中所述CRISPR系统在所述CISH基因中引入双链断裂，以生成工程化细胞群体；使用腺相关病毒基因递送系统向所述工程化细胞群体中引入癌症响应性受体，以在所述双链断裂处整合至少一种外源转基因，从而生成癌症响应性细胞群体，其中所述腺相关病毒基因递送系统包含腺相关病毒(AAV)载体；以及向所述受试者施用治疗有效量的所述癌症响应性细胞群体。

本文公开了一种治疗胃肠癌的方法，其包括：使用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统离体修饰来自人类受试者的细胞群体中的细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因，其中所述CRISPR系统在所述CISH基因中引入双链断裂，以生成工程化细胞群体；使用腺相关病毒基因递送系统向所述工程化细胞群体中引入癌症响应性受体，以在所述双链断裂处整合至少一种外源转基因，从而生成癌症响应性细胞群体，其中所述腺相关病毒基因递送系统包含腺相关病毒(AAV)载体；以及向所述受试者施用治疗有效量的所述癌症响应性细胞群体。

本文公开了一种制备遗传修饰细胞的方法，其包括：提供宿主细胞群体；引入重组腺相关病毒(AAV)载体和包含核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统；其中所述核酸酶在细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中引入断裂，并且所述AAV载体在所述断裂处引入外源核酸；其中与使用微环载体在可比细胞中整合所述至少一种外源转基因相比，使用所述AAV载体整合所述至少一种外源转基因降低细胞毒性；其中与已经引入所述CRISPR系统和相应野生型AAV载体的可比宿主细胞群体相比，所述外源核酸以更高的效率被引入。

本文公开了一种产生遗传修饰肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体的方法，其包括：提供来自人类受试者的TIL群体；用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统对所述TIL群体进行离体电穿孔，其中所述CRISPR系统包含核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸，其包含指导核糖核酸(gRNA)；其中所述gRNA包含与细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因互补的序列，并且所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸在所述TIL群体中的至少一个TIL的所述CISH基因中引入双链断裂；其中所述核酸酶是Cas9或者所述多核苷酸编码Cas9；以及在采用所述CRISPR系统进行电穿孔后约1小时至约4天，将腺相关病毒(AAV)载体引入到所述TIL群体中的所述至少一个TIL中，以将至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因整合到所述双链断裂中。

本文公开了一种产生遗传修饰肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体的方法，其包括：提供来自人类受试者的TIL群体；用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统对所述TIL群体进行离体电穿孔，其中所述CRISPR系统包含核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸，其包含指导核糖核酸(gRNA)；其中所述gRNA包含与细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因互补的序列，并且所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸在所述TIL群体中的至少一个TIL的所述CISH基因中引入双链断裂；其中所述核酸酶是Cas9或者所述多核苷酸编码Cas9；以及在采用所述CRISPR系统进行电穿孔后约1小时至约3天，将腺相关病毒(AAV)载体引入到所述TIL群体中的所述至少一个TIL中，以将至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因整合到所述双链断裂中。

本文公开了一种产生遗传修饰肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体的方法，其包括：提供来自人类受试者的TIL群体；用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统对所述TIL群体进行离体电穿孔，其中所述CRISPR系统包含核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸以及至少一种指导核糖核酸(gRNA)；其中所述至少一种gRNA包含含有与细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因互补的序列的gRNA以及含有与T细胞受体(TCR)基因互补的序列的gRNA；其中，所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸在所述TIL群体中的至少一个TIL的所述CISH基因中引入第一双链断裂并在其所述TCR基因中引入第二双链断裂；并且，其中所述核酸酶是Cas9或者所述多核苷酸编码Cas9；以及在采用所述CRISPR系统进行电穿孔后约1小时至约4天，将腺相关病毒(AAV)载体引入到所述TIL群体中的所述至少一个TIL中，以将至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因整合到所述第一双链断裂或所述第二双链断裂中的至少一个中。

本文公开了一种产生遗传修饰细胞群体的方法，其包括：提供来自人类受试者的细胞群体；使用核酸酶或编码所述核酸酶的多肽以及指导多核酸，通过在细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中引入断裂来离体修饰所述细胞群体中的至少一个细胞；以及将包含至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因的腺相关病毒(AAV)载体引入到所述细胞群体中的至少一个细胞中，以将所述外源转基因在所述断裂处整合到所述至少一个细胞的基因组中；其中与使用微环载体在可比细胞中整合所述至少一种外源转基因相比，使用所述AAV载体整合所述至少一种外源转基因降低细胞毒性。

本文公开了一种产生遗传修饰细胞群体的方法，其包括：提供来自人类受试者的细胞群体；向所述细胞群体中引入包含至少一种指导多核酸的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统，其中所述至少一种指导多核酸包含与所述细胞群体内多个细胞中的T细胞受体(TCR)基因特异性结合的指导多核酸和与其中的细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因特异性结合的指导多核酸，并且所述CRISPR系统在所述TCR基因和所述CISH基因中引入断裂，从而抑制所述多个细胞中的TCR蛋白质功能和CISH蛋白质功能；以及向所述多个细胞中引入腺相关病毒(AAV)载体，其中所述AAV载体将至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因在所述断裂处整合到所述多个细胞的基因组中，从而产生遗传修饰细胞群体；其中所述遗传修饰细胞群体中至少约10％的细胞表达所述至少一种外源转基因。

在一些情况下，本发明的方法可进一步包括使用CRISPR系统向内源TCR基因中引入断裂。在一些情况下，向至少一个细胞中引入AAV载体包括向包含断裂(例如，CISH和/或TCR基因中的断裂)的细胞中引入AAV载体。

在一些情况下，本发明的方法或系统可包括电穿孔和/或核转染。在一些情况下，本发明的方法或系统可进一步包括核酸酶或编码所述核酸酶的多肽。在一些情况下，所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸可向CISH基因和/或TCR基因中引入断裂。在一些情况下，所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸可包含CISH基因和/或TCR基因的失活或表达降低。在一些情况下，所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸选自成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、锌指、转录激活因子样效应物(TALEN)和针对TAL重复序列的大范围核酸酶(MEGATAL)。在一些情况下，所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸来自CRISPR系统。在一些情况下，所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸来自酿脓链球菌(S.pyogenes)CRISPR系统。在一些情况下，CRISPR系统包含核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸。在一些情况下，所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸选自Cas9和Cas9HiFi。在一些情况下，所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸是Cas9或编码Cas9的多核苷酸。在一些情况下，所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸是催化失效的。在一些情况下，所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸是催化失效的Cas9(dCas9)或编码dCas9的多核苷酸。

在一些情况下，本发明的方法可包括(或者可进一步包括)通过在细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因和/或TCR基因中引入断裂来离体修饰细胞群体中的至少一个细胞。在一些情况下，修饰包括使用指导多核酸进行修饰。在一些情况下，修饰包括引入核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸。在一些情况下，CRISPR系统包含指导多核酸。在一些情况下，本发明的方法或系统或群体可进一步包含指导多核酸。在一些情况下，所述指导多核酸包含与所述CISH基因互补的序列。在一些情况下，所述指导多核酸包含与所述TCR基因互补的序列。在一些情况下，所述指导多核酸是指导核糖核酸(gRNA)。在一些情况下，所述指导多核酸是指导脱氧核糖核酸(gDNA)。

在一些情况下，测量细胞活力。在一些情况下，通过荧光激活细胞分选(FACS)测量细胞活力。在一些情况下，在引入AAV载体后，如通过荧光激活细胞分选(FACS)所测量的，遗传修饰细胞群体或肿瘤浸润性淋巴细胞群体具有至少约90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的细胞活力。在一些情况下，在引入AAV载体后约4小时、6小时、10小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、120小时、132小时、144小时、156小时、168小时、180小时、192小时、204小时、216小时、228小时、240小时或超过240小时测量细胞活力。在一些情况下，在引入AAV载体后约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、45天、50天、60天、70天、90天或超过90天测量细胞活力。在一些情况下，在引入AAV载体后约4天，如通过荧光激活细胞分选(FACS)所测量的，遗传修饰细胞群体或肿瘤浸润性淋巴细胞群体可具有至少约92％的细胞活力。在一些情况下，在引入重组AAV载体后约4天，如通过荧光激活细胞分选(FACS)所测量的，遗传修饰细胞群体可具有至少约92％的细胞活力。

在一些情况下，AAV载体与相应未修饰的或野生型AAV载体相比降低细胞毒性。在一些情况下，测量细胞毒性。在一些情况下，通过流式细胞术测量毒性。在一些情况下，与使用微环或相应未修饰的或野生型AAV载体在可比细胞群体中整合至少一种外源转基因相比，使用AAV载体整合所述至少一种外源转基因降低细胞毒性。在一些情况下，毒性降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些情况下，在引入所述AAV载体或所述相应未修饰的或野生型AAV载体或所述微环载体后约4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、120小时、132小时、144小时、156小时、168小时、180小时、192小时、204小时、216小时、228小时、240小时或超过240小时测量毒性。在一些情况下，在引入所述AAV载体或所述相应未修饰的或野生型AAV载体或所述微环后约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、45天、50天、60天、70天、90天或超过90天测量毒性。

在一些情况下，遗传修饰细胞群体中的至少约15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％包含至少一种外源转基因在断裂处向细胞基因组的CISH基因中的整合。在一些情况下，遗传修饰细胞群体中的至少约15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％包含至少一种外源转基因在断裂处向细胞基因组的TCR基因中的整合。

在一些情况下，遗传修饰细胞群体和/或遗传修饰肿瘤浸润性淋巴细胞群体可以按照本发明的方法制备。在一些情况下，细胞或细胞群体或遗传修饰细胞群体可以是肿瘤浸润性淋巴细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体。在一些情况下，细胞群体或遗传修饰细胞群体分别是原代细胞或原代细胞群体。在一些情况下，原代细胞或原代细胞群体是原代淋巴细胞或原代淋巴细胞群体。在一些情况下，原代细胞或原代细胞群体是TIL或TIL群体。在一些情况下，TIL是自体的。在一些情况下，TIL是自然杀伤(NK)细胞。在一些情况下，TIL是B细胞。在一些情况下，TIL是T细胞。

在一些情况下，所述AAV载体以每个细胞约1x10⁵、2x10⁵、3x10⁵、4x10⁵、5x10⁵、6x10⁵、7x10⁵、8x10⁵、9x10⁵、1x10⁶、2x10⁶、3x10⁶、4x10⁶、5x10⁶、6x10⁶、7x10⁶、8x10⁶、9x10⁶、1x10⁷、2x10⁷、3x10⁷或最多约9x10⁹个基因组拷贝/病毒颗粒的感染复数(MOI)引入。在一些情况下，所述野生型AAV载体以每个细胞约1x10⁵、2x10⁵、3x10⁵、4x10⁵、5x10⁵、6x10⁵、7x10⁵、8x10⁵、9x10⁵、1x10⁶、2x10⁶、3x10⁶、4x10⁶、5x10⁶、6x10⁶、7x10⁶、8x10⁶、9x10⁶、1x10⁷、2x10⁷、3x10⁷或最多约9x10⁹个基因组拷贝/病毒颗粒的感染复数(MOI)引入。在一些情况下，在引入所述CRISPR或所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核酸后1-3小时、3-6小时、6-9小时、9-12小时、12-15小时、15-18小时、18-21小时、21-23小时、23-26小时、26-29小时、29-31小时、31-33小时、33-35小时、35-37小时、37-39小时、39-41小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、14天、16天、20天或超过20天，将AAV载体引入到所述细胞中。在一些情况下，在引入CRISPR系统或核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸后15至18小时，将所述AAV载体引入到细胞中。在一些情况下，在引入CRISPR系统或核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸后16小时，将所述AAV载体引入到细胞中。

在一些情况下，至少一种外源转基因(例如，编码TCR的外源转基因)被随机***到基因组中。在一些情况下，至少一种外源转基因被***到基因组的CISH基因和/或TCR基因中。在一些情况下，至少一种外源转基因被***基因组的CISH基因中。在一些情况下，至少一种外源转基因未***基因组的CISH基因中。在一些情况下，至少一种外源转基因被***基因组的CISH基因中的断裂中。在一些情况下，转基因(例如，至少一种编码TCR的转基因)被***TCR基因中。在一些情况下，至少一种外源转基因以随机和/或位点特异性方式***到CISH基因中。在一些情况下，至少一种外源转基因的侧翼为与CISH基因和/或TCR基因中的断裂互补的工程化位点。在一些情况下，细胞群体或遗传修饰细胞群体或遗传修饰TIL群体中至少约15％、或至少约20％、或至少约25％、或至少约30％、或至少约35％、或至少约40％、或至少约45％、或至少约50％、或至少约55％、或至少约60％、或至少约65％、或至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的细胞包含至少一种外源转基因。

在一些情况下，所述治疗癌症的方法可包括施用治疗有效量的本发明的细胞群体。在一些情况下，与提供分别由相应未修饰的或野生型AAV载体或由微环产生的相同治疗效果所需的细胞数目相比，治疗有效量的细胞群体可包含较少数目的细胞。

附图说明

本发明的新颖特征在随附权利要求中具体阐述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实例加以阐述的详细描述以及附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些附图中：

图1描绘了可使用体外测定(例如全外显子组测序)从获自癌症患者的样品鉴别癌症相关靶序列(例如，新抗原(Neoantigen))的方法的示例。该方法可进一步从识别靶序列的第一T细胞鉴别TCR转基因。癌症相关靶序列和TCR转基因可从同一患者或不同患者的样品获得。该方法可有效且高效地穿过第二T细胞的膜递送包含TCR转基因的核酸。在一些情况下，第一和第二T细胞可从同一患者获得。在其它情况下，第一和第二T细胞可从不同患者获得。在其它情况下，第一和第二T细胞可从不同患者获得。该方法可使用非病毒整合系统(例如，CRISPR、TALEN、基于转座子、ZEN、大范围核酸酶或Mega-TAL)安全且有效地将TCR转基因整合到T细胞的基因组中，以产生工程化T细胞，从而可在该工程化T细胞中可靠地表达TCR转基因。工程化T细胞可在维持其免疫学和抗肿瘤效力的条件下生长和扩充，并且可进一步施用于患者以用于癌症治疗。

图2示出了用于TCR转基因整合和TCR表达的一些示例性转座子构建体。

图3显示了mRNA的体外转录及其作为模板在任何类型的细胞(例如，原代细胞、细胞系等)中产生同源重组(HR)底物的应用。在病毒基因组的5’LTR区上游，可以放置T7、T3或其它转录起始序列以供病毒盒的体外转录。可使用编码病毒载体的有义链和反义链的mRNA来提高产量。

图4显示了四种质粒的结构，包括Cas9核酸酶质粒、HPRT gRNA质粒、AmaxaEGFPmax质粒和HPRT靶载体。

图5示出了具有0.5kb的靶向臂的示例性HPRT靶载体。

图6显示了针对示例性基因(例如，HPRT基因)的三种潜在TCR转基因敲入设计。(1)外源启动子：由外源启动子(“启动子”)转录的TCR转基因(“TCR”)；(2)SA框内转录：通过剪接由内源启动子(由箭头指示)转录的TCR转基因；和(3)融合框内翻译：通过框内翻译由内源启动子转录的TCR转基因。所有三种示例性设计均可敲除基因功能。例如，当通过***TCR转基因敲除HPRT基因或PD-1基因时，可使用6-硫代鸟嘌呤选择作为选择分析。

图7证明了Cas9+gRNA+靶质粒共转染在混合群体中具有良好的转染效率。

图8显示了CD3+T细胞的EGFP FACS分析结果。

图9示出了两种类型的T细胞受体。

图10示出了使用两种平台的成功的T细胞转染效率。

图11示出了当T细胞数目成比例增加，例如，当T细胞数目增加时的高效转染。

图12示出了通过CRISPR gRNA在潜在靶位点发生的基因修饰百分比。

图13显示了经刺激的T细胞中CRISPR诱导的DSB。

图14示出了RNA递送的优化。

图15显示了靶位点处的双链断裂。在引入靶向CRISPR-Cas系统之前在用抗CD3和抗CD28激活的T细胞中诱导双链断裂方面，基因靶向是成功的。举例而言，使用免疫检查点基因PD-1、CCR5和CTLA4来验证该系统。

图16示出了CCR5处的TCR整合的图示。具有与CCR5的1kb重组臂的质粒靶向载体的示例性设计。3kb TCR表达转基因可以***到具有与不同基因的重组臂的类似载体中，以便使用同源重组靶向其它感兴趣的基因。使用重组臂之外的引物进行的PCR分析可证明在基因处成功的TCR整合。

图17描绘了经刺激的T细胞中CCR5基因处的TCR整合。阳性PCR结果证明在转染后72小时在CCR5基因处的成功同源重组。

图18示出了响应于质粒DNA转染的T细胞死亡。

图19是存在于不同类型细胞(包括但不限于T细胞)中的胞质DNA的先天免疫传感途径的示意图。T细胞表达两种用于检测外来DNA的途径。细胞毒性可由基因组工程化期间这些途径的激活而引起。

图20证明了图19的抑制剂阻断凋亡和焦亡(pyropoptosis)。

图21示出了代表性质粒修饰的示意图。标准质粒含有可触发先天免疫传感系统的细菌甲基化。去除细菌甲基化可降低由标准质粒引起的毒性。也可去除细菌甲基化，并添加哺乳动物甲基化，以使载体看起来像“自身DNA”。修饰还可包括合成单链DNA的使用。

图22示出了代表性功能性工程化TCR抗原受体。这种工程化TCR对表达MART-1的黑素瘤肿瘤细胞系具有高度反应性。TCRα和TCRβ链与弗林蛋白酶切割位点连接，然后是2A核糖体跳跃肽。

图23A和图23B示出了在用指导RNA转染后第6天，PD-1、CTLA-4，PD-1和CTLA-2，或CCR5、PD-1和CTLA-4的表达。代表性指导物：PD-1(P2、P6、P2/6)，CTLA-4(C2、C3、C2/3)，或CCR5(CC2)。A.示出了抑制性受体表达百分比。B.示出了相对于对照指导RNA归一化的抑制性受体表达。

图24A和图24B示出了与未染色和无指导物对照相比，用CRISPR和CTLA-4特异性指导RNA(指导物#2和指导物#3)电穿孔后原代人T细胞中的CTLA-4表达。B.示出了与未染色和无指导物对照相比，用CRISPR和PD-1特异性指导RNA(指导物#2和指导物#6)电穿孔后原代人T细胞中的PD-1表达。

图25示出了在用CRISPR和多重CTLA-4和PD-1指导RNA进行电穿孔后，原代人T细胞中CTLA-4和PD-1表达的FACS结果。

图26A和图26B示出了用CRISPR处理后原代人T细胞中的双敲除百分比。A.示出了与仅Zap、仅Cas9以及所有指导RNA对照相比，用CTLA-4指导物#2、CTLA-4指导物#3、CTLA-4指导物#2和#3、PD-1指导物#2和CTLA-4指导物#2、PD-1指导物#6和CTLA-4指导物#3处理的T细胞中的CTLA-4敲除百分比。B.示出了与仅Zap、仅Cas9以及所有指导RNA对照相比，用PD-1指导物#2、PD-1指导物#6、PD-1指导物#2和#6、PD-1指导物#2和CTLA-4指导物#2、PD-1指导物#6和CTLA-4指导物#3处理的T细胞中的PD-1敲除百分比。

图27示出了用CRISPR和对CTLA-4、PD-1或其组合具有特异性的指导RNA进行电穿孔后的T细胞活力。

图28为CEL-I测定的结果，示出了在仅引入PD-1指导RNA，引入PD-1和CTLA-4指导RNA，或引入CCR5、PD-1和CLTA-4指导RNA，以仅Zap或仅gRNA作为对照的条件下，由PD-1指导RNA#2、#6、#2和#6进行的切割。

图29为CEL-I测定的结果，示出了在仅引入CTLA-4指导RNA，引入PD-1和CTLA-4指导RNA，或引入CCR5、PD-1和CLTA-4指导RNA，以仅Zap或仅gRNA作为对照的条件下，由CTLA-4指导RNA#2、#3、#2和#3进行的切割。

图30为CEL-I测定的结果，示出了与仅Zap、仅Cas 9或仅指导RNA对照相比，在引入CCR5指导RNA、PD-1指导RNA或CTLA-4指导RNA的条件下，由CCR5指导RNA#2进行的切割。

图31示出了如通过CD3FACS表达所测量的，利用5微克和10微克具有2’O-甲基RNA修饰的优化CRISPR指导RNA在原代人T细胞中的TCRα敲除。

图32描绘了在用CRISPR和针对CTLA-4的指导RNA处理后检测T细胞活力和表型的方法。通过对显示正常FSC/SSC谱的经处理细胞的频率(相对于单独电穿孔对照的频率进行归一化)进行定量来检测表型。还通过FSC/SSC门控群体内的细胞对活力染料的拒染来测量活力。通过CD3和CD62L来检测T细胞表型。

图33示出了在用CRISPR和针对PD-1的指导RNA以及针对PD-1和CTLA-4的指导RNA处理后检测T细胞活力和表型的方法。通过对显示正常FSC/SSC谱的经处理细胞的频率(相对于单独电穿孔对照的频率进行归一化)进行定量来检测表型。还通过FSC/SSC门控群体内的细胞对活力染料的拒染来测量活力。通过CD3和CD62L来检测T细胞表型。

图34示出了在用PD-1或CTKA-4指导RNA转染原代人T细胞和Jurkat对照后第4天检测CRISPR基因编辑的T7E1测定的结果。NN为无T7E1核酸酶的对照。

图35示出了通过分解追踪***缺失(TIDE)分析的结果。示出了PD-1和CTLA-4指导RNA的基因编辑效率百分比。

图36示出了对于单指导物转染，通过分解追踪***缺失(TIDE)分析的结果。对于用PD-1或CTLA-1指导RNA和CRISPR转染的原代人T细胞，示出了具有缺失或***的序列的百分比。

图37示出了具有双靶向的PD-1序列缺失。

图38示出了具有双靶向的PD-1序列缺失的PCR产物的测序结果。显示样品6和14具有两个gRNA序列的融合体，其间的135bp被切除。

图39示出了CTLA-4的双靶向序列缺失。两个指导RNA序列之间的缺失也存在于双指导靶向CTLA-4(样品9和14)的测序中。T7E1测定通过PCR证实了缺失。

图40A和图40B示出了A.CRISPR转染后第6天人T细胞的活力。B.人T细胞的转染效率的FACS分析(％GFP阳性)。

图41示出了用抗CTLA-4CRISPR指导RNA转染的染色人T细胞中CTLA-4表达的FACS分析。PE为抗人CD152(CTLA-4)。

图42A和图42B示出了用抗CTLA-4指导RNA和CRISPR转染后，CTLA-4阳性人T细胞的CTLA-4FACS分析。B.示出了用抗CTLA-4指导RNA和CRISPR转染后，人T细胞中相对于脉冲对照的CTLA-4敲除效率。

图43示出了含有工程化TCR的微环DNA。

图44描绘了针对CISH、PD-1、CTLA4和AAVS1的经修饰的sgRNA。

图45描绘了用CRISPR和抗PD-1指导RNA转染后第14天PD-1KO的FACS结果。PerCP-Cy5.5为小鼠抗人CD279(PD-1)。

图46A和图46B。A.示出了用抗PD-1CRISPR系统转染后的PD-1表达百分比。B.示出了与仅Cas9的对照相比的PD-1敲除效率百分比。

图47示出了用CRISPR系统与抗PD-1指导物#2、抗PD-1指导物#6、抗PD1指导物#2和#6、或抗PD-1指导物#2和#6以及抗CTLA-4指导物#2和#3转染的人T细胞的FSC/SSC子集的FACS分析。

图48示出了用CRISPR和抗CTLA-4指导RNA转染后第6天人T细胞的FACS分析。PE为小鼠抗人CD152(CTLA-4)。

图49示出了用CRISPR和抗PD-1以及抗CTLA-4指导RNA转染后第1天人T细胞和对照Jurkat细胞的FACS分析。示出了与转染的Jurkat细胞相比，人T细胞的活力和转染效率。

图50描绘了来自用CRISPR和抗CTLA-4指导RNA转染的CTLA-4染色人T细胞的FACS分析的定量数据。示出了转染后第6天CTLA-4表达百分比和敲除百分比的数据。

图51示出了用CRISPR和抗PD-1指导RNA转染的PD-1染色人T细胞的FACS分析。示出了转染后第14天PD-1表达(抗人CD279PerCP-Cy5.5)的数据。

图52示出了与仅Cas9的对照相比，用CRISPR和抗PD-1指导RNA转染的人T细胞的PD-1表达百分比和PD-1敲除百分比。

图53示出了用CRISPR、抗CTLA-4和抗PD-1指导RNA转染的人T细胞的第14天细胞计数和活力。

图54示出了用CRISPR，以及单独的抗PD-1指导物#2，抗PD-1指导物#2和#6，或单独的抗CTLA-4指导物#3进行电穿孔后第14天的人T细胞的FACS数据。将工程化T细胞再刺激48小时以评估CTLA-4和PD-1的表达，并与未用指导RNA进行电穿孔的对照细胞进行比较。

图55示出了用CRISPR，以及抗CTLA-4指导物#2和#3，抗PD-1指导物#2和抗CTLA-4指导物#3，或抗PD-1指导物#2和#6、抗CTLA-4指导物#3和#2进行电穿孔后第14天的人T细胞的FACS数据。将工程化T细胞再刺激48小时以评估CTLA-4和PD-1的表达，并与未用指导RNA进行电穿孔的对照细胞进行比较。

图56描绘了针对原代人T细胞中CISH基因座的CRISPR介导的基因修饰的surveyor测定结果。

图57A、图57B和图57C。A.描绘了T细胞受体(TCR)的示意图。B.示出了嵌合抗原受体的示意图。C.示出了B细胞受体(BCR)的示意图。

图58示出了体细胞突变负荷在各肿瘤类型之间变化。肿瘤特异性新抗原的产生和呈现在理论上与突变负荷成正比。

图59示出了可对核酸进行的假尿苷-5’-三磷酸和5-甲基胞苷-5-三磷酸修饰。

图60示出了用CRISPR和CISH gRNA 1、3、4、5或6转染的293T细胞的TIDE和密度测定数据比较。

图61描绘了用CRISPR和CISH gRNA 1、3、4、5或6转染的293T细胞的密度测定分析的重复实验。

图62A和图62B示出了CISH gRNA 1的重复TIDE分析A和B。

图63A和图63B示出了CISH gRNA 3的重复TIDE分析A和B。

图64A和图64B示出了CISH gRNA 4的重复TIDE分析A和B。

图65A和图65B示出了CISH gRNA 5的重复TIDE分析A和B。

图66A和图66B示出了CISH gRNA 6的重复TIDE分析A和B。

图67示出了Western印迹，其显示在原代T细胞中CRISPR敲除后的CISH蛋白损失。

图68A、图68B和图68C描绘了在用单链或双链DNA转染后

A.1天、B.2天、C.3天，通过细胞计数得到的DNA活力。M13ss/dsDNA为7.25kb。pUC57为2.7kb。GFP质粒为6.04kb。

图69示出了可在工程化细胞制备期间或制备之后调节的机制途径。

图70A和图70B描绘了在A.第3天和B.第7天用CRISPR系统(15μg Cas9，10μg gRNA)转染后的细胞计数。样品1-未处理的。样品2-仅脉冲的。样品3-GFP mRNA。样品4-仅Cas9脉冲。样品5-仅5微克微环供体脉冲。样品6-仅20微克微环供体脉冲。样品7-质粒供体(5微克)。样品8-质粒供体(20微克)。样品9-+指导PD1-2/+Cas9/-供体。样品10-+指导PD1-6/+Cas9/-供体。样品11-+指导CTLA4-2/+Cas9/-供体。样品12-+指导CTLA4-3/+Cas9/-供体。样品13-PD1-2/5ug供体。样品14-PD1双重/5ug供体。样品15-CTLA4-3/5ug供体。样品16-CTLA4双重/5ug供体。样品17-PD1-2/20ug供体。样品18-PD1双重/20ug供体。样品19-CTLA4-3/20ug供体。样品20-CTLA4双重/20ug供体。

图71A和图71B示出了无供体核酸的A.PD-1gRNA 2和B.PD-1gRNA6的第4天TIDE分析。

图72A和图72B示出了无供体核酸的A.CTLA4gRNA 2和B.CTLA4gRNA3的第4天TIDE分析。

图73示出了对照细胞、用5微克供体DNA(微环)电穿孔的细胞或用20微克供体DNA(微环)电穿孔的细胞的第7天TCRβ检测的FACS分析。

图74示出了用CRISPR系统以及无多核酸供体(对照)、5微克多核酸供体(微环)或20微克多核酸供体(微环)电穿孔的第7天T细胞的总结。示出了TCR阳性细胞的FACS分析的总结。

图75示出了TCR微环以正向方向向PD1gRNA#2切割位点中的整合。

图76A和图76B示出了在双链多核酸供体浓度逐渐增加的情况下，使用经CRISPR和具有5’或3’修饰(或两者)的PD-1或CISH gRNA转染的人T细胞的GUIDE-Seq剂量测试得到的第4天活细胞百分比。

B.示出了在用CRISPR和PD-1或CISH特异性gRNA转染的人T细胞的PD-1或CISH基因座处的整合效率。

图77示出了在PD-1或CISH基因位点处的dsDNA整合的GoTaq和PhusionFlex分析。

图78示出了用CRISPR和5微克或20微克编码外源TCR的微环DNA转染的人T细胞的第15天FACS分析。

图79示出了用CRISPR系统以及无多核酸供体(对照)、5微克多核酸供体(微环)或20微克多核酸供体(微环)进行电穿孔的第15天T细胞的总结。示出了TCR阳性细胞的FACS分析的总结。

图80描绘了在CRISPR和编码mTCRb链的微环转染后第4天，相对于RNA酶P的数字PCR拷贝数数据。编码mTCRb链的质粒供体用作对照。

图81A和图81B示出了A.随着编码外源TCR的微环的剂量逐渐增加，第3天的T细胞活力。B.随着编码外源TCR的微环的剂量逐渐增加，第7天的T细胞活力。

图82A和图82B示出了A.T细胞双链DNA转染的Lonza核转染的优化条件。细胞数目对比编码GFP的质粒的浓度。B.用编码GFP蛋白的双链DNA进行T细胞的Lonza核转染的优化条件。相对于用于转染的GFP质粒的浓度示出了转导百分比。

图83A和图83B。A.描绘了用于AAV TCR递送的pDG6-AAV无辅助包装质粒。B.示出了用于293细胞的AAV瞬时转染以产生病毒的方案的示意图。将对病毒进行纯化和储存，以供转导至原代人T细胞中。

图84示出了一种rAAV供体，其编码外源TCR，该外源TCR的侧翼为与内源免疫检查点(CTLA4和PD1作为示例性实例示出)的900bp同源臂。

图85示出了rAAV同源重组供体的基因组整合示意图，该供体编码外源TCR，该外源TCR的侧翼为与AAVS1基因的同源臂。

图86A、图86B、图86C和图86D示出了使用AAVS1系统可发生的可能的重组事件。A.示出了在AAVS1处的双链断裂的同源性指导的修复，以及转基因的整合。B.示出了AAVS1基因一条链的同源性指导的修复以及AAVS1互补链的非同源末端连接***缺失。C.示出了转基因向AAVS1基因位点中的非同源末端连接***以及AAVS1处的非同源末端连接***缺失。D.示出了在两个AAVS1位置处的非同源***缺失以及转基因向基因组位点中的随机整合。

图87示出了将编码外源TCR的转基因引入免疫检查点基因中的组合CRISPR和rAAV靶向方法。

图88A和图88B示出了第3天数据：A.CRISPR电穿孔实验，其中在用7.5微克编码外源TCR的微环供体进行电穿孔期间使用胱天蛋白酶和TBK抑制剂。相比于所用抑制剂的浓度对活力进行绘图。B.示出了电穿孔的效率。相对于所用抑制剂的浓度示出了阳性TCR百分比。

图89示出了用CRISPR和编码外源TCR的微环DNA(7.5微克)进行电穿孔的人T细胞的FACS数据。在电穿孔期间添加胱天蛋白酶和TBK抑制剂。

图90A和图90B示出了用CRISPR和编码外源TCR的微环DNA(20微克)进行电穿孔的人T细胞的FACS数据。A.电穿孔效率，显示TCR阳性细胞与所用免疫检查点特异性指导物。B.电穿孔效率的FACS数据，显示TCR阳性细胞与所用免疫检查点特异性指导物。

图91示出了在不同的微环浓度下，用CRISPR和编码外源TCR的微环进行电穿孔后第13天的TCR表达。

图92A和图92B示出了细胞死亡抑制剂研究，其中在用CRISPR和编码外源TCR的微环DNA进行转染之前用布雷菲德菌素A(Brefeldin A)和ATM抑制剂对人T细胞进行预处理。A.示出了在电穿孔后第3天的T细胞活力。B.示出了在电穿孔后第7天的T细胞活力。

图93A和图93B示出了细胞死亡抑制剂研究，其中在用CRISPR和编码外源TCR的微环DNA进行转染之前用布雷菲德菌素A和ATM抑制剂对人T细胞进行预处理。A.示出了电穿孔后第3天在T细胞上的TCR表达。B.示出了电穿孔后第7天在T细胞上的TCR表达。

图94示出了用来快速检测外源转基因(例如，TCR)整合的剪接受体GFP报告基因测定。

图95示出了用来快速检测外源转基因(例如，TCR)整合的基因座特异性数字PCR测定。

图96示出了使用PGK启动子或剪接受体的编码外源TCR的重组(rAAV)供体构建体。每个构建体的侧翼为与AAVS1检查点基因的850个碱基对的同源臂(HA)。

图97示出了rAAV AAVS1-TCR基因靶向载体。用于将转基因TCR表达盒***到PPP1R12C基因的内含子区域内的AAVS1“安全港”基因座中的rAAV靶向载体的示意性图示。示出了主要特征及其核苷酸数目的大小(bp)。ITR：内部串联重复序列；PGK：磷酸甘油酸激酶；mTCR：鼠T细胞受体β；SV40PolyA：猿猴病毒40聚腺苷酸化信号。

图98示出了在用修饰的gRNA刺激后48小时用GFP+转基因进行电穿孔的T细胞。用假尿苷、5’moC、5’meC、5’moU、5’hmC+5’moU、m6A或5’moC+5’meC对gRNA进行修饰。

图99A和图99B描绘了对于用修饰的gRNA刺激后48小时用GFP+转基因进行电穿孔的T细胞，表达GFP的细胞的A.活力和B.MFI。用假尿苷、5’moC、5’meC、5’moU、5’hmC+5’moU、m6A或5’moC+5’meC对gRNA进行修饰。

图100A和图100B示出了A.修饰的洁净帽(clean cap)Cas9蛋白或B.未修饰的Cas9蛋白的比较的TIDE结果。在用未修饰的Cas9或洁净帽Cas9(15微克Cas9和10微克化学修饰的gRNA)进行电穿孔的T细胞的CCR5基因座处检测到基因组整合。

图101A和图101B示出了表达逆转录酶(RT)报告RNA的Jurkat细胞的A.活力和B.逆转录酶活性，该Jurkat细胞使用Neon转染系统采用编码RT的质粒和引物进行转染(浓度参见表格)并测定转染后第3天的细胞活力和GFP表达。GFP阳性细胞表示具有RT活性的细胞。

图102A和图102B示出了人TIL刺激前后的绝对细胞计数。

A.示出了在RPMI培养基或离体培养基中培养的刺激前后的第一供体细胞计数。B.示出了在RPMI培养基中培养的刺激前后的第二供体细胞计数。

图103A和图103B示出了用靶向PD-1基因座的CRISPR系统进行电穿孔的人肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)或对照细胞的细胞扩充，其中A.添加了自体饲养细胞，或B.未添加自体饲养细胞。

图104A和图104B示出了用以下物质进行电穿孔的人T细胞：单独的CRISPR系统(对照)；单独的GFP质粒(供体)(对照)；供体和CRISPR系统；供体、CRISPR和cFLP蛋白；供体、CRISPR和hAd5E1A(E1A)蛋白；或供体、CRISPR和HPV18E7蛋白。在电穿孔后A.48小时或B.8天进行GFP的FACS分析。

图105示出了在有血清转染后第4天的T细胞的流式细胞术分析，该T细胞使用CRISPR系统，用含有编码剪接受体GFP的转基因的重组AAV(rAAV)载体进行转染。示出的条件是Cas9和gRNA、GFP mRNA、Virapur低滴度病毒、Virapur低滴度病毒和CRISPR、SA-GFPpAAV质粒、SA-GFP pAAV质粒和CRISPR、AAVananced病毒，或AAVanced病毒和CRISPR。

图106示出了在无血清转染后第4天的T细胞的流式细胞术分析，该T细胞使用CRISPR系统，用含有编码剪接受体GFP的转基因的重组AAV(rAAV)载体进行转染。示出的条件是Cas9和gRNA、GFP mRNA、Virapur低滴度病毒、Virapur低滴度病毒和CRISPR、SA-GFPpAAV质粒、SA-GFP pAAV质粒和CRISPR、AAVananced病毒，或AAVanced病毒和CRISPR。

图107A和图107B示出了A.在有血清转染后第7天的T细胞的流式细胞术分析，该T细胞使用CRISPR系统，用含有编码剪接受体GFP的转基因的重组AAV(rAAV)载体进行转染。示出的条件是SA-GFP pAAV质粒以及SA-GFP pAAV质粒和CRISPR。B.在有血清或无血清转染后第7天的T细胞的流式细胞术分析，该T细胞使用CRISPR系统，用含有编码剪接受体GFP的转基因的重组AAV(rAAV)载体进行转染。示出的条件是仅AAVanced病毒或AAVanced病毒和CRISPR。

图108显示了在转染时(+)、血清去除和转染后4小时或血清去除和转染后16小时，SA-GFP pAAV质粒或SA-GFP pAAV质粒和CRISPR转染后的细胞活力。

图109示出了在有血清、4小时去除血清或16小时去除血清的条件下，在3-4天时剪接受体-GFP(SA-GFP)pAAV质粒的敲入的读出。将对照(未转染的)细胞与仅用SA-GFP pAAV质粒或用SA-GFP pAAV质粒和CRISPR转染的细胞进行比较。

图110示出了以1x10⁵MOI、3x10⁵MOI或1x10⁶MOI的浓度用编码SA-GFP转基因的rAAV或rAAV和CRISPR转染的人T细胞在转染后第3天的FACS分析。

图111示出了以1x10⁵MOI、3x10⁵MOI或1x10⁶MOI的浓度用编码SA-GFP转基因的rAAV或rAAV和CRISPR转染的人T细胞在转染后第7天的FACS分析。

图112示出了以1x10⁵MOI、3x10⁵MOI或1x10⁶MOI的浓度用编码TCR转基因的rAAV或rAAV和CRISPR转染的人T细胞在转染后第3天的FACS分析。

图113示出了以1x10⁵MOI、3x10⁵MOI或1x10⁶MOI的浓度用编码TCR转基因的rAAV或rAAV和CRISPR转染的人T细胞在转染后第7天的FACS分析。

图114A和图114B显示了在4小时、6小时、8小时、12小时、18小时和24小时的时间点，用A.仅Cas9和gRNA或B.rAAV、CRISPR和SA-GFP转基因转染的人T细胞的FACS分析。

图115A和图115B示出了A.在刺激后第4天，rAAV转导(％GFP+)随时间的变化。B.示出了在刺激后第4天，在4小时、6小时、8小时、12小时、18小时和24小时的时间点，用rAAV转染或未转染的细胞的活细胞计数。

图116示出了以1x10⁵MOI、3x10⁵MOI、1x10⁶MOI、3x10⁶MOI或5x10⁶MOI的浓度用编码SA-GFP转基因的rAAV或rAAV和CRISPR转染的人T细胞在转染后第4天的FACS分析。

图117A和图117B示出了A.以不同的感染复数(MOI)水平(1至5x10⁶)用编码SA-GFP转基因的AAV载体转染的人T细胞在刺激后第4天的GFP阳性(GFP+ve)表达。B.以0至5x10⁶的MOI水平用编码SA-GFP转基因的AAV转染或未转染的人T细胞在刺激后第4天的活细胞数目。

图118示出了在刺激后第4天，用rAAV或rAAV和CRISPR转染的人T细胞的FACS分析。以1x10⁵MOI、3x10⁵MOI、1x10⁶MOI、3x10⁶MOI或5x10⁶MOI的MOI水平将细胞转染。

图119示出了以不同的感染复数(MOI)水平(1至5x10⁶)用编码TCR转基因的AAV载体转染的人T细胞在刺激后第4天的TCR阳性(TCR+ve)表达。

图120A和图120B示出了A.人T细胞的表达效率百分比，该T细胞用编码SA-GFP转基因的AAV、编码TCR转基因的AAV、靶向CISH和TCR转基因的CRISPR、或靶向CTLA-4和TCR转基因的CRISPR进行病毒转染。B.为FACS图，其显示用靶向CISH或CTLA-4基因的rAAV或rAAV和CRISP gRNA转染的细胞在刺激后第4天的TCR表达。

图121A和图121B描绘了在刺激后第4天在人T细胞上的TCR表达的FACS图。A.示出了对照未转染的细胞，而B.示出了用仅AAS1pAAV质粒、靶向CISH和pAAV的CRISPR、靶向CTLA-4和pAAV的CRISPR、NHEJ微环载体、AAVS1pAAV和CRISPR、靶向CISH和pAAV-CISH质粒的CRISIR、CTLA-4pAAV质粒和CRISPR，或NHEJ微环和CRISPR转染的细胞。

图122A和图122B示出了A.以1x10⁵MOI、3x10⁵MOI、1x10⁶MOI的MOI用编码SA-GFP的rAAV转染的人T细胞在转染后第3天或转染前(对照)的GFP阳性(GFP+)表达百分比。B.以1x10⁵MOI、3x10⁵MOI至1x10⁶的MOI用编码TCR转基因的rAAV转染的人T细胞在转染后第3天或转染前(对照)的TCR阳性表达。

图123A和图123B示出了A.用编码TCR的rAAV病毒转染后4至19天，在人T细胞上的外源TCR表达。B.用编码SA-GFP的rAAV病毒转染后2至19天，在人T细胞上的SA-GFP表达。

图124描绘了在转染后第14天，以1x10⁵MOI、3x10⁵MOI或1x10⁶的MOI用rAAV或rAAV+CRISPR(每个rAAV编码SA-GFP转基因)转染的人T细胞的FACS图。

图125描绘了在转染后第14天，以1x10⁵MOI、3x10⁵MOI或1x10⁶的MOI用rAAV或rAAV+CRISPR(每个rAAV编码TCR转基因)转染的人T细胞的FACS图。

图126示出了在转染后第19天，以1x10⁵MOI、3x10⁵MOI或1x10⁶的MOI用rAAV或rAAV+CRISPR(每个rAAV编码SA-GFP转基因)转染的人T细胞的FACS图。

图127示出了在转染后第19天，以1x10⁵MOI、3x10⁵MOI或1x10⁶的MOI用rAAV或rAAV+CRISPR(每个rAAV编码TCR转基因)转染的人T细胞的FACS图。

图128示出了在转染后第3或4天、第7天、第14天或第19天，用编码SA-GFP或TCR的AAV转染的人T细胞的FACS图。X轴显示转基因表达。

图129A和图129B示出了A.在刺激后第3至14天，以1x10⁵MOI、3x10⁵MOI、1x10⁶、3x10⁶MOI或5x10⁶的MOI用编码TCR的rAAV转染的人T细胞上的TCR表达。B.示出了在有CRISPR和没有CRISPR的情况下以1x10⁵MOI、3x10⁵MOI、1x10⁶、3x10⁶MOI或5x10⁶的MOI用编码TCR的rAAV转染的细胞在刺激后第14天的活细胞数目。

图130示出了以1x10⁵MOI、3x10⁵MOI、1x10⁶、3x10⁶MOI或5x10⁶的MOI用仅rAAV或rAAV和CRISPR转染的细胞在刺激后第14天的TCR表达。

图131示出了从第4天至第14天，用靶向CISH基因并编码TCR的仅rAAV或rAAV和CRISPR转染的细胞的TCR表达。

图132示出了从第4天至第14天，用靶向CTLA-4基因并编码TCR的仅rAAV或rAAV和CRISPR转染的细胞的TCR表达。

图133A和图133B示出了用编码SA-GFP的转基因转染的人T细胞在刺激后第3天的GFP FACS数据。A.未转染的对照或GFP mRNA转染的对照细胞。B.无病毒蛋白质、仅E4orf6、E1b55k H373A或E4orf6+E1b55K H373A的rAAV脉冲的或rAAV和CRISPR转染的细胞。

图134示出了在采用无病毒蛋白质或采用E4orf6和E1b55k H373A用rAAV脉冲或rAAV和CRISPR刺激后第3天，用编码TCR的rAAV转染的人T细胞的FACS分析。AAVS1基因用于TCR整合。

图135A和图135B示出了在采用无病毒蛋白质或采用E4orf6和E1b55k H373A用rAAV脉冲或rAAV和CRISPR刺激后第3天，用编码TCR的rAAV转染的人T细胞的FACS分析。CTLA4基因用于TCR整合。B示出了未转染的对照和仅微环的对照的FACS数据。

图136A和图136B示出了在刺激后第3天，用编码TCR的rAAV转染的人T细胞的表达数据。A.与对照细胞(NT)相比，具有CTLA4、PD-1、AAVS1或CISH的基因组修饰的T细胞上TCR表达的流式细胞术数据的总结。B.与对照细胞(NT)相比，具有CTLA4、PD-1、AAVS1或CISH的基因组修饰的T细胞的TCR表达的流式细胞术数据。

图137A和图137B示出了在刺激后第3天和第7天，用编码TCR的rAAV转染的人T细胞的表达数据。A.在第3天和第7天，与对照细胞(NT)相比，具有CTLA4、PD-1、AAVS1或CISH的基因组修饰的T细胞上TCR表达的流式细胞术数据的总结。B.在刺激后第7天，与对照细胞(NT)相比，具有CTLA4、PD-1、AAVS1或CISH的基因组修饰的T细胞的TCR表达的流式细胞术数据。

图138为rAAV供体设计的示意图。

图139示出了用rAAV转导后第14天的TCR表达。还用CRISPR修饰细胞以敲低PD-1或CTLA-4。示出了工程化细胞与非转导(NT)细胞相比的数据。

图140示出了用rAAV敲入TCR后的PD-1和CTLA-4表达。示出了转染后第17天的FACS数据。

图141A示出了针对多个PBMC供体的CRISPR和rAAV工程化细胞的TCR表达百分比。图141B示出了针对供体91、92和93的单核苷酸多态性(SNP)数据。

图142示出了针对多个供体的在PD-1、AAVS1、CISH和CTLA-4处的SNP频率。

图143示出了来自针对被工程化为表达TCR并具有CISH敲除的细胞的mTOR测定的数据。数据总结针对电穿孔后第3、7和14天。

图144示出了对于使用CRISPR和rAAV被工程化为表达外源TCR并具有CISH敲除的T细胞，相比于参考对照的CISH拷贝数。

图145A示出了在CISH KO后第3、7、14天，mTOR1相比于GAPDH对照的ddPCR数据。图145B示出了在CISH KO和经由rAAV敲入TCR后第3、7、14天的TCR表达。

图146A示出了对于在PD-1处是否存在***缺失的脱靶(OT)分析的总结。图146B示出了对于在CISH处是否存在***缺失的脱靶分析的总结。

图147A示出了相对于掺入的TCR的数字PCR引物和探针放置。图147B示出了数字PCR数据，其显示对于未处理的细胞和经CRISPR CISH KO+rAAV修饰的细胞，相对于参照基因的整合TCR。

图148A示出了在CISH KO细胞中通过ddPCR的TCR整合的百分比。图148B示出了在用CRISPR进行电穿孔和用rAAV转导后第3、7和14天的TCR整合和蛋白质表达。

图149示出了数字PCR数据，其显示对于未处理的细胞和经CRISPR CTLA-4KO+rAAV修饰的细胞，相对于参照基因的整合TCR。

图150A示出了在第3、7和14天，在CTLA-4KO细胞中通过ddPCR的TCR整合的百分比。图150B示出了在用CRISPR CTLA-4KO进行电穿孔和用编码外源TCR的rAAV转导后第3、7和14天的TCR整合和蛋白质表达。

图151示出了在用rAAV转染(用2x 10⁵个细胞进行小规模转染，以及用1x 10⁶个细胞进行大规模转染)和用CRISPR进行电穿孔后第3、7和14天，完美TCR表达的流式细胞术数据。

图152示出了对于经CRISPR处理的细胞(2x 10⁵个细胞)，在用rAAV转导后第14天通过FACS分析得到的TCR表达。还用CRISPR和针对CTLA-4或PD-1的指导RNA对细胞进行电穿孔。

图153示出了针对多个PBMC供体，在AAVS1、PD-1、CISH或CTLA-4处用rAAV和CRISPRKO转导后第14天的TCR表达百分比。

图154示出了利用8pmol双链(ds)或16pmol ds供体(ODN)，在CISH处的GUIDE-seq数据。

图155A示出了rAAV载体的载体图谱，其编码具有与PD-1的同源臂的外源TCR。图155B示出了rAAV载体的载体图谱，其编码具有与PD-1的同源臂和MND启动子的外源TCR。

图156示出了不使用裂解缓冲液或使用裂解缓冲液的单细胞PCR的比较。细胞用CRISPR处理并在CISH基因处具有敲除。

图157A示出了显示TCR敲入的示意图。图157B示出了具有rAAV TCR敲入的细胞的Western印迹。

图158示出了在用CRISPR和抗CISH指导RNA转染后第28天，在CISH基因座处的单细胞PCR。还用编码外源TCR的rAAV转导细胞。

图159A示出了在用编码外源TCR的rAAV转导后第7天的TCR表达。图159B示出了在用编码外源TCR的rAAV转导后第7天的Western印迹。

图160示出了HIF-1及其参与代谢的示意图。

具体实施方式

以下描述和实施例详细阐明了本公开内容的实施方案。应当理解，本公开内容不限于本文所述的特定实施方案，因此可以变化。本领域技术人员将会认识到，本公开内容存在许多变化和修改，其包含在本发明的范围内。

定义

术语“AAV”或“重组AAV”或“rAAV”是指任何已知血清型的腺相关病毒，包括AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11或AAV-12、自身互补AAV(scAAV)、rh10或杂合AAV，或其任意组合、衍生物或变体。AAV是一种小的无包膜单链DNA病毒。它们是非致病性细小病毒，并且其复制可能需要辅助病毒，如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒和CMV。野生型AAV常见于一般群体中，并且与任何已知的病理学无关。杂合AAV是包含来自AAV和来自不同病毒的遗传物质的AAV。嵌合AAV是包含来自两种或更多种AAV血清型的遗传物质的AAV。AAV变体是与其亲本AAV相比在其衣壳蛋白中包含一个或多个氨基酸突变的AAV。如本文所用，AAV包括禽类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类动物AAV、非灵长类动物AAV和羊AAV，其中灵长类动物AAV是指感染灵长类动物的AAV，并且其中非灵长类动物AAV是指感染非灵长类动物的AAV，如感染禽类动物的禽类AAV。在一些情况下，野生型AAV含有rep和cap基因，其中rep基因是病毒复制所必需的，而cap基因是衣壳蛋白合成所必需的。

术语“重组AAV载体”或“rAAV载体”或“AAV载体”是指衍生自上述任何AAV血清型的载体。在一些情况下，AAV载体可包含一种或多种AAV野生型基因如rep和/或cap基因的完全或部分缺失，但含有包装和使用AAV病毒进行基因疗法所需的功能元件。例如，已知在开放阅读框架或克隆的外源序列侧翼的功能性反向末端重复序列或ITR序列对于AAV病毒粒子的复制和包装是至关重要的，但ITR序列可从野生型核苷酸序列进行修饰，包括核苷酸的***、缺失或置换，使得该AAV适用于本文所述的实施方案，如基因疗法或基因递送系统。在一些方面，可以使用自身互补载体(sc)，如自身互补AAV载体，其可绕过对病毒第二链DNA合成的需要并且可使转基因蛋白质的表达率更高，如通过引用并入本文的Wu,Hum GeneTher.2007,18(2):171-82中所述。在一些方面，可以产生AAV载体以允许选择最佳血清型、启动子和转基因。在一些情况下，该载体可以是靶向载体或选择性结合或感染免疫细胞的修饰载体。

术语“AAV病毒粒子”或“rAAV病毒粒子”是指包含衣壳的病毒颗粒，该衣壳包含包裹如本文所述的AAV载体的至少一种AAV衣壳蛋白，其中在一些实施方案中，该载体可进一步包含异源多核苷酸序列或转基因。

如本文所用的涉及参考数值及其语法等同语的术语“约”及其语法等同语可包括从该值加上或减去10％的数值范围。例如，“约10”的量包括9至11的量。涉及参考数值的术语“约”还可包括从该值加上或减去10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数值范围。

如本文所用的术语“激活(活化)”及其语法等同语可指使细胞从静息状态转变成活跃状态的过程。该过程可包括对抗原的应答、迁移和/或向功能活性状态的表型或遗传改变。例如，术语“激活(活化)”可指T细胞激活的逐步过程。例如，T细胞可能需要至少两种信号来变得完全激活。第一种信号可在TCR被抗原-MHC复合物接合之后发生，而第二种信号可通过共刺激分子接合而发生。在体外，抗CD3可模拟第一种信号，而抗CD28可模拟第二种信号。

如本文所用的术语“邻近(相邻)”及其语法等同语可指正好在参考对象旁边。例如，在核苷酸序列的语境下的术语邻近(相邻)可意指其间没有任何核苷酸。例如，多核苷酸A与多核苷酸B相邻(邻近)可意指在A与B之间没有任何核苷酸的AB。

如本文所用的术语“抗原”及其语法等同语可指含有能够被一个或多个受体结合的一个或多个表位的分子。例如，抗原可在被呈递时刺激宿主的免疫系统，以产生细胞抗原特异性免疫应答，或者可产生体液抗体应答。抗原还可具有自身或在与另一分子组合存在时引发细胞和/或体液应答的能力。例如，肿瘤细胞抗原可被TCR识别。

如本文所用的术语“表位”及其语法等同语可指可以被抗体、B细胞、T细胞或工程化细胞识别的抗原的一部分。例如，表位可以是被TCR识别的癌症表位。抗原内的多个表位也可被识别。表位也可是突变的。

如本文所用的术语“自体的”及其语法等同语可指来源于相同的生物体。例如，可将样品(例如，细胞)取出、处理，并在以后的时间返回至同一受试者(例如，患者)。自体过程不同于同种异体过程，在同种异体过程中，供体和接受者是不同的受试者。

术语“条形码化为”是指分子之间的关系，其中第一分子含有可用来鉴别第二分子的条形码。

如本文所用的术语“癌症”及其语法等同语可指其独特性状(丧失正常控制)导致不受调节的生长、缺乏分化、局部组织侵入和转移的细胞过度增殖。对于本发明的方法而言，癌症可以是任何癌症，包括以下任一种：急性淋巴细胞癌、急性髓样白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、***癌、肛管癌、直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓样癌、结肠癌、食管癌、***、纤维肉瘤、胃肠类癌瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病、液体肿瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌和肠系膜癌、咽癌、***癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌和/或尿膀胱癌。如本文所用的，术语“肿瘤”是指，例如，恶性类型或良性类型的细胞或组织异常生长。

如本文所用的术语“癌症新抗原”或“新抗原”或“新表位”及其语法等同语可指不在正常的、未突变的宿主基因组中编码的抗原。在一些情况下，“新抗原”可代表由于体细胞突变而产生的致癌病毒蛋白质或异常蛋白质。例如，新抗原可通过经由病毒蛋白质活性破坏细胞机制而产生。另一实例可以是致癌化合物的暴露，该致癌化合物在一些情况下可导致体细胞突变。这种体细胞突变最终可导致肿瘤/癌症的形成。

如本说明书中所用的术语“细胞毒性”是指细胞正常状态的非预期或不希望的改变。细胞的正常状态可指在细胞暴露于细胞毒性组合物、药剂和/或条件之前所表现或存在的状态。通常，处于正常状态的细胞是处于稳态中的细胞。细胞正常状态的非预期或不希望的改变可以以例如细胞死亡(例如，程序性细胞死亡)、复制潜能的降低、细胞完整性如膜完整性的降低、代谢活性的降低、发育能力的降低或本申请中公开的任何细胞毒性效应的形式表现出来。

短语“减少细胞毒性”或“降低细胞毒性”是指细胞暴露于细胞毒性组合物、药剂和/或条件后，细胞正常状态的非预期或不希望的改变的程度或频率降低。该短语可指降低暴露于细胞毒性组合物、药剂和/或条件的单个细胞中的细胞毒性程度，或指降低当细胞群体暴露于细胞毒性组合物、药剂和/或条件时群体中表现出细胞毒性的细胞数目。

如本文所用的术语“工程化的”及其语法等同语可指核酸，例如，生物体基因组内的核酸的一个或多个改变。术语“工程化的”可指基因的改变、添加和/或缺失。工程化细胞也可指具有添加、缺失和/或改变的基因的细胞。

如本文所用的术语“细胞”或“工程化细胞”或“遗传修饰细胞”及其语法等同语可指人或非人动物来源的细胞。术语“工程化细胞”和“遗传修饰细胞”在本文中可互换使用。

如本文所用的术语“检查点基因”及其语法等同语可指参与用来调节免疫应答幅度的抑制过程(例如，反馈环)(例如，减少有害应答的不受控传播的免疫抑制性反馈环)的任何基因(例如，CTLA-4和PD-1)。这些应答可包括促成分子屏，该分子屏防止可能在针对感染的免疫应答和/或维持外周自身耐受性期间发生的旁侧组织损伤。检查点基因的非限制性实例可包括延伸的CD28受体家族成员及其配体以及参与共抑制途径的基因(例如，CTLA-4和PD-1)。术语“检查点基因”也可指免疫检查点基因。

“CRISPR”、“CRISPR系统”或“CRISPR核酸酶系统”及其语法等同语可包括与具有核酸酶功能(例如，两个核酸酶结构域)的DNA和Cas蛋白(例如，Cas9)结合的非编码RNA分子(例如，指导RNA)。参见，例如，Sander,J.D.等人,“CRISPR-Cas systems for editing,regulating and targeting genomes,”Nature Biotechnology,32:347–355(2014)；还参见，例如，Hsu,P.D.等人,“Development and applications of CRISPR-Cas9for genomeengineering,”Cell 157(6):1262-1278(2014)。

如本文所用的术语“破坏”及其语法等同语可指例如通过切割、缺失、***、突变、重排或其任意组合而改变基因的过程。破坏可导致蛋白质表达的敲除或敲低。敲除可以是完全或部分敲除。例如，基因可通过敲除或敲低而被破坏。破坏基因可部分降低或完全抑制由该基因所编码的蛋白质的表达。破坏基因还可引起不同基因，例如，下游基因的激活。在一些情况下，术语“破坏”可与诸如抑制、中断或工程化等术语互换使用。

如本文所用的术语“功能”及其语法等同语可指执行、具有或服务于预期目的的能力。功能性的可包括从基线到正常功能的100％的任何百分比。例如，功能性的可包括正常功能的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和/或100％，或大约以上百分比。在一些情况下，术语功能性的可意指超过正常功能的100％或大约100％，例如，正常功能的125％、150％、175％、200％、250％、300％和/或以上。

如本文所用的术语“基因编辑”及其语法等同语可指***、替代或从基因组中去除一个或多个核苷酸的遗传工程化。可使用核酸酶(例如，天然存在的核酸酶或人工改造的核酸酶)进行基因编辑。

如本文所用的术语“突变”及其语法等同语可包括多核苷酸中一个或多个核苷酸的置换、缺失和***。例如，多核苷酸(cDNA，基因)或多肽序列中的至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50个或更多个核苷酸/氨基酸可被置换、删除和/或***。突变可影响基因或其调节序列的编码序列。突变还可影响基因组序列的结构或所编码的mRNA的结构/稳定性。

如本文所用的术语“非人动物”及其语法等同语可包括除人之外的所有动物物种，包括非人哺乳动物，其可以是天然动物或遗传修饰的非人动物。术语“核酸”、“多核苷酸”、“多核酸”和“寡核苷酸”及其语法等同语可互换使用，并且可指呈线性或环状构象且为单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。对本公开内容而言，这些术语不应被解释为对于长度的限制。这些术语还可涵盖天然核苷酸的类似物以及在碱基、糖和/或磷酸部分(例如，硫代磷酸骨架)中修饰的核苷酸。这些术语的修饰还可涵盖去甲基化、CpG甲基化的添加、细菌甲基化的去除和/或哺乳动物甲基化的添加。通常，特定核苷酸的类似物可具有相同的碱基配对特异性，即，A的类似物可与T进行碱基配对。

如本文所用的术语“外周血淋巴细胞”(PBL)及其语法等同语可指在血液(例如，外周血)中循环的淋巴细胞。外周血淋巴细胞可指不定位于器官的淋巴细胞。外周血淋巴细胞可包括T细胞、NK细胞、B细胞或其任意组合。

如本文所用的术语“表型”及其语法等同语可指生物体的可观察特征或性状，如其形态、发育、生化或生理特性、物候、行为和行为产物的组合。根据语境，术语“表型”有时可指群体的可观察特征或性状的组合。

如本文所用的术语“前间区(protospacer)”及其语法等同语可指能够与指导RNA的一部分如指导RNA的间隔区序列或工程化靶向部分杂交的PAM邻近核酸序列。前间区可以是被指导RNA靶向的基因、基因组或染色体内的核苷酸序列。在天然状态下，前间区与PAM(前间区邻近基序)相邻。由RNA指导的核酸酶切割的位点在前间区序列内。例如，当指导RNA靶向特定的前间区时，Cas蛋白将在前间区序列内产生双链断裂，从而切割前间区。在切割之后，前间区的破坏可导致非同源末端连接(NHEJ)或同源性指导的修复(HDR)。前间区的破坏可导致前间区的缺失。另外或备选地，前间区的破坏可导致外源核酸序列***到前间区中或替代前间区。

如本文所用的术语“接受者”及其语法等同语可指人或非人动物。接受者也可以是有需要的接受者。

如本文所用的术语“重组”及其语法等同语可指两个多核酸之间遗传信息交换的过程。对本公开内容而言，“同源重组”或“HR”可指例如在双链断裂修复期间可能发生的此类遗传交换的特化形式。该过程可能需要核苷酸序列同源性，例如，使用供体分子进行靶分子(例如，经历双链断裂的分子)的模板修复，并且有时被称为非交叉基因转换或短程基因转换。此类转移还可涉及在破坏的靶标与供体之间形成的异源双链体DNA的错配校正，和/或依赖于合成的链退火(其中供体可用来重新合成可成为靶标的一部分的遗传信息)，和/或相关过程。这样的特化HR通常可导致靶分子序列的改变，使得供体多核苷酸的部分或全部序列可并入靶多核苷酸中。在一些情况下，术语“重组臂”和“同源臂”可互换使用。

术语“靶载体”和“靶向载体”在本文中可互换使用。

如本文所用的术语“转基因”及其语法等同语可指被转移到生物体中的基因或遗传物质。例如，转基因可以是含有被引入生物体中的基因的DNA的片段或区段。当转基因被转移到生物体中时，该生物体于是被称为转基因生物体。转基因可保留其在转基因生物体中产生RNA或多肽(例如，蛋白质)的能力。转基因可由不同的核酸例如RNA或DNA组成。转基因可编码工程化T细胞受体，例如TCR转基因。转基因可包含TCR序列。转基因可包含重组臂。转基因可包含工程化位点。

如本文所用的术语“T细胞”及其语法等同语可指来自任何来源的T细胞。例如，T细胞可以是原代T细胞，例如，自体T细胞、细胞系等。T细胞也可以是人类或非人类T细胞。

如本文所用的术语“TIL”或肿瘤浸润性淋巴细胞及其语法等同语可指从肿瘤分离的细胞。例如，TIL可以是迁移到肿瘤的细胞。TIL也可以是已浸润肿瘤的细胞。TIL可以是在肿瘤内发现的任何细胞。例如，TIL可以是T细胞、B细胞、单核细胞、自然杀伤细胞或其任意组合。TIL可以是混合的细胞群体。TIL群体可包含不同表型的细胞、不同分化程度的细胞、不同谱系的细胞或其任意组合。

如果所治疗的病况发生变化，则可能出现“治疗效果”。该变化可以是正面的或反面的。例如，“正面效果”可对应于受试者中激活的T细胞的数目增加。在另一个实例中，“反面效果”可对应于受试者中肿瘤的量或大小的减小。如果改善至少10％，优选至少25％，更优选至少50％，甚至更优选至少75％，最优选100％，则存在所治疗的病况的“变化”。该变化可基于个体中所治疗病况的严重程度的改善，或基于采用和未采用治疗性组合物(该治疗性组合物与本发明的组合物联合施用)进行治疗的个体群体中改善的病况的频率差异。类似地，本公开内容的方法可包括向受试者施用“治疗有效”的量的细胞。术语“治疗有效的”应当理解成具有对应于“具有治疗效果”的定义。

如本文所用的术语“安全港(safe harbor)”和“免疫安全港(immune safeharbor)”及其语法等同语可指可用于整合外源核酸的基因组内的位置，其中该整合不会通过单独添加核酸对宿主细胞的生长造成任何显著的影响。安全港的非限制性实例可包括HPRT、AAVS SITE(例如，AAVS1、AAVS2等)、CCR5或Rosa26。例如，已知人细小病毒AAV优先整合到人染色体19q13.3-qter或AAVS1基因座中。在AAVS1基因座处整合感兴趣的基因可支持转基因在各种细胞类型中的稳定表达。在一些情况下，核酸酶可被工程化为以在AAVS1基因座处产生双链断裂为目标，以允许转基因在AAVS1基因座处整合或促进AAVS1基因座处的同源重组，以便在AAVS1位点处整合外源核酸序列，如转基因、细胞受体或本文公开的任何感兴趣的基因。在一些情况下，使用AAV病毒载体来递送转基因，以便在有或没有外源核酸酶的情况下在AAVS1位点处进行整合。

如本文所用的术语“序列”及其语法等同语可指核苷酸序列，该核苷酸序列可以是DNA或RNA；可以是线性的、环状的或分支的；并且可以是单链的或双链的。序列可以突变。序列可以是任何长度，例如，2至1,000,000个或更多个核苷酸的长度(或在其之间或其以上的任何整数值)，例如，约100至约10,000个核苷酸，或约200至约500个核苷酸。

术语“病毒载体”是指源自病毒的基因转移载体或基因递送系统。可使用本领域已知的重组技术构建这样的载体。在一些方面，用于衍生出这样的载体的病毒选自腺相关病毒(AAV)、依赖于辅助病毒的腺病毒、杂合腺病毒、EB病毒、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、日本血凝病毒(HVJ)、莫洛尼鼠白血病病毒、痘病毒和基于HIV的病毒。

概述

本文公开了产生遗传修饰细胞群体的方法。在一些情况下，至少一种方法包括提供来自人类受试者的细胞群体。在一些情况下，至少一种方法包括通过在至少一种基因(例如，细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因和/或T细胞受体(TCR)基因)中引入至少一个断裂来修饰(例如，离体)所述细胞群体中的至少一个细胞。在一些情况下，断裂可以抑制所述至少一种基因的蛋白质功能(例如，抑制CISH和/或TCR蛋白质功能)。在一些情况下，基因抑制可以是部分的或完全的。在一些情况下，使用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统和/或指导多核酸引入断裂。在一些情况下，使用包含核酸酶和/或指导多核酸的CRISPR系统引入断裂。在一些情况下，使用核酸酶或包含核酸酶的多肽和/或指导多核酸引入断裂。在一些情况下，指导多核酸与至少一个细胞或多个细胞中的至少一种基因(例如，CISH和/或TCR)特异性结合。在一些情况下，将腺相关病毒(AAV)载体引入到所述细胞群体中的至少一个细胞中。在一些情况下，所述AAV包含至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因。在一些情况下，所述AAV将所述外源转基因整合到所述至少一个细胞的基因组中。在一些情况下，所述AAV在CRISPR系统和/或指导多核酸和/或核酸酶或编码核酸酶的多肽之后、同时或之前引入。在一些情况下，可以使用微环载体将至少一种外源转基因整合到至少一个细胞的基因组中。在一些情况下，将所述至少一种外源转基因整合到所述断裂处。在一些情况下，将所述至少一种外源转基因随机地和/或位点特异性地整合到所述基因组中。在一些情况下，至少一次将所述至少一种外源转基因整合到所述基因组中。在一些情况下，与在可比细胞中使用微环载体相比，使用AAV载体整合所述至少一种外源转基因降低细胞毒性。在一些情况下，在引入所述AAV载体后约4天，所述细胞群体包含至少约90％的活细胞。在一些情况下，通过荧光激活细胞分选(FACS)测量细胞活力。在一些情况下，所述遗传修饰细胞群体中至少约10％的细胞表达所述至少一种外源转基因。在一些情况下，所述AAV载体包含修饰的AAV。

本文公开了治疗人类受试者的癌症的方法。在一些情况下，方法包括向人类受试者施用治疗有效量的离体遗传修饰细胞群体。在一些情况下，至少一个所述离体遗传修饰细胞包含至少一种基因(例如，细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因和/或TCR)中的基因组改变。在一些情况下，所述基因组改变导致所述至少一个离体遗传修饰细胞中至少一种基因(例如，CISH和/或TCR)蛋白质功能的抑制(例如，部分的或完全的)。在一些情况下，所述基因组改变是通过成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统引入的。在一些情况下，所述至少一个离体遗传修饰细胞进一步包含编码T细胞受体(TCR)的外源转基因。在一些情况下，所述外源转基因通过腺相关病毒(AAV)载体被引入到所述至少一个遗传修饰细胞的基因组中。在一些情况下，施用治疗有效量的所述遗传修饰细胞群体在人类受试者中治疗癌症或改善癌症的至少一种症状。在一些情况下，所述AAV载体包含修饰的AAV。

本文公开了遗传修饰细胞离体群体。在一些情况下，遗传修饰细胞离体群体包含至少一种基因(例如，细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因和/或TCR基因)中的外源基因组改变。在一些情况下，所述基因组改变抑制至少一个遗传修饰细胞中的所述至少一种基因(例如，CISH和/或TCR)蛋白质功能。在一些情况下，所述群体进一步包含腺相关病毒(AAV)载体。在一些情况下，所述群体包含微环载体，而不是AAV载体。在一些情况下，所述AAV载体(或微环载体)包含至少一种外源转基因。在一些情况下，所述外源转基因编码T细胞受体(TCR)，以供***到所述至少一个遗传修饰细胞的基因组中。在一些情况下，所述AAV载体包含修饰的AAV。在一些情况下，所述AAV载体包含未修饰的或野生型AAV。在一些情况下，向受试者施用治疗有效量的所述群体以治疗或改善癌症。在一些情况下，与提供分别由相应未修饰的或野生型AAV载体或由微环产生的相同治疗效果所需的细胞数目相比，所述治疗有效量的所述群体包含较少数目的细胞。

本文公开了用于将至少一种外源转基因引入细胞中的系统。在一些情况下，系统包含核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸。在一些情况下，所述系统进一步包含腺相关病毒(AAV)载体。在一些情况下，所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸在至少一个细胞的至少一种基因(例如，细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因和/或TCR基因)中引入双链断裂。在一些情况下，所述AAV载体向所述细胞的基因组中引入至少一种外源转基因。在一些情况下，所述至少一种外源转基因编码T细胞受体(TCR)。在一些情况下，所述系统包含微环载体，而不是AAV载体。在一些情况下，所述微环载体向细胞的基因组中引入至少一种外源转基因。在一些情况下，与包含微环和所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸的类似系统(其中所述微环向所述基因组中引入所述至少一种外源转基因)相比，所述系统具有较高的向所述基因组中引入所述转基因的效率，并且导致更低的细胞毒性。在一些情况下，所述AAV载体包含修饰的AAV。在一些情况下，所述AAV载体包含未修饰的或野生型AAV。

本文公开了治疗人类受试者的癌症的方法。在一种情况下，治疗癌症的方法包括离体修饰来自人类受试者的细胞群体中的至少一种基因(例如，细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因和/或TCR基因)。在一些情况下，所述修饰包括使用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统。在一些情况下，所述修饰包括使用指导多核酸和/或核酸酶或包含核酸酶的多肽。在一些情况下，所述CRISPR系统(或所述指导多核酸和/或核酸酶或包含核酸酶的多肽)在所述至少一种基因(例如，CISH基因和/或TCR基因)中引入双链断裂，以生成工程化细胞群体。在一些情况下，所述方法进一步包括向所述工程化细胞群体中引入癌症响应性受体。在一些情况下，所述引入包括使用腺相关病毒基因递送系统在所述双链断裂处整合至少一种外源转基因，从而生成癌症响应性细胞群体。在一些情况下，所述引入包括使用微环非病毒基因递送系统在所述双链断裂处整合至少一种外源转基因，从而生成癌症响应性细胞群体。在一些情况下，所述腺相关病毒基因递送系统包含腺相关病毒(AAV)载体。在一些情况下，所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的所述癌症响应性细胞群体。在一些情况下，所述AAV载体包含修饰的AAV。在一些情况下，所述AAV载体包含未修饰的或野生型AAV。在一些情况下，向受试者施用治疗有效量的所述癌症响应性细胞群体，以治疗或改善癌症。在一些情况下，与提供分别由相应未修饰的或野生型AAV载体或由微环产生的相同治疗效果所需的细胞数目相比，所述治疗有效量的所述癌症响应性细胞群体包含较少数目的细胞。

本文公开了制备遗传修饰细胞的方法。在一个情况下，方法包括提供宿主细胞群体。在一些情况下，所述方法包括引入修饰的腺相关病毒(AAV)载体和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统。在一些情况下，所述方法包括引入微环载体和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统。在一些情况下，所述CRISPR系统包含核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸。在一些情况下，所述核酸酶在至少一种基因(细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因和/或TCR基因)中引入断裂。在一些情况下，所述AAV载体引入外源核酸。在一些情况下，所述微环载体引入外源核酸。在一些情况下，所述外源核酸在所述断裂处被引入。在一些实施方案中，与使用微环载体在可比细胞群体中整合所述至少一种外源转基因相比，使用所述AAV载体整合所述至少一种外源转基因降低细胞毒性。在一些情况下，与已经引入所述CRISPR系统和相应未修饰的或野生型AAV载体的可比宿主细胞群体相比，所述外源核酸以更高的效率被引入。

本文公开了产生遗传修饰肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体的方法。在一些情况下，方法包括提供来自人类受试者的TIL群体。在一些情况下，所述方法包括采用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统对所述TIL群体进行离体电穿孔。在一些情况下，所述CRISPR系统包含核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸，以及至少一种指导多核酸(例如，指导核糖核酸(gRNA))。在一些情况下，所述CRISPR系统包含核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸，其包含指导核糖核酸(gRNA)。在一些情况下，所述gRNA包含与至少一种基因(细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因和/或TCR)互补的序列。在一些情况下，所述至少一种gRNA包含含有与第一基因(例如，细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因)互补的序列的gRNA和含有与第二基因(例如，T细胞受体(TCR)基因)互补的序列的gRNA。在一些情况下，所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸在所述TIL群体中的至少一个TIL的所述至少一种基因(例如，CISH基因和/或TCR)中引入双链断裂。在一些情况下，所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸在所述TIL群体中的至少一个TIL的所述第一基因(例如，CISH基因)和/或所述第二基因(例如，TCR基因)中引入双链断裂。在一些情况下，所述核酸酶是Cas9或者所述多核苷酸编码Cas9。在一些情况下，所述方法进一步包括向所述TIL群体中的所述至少一个TIL中引入腺相关病毒(AAV)载体。在一些情况下，所述引入在用所述CRISPR系统进行电穿孔后约1小时至约4天进行。在一些情况下，在用所述CRISPR系统进行电穿孔后约1小时之后的某个时间(例如，在用所述CRISPR系统进行所述电穿孔后10小时、1天、2天、5天、10天、30天、一个月、两个月，等等)引入所述AAV载体。在一些情况下，在用所述CRISPR系统进行电穿孔之前(例如，在用所述CRISPR系统进行所述电穿孔之前30分钟、1小时、2小时、5小时、10小时、18小时、1天、2天、3天、5天、8天、10天、30天、一个月、两个月，等等)引入所述AAV载体。在一些情况下，所述引入将至少一种外源转基因整合到所述双链断裂中或至少一个所述双链断裂中。在一些情况下，所述至少一种外源转基因编码T细胞受体(TCR)。在一些情况下，所述AAV载体包含修饰的AAV。在一些情况下，所述AAV载体包含未修饰的或野生型AAV。

在一些情况下，本文公开的任何方法和/或任何系统可进一步包括核酸酶或编码核酸酶的多肽。在一些情况下，本文公开的任何方法和/或任何系统可进一步包括指导多核酸。在一些情况下，本文公开的任何方法和/或任何系统可包括电穿孔和/或核转染。

细胞

本文公开的组合物和方法可以采用细胞。细胞可以是原代细胞。原代细胞可以是原代淋巴细胞。原代细胞群体可以是原代淋巴细胞群体。细胞可以是重组细胞。细胞可获自许多非限制性来源，包括外周血单核细胞、骨髓、***组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。例如，可使用任何T细胞系。或者，细胞可来源于健康供体、被诊断为患有癌症的患者或被诊断为患有感染的患者。在另一种情况下，细胞可以是呈现不同表型特征的混合细胞群体的一部分。细胞还可从细胞治疗储库(bank)中获得。可以获得对免疫抑制治疗具有抗性的经破坏的细胞。还可以在修饰之前选择所需的细胞群体。选择可包括以下至少一种：磁分离、流式细胞术选择、抗生素选择。所述一个或多个细胞可以是任何血细胞，如外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞。所述一个或多个细胞可以是任何免疫细胞，如淋巴细胞、B细胞或T细胞。细胞也可以从受试者的全血、单采血液成分术(apheresis)或肿瘤样品中获得。细胞可以是肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。在一些情况下，单采血液成分术可以是白细胞去除术。白细胞去除术可以是从血液中分离血细胞的过程。在白细胞去除术期间，可以从受试者的手臂中的针头移取血液，通过将全血分成红细胞、血浆和淋巴细胞的机器进行循环，然后通过另一只手臂中的针头使血浆和红细胞返回受试者。在一些情况下，在施用治疗方案和细胞疗法后分离细胞。例如，单采血液成分术可以与细胞施用顺序或同时进行。在一些情况下，在施用细胞产品之前和之后最多约6周进行单采血液成分术。在一些情况下，在施用细胞产品之后-3周、-2周、-1周、0周、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年或多达10年进行单采血液成分术。在一些情况下，通过单采血液成分术获得的细胞可以经历关于特异性裂解、细胞因子释放、代谢组学研究、生物能学研究、细胞因子产生的细胞内FAC、ELISA斑点测定和淋巴细胞亚群分析的测试。在一些情况下，可以冷冻保存细胞产品或单采血液成分术产品的样品，以用于经输注细胞的表型和功能的回顾性分析。

本文公开了可用于进行细胞内基因组移植的组合物和方法。用于基因组移植的示例性方法描述于PCT/US2016/044858中，其通过引用以其全文并入本文。细胞内基因组移植可包括对细胞和核酸进行遗传修饰以供治疗应用。全文描述的组合物和方法可使用核酸介导的遗传工程化过程，以用于以改善工程化细胞的生理和免疫学抗肿瘤效力的方式递送肿瘤特异性TCR。有效的基于过继细胞转移的免疫疗法(ACT)可用于治疗癌症(例如，转移癌)患者。例如，自体外周血淋巴细胞(PBL)可使用病毒或非病毒方法进行修饰，以表达识别癌细胞上的独特突变—新抗原—的转基因如T细胞受体(TCR)，并且可以在所公开的细胞内基因组移植的组合物和方法中使用。新抗原可能与高突变负荷的肿瘤相关，图58。

可对细胞进行遗传修饰或工程化。细胞(例如，遗传修饰或工程化细胞)可在一旦施用于患者即可改善其性能的条件下生长和扩充。可对工程化细胞进行选择。例如，在细胞的扩充和工程化之前，可通过多种非限制性方法从受试者获得细胞来源。细胞可获自许多非限制性来源，包括外周血单核细胞、骨髓、***组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。例如，可使用任何T细胞系。或者，细胞可来源于健康供体、被诊断为患有癌症的患者或被诊断为患有感染的患者。在另一种情况下，细胞可以是呈现不同表型特征的混合细胞群体的一部分。还可根据先前描述的方法从转化的T细胞获得细胞系。细胞还可从细胞治疗储库获得。可以获得对免疫抑制治疗具有抗性的修饰细胞。还可在修饰之前对所需的细胞群体进行选择。还可在修饰之后对工程化细胞群体进行选择。

在一些情况下，工程化细胞可在自体移植中使用。或者，工程化细胞可在同种异体移植中使用。在一些情况下，工程化细胞可施用于同一患者，该患者的样品用于鉴别癌症相关靶序列和/或转基因(例如，TCR转基因)。在一些情况下，工程化细胞可施用于与其样品用于鉴别癌症相关靶序列和/或转基因(例如，TCR转基因)的患者不同的患者。一种或多种同源重组增强子可与本公开内容的细胞一起引入。增强子可促进双链断裂的同源性指导的修复。增强子可促进转基因(例如，TCR转基因)向本公开内容的细胞中的整合。增强子可阻断非同源末端连接(NHEJ)，使得优先发生双链断裂的同源性指导的修复。

一种或多种细胞因子可与本公开内容的细胞一起引入。细胞因子可用来促进细胞毒性T淋巴细胞(包括过继转移的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞)在肿瘤微环境内扩充。在一些情况下，IL-2可用来促进本文所述细胞的扩充。还可使用诸如IL-15等细胞因子。还可使用免疫疗法领域中的其它相关细胞因子，如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21或其任意组合。在一些情况下，使用IL-2、IL-7和IL-15来培养本发明的细胞。

在一些情况下，可以用药剂例如S-2-羟基戊二酸(S-2HG)处理细胞以改善体内细胞性能。与未经处理的细胞相比，用S-2HG处理可改善细胞增殖和在体内的持久性。与未用S-2HG处理的细胞相比，S-2HG还可改善经处理的细胞的抗肿瘤功效。在一些情况下，用S-2HG处理可导致CD62L表达增加。在一些情况下，与未经处理的细胞相比，用S-2HG处理的细胞可表达更高水平的CD127、CD44、4-1BB、Eomes。在一些情况下，与未经处理的细胞相比，用S-2HG处理的细胞可具有降低的PD-1表达。与未经处理的细胞相比，CD127、CD44、4-1BB和Eomes的水平增加可以是约5％至约700％，例如，用S-2HG处理的细胞中的CD127、CD44、4-1BB和Eomes表达增加约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％或最高700％。在一些情况下，与未经处理的细胞相比，如通过流式细胞术分析所测量的，用S-2HG处理的细胞可具有增加约5％至约700％的细胞扩充和/或增殖，例如，与未经处理的细胞相比，如通过流式细胞术分析所测量的，具有增加约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％或最高700％的细胞扩充和/或增殖。

用S-2HG处理的细胞可暴露于约10μM至约500μM的浓度。浓度可以是约10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM或最高500μM。

细胞毒性通常可指对细胞具有毒性的组合物、药剂和/或条件(例如，外源DNA)的性质。在一些方面，本公开内容的方法通常涉及降低在遗传修饰期间引入到一个或多个细胞中的外源DNA的细胞毒性作用。在一些情况下，细胞毒性或对细胞具有细胞毒性的物质的作用可包括DNA切割、细胞死亡、自噬、凋亡、核凝聚、细胞裂解、坏死、细胞运动性改变、细胞硬度改变、胞质蛋白质表达改变、膜蛋白表达改变、不期望的细胞分化、膨胀、膜完整性丧失、代谢活动停止、低活性代谢、高活性代谢、活性氧增多、细胞质收缩、促炎细胞因子产生(例如，作为DNA传感途径的产物)或其任意组合。促炎细胞因子的非限制性实例包括白介素6(IL-6)、干扰素α(IFNα)、干扰素β(IFNβ)、C-C基序配体4(CCL4)、C-C基序配体5(CCL5)、C-X-C基序配体10(CXCL10)、白介素1β(IL-1β)、IL-18和IL-33。在一些情况下，细胞毒性可受到多核酸如转基因或TCR引入的影响。可以以本领域已知的许多方法中的任一种测量细胞毒性的变化。在一些情况下，可基于细胞毒性相关作用如细胞死亡或不期望的细胞分化的发生程度和/或频率来评估细胞毒性的变化。在一些情况下，通过使用本领域已知的测定法测量细胞毒性的量来评估细胞毒性的降低，该测定法包括标准实验室技术，如染料排斥，与细胞活力、损伤和/或死亡相关的形态学特征的检测，以及与感兴趣的细胞类型相关的酶和/或代谢活性的测量。

在一些情况下，经历基因组移植的细胞可通过与组织或细胞共培养而被激活或扩充。细胞可以是抗原呈递细胞。人工抗原呈递细胞(aAPC)可表达T细胞受体的配体和共刺激分子，并且可激活并扩充T细胞以供转移，同时在一些情况下改善其效力和功能。aAPC可被工程化为表达用于T细胞激活的任何基因。aAPC可被工程化为表达用于T细胞扩充的任何基因。aAPC可以是珠子、细胞、蛋白质、抗体、细胞因子或任意组合。aAPC可将信号递送至可经历基因组移植的细胞群体。例如，aAPC可递送信号1、信号2、信号3或任意组合。信号1可以是抗原识别信号。例如，信号1可以是TCR被肽-MHC复合物连接或是可导致CD3信号转导复合物激活的针对CD3的激动性抗体的结合。信号2可以是共刺激信号。例如，共刺激信号可以是分别与ICOS-L、CD70和4-1BBL结合的抗CD28、可诱导的共刺激物(ICOS)、CD27和4-1BB(CD137)。信号3可以是细胞因子信号。细胞因子可以是任何细胞因子。细胞因子可以是IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21或其任意组合。

在一些情况下，人工抗原呈递细胞(aAPC)可用来激活和/或扩充细胞群体。在一些情况下，人工抗原呈递细胞可以不诱导同种异体特异性(allospecificity)。在一些情况下，aAPC可以不表达HLA。可对aAPC进行遗传修饰以稳定表达可用来激活和/或刺激的基因。在一些情况下，K562细胞可用于激活。K562细胞还可用于扩充。K562细胞可以是人红白血病细胞系。K562细胞可被工程化为表达感兴趣的基因。K562细胞可以不内源性表达HLA I类、II类或CD1d分子，但可表达ICAM-1(CD54)和LFA-3(CD58)。K562可被工程化为向T细胞传递信号1。例如，K562细胞可被工程化为表达HLA I类。在一些情况下，K562细胞可被工程化为表达另外的分子，如B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3mAb、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜结合的IL-15、膜结合的IL-17、膜结合的IL-21、膜结合的IL-2、截短的CD19或任意组合。在一些情况下，除CD80和CD83之外，工程化K562细胞还可表达膜形式的抗CD3mAb，克隆OKT3。在一些情况下，除CD80和CD83之外，工程化K562细胞还可表达膜形式的抗CD3mAb，克隆OKT3，膜形式的抗CD28mAb。

aAPC可以是珠子。球形聚苯乙烯珠子可用针对CD3和CD28的抗体进行包被并用于T细胞激活。珠子可以是任何大小。在一些情况下，珠子可以是或可以是约3微米和6微米。珠子可以是或可以是约4.5微米的大小。珠子可以以任何细胞:珠子比例使用。例如，可使用每毫升100万个细胞3:1的珠子:细胞比例。aAPC还可以是刚性球形颗粒、聚苯乙烯乳胶微珠、磁性纳米或微米颗粒、纳米级量子点、(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)微球(4)、非球形颗粒、碳纳米管束(5)、椭圆体PLGA微粒(6)、纳米虫(nanoworm)(7)、含流体脂双层的系统、2D-支持的脂双层(2D-SLB)(8)、脂质体(9)、RAFTsome/微域脂质体(10)、SLB颗粒(11)或其任意组合。

在一些情况下，aAPC可扩充CD4T细胞。例如，aAPC可被工程化，以模拟HLA II类限制性CD4T细胞的抗原加工和呈递途径。K562可被工程化为表达HLA-D、DPα链、DPβ链、Ii、DMα、DMβ、CD80、CD83或其任意组合。例如，可用HLA限制性肽对工程化K562细胞进行脉冲，以便扩充HLA限制性抗原特异性CD4T细胞。

在一些情况下，可将aAPC的使用与外源引入的细胞因子相组合，以用于细胞(例如，T细胞)激活、扩充或任意组合。还可在体内扩充细胞，例如在将基因组移植的细胞施用于受试者之后，在受试者的血液中扩充细胞。

这些用于细胞内基因组移植的组合物和方法可提供具有许多优点的癌症疗法。例如，它们可提供高效率的基因转移、表达，增加的细胞存活率，重组双链断裂的有效引入，以及相比于非同源末端连接(NHEJ)机制有利于同源性指导的修复(HDR)的过程，以及同源重组体的有效回收和扩充。

细胞内基因组移植

细胞内基因组移植可以是对细胞和核酸进行遗传修饰以供治疗应用的方法。全文描述的组合物和方法可使用核酸介导的遗传工程过程，以用于以使T细胞的生理和免疫学抗肿瘤效力不受干扰的方式进行肿瘤特异性TCR表达。有效的基于过继细胞转移的免疫疗法(ACT)可用于治疗癌症(例如，转移癌)患者。例如，自体外周血淋巴细胞(PBL)可使用非病毒方法进行修饰，以表达识别癌细胞上的独特突变—新抗原—的T细胞受体(TCR)，并且可以在所公开的细胞内基因组移植的组合物和方法中使用。

PCT/US14/58796中描述了一种对识别患者癌症上的独特免疫原性突变的癌症特异性TCR序列进行鉴别的示例性方法。例如，可以使用随机或特异性***将转基因(例如，癌症特异性TCR或外源转基因)***到细胞(例如，T细胞)的基因组中。在一些情况下，***可以是病毒***。在一些情况下，***可以经由非病毒***(例如，采用微环载体)。在一些情况下，转基因的病毒***可以靶向特定的基因组位点，或者在其它情况下，转基因的病毒***可以是向基因组位点中的随机***。在一些情况下，将转基因(例如，至少一种外源转基因，T细胞受体(TCR))或核酸(例如，至少一种外源核酸)一次性***细胞的基因组中。在一些情况下，将转基因(例如，至少一种外源转基因，T细胞受体(TCR))或核酸(例如，至少一种外源核酸)随机***基因组基因座中。在一些情况下，将转基因(例如，至少一种外源转基因，T细胞受体(TCR))或核酸(例如，至少一种外源核酸)随机***多于一个基因组基因座中。在一些情况下，将转基因(例如，至少一种外源转基因，T细胞受体(TCR))或核酸(例如，至少一种外源核酸)***至少一种基因(例如，CISH和/或TCR)中。在一些情况下，将转基因(例如，至少一种外源转基因，TCR)或核酸(例如，至少一种外源核酸)在断裂处***基因(例如，CISH和/或TCR)中。在一些情况下，将多于一种转基因(例如，外源转基因，TCR)***细胞的基因组中。在一些情况下，将多于一种转基因***一个或多个基因组基因座中。在一些情况下，将转基因(例如，至少一种外源转基因)或核酸(例如，至少一种外源核酸)***至少一种基因中。在一些情况下，将转基因(例如，至少一种外源转基因)或核酸(例如，至少一种外源核酸)***两种或更多种基因(例如，CISH和/或TCR)中。在一些情况下，将转基因(例如，至少一种外源转基因)或核酸(例如，至少一种外源核酸)以随机和/或特异性方式***细胞的基因组中。在一些情况下，转基因是外源转基因。在一些情况下，转基因(例如，至少一种外源转基因)的侧翼为与基因(例如，CISH和/或TCR)的至少一部分互补的工程化位点。在一些情况下，转基因(例如，至少一种外源转基因)的侧翼为与基因(例如，CISH和/或TCR)中的断裂互补的工程化位点。在一些情况下，转基因(例如，至少一种外源转基因)未***基因中(例如，未***CISH和/或TCR中)。在一些情况下，转基因未***基因中的断裂(例如，CISH和/或TCR中的断裂)处。

在一些情况下，遗传修饰细胞群体或遗传修饰TIL群体中至少约5％、或至少约10％、或至少约15％、或至少约20％、或至少约25％、或至少约30％、或至少约35％、或至少约40％、或至少约45％、或至少约50％、或至少约55％、或至少约60％、或至少约65％、或至少约70％、或至少约75％，或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％的细胞包含至少一种外源转基因(例如，外源TCR)。在一些情况下，本公开内容的任何方法可导致遗传修饰细胞群体或遗传修饰TIL群体中至少约或约5％、或至少约或约10％、或至少约或约15％、或至少约或约20％、或至少约或约25％、或至少约或约30％、或至少约或约35％、或至少约或约40％、或至少约或约45％、或至少约或约50％、或至少约或约55％、或至少约或约60％、或至少约或约65％、或至少约或约70％、或至少约或约75％、或至少约或约80％、或至少约或约85％、或至少约或约90％、或至少约或约95％、或至少约或约97％、或至少约或约98％或至少约或约99％的细胞包含至少一种外源转基因(例如TCR)。在一些情况下，遗传修饰细胞群体中至少约或约3％、5％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％的细胞包含在断裂处整合到至少一种基因(例如，CISH和/或TCR)中的至少一种外源转基因(例如TCR)。在一些情况下，至少一种外源转基因在断裂处整合到一种或多种基因(例如，CISH和/或TCR)中。在一些情况下，遗传修饰细胞群体中至少约或约3％、5％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％的细胞包含在细胞的基因组中整合的至少一种外源转基因。在一些情况下，遗传修饰细胞群体中至少约或约3％、5％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％的细胞包含在基因组基因座(例如，CISH和/或TCR)中整合的至少一种外源转基因。在一些情况下，整合包括病毒系统(例如，AAV或修饰的AAV)或非病毒系统(例如，微环)。

在一些情况下，本公开内容提供了遗传修饰细胞群体和/或肿瘤浸润性淋巴细胞(例如遗传修饰TIL)群体以及产生遗传修饰细胞(例如遗传修饰TIL)群体的方法。在一些情况下，所述遗传修饰细胞群体具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％的细胞活力(例如，在将AAV载体(或非病毒载体(例如，微环载体))引入细胞群体后的某个时间测量细胞活力，并且/或者在将至少一种外源转基因整合到至少一个细胞的基因组基因座(例如，CISH和/或TCR)中后的某个时间测量细胞活力)。在一些情况下，通过FACS测量细胞活力。在一些情况下，在将病毒(例如，AAV)或非病毒(例如，微环)载体引入到细胞和/或细胞群体后约、至少约或至多约4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、18小时、20小时、24小时、30小时、36小时、40小时、48小时、54小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、120小时、132小时、144小时、156小时、168小时、180小时、192小时、204小时、216小时、228小时、240小时或超过240小时测量细胞活力。在一些情况下，在将病毒载体(例如，AAV)或非病毒载体(例如，微环)引入到细胞和/或细胞群体后约、至少约或至多约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、45天、50天、60天、70天、90天或超过90天测量细胞活力。在一些情况下，在将至少一种外源转基因(例如TCR)整合到至少一个细胞的基因组基因座(例如，CISH和/或TCR)中后测量细胞活力。在一些情况下，在将至少一种外源转基因(例如TCR)整合到至少一个细胞的基因组基因座中后约、至少约或至多约4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、18小时、20小时、24小时、30小时、36小时、40小时、48小时、54小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、120小时、132小时、144小时、156小时、168小时、180小时、192小时、204小时、216小时、228小时、240小时、超过240小时、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、45天、50天、60天、70天、90天或超过90天测量细胞活力。在一些情况下，在将病毒或非病毒系统引入到细胞或细胞群体后测量细胞毒性。在一些情况下，在将至少一种外源转基因(例如TCR)整合到至少一个细胞的基因组基因座(例如，CISH和/或TCR)中后测量细胞毒性。在一些情况下，使用修饰的AAV载体时的细胞毒性低于将野生型或未修饰的AAV或非病毒系统(例如，微环载体)引入到可比细胞或可比细胞群体时的细胞毒性。在一些情况下，使用AAV载体时的细胞毒性低于将非病毒载体(例如，微环载体)引入到可比细胞或可比细胞群体时的细胞毒性。在一些情况下，通过流式细胞术测量细胞毒性。在一些情况下，与使用野生型或未修饰的AAV载体或微环载体整合至少一种外源转基因(例如TCR)时相比，使用修饰的或重组AAV载体整合至少一种外源转基因(例如TCR)时的细胞毒性降低约、至少约或至多约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些情况下，与使用微环载体或另一种非病毒系统整合至少一种外源转基因时相比，使用AAV载体时的细胞毒性降低约、至少约或至多约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些情况下，AAV选自重组AAV(rAAV)、修饰的AAV、杂合AAV、自身互补AAV(scAAV)及其任意组合。

在一些情况下，本文所公开的方法包括向细胞中引入一种或多种核酸(例如，第一核酸和/或第二核酸)。本领域技术人员将会理解，核酸通常可指其分子由在长链中连接的许多核苷酸组成的物质。核酸的非限制性实例包括人工核酸类似物(例如，肽核酸、吗啉代寡聚物、锁定核酸、二醇核酸或苏糖核酸)、环状核酸、DNA、单链DNA、双链DNA、基因组DNA、微环DNA、质粒、质粒DNA、病毒DNA、病毒载体、γ-逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体、RNA、短发夹RNA、psiRNA和/或其杂合体或组合。在一些情况下，方法可包括核酸，并且该核酸是合成的。在一些情况下，样品可包含核酸，并且该核酸可被片段化。在一些情况下，核酸为微环。

在一些情况下，核酸可包含启动子区域、条形码、限制性位点、切割位点、内切核酸酶识别位点、引物结合位点、选择性标记、独特标识序列、抗性基因、接头序列或其任意组合。可以在不使用细菌的情况下产生核酸。例如，核酸可具有减少的细菌元素痕迹或完全没有细菌元素。如通过PCR所测量的，与质粒载体相比，核酸可具有比质粒载体少20％-40％、40％-60％、60％-80％或80％-100％的细菌痕迹。如通过PCR所测量的，与质粒载体相比，核酸可具有比质粒载体少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或最多100％的细菌痕迹。在一些方面，这些位点可用于酶消化、扩增、测序、靶向结合、纯化、提供抗性特性(例如，抗生素抗性)或其任意组合。在一些情况下，核酸可包含一个或多个限制性位点。限制性位点通常可指特定的肽或核苷酸序列，在该序列处，位点特异性分子(例如，蛋白酶、内切核酸酶或酶)可以切割该核酸。在一个实例中，核酸可包含一个或多个限制性位点，其中在限制性位点处切割核酸使该核酸被片段化。在一些实施方案中，该核酸可包含至少一个内切核酸酶识别位点。

在一些情况下，核酸可容易地与另一核酸结合(例如，该核酸包含粘端或核苷酸突出端)。例如，核酸可包含在该核酸的第一末端处的突出端。通常，粘端或突出端可指在核酸末端处的一系列未配对的核苷酸。在一些情况下，核酸可包含在该核酸的一个或多个末端处的单链突出端。在一些情况下，突出端可出现在核酸的3’端。在一些情况下，突出端可出现在核酸的5’端。突出端可包含任何数目的核苷酸。例如，突出端可包含1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸或者5个或更多个核苷酸。在一些情况下，核酸在与另一核酸结合之前可能需要修饰(例如，核酸可能需要用内切核酸酶进行消化)。在一些情况下，核酸的修饰可产生核苷酸突出端，并且该突出端可包含任何数目的核苷酸。例如，突出端可包含1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸或者5个或更多个核苷酸。在一个实例中，核酸可包含限制性位点，其中用限制酶(例如，NotI)在限制性位点处消化核酸产生具有4个核苷酸的突出端。在一些情况下，修饰包括在核酸的一个或多个末端处产生平端。通常，平端可指双链核酸，其中两条链均以碱基对终止。在一个实例中，核酸可包含限制性位点，其中用限制酶(例如，BsaI)在限制性位点处消化核酸产生平端。

启动子是控制RNA聚合酶与转录因子结合的核酸序列，并且可对基因转录的效率、基因可在细胞中表达的位置和/或基因可在何种类型的细胞中表达具有重大影响。启动子的非限制性实例包括巨细胞病毒(CMV)启动子、延伸因子1α(EF1α)启动子、猿猴空泡病毒(SV40)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK1)启动子、泛素C(Ubc)启动子、人β肌动蛋白启动子、CAG启动子、四环素应答元件(TRE)启动子、UAS启动子、肌动蛋白5c(Ac5)启动子、多角体启动子、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKIIa)启动子、GAL1启动子、GAL 10启动子、TEF1启动子、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GDS)启动子、ADH1启动子、CaMV35S启动子、Ubi启动子、人聚合酶III RNA(H1)启动子、U6启动子或其组合。

启动子可以是CMV、U6、MND或EF1a，图155A。在一些情况下，启动子可与外源TCR序列相邻。在一些情况下，rAAV载体可进一步包含剪接受体。在一些情况下，该剪接受体可与外源TCR序列相邻。启动子序列可以是PKG或MND启动子，图155B。MND启动子可以是合成启动子，其含有修饰的MoMuLV LTR的U3区和骨髓增生性肉瘤病毒增强子。

病毒载体

在一些情况下，可以利用病毒载体将转基因引入细胞中。病毒载体可以是但不限于慢病毒、逆转录病毒或腺相关病毒。病毒载体可以是腺相关病毒载体，图139和图140。在一些情况下，腺相关病毒(AAV)载体可以是重组AAV(rAAV)载体、杂合AAV载体、自身互补AAV(scAAV)载体、突变AAV载体及其任意组合。在一些情况下，可以使用腺相关病毒来引入外源转基因(例如，至少一种外源转基因)。在一些情况下，病毒载体可以是同基因的。在一些情况下，病毒载体可被整合到具有已知SNP的基因组的一部分中。在其它情况下，病毒载体可能无法整合到具有已知SNP的基因组的一部分中。例如，rAAV可被设计为与受试者自身的基因组DNA是同基因或同源的。在一些情况下，同基因载体可提高同源重组的效率。在一些情况下，gRNA可被设计为使其不靶向具有已知SNP的区域，以改善整合的载体转基因的表达。可以确定检查点基因如PD-1、CISH、AAVS1和CTLA-4处的SNP的频率，图141A、图141B和图142。

腺相关病毒(AAV)可以是非致病性单链DNA细小病毒。AAV可具有约26nm的衣壳直径。在一些情况下，衣壳直径也可以是约20nm至约50nm。AAV单链DNA基因组的每个末端可含有反向末端重复序列(ITR)，该反向末端重复序列(ITR)可以是基因组复制和包装所需的唯一顺式作用元件。基因组携带两种病毒基因：rep和cap。该病毒利用两种启动子和选择性剪接来产生复制所必需的四种蛋白质(Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep 40)，而第三种启动子通过另路剪接和另路翻译起始密码子的组合来产生三种结构病毒衣壳蛋白的转录物，1、2和3(VP1、VP2和VP3)。这三种衣壳蛋白共有相同的C末端533个氨基酸，而VP2和VP1分别含有65个和202个氨基酸的额外N末端序列。AAV病毒粒子可以以1:1:20的比例含有总共60个拷贝的VP1、VP2和VP3，以T＝1二十面体对称进行排列。

在细胞水平上，AAV可以在实现基因表达之前经历5个主要步骤：1)结合或附着于细胞表面受体，2)内吞作用，3)运输至细胞核，4)病毒脱壳以释放基因组，以及5)基因组从单链转换为双链DNA，以作为细胞核中的转录的模板。rAAV可成功地执行每个单独步骤的累积效率可以决定整体转导效率。rAAV转导中的限速步骤可包括病毒附着和内化所需的细胞表面受体的缺失或低丰度、导致溶酶体降解的低效内体逃逸，以及单链到双链DNA模板的缓慢转换。因此，可以设计具有针对基因组和/或衣壳的修饰的载体，以促进更有效或更特异性的细胞或组织转导，以用于基因疗法。

在一些情况下，可以对病毒衣壳进行修饰。修饰可包括对衣壳组分的组合进行修饰。例如，镶嵌衣壳AAV是这样的病毒粒子，其可以由来自不同血清型的病毒衣壳蛋白的混合物组成。衣壳蛋白可以通过与以不同比例混合的单独质粒互补来提供。在病毒装配过程中，不同血清型衣壳蛋白可以以化学计量地反映互补质粒的比例的亚单位比率在每个病毒粒子中混合。与未修饰的衣壳相比，镶嵌衣壳可对某些细胞类型赋予增加的结合功效或改善的性能。

在一些情况下，可以产生嵌合衣壳AAV。嵌合衣壳可具有来自另一种野生型(wt)AAV序列或不相关蛋白质的外来蛋白质序列向衣壳基因的开放阅读框中的***。嵌合修饰可包括使用天然存在的血清型作为模板，其可涉及缺乏某种功能的AAV衣壳序列与来自另一衣壳的DNA序列共转染。同源重组在交叉点处发生，从而导致衣壳具有新特征和独特性质。在其它情况下，使用与衣壳编码序列的N或C末端融合的表位编码序列来试图在病毒衣壳表面上暴露新的肽，而不影响基因功能。在一些情况下，可以使用***衣壳编码序列中特定位置的表位序列，但使用不同的将表位标记到编码序列本身中的方法。嵌合衣壳还可包括使用从***衣壳编码序列中特定位置的肽文库中鉴别的表位。可以使用基因文库进行筛选。筛选可以捕获不能按预期起作用的***，并且随后可以删除该***并进行筛选。rAAV载体中的嵌合衣壳可以扩展可转染的细胞类型的范围，并且可以提高转导效率。与使用未修饰衣壳的转导相比，增加的转导可以是约10％的增加至约300％的增加。嵌合衣壳可含有简并、重组、改组或以其它方式修饰的Cap蛋白。例如，可以在VP蛋白的N末端靶向***受体特异性配体或单链抗体。可将淋巴细胞抗体或靶标***AAV中以改善T细胞的结合和感染。

在一些情况下，嵌合AAV可具有在至少一种AAV衣壳蛋白中的修饰(例如，在VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白中的修饰)。在一些情况下，AAV载体包含在VP1、VP2和VP3衣壳基因序列的至少一种中的修饰。在一些情况下，至少一种衣壳基因可以从AAV中删除。在一些情况下，AAV载体可包含一种或多种衣壳基因序列的缺失。在一些情况下，AAV载体可以在VP1、VP2和VP3衣壳基因序列的至少一种中具有至少一个氨基酸置换、缺失和/或***。

在一些情况下，可以制备具有嵌合衣壳(例如，含有简并或以其它方式修饰的Cap蛋白的衣壳)的病毒粒子。为了进一步改变这类病毒粒子的衣壳，例如，为了增强或修改对特定细胞类型如淋巴细胞的结合亲和力，可将另外的突变引入病毒粒子的衣壳中。例如，合适的嵌合衣壳可具有配体***突变，以用于促进病毒靶向特定细胞类型。包括***突变体、丙氨酸筛选突变体和表位标签突变体在内的AAV衣壳突变体的构建和表征在Wu等人,J.Virol.74:8635-45,2000中描述。制备AAV衣壳突变体的方法是已知的，并且包括定点诱变(Wu等人,J.Virol.72:5919-5926)；分子培育、核酸、外显子和DNA家族改组(Soong等人,Nat.Genet.25:436-439,2000；Coco等人,Nature Biotech.2001；19:354；以及美国专利5,837,458、5,811,238和6,180,406；Kolkman和Stemmer,Nat.Biotech.19:423-428,2001；Fisch等人,Proceedings of the National Academy of Sciences 93:7761-7766,1996；Christians等人,Nat.Biotech.17:259-264,1999)；配体***(Girod等人Nat.Med.9:1052-1056,1999)；盒式诱变(Rueda等人Virology 263:89-99,1999；Boyer等人,J.Virol.66:1031-1039,1992)；以及短随机寡核苷酸序列的***。

在一些情况下，可以进行转衣壳。转衣壳可以是涉及将一种血清型AAV的ITR包装到不同血清型的衣壳中的过程。在另一种情况下，可以将受体配体吸附到AAV衣壳表面，并且这种吸附可以是将外来肽添加到AAV衣壳的表面。在一些情况下，这可以赋予特异性地靶向目前没有AAV血清型对之具有向性的细胞的能力，并且这可以极大地扩展AAV作为基因疗法工具的应用。

在一些情况下，可以修饰rAAV载体。例如，rAAV载体可包含修饰如***、缺失、化学改变或合成修饰。在一些情况下，将单个核苷酸***rAAV载体中。在其它情况下，将多个核苷酸***载体中。可***的核苷酸可在约1个核苷酸至约5kb的范围内。可***的核苷酸可编码功能性蛋白质。可***的核苷酸对于接受载体的受试者可以是内源的或外源的。例如，人细胞可接受可含有鼠基因组的至少一部分，如TCR的一部分的rAAV载体。在一些情况下，rAAV载体的修饰如***或缺失可包括载体的蛋白质编码区或非编码区。在一些情况下，修饰可以在被引入到细胞中时改善载体的活性。例如，修饰可以在被引入到人细胞中时改善载体的蛋白质编码区的表达。

在一些情况下，本公开内容提供了辅助载体的构建，该辅助载体提供AAV Rep和Cap蛋白，以供产生由rAAV载体(例如，编码外源受体序列的载体)和嵌合衣壳(例如，包含简并、重组、改组或以其它方式修饰的Cap蛋白的衣壳)组成的病毒粒子储备物。在一些情况下，修饰可涉及产生经修饰的AAV cap核酸，例如含有来源于超过一种AAV血清型(例如，AAV血清型1-8)的序列部分的cap核酸。这类嵌合核酸可以通过多种诱变技术产生。用于产生嵌合帽基因的方法可涉及在体外DNA扩增反应中使用简并寡核苷酸。用于将简并突变(例如，来自不同AAV血清型的多态性)并入核酸序列中的方案在Coco等人Nature Biotechnology20:1246-1250,2002中描述。在这种被称为简并同源双链重组的方法中，构建了“顶链(top-strand)”寡核苷酸，其含有来自基因家族内的基因的多态性(简并性)。互补的简并性被工程化为多个桥接“支架“寡核苷酸。单一顺序的退火、间隙填充和连接步骤导致产生捕获亲本多态性的每种可能排列的核酸文库。可以使用诸如简并同源双链重组等方法使衣壳基因的任何部分突变。然而，特定的衣壳基因序列是优选的。例如，已经定位了负责将AAV2衣壳与其细胞表面受体硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)结合的关键残基。位置585和588处的精氨酸残基似乎对于结合至关重要，因为这些残基内的非保守突变消除了与肝素-琼脂糖的结合。AAV2和AAV4原子结构的计算机建模鉴别了七个高变区，这些高变区与精氨酸残基585和588重叠，并且暴露于衣壳的表面。这些高变区被认为作为衣壳上的表面环而暴露，该表面环介导受体结合。因此，这些环可在产生具有不同于野生型病毒粒子的向性的嵌合病毒粒子的方法中用作诱变靶标。在一些情况下，修饰可以是AAV血清型6衣壳的修饰。

可以在本公开内容的方法中使用的另一种诱变技术是DNA改组。DNA或基因改组涉及创建基因家族成员的随机片段以及该片段的重组以产生许多新组合。为了改组AAV衣壳基因，可以考虑数个参数，包括：VP1、VP2和VP3这三种衣壳蛋白的参与以及8种血清型之间的不同程度的同源性。例如，为了增加获得具有细胞或组织特异性向性的可行rcAAV载体的可能性，优选产生高度多样性和大量排列的改组方案。用于产生嵌合rcAAV的DNA改组方案的实例是过渡模板随机嵌合生长(RACHITT)，Coco等人,Nat.Biotech.19:354-358,2001。RACHITT方法可用来重组来源于两种不同血清型的AAV基因组(例如，AAV 5d AAV6)的两个PCR片段。例如，可以使用RATCHITT或其它DNA改组方案(包括体内改组方案)来改组cap基因的保守区，该保守区是85％相同的区段，跨越大约1kbp并且包括所有三种基因(VP1、VP2和VP3)的起始密码子(美国专利5,093,257；Volkov等人,NAR 27:e18,1999；以及Wang P.L.,Dis.Markers 16:3-13,2000)。可将得到的组合嵌合文库克隆到合适的含有AAV TR的载体中以替换WT AAV基因组的相应片段。可以对随机克隆进行测序并使用Vector NTI 7Suite软件的AlignX应用与亲本基因组进行比对。从测序和比对可以确定每1Kbp基因的重组交换数目。或者，可以使用本公开内容的方法改组AAV基因组的可变域。例如，可以在AAV的两个氨基酸簇(氨基酸509-522和561-591)内产生突变，该氨基酸簇可能在VP3中形成颗粒表面环。为了改组这种低同源性结构域，可以使用独立于亲本同源性的重组方案(Ostermeier等人,Nat.Biotechnol.17:1205-1209,1999；Lutz等人,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences 98:11248-11253,2001；以及Lutz等人,NAR29:E16,2001)或被修改为使低同源性的DNA片段退火和重组的RACHITT方案。

在一些情况下，可以进行AAV衣壳上的S/T/K残基的靶向突变。在通过受体介导的内吞作用使AAV发生细胞内化后，该AAV可以穿过胞质溶胶，在内体中经历酸化，之后被释放。在内体逃逸后，AAV经历核运输，其中发生病毒衣壳的脱壳，从而导致其基因组的释放和基因表达的诱导。S/T/K残基是磷酸化和随后的多泛素化的潜在位点，多泛素化作为衣壳蛋白的蛋白酶体降解的提示。这可以阻止载体运输到细胞核中以表达其转基因，即外源TCR，从而导致低基因表达。此外，蛋白酶体降解的衣壳片段可以由细胞表面上的MHC-I类分子呈递，以供CD8T细胞识别。这导致免疫应答，从而破坏转导的细胞并进一步降低持久的转基因表达。S/T到A和K到R点突变可以防止/减少衣壳上的磷酸化位点。这可导致泛素化和蛋白酶体降解减少，从而允许更多数目的完整载体进入细胞核并表达转基因。防止/降低整体衣壳降解还降低了对T细胞的抗原呈递，从而导致较低的宿主对载体的免疫应答。

在一些方面，可以通过将异源序列直接***AAV载体中来构建包含侧翼为AAV ITR的感兴趣核苷酸序列的AAV载体。可以使用本领域熟知的技术设计这些构建体。参见，例如，Carter B.,Adeno-associated virus vectors,Curr.Opin.Biotechnol.,3:533-539(1992)；以及Kotin RM,Prospects for the use of adeno-associated virus as avector for human gene therapy,Hum Gene Ther 5:793–801(1994)。

在一些情况下，AAV表达载体包含感兴趣的异源核酸序列，如具有治疗效果的转基因。可以使用本领域已知的方法构建rAAV病毒粒子。参见，例如，Koerber等人(2009)Mol.Ther.17:2088；Koerber等人(2008)Mol Ther.16:1703-1709；美国专利7,439,065和6,491,907。例如，可以将外源或异源序列***AAV基因组中，其中AAV基因组的主要AAV开放阅读框已被从中切除。还可以删除AAV基因组的其它部分，其中ITR的某些部分保持完整以支持复制和包装功能。可以使用本领域熟知的技术设计这类构建体。参见，例如，美国专利5,173,414和5,139,941；Lebkowski等人(1988)Molec.Cell.Biol.8:3988-3996。

本申请提供了用于产生重组AAV的方法和材料，该重组AAV可在细胞中表达一种或多种感兴趣的蛋白质。如本文所述，本文公开的方法和材料允许感兴趣的蛋白质大量产生或以在体内实现治疗效果的水平产生。感兴趣的蛋白质的实例是外源受体。外源受体可以是TCR。

通常，使用已知技术，如通过转染，将rAAV病毒粒子或病毒颗粒或AAV表达载体引入合适的宿主细胞中。转染技术是本领域已知的。参见，例如，Graham等人(1973)Virology,52:456，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratories,New York，Davis等人(1986)Basic Methods in MolecularBiology,Elsevier，以及Chu等人(1981)Gene 13:197。合适的转染方法包括磷酸钙共沉淀、直接显微注射、电穿孔、脂质体介导的基因转移和使用高速微粒发射的核酸递送，它们都是本领域已知的。

在一些情况下，用于产生重组AAV的方法包括提供具有病毒构建体的包装细胞系，该病毒构建体包含如本文所述的AAV的5’反向末端重复序列(ITR)和3’AAV ITR、用于产生生产性AAV感染的辅助功能和AAV cap基因；以及从包装细胞系的上清液中回收重组AAV。可以使用各种类型的细胞作为包装细胞系。例如，可以使用的包装细胞系包括但不限于HEK293细胞、HeLa细胞和Vero细胞等。在一些情况下，通过PEG沉淀来处理包装细胞系的上清液以浓缩病毒。在其它情况下，可以使用离心步骤来浓缩病毒。例如，在离心过程中，可以使用柱来浓缩病毒。在一些情况下，沉淀在不超过约4℃(例如约3℃、约2℃、约1℃或约1℃)下进行至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约6小时、至少约9小时、至少约12小时或至少约24小时。在一些情况下，通过低速离心和随后的CsCl梯度从PEG沉淀的上清液中分离重组AAV。低速离心可以是约4000rpm、约4500rpm、约5000rpm或约6000rpm持续约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟或约60分钟。在一些情况下，通过在约5000rpm下离心约30分钟和随后的CsCl梯度从PEG沉淀的上清液中分离重组AAV。

在一些情况下，辅助功能由一种或多种包含腺病毒辅助基因的辅助质粒或辅助病毒提供。腺病毒辅助基因的非限制性实例包括E1A、E1B、E2A、E4和VA，它们可以为AAV包装提供辅助功能。在一些情况下，AAV cap基因可存在于质粒中。质粒可进一步包含AAV rep基因。

血清学可被定义为对一种血清型的病毒衣壳蛋白具有反应性的抗体不能中和另一种血清型的病毒衣壳蛋白。在一些情况下，可以在本文中使用来自任何AAV血清型(包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12及其任何变体或衍生物)的cap基因和/或rep基因来产生本文公开的重组AAV，以表达一种或多种感兴趣的蛋白质。腺相关病毒可以是AAV5或AAV6或其变体。在一些情况下，AAV cap基因可编码来自血清型1、血清型2、血清型3、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、血清型9、血清型10、血清型11、血清型12或其变体的衣壳。在一些情况下，可以用辅助质粒或辅助病毒、病毒构建体和编码AAV cap基因的质粒转染包装细胞系；并且可以在共转染后的不同时间点采集重组AAV病毒。例如，可以在共转染后约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、约96小时、约120小时或任何两个时间点之间的时间采集重组AAV病毒。

AAV的辅助病毒是本领域已知的，并且包括例如来自腺病毒科和疱疹病毒科的病毒。AAV的辅助病毒的实例包括但不限于在美国公开20110201088中描述的SAdV-13辅助病毒和SAdV-13样辅助病毒、辅助载体pHELP(Applied Viromics)。本领域技术人员将会理解，可以在本文中使用能够为AAV提供足够辅助功能的AAV的任何辅助病毒或辅助质粒。本文公开的重组AAV病毒也可使用本领域已知的适于产生感染性重组AAV的任何常规方法来产生。在一些情况下，可以通过使用稳定表达对于AAV颗粒产生而言必需的一些组分的细胞系来产生重组AAV。例如，可将包含AAV rep和cap基因的质粒(或多个质粒)和选择性标记如新霉素抗性基因整合到细胞(包装细胞)的基因组中。然后可用辅助病毒(例如，提供辅助功能的腺病毒)和包含5’和3’AAV ITR和编码感兴趣蛋白质的核苷酸序列的病毒载体来共感染包装细胞系。在另一个非限制性实例中，可以使用腺病毒或杆状病毒而不是质粒来将rep和cap基因引入包装细胞中。作为另一个非限制性实例，可将含有5’和3’AAV ITR的病毒载体和rep-cap基因二者稳定地整合到生产细胞的DNA中，并且可以由野生型腺病毒提供辅助功能以产生重组AAV。

可用来产生rAAV病毒粒子或病毒颗粒的合适宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞、微生物和哺乳动物细胞。可以使用各种稳定的人细胞系，包括但不限于293细胞。宿主细胞可被工程化为用来提供辅助功能，以便复制和包裹侧翼为AAV ITR的核苷酸序列，从而产生病毒颗粒或AAV病毒粒子。AAV辅助功能可以由在宿主系统中表达的AAV衍生的编码序列提供，以便反过来为AAV复制和包装提供AAV基因产物。可以使AAV病毒能够复制或有复制缺陷。通常，复制缺陷型AAV病毒缺少一种或多种AAV包装基因。细胞可以在体外、离体或体内与本文所述的病毒载体、病毒颗粒或病毒接触。在一些情况下，体外接触的细胞可来源于已建立的细胞系或来自受试者的原代细胞，该细胞经离体修饰以供返回受试者或者被允许在体外培养中生长。在一些方面，使用病毒将病毒载体递送至离体原代细胞中以修饰细胞，如在免疫细胞或特别是T细胞中引入外源核酸序列、转基因或工程化细胞受体，随后在培养物中进行扩充、选择或有限次数的传代，之后将此类修饰的细胞返回到受试者中。在一些方面，在基于细胞的疗法中使用此类修饰的细胞，以治疗包括癌症在内的疾病或病况。在一些情况下，原代细胞可以是原代淋巴细胞。在一些情况下，原代细胞群体可以是原代淋巴细胞群体。在一些情况下，原代细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。在一些情况下，原代细胞群体是TIL群体。

在一些情况下，重组AAV不是自身互补AAV(scAAV)。适用于纯化AAV的任何常规方法均可在本文所述的实施方案中使用，以纯化重组AAV。例如，可以从包装细胞和/或包装细胞的上清液中分离并纯化重组体。在一些情况下，可以使用CsCl梯度通过分离方法来纯化AAV。此外，美国专利公开20020136710描述了用于纯化AAV的方法的另一个非限制性实例，其中使用包含基质的固体支持物从样品中分离并纯化AAV，该基质上固定有介导AAV附着的人工受体或受体样分子。

在一些情况下，例如，可以用病毒载体、AAV、修饰的AAV或rAAV来转导细胞群体。采用病毒的转导可发生在用CRISPR系统进行基因组破坏之前、在用CRISPR系统进行基因组破坏之后或者在用CRISPR系统进行基因组破坏的同时。例如，采用CRISPR系统的基因组破坏可有利于将外源多核酸整合到基因组的一部分中。在一些情况下，CRISPR系统可用来在包含基因如免疫检查点基因或安全港基因座的基因组的一部分中引入双链断裂。在一些情况下，CRISPR系统可用来在至少一种基因(例如，CISH和/或TCR)中引入断裂。在一些情况下，可通过引入由病毒载体、AAV或修饰的AAV或rAAV递送至细胞的外源受体序列来修复双链断裂。在一些情况下，可通过在所述断裂中整合外源转基因(例如TCR)来修复双链断裂。AAV或修饰的AAV或rAAV可包含多核酸，该多核酸具有与被CRISPR系统破坏的基因的一部分的重组臂。在一些情况下，CRISPR系统包含指导多核酸。在一些情况下，指导多核酸是指导核糖核酸(gRNA)和/或指导脱氧核糖核酸(gDNA)。例如，CRISPR系统可在CISH和/或TCR基因处引入双链断裂。然后可通过引入转基因(例如，编码外源TCR的转基因)来修复CISH和/或TCR基因，其中转基因的侧翼可以是具有与先前被CRISPR系统破坏的基因组的一部分互补的区域的重组臂。可以转导包含基因组破坏和病毒引入的细胞群体。转导的细胞群体可以是约5％至约100％。例如，细胞群体中的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或最高约100％可被转导。

在一些情况下，在CRISPR系统或核酸酶或编码核酸酶的多核苷酸或指导多核酸被引入到细胞或细胞群体之后约、至少约或至多约1-3小时、3-6小时、6-9小时、9-12小时、12-15小时、15-18小时、18-21小时、21-23小时、23-26小时、26-29小时、29-31小时、31-33小时、33-35小时、35-37小时、37-39小时、39-41小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、14天、16天、20天或超过20天时，将病毒(例如，AAV或修饰的AAV)和/或病毒载体(例如，AAV载体或修饰的AAV载体)和/或非病毒载体(例如，微环载体)引入到所述细胞或所述细胞群体。在一些情况下，病毒载体包含至少一种外源转基因(例如，AAV载体包含至少一种外源转基因)。在一些情况下，非病毒载体包含至少一种外源转基因(例如，微环载体包含至少一种外源转基因)。在一些情况下，AAV载体(例如，修饰的AAV载体)包含至少一种外源核酸。在一些情况下，将AAV载体(例如，修饰的AAV载体)引入到细胞群体中的至少一个细胞，以将至少一种外源核酸整合到至少一个细胞的基因组基因座中。

在一些情况下，所述核酸可包含条形码或条形码序列。条形码或条形码序列涉及由多核苷酸组成的天然或合成的核酸序列(其允许明确鉴别该多核苷酸)和由具有所述条形码序列的多核苷酸组成的其它序列。例如，包含条形码的核酸可允许鉴别被编码的转基因。条形码序列可包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45或50个或更多个连续核苷酸的序列。核酸可包含两个或更多个条形码序列或其互补序列。条形码序列可包括随机装配的核苷酸序列。条形码序列可以是简并序列。条形码序列可以是已知序列。条形码序列可以是预定义的序列。

在一些情况下，本文所公开的方法可包括核酸(例如，第一核酸和/或第二核酸)。在一些情况下，该核酸可编码转基因。通常，转基因可指包含多个核苷酸亚单位的线性聚合物。转基因可包含任何数目的核苷酸。在一些情况下，转基因可包含少于约100个核苷酸。在一些情况下，转基因可包含至少约100个核苷酸。在一些情况下，转基因可包含至少约200个核苷酸。在一些情况下，转基因可包含至少约300个核苷酸。在一些情况下，转基因可包含至少约400个核苷酸。在一些情况下，转基因可包含至少约500个核苷酸。在一些情况下，转基因可包含至少约1000个核苷酸。在一些情况下，转基因可包含至少约5000个核苷酸。在一些情况下，转基因可包含至少约10,000个核苷酸。在一些情况下，转基因可包含至少约20,000个核苷酸。在一些情况下，转基因可包含至少约30,000个核苷酸。在一些情况下，转基因可包含至少约40,000个核苷酸。在一些情况下，转基因可包含至少约50,000个核苷酸。在一些情况下，转基因可包含约500至约5000个核苷酸。在一些情况下，转基因可包含约5000至约10,000个核苷酸。在本文公开的任何情况下，转基因可包括DNA、RNA，或DNA和RNA的杂合体。在一些情况下，转基因可以是单链的。在一些情况下，转基因可以是双链的。

a.随机***

本文所述方法的一种或多种转基因可随机***细胞的基因组中。当***到基因组中的任何位置时，这些转基因均可以是功能性的。例如，转基因可编码其自身的启动子，或者可***处于内源启动子控制下的位置中。或者，转基因可***基因中，如基因的内含子、基因的外显子、启动子或非编码区中。

编码转基因序列的核酸例如RNA可随机***细胞的染色体中。随机整合可由将核酸例如RNA引入到细胞中的任何方法产生。例如，该方法可以是但不限于电穿孔，声致穿孔，基因枪的使用，脂质体转染(lipotransfection)，磷酸钙转染，树状聚体的使用，显微注射，以及包括腺病毒、AAV和逆转录病毒载体在内的病毒载体的使用，和/或II族核酶。

编码转基因的RNA还可被设计成包含报告基因，以便可经由报告基因的激活来检测转基因或其表达产物的存在。可以使用任何报告基因，如上文公开的那些。通过在细胞培养物中选择报告基因已被激活的那些细胞，可选择含有转基因的细胞。

待***的转基因的侧翼可以是与基因组中的靶向双链断裂位点类似的工程化位点，以便从多核酸中切除转基因，从而可将该转基因***双链断裂区处。在一些情况下，可通过病毒引入转基因。例如，可利用AAV病毒以转基因感染细胞。流式细胞术可用来测量通过AAV病毒整合的转基因的表达，图107A、图107B和图128。通过AAV病毒整合转基因可能不会诱导细胞毒性，图108。在一些情况下，如通过流式细胞术所测量的，利用AAV病毒工程化的细胞群体的细胞活力可以是约30％至100％的活细胞。如通过流式细胞术所测量的，工程化细胞群体的细胞活力可以是约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％至约100％。在一些情况下，rAAV病毒可以将转基因引入细胞的基因组中，图109、图130、图131和图132。从紧接着基因组引入后直到工程化细胞的生命期，工程化细胞可以表达整合的转基因。例如，整合的转基因可在引入细胞基因组中后约0.1分钟直到转基因最初被引入细胞中后的1小时至5小时、5小时至10小时、10小时至20小时、20小时至1天、1天至3天、3天至5天、5天至15天、15天至30天、30天至50天、50天至100天或最长1000天测量到。转基因的表达可在3天时检测到，图110和图112。转基因的表达可在7天时检测到，图111、图113。转基因的表达可在转基因被引入细胞基因组中后的约4小时、6小时、8小时、12小时、18小时至约24小时检测到，图114A、图114B、图115A和图115B。在一些情况下，病毒滴度可以影响转基因表达的百分比，图116、图117A、图117B、图118、图119A、图120A、图120B、图121A、图121B、图122A、图122B、图123A、图123B、图124、图125、图126、图127、图129A、图129B、图130A、图130B。

在一些情况下，含有如本文所述的感兴趣的基因或转基因的病毒载体，如AAV病毒载体，可以在用含有病毒载体的病毒颗粒转染细胞后随机***细胞的基因组中。这类用于***的随机位点包括具有双链断裂的基因组位点。一些病毒，如逆转录病毒，包含可导致病毒载体随机***的因子，如整合酶。

在一些情况下，可使用修饰的或工程化的AAV病毒将转基因引入细胞，图83A和图83B。修饰的或野生型AAV可包含与至少一个基因组位置的同源臂，图84至图86D。

可经由电穿孔将编码转基因的RNA引入细胞中。还可经由脂质转染、感染或转化将RNA引入细胞中。电穿孔和/或脂质转染可用来转染原代细胞。电穿孔和/或脂质转染可用来转染原代造血细胞。在一些情况下，RNA可在细胞内逆转录为DNA。然后可在同源重组反应中使用DNA底物。还可以在不使用同源重组的情况下将DNA引入细胞基因组中。在一些情况下，DNA的侧翼可以是与基因组中的靶向双链断裂区互补的工程化位点。在一些情况下，可从多核酸中切除DNA，以便可在不进行同源重组的情况下将该DNA***双链断裂区处。

可通过表达测定，例如qPCR，或通过测量RNA水平，来验证转基因的表达。表达水平还可指示拷贝数，图143和图144。例如，如果表达水平非常高，则这可指示转基因的多于一个拷贝被整合到基因组中。或者，高表达可指示转基因被整合到高转录区域中，例如，高度表达的启动子附近。还可通过测量蛋白质水平，如通过Western印迹法来验证表达。在一些情况下，剪接受体测定可与报告系统一起使用以检测转基因整合，图94。在一些情况下，当使用AAV系统将转基因引入基因组中时，剪接受体测定可与报告系统一起使用以检测转基因整合，图106。

b.位点特异性***

以本文公开的任何方法***一种或多种转基因可以是位点特异性的。例如，一种或多种转基因可***到启动子附近或周围。在另一个实例中，一种或多种转基因可***到基因(例如，CISH基因和/或TCR基因)的外显子附近、周围或内部。这样的***可用来敲入转基因(例如，癌症特异性TCR转基因)，同时破坏另一基因(例如，CISH基因和/或TCR)。在另一个实例中，一种或多种转基因可***到基因的内含子附近、周围或内部。可通过AAV病毒载体引入转基因并将其整合到靶向基因组位置中，图87。在一些情况下，rAAV载体可用来指导转基因向某位置中的***。例如，在一些情况下，转基因可通过rAAV或AAV载体整合到TCR、CTLA4、PD-1、AAVS1、TCR或CISH基因的至少一部分中，图136A、图136B、图137A和图137B。

可通过将DNA引入细胞中而产生细胞的靶向基因座的修饰，其中该DNA与该靶基因座具有同源性。DNA可包括标记物基因，从而允许对包含整合的构建体的细胞进行选择。靶载体中的互补DNA可与染色体DNA在靶基因座处重组。标记物基因的侧翼可以是互补DNA序列、3’重组臂和5’重组臂。可靶向细胞内的多个基因座。例如，可一次引入具有对1个或多个靶基因座具有特异性的重组臂的转基因，使得在一个步骤中发生多个基因组修饰。

在一些情况下，与特定基因组位点的重组臂或同源臂的长度可以是约0.2kb至约5kb。重组臂的长度可以是约0.2kb、0.4kb、0.6kb、0.8kb、1.0kb、1.2kb、1.4kb、1.6kb、1.8kb、2.0kb、2.2kb、2.4kb、2.6kb、2.8kb、3.0kb、3.2kb、3.4kb、3.6kb、3.8kb、4.0kb、4.2kb、4.4kb、4.6kb、4.8kb至约5.0kb。

多种酶可催化外来DNA向宿主基因组中的***。例如，位点特异性重组酶可簇集成具有不同生物化学性质的两个蛋白家族，即酪氨酸重组酶(其中DNA与酪氨酸残基共价连接)和丝氨酸重组酶(其中共价连接发生在丝氨酸残基处)。在一些情况下，重组酶可包括Cre,fC31整合酶(衍生自链霉菌噬菌体fC31的丝氨酸重组酶)或噬菌体衍生的位点特异性重组酶(包括Flpλ整合酶、噬菌体HK022重组酶、噬菌体R4整合酶和噬菌体TP901-1整合酶)。

也可在构建体中使用表达控制序列。例如，表达控制序列可包含在很多种细胞类型中表达的组成型启动子。也可使用组织特异性启动子，并且其可用来引导向特定细胞谱系的表达。

可以使用非病毒基因编辑如CRISPR、TALEN(参见美国专利14/193,037)、基于转座子、ZEN、大范围核酸酶或Mega-TAL或基于转座子的系统来实现位点特异性基因编辑。例如，可以使用PiggyBac(参见Moriarty,B.S.等人,“Modular assembly of transposonintegratable multigene vectors using RecWay assembly,”Nucleic Acids Research(8):e92(2013))或睡美人(sleeping beauty)(参见Aronovich,E.L等人,“The SleepingBeauty transposon system:a non-viral vector for gene therapy,”Hum.Mol.Genet.,20(R1):R14–R20.(2011))转座子系统。

还可在不进行同源重组的情况下实现位点特异性基因编辑。可在不使用同源重组的情况下将外源多核酸引入细胞基因组中。在一些情况下，转基因的侧翼可以是与基因组中的靶向双链断裂区互补的工程化位点。可从多核酸中切除转基因，以便可在不进行同源重组的情况下将该转基因***双链断裂区处。

在希望对转基因进行基因组整合的一些情况下，除了质粒、线性或环状多核苷酸、包含转基因的病毒或非病毒载体外，还可将外源或工程化核酸酶引入细胞中，以促进转基因在该核酸酶切割基因组DNA的位点处的整合。将转基因整合到细胞的基因组中允许转基因随时间稳定表达。在一些方面，病毒载体可用来引入与转基因可操作地连接的启动子。在其它情况下，病毒载体可不包含启动子，这要求转基因在包含用于表达***的转基因的内源启动子的靶基因座处***。

在一些情况下，病毒载体(图138)包含同源臂，该同源臂指导转基因整合到靶基因组基因座中，如CISH和/或TCR和/或安全港位点。在一些情况下，第一核酸酶被工程化为在特定基因组位点处进行切割，以抑制(例如，部分或完全抑制基因(例如，CISH和/或TCR))或禁用有害基因，如癌基因、检查点抑制基因或与疾病或病况如癌症有关的基因。在通过核酸酶在这样的基因组基因座处产生双链断裂后，可以引入非病毒或病毒载体(例如，AAV病毒载体)，以允许在DNA切割位点处或由核酸酶产生的双链断裂位点处整合具有治疗效果的转基因或任何外源核酸序列。或者，可以使用本领域已知的方法，如经由同源重组的定点***，使用包含与所需***位点如CISH和/或TCR或安全港基因座互补的序列的同源臂，将转基因***不同的基因组位点处。在一些情况下，可以提供第二核酸酶以促进转基因在与第一核酸酶的DNA切割位点不同的基因座处的位点特异性***。在一些情况下，AAV病毒或AAV病毒载体可用作引入转基因如T细胞受体的递送系统。rAAV供体上的同源臂可以是500个碱基对至2000个碱基对。例如，rAAV供体上的同源臂的长度可以是500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp、1600bp、1700bp、1800bp、1900bp或至多2000bp。同源臂长度可以是850bp。在其它情况下，同源臂长度可以是1040bp。在一些情况下，对同源臂进行延伸以允许供体的精确整合。在其它情况下，对同源臂进行延伸以改善供体的整合。在一些情况下，为了增加同源臂的长度而不影响供体多核酸的大小，可以消除供体多核酸的可替代部分。在一些情况下，可以减少poly A尾以允许同源臂长度增加。

c.感兴趣的转基因或核酸序列

转基因可用于使内源基因以比没有转基因的情况下更高的水平表达，例如，过表达。此外，转基因可用来使外源基因以高于背景(即未用转基因进行转染的细胞)的水平表达。转基因还可包括其它类型的基因，例如，显性失活基因。

可以以产生转基因产物的方式将转基因置于生物体、细胞、组织或器官中。多核酸可包含转基因。多核酸可编码外源受体，图57A、图57B和图57C。例如，本文公开了包含至少一种侧翼为至少两个重组臂的外源T细胞受体(TCR)序列的多核酸，该重组臂具有与基因组序列内的多核苷酸互补的序列，该基因组序列为腺苷A2a受体、CD276、含V-set域的T细胞激活抑制物1、B和T淋巴细胞相关因子、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4、吲哚胺2,3-双加氧酶1、杀伤细胞免疫球蛋白样受体三域长细胞质尾1、淋巴细胞激活基因3、程序性细胞死亡因子1、甲型肝炎病毒细胞受体2、V域免疫球蛋白T细胞激活阻抑物或自然杀伤细胞受体2B4。一种或多种转基因可与一种或多种破坏相组合。

在一些情况下，可使用非病毒整合或病毒整合方法将转基因(例如，至少一种外源转基因)或核酸(例如，至少一种外源核酸)整合到基因组基因座中和/或基因(例如，CISH和/或TCR)中的断裂处。在一些情况下，病毒整合包含AAV(例如，AAV载体或修饰的AAV载体或重组AAV载体)。在一些情况下，AAV载体包含至少一种外源转基因。在一些情况下，在将包含至少一种外源转基因(例如，至少一种外源转基因)的AAV载体引入到细胞或细胞群体后测量细胞活力。在一些情况下，在将转基因整合到细胞群体中的至少一个细胞的基因组基因座中(例如，通过病毒或非病毒方法)后测量细胞活力。在一些情况下，通过荧光激活细胞分选(FACS)测量细胞活力。在一些情况下，在将包含至少一种外源转基因的病毒或非病毒载体引入到细胞或细胞群体后测量细胞活力。在一些情况下，在将病毒载体(例如，包含至少一种外源转基因的AAV载体)或非病毒载体(例如，包含至少一种外源转基因的微环载体)引入到细胞或细胞群体后，细胞群体中至少约或至多约或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或100％的细胞是活细胞。在一些情况下，在将病毒(例如，AAV)或非病毒(例如，微环)载体引入到细胞和/或细胞群体后约、至少约或至多约4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、18小时、20小时、24小时、30小时、36小时、40小时、48小时、54小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、120小时、132小时、144小时、156小时、168小时、180小时、192小时、204小时、216小时、228小时、240小时或超过240小时测量细胞活力。在一些情况下，在将病毒(例如，AAV)或非病毒(例如，微环)载体引入到细胞和/或细胞群体后约、至少约或至多约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、45天、50天、60天、70天、90天或超过90天测量细胞活力。在一些情况下，在将至少一种外源转基因引入到细胞群体中的至少一个细胞后测量细胞活力。在一些情况下，病毒载体或非病毒载体包含至少一种外源转基因。在一些情况下，与使用非病毒方法(例如，微环载体)时相比，使用病毒方法(例如，AAV载体)将至少一种外源转基因整合到细胞和/或细胞群体中时的细胞活力和/或细胞毒性得到改善。在一些情况下，通过流式细胞术测量细胞毒性。在一些情况下，在将包含至少一种外源转基因的病毒或非病毒载体引入到细胞或细胞群体后测量细胞毒性。在一些情况下，与引入非病毒载体(例如，包含至少一种外源转基因的微环)时相比，将病毒载体(例如，包含至少一种外源转基因的AAV载体)引入到细胞或细胞群体时的细胞毒性降低至少约或至多约或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或100％。在一些情况下，在将病毒载体或非病毒载体引入到细胞或细胞群体后(例如，在将包含至少一种外源转基因的AAV载体或包含至少一种外源转基因的微环载体引入到细胞或细胞群体后)约、至少约或至多约4小时、6小时、8小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、54小时、60小时、66小时、72小时、78小时、84小时、90小时、96小时、102小时、108小时、114小时、120小时、126小时、132小时、138小时、144小时、150小时、156小时、168小时、180小时、192小时、204小时、216小时、228小时、240小时或超过240小时测量细胞毒性。在一些情况下，在将病毒载体或非病毒载体引入到细胞或细胞群体后(例如，在将包含至少一种外源转基因的AAV载体或包含至少一种外源转基因的微环载体引入到细胞或细胞群体后)约、至少约或至多约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、45天、50天、60天、70天、90天或超过90天测量细胞毒性。在一些情况下，在将至少一种外源转基因整合到细胞群体中的至少一个细胞中后测量细胞毒性。

在一些情况下，可以使用随机或位点特异性***将转基因***细胞(例如，T细胞)的基因组中。在一些情况下，***可通过病毒***。在一些情况下，转基因的病毒***可靶向特定的基因组位点，或者在其它情况下，转基因的病毒***可以是向基因组位点中的随机***。在一些情况下，将转基因一次性***细胞的基因组中。在一些情况下，将转基因随机***基因组中的基因座中。在一些情况下，将转基因随机***基因组中的多于一个基因座中。在一些情况下，将转基因***基因(例如，CISH和/或TCR)中。在一些情况下，将转基因在断裂处***基因(例如，CISH和/或TCR)中。在一些情况下，将超过一种转基因***细胞的基因组中。在一些情况下，将超过一种转基因***基因组的一个或多个基因座中。在一些情况下，将转基因***至少一个基因中。在一些情况下，将转基因***两个或更多个基因(例如，CISH和/或TCR)中。在一些情况下，将转基因或至少一种转基因以随机和/或特异性方式***细胞的基因组中。在一些情况下，转基因是外源转基因。在一些情况下，转基因的侧翼为与基因(例如，CISH和/或TCR)的至少一部分互补的工程化位点。在一些情况下，转基因的侧翼为与基因(例如，CISH和/或TCR)中的断裂互补的工程化位点。在一些情况下，转基因未***基因中(例如，未***CISH和/或TCR基因中)。在一些情况下，转基因未***基因中的断裂(例如，CISH和/或TCR中的断裂)处。在一些情况下，转基因的侧翼为与基因组基因座中的断裂互补的工程化位点。

T细胞受体(TCR)

T细胞可包含一种或多种转基因。一种或多种转基因可表达识别并结合抗原上的至少一个表位(例如，癌症表位)的TCRα、β、γ和/或δ链蛋白质，或结合抗原上的突变表位。TCR可与癌症新抗原结合。TCR可以是如图22和图26中所示的功能性TCR。TCR可以仅包含如本文所定义的α链或β链序列之一(例如，分别与另外的α链或β链组合)，或者可包含这两条链。TCR可以仅包含如本文所定义的γ链或δ链序列之一(例如，分别与另外的γ链或δ链组合)，或者可包含这两条链。功能性TCR至少维持融合蛋白中的大部分生物学活性。在TCR的α和/或β链的情况下，这可能意味着这两条链仍然能够形成T细胞受体(具有未修饰的α和/或β链或具有另一融合蛋白α和/或β链)，该T细胞受体发挥其生物学功能，特别是与TCR的特定肽-MHC复合物结合，和/或肽活化后的功能性信号转导。在TCR的γ和/或δ链的情况下，这可能意味着这两条链仍然能够形成T细胞受体(具有未修饰的γ和/或δ链或具有另一融合蛋白γ和/或δ链)，该T细胞受体发挥其生物学功能，特别是与TCR的特定肽-MHC复合物结合，和/或肽活化后的功能性信号转导。T细胞还可包含一种或多种TCR。T细胞还可包含对多于一种靶标具有特异性的单个TCR。

可以使用多种方法鉴别TCR。在一些情况下，可以使用全外显子组测序来鉴别TCR。例如，TCR可靶向含有通过全外显子组测序鉴别的E805G突变的ErbB2相互作用蛋白(ERBB2IP)抗原。或者，可从自体、同种异体或异种组库中鉴别TCR。自体和同种异体鉴别可能需要多步骤的过程。在自体和同种异体鉴别中，可从CD14选择的单核细胞产生树突细胞(DC)，并在成熟后，用特定肽进行脉冲或转染。肽脉冲的DC可用来刺激自体或同种异体T细胞。可通过有限稀释从这些肽脉冲的T细胞系中分离单细胞肽特异性T细胞克隆。可鉴别并分离感兴趣的TCR。可对感兴趣的TCR的α和β链进行克隆、密码子优化并将其编码到载体或转基因中。TCR的部分可被替换。例如，人TCR的恒定区可被相应的鼠区替换。可以采用相应的鼠区对人恒定区进行替换以增加TCR稳定性。还可以以高亲合力或超生理学亲合力对TCR进行离体鉴别。

为了产生成功的肿瘤特异性TCR，应当鉴别合适的靶序列。可通过分离罕见的肿瘤反应性T细胞来找到该序列，或者在这种方法不可行的情况下，可以采用替代技术来产生高活性的抗肿瘤T细胞抗原。一种方法可能需要用人肿瘤蛋白质对表达人白细胞抗原(HLA)系统的转基因小鼠进行免疫，以产生表达针对人抗原的TCR的T细胞(参见，例如，Stanislawski等人,Circumventing tolerance to a human MDM2-derived tumorantigen by TCR gene transfer,Nature Immunology2,962-970(2001))。一种替代方法可以是同种异体TCR基因转移，其中从经历肿瘤缓解的患者中分离肿瘤特异性T细胞，并且可将反应性TCR序列转移到来自另一患有该疾病但可能无应答的患者的T细胞中(de Witte,M.A.等人,Targeting self-antigens through allogeneic TCR gene transfer,Blood108,870–877(2006))。最后，可以采用体外技术来改变TCR的序列，从而通过增加弱反应性肿瘤特异性TCR与靶抗原相互作用的强度(亲合力)来增强其杀肿瘤活性(Schmid,D.A.等人,Evidence for a TCR affinity threshold delimiting maximal CD8T cellfunction.J.Immunol.184,4936–4946(2010))。或者，可以使用全外显子组测序来鉴别TCR。

本发明的功能性TCR融合蛋白可针对MHC呈递的表位。该MHC可以是I类分子，例如HLA-A。该MHC可以是II类分子。本发明的功能性TCR融合蛋白还可具有基于肽或肽指导的功能，以便靶向抗原。本发明的功能性TCR可以被连接，例如，本发明的功能性TCR可与2A序列连接。如图26所示，本发明的功能性TCR还可与弗林蛋白酶-V5-SGSGF2A连接。本发明的功能性TCR还可含有哺乳动物组分。例如，本发明的功能性TCR可含有小鼠恒定区。本发明的功能性TCR在一些情况下还可含有人恒定区。原则上可通过将肽序列引入TCR中并通过用这些肽序列靶向肿瘤来实现肽指导的功能。这些肽可来源于噬菌体展示或合成的肽文库(参见，例如，Arap,W.等人,“Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to TumorVasculature in a Mouse Model,”Science,279,377-380(1998)；Scott,C.P.等人,“Structural requirements for the biosynthesis of backbone cyclic peptidelibraries,”8:801–815(2001))。其中，对乳腺癌、***癌和结肠癌特异性的肽以及对新血管系统特异性的肽已被成功分离并且可用于本公开内容(Samoylova,T.I.等人,“Peptide Phage Display:Opportunities for Development of Personalized Anti-Cancer Strategies,”Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry,6(1):9-17(9)(2006))。本发明的功能性TCR融合蛋白可针对突变的癌症表位或突变的癌症抗原。

可以使用并特别考虑的转基因可包括那些与本文公开的基因例如TCR基因表现出一定的同一性和/或同源性的基因。因此，考虑到如果基因表现出至少或至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同源性(在核酸或蛋白质水平上)，则该基因可用作转基因。还考虑到表现出至少或至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性(在核酸或蛋白质水平上)的基因可用作转基因。在一些情况下，转基因可以是功能性的。

转基因可并入细胞中。例如，转基因可并入生物体的种系中。当***到细胞中时，转基因可以是互补DNA(cDNA)区段(其为信使RNA(mRNA)的拷贝)，或者是位于其基因组DNA原始区域(含有或不含有内含子)的基因本身。蛋白质X的转基因可指包含编码蛋白质X的核苷酸序列的转基因。如本文所用的，在一些情况下，编码蛋白质X的转基因可以是编码蛋白质X的100％或约100％的氨基酸序列的转基因。在其它情况下，编码蛋白质X的转基因可以是编码蛋白质X的至少或至少约99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的氨基酸序列的转基因。转基因的表达可最终产生功能性蛋白质，例如，部分、完全或过度功能性蛋白质。如上文所讨论的，如果部分序列被表达，则最终的结果可以是非功能性蛋白质或显性失活蛋白质。非功能性蛋白质或显性失活蛋白质还可与功能性(内源或外源)蛋白质竞争。转基因还可编码RNA(例如，mRNA、shRNA、siRNA或微小RNA)。在一些情况下，当转基因编码mRNA时，该mRNA继而可被翻译成多肽(例如蛋白质)。因此，考虑到转基因可编码蛋白质。在一些情况下，转基因可编码蛋白质或蛋白质的一部分。此外，与野生型多肽相比，蛋白质可具有一个或多个突变(例如，缺失、***、氨基酸置换或重排)。蛋白质可以是天然多肽或人工多肽(例如，重组多肽)。转基因可编码由两个或更多个多肽形成的融合蛋白。T细胞可包含或可包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或更多种转基因。例如，T细胞可包含一种或多种含有TCR基因的转基因。

转基因(例如，TCR基因)可***安全港基因座中。安全港可包含其中转基因可整合并发挥作用而不干扰内源活性的基因组位置。例如，一种或多种转基因可***到HPRT、AAVSSITE(例如，AAVS1、AAVS2等)、CCR5、hROSA26和/或其任意组合中的任一种中。转基因(例如，TCR基因)也可***内源免疫检查点基因中。内源免疫检查点基因可以是刺激性检查点基因或抑制性检查点基因。转基因(例如，TCR基因)也可***刺激性检查点基因如CD27、CD40、CD122、OX40、GITR、CD137、CD28或ICOS中。使用基因组参照序列联盟人类基因组序列第38版第2次补充版(Genome Reference Consortium Human Build 38patch release 2，GRCh38.p2)程序集提供免疫检查点基因位置。转基因(例如，TCR基因)也可***内源抑制性检查点基因如A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3、VISTA、TCR或CISH中。例如，一种或多种转基因可***到CD27、CD40、CD122、OX40、GITR、CD137、CD28、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3、VISTA、HPRT、AAVSSITE(例如AAVS1、AAVS2等)、PHD1、PHD2、PHD3、CCR5、TCR、CISH、PPP1R12C和/或其任意组合中的任一种中。转基因可***内源TCR基因中。转基因可***编码基因组区域内。转基因也可***非编码基因组区域内。转基因可在不进行同源重组的情况下***到基因组中。转基因的***可包括细胞内基因组移植的步骤。转基因可***PD-1基因处，图46A和图46B。在一些情况下，多于一种指导物可靶向免疫检查点，图47。在其它情况下，转基因可整合到CTLA-4基因处，图48和图50。在其它情况下，转基因可整合到CTLA-4基因和PD-1基因处，图49。转基因也可整合到安全港如AAVS1中，图96和图97。转基因可***CISH基因处。转基因可***TCR基因处。转基因可***AAV整合位点中。在一些情况下，AAV整合位点可以是安全港。可以存在可替代的AAV整合位点，如5号染色体上的AAVS2或3号染色体上的AAVS3。另外的AAV整合位点如AAVS2、AAVS3、AAVS4、AAVS5、AAVS6、AAVS7、AAVS8等也被认为是外源受体如TCR的可能的整合位点。如本文所用的，AAVS可指AAVS1以及相关的腺相关病毒(AAVS)整合位点。

嵌合抗原受体可由胞外抗原识别域、跨膜域和控制T细胞激活的信号传导区组成。胞外抗原识别域可来源于鼠、人源化或完全人类单克隆抗体。具体而言，胞外抗原识别域由单克隆抗体的重链和轻链的可变区组成，其以单链可变片段(scFv)的形式进行克隆并通过铰链和跨膜域与T细胞受体(TCR)复合物的胞内信号传导分子以及至少一种共刺激分子连接。在一些情况下，不使用共刺激域。

本公开内容的CAR可存在于真核细胞例如哺乳动物细胞的质膜中，其中合适的哺乳动物细胞包括但不限于细胞毒性细胞、T淋巴细胞、干细胞、干细胞的子代、祖细胞、祖细胞的子代和NK细胞。当存在于真核细胞的质膜中时，CAR在其结合靶标的存在下可以是活性的。靶标可在膜上表达。靶标还可以是可溶的(例如，不与细胞结合)。靶标可存在于细胞如靶细胞的表面上。靶标可存在于诸如脂双层等固体表面上。靶标可以是可溶的，如可溶性抗原。靶标可以是抗原。抗原可存在于细胞如靶细胞的表面上。抗原可存在于诸如脂双层等固体表面上。在一些情况下，靶标可以是抗原的表位。在一些情况下，靶标可以是癌症新抗原。

一些近期进展关注于鉴别在一些情况下触发抗肿瘤T细胞应答的肿瘤特异性突变。例如，可使用全外显子组测序方法来鉴别这些内源突变。Tran E等人,“Cancerimmunotherapy based on mutation-specific CD4+T cells in a patient withepithelial cancer,”Science 344:641-644(2014)。因此，CAR可由靶向肿瘤特异性新抗原的scFv组成。

一种方法可使用体外测定(例如全外显子组测序)从获自癌症患者的样品鉴别癌症相关靶序列。一种方法可进一步鉴别来自识别靶序列的第一T细胞的TCR转基因。癌症相关靶序列和TCR转基因可从同一患者或不同患者的样品获得。可在CAR转基因上编码癌症相关靶序列，以使CAR对靶序列具有特异性。一种方法可穿过T细胞的膜有效递送包含CAR转基因的核酸。在一些情况下，第一和第二T细胞可从同一患者获得。在其它情况下，第一和第二T细胞可从不同患者获得。在其它情况下，第一和第二T细胞可从不同患者获得。该方法可使用非病毒整合或病毒整合系统安全高效地将CAR转基因整合到T细胞的基因组中，以产生工程化T细胞，从而可在该工程化T细胞中可靠地表达CAR转基因。

T细胞可包含一种或多种被破坏的基因和一种或多种转基因。例如，其表达被破坏的一种或多种基因可包括CD27、CD40、CD122、OX40、GITR、CD137、CD28、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3、PHD1、PHD2、PHD3、VISTA、TCR、CISH、PPP1R12C、TCR和/或其任意组合中的任一种。例如，仅为了说明各种组合，其表达被破坏的一种或多种基因可包括PD-1，并且一种或多种转基因包括TCR。例如，仅为了说明各种组合，其表达被破坏的一种或多种基因可包括CISH，并且一种或多种转基因包括TCR。例如，仅为了说明各种组合，其表达被破坏的一种或多种基因可包括TCR，并且一种或多种转基因包括TCR。在另一个实例中，其表达被破坏的一种或多种基因还可包括CTLA-4，并且一种或多种转基因包括TCR。破坏可导致被破坏的基因或其部分的基因组转录物的拷贝数减少。例如，与未被破坏的细胞中的相同基因相比，可被破坏的基因可具有降低的转录物量。破坏可导致少于145个拷贝/μL、140个拷贝/μL、135个拷贝/μL、130个拷贝/μL、125个拷贝/μL、120个拷贝/μL、115个拷贝/μL、110个拷贝/μL、105个拷贝/μL、100个拷贝/μL、95个拷贝/μL、190个拷贝/μL、185个拷贝/μL、80个拷贝/μL、75个拷贝/μL、70个拷贝/μL、65个拷贝/μL、60个拷贝/μL、55个拷贝/μL、50个拷贝/μL、45个拷贝/μL、40个拷贝/μL、35个拷贝/μL、30个拷贝/μL、25个拷贝/μL、20个拷贝/μL、15个拷贝/μL、10个拷贝/μL、5个拷贝/μL、1个拷贝/μL或0.05个拷贝/μL。在一些情况下，破坏可导致少于100个拷贝/μL。

T细胞可包含一种或多种被抑制的基因和一种或多种转基因。例如，其表达被抑制的一种或多种基因可包括CD27、CD40、CD122、OX40、GITR、CD137、CD28、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3、PHD1、PHD2、PHD3、VISTA、CISH、PPP1R12C、TCR和/或其任意组合中的任一种。例如，仅为了说明各种组合，其表达被抑制的一种或多种基因可包括PD-1，并且一种或多种转基因包括TCR。例如，仅为了说明各种组合，其表达被抑制的一种或多种基因可包括CISH，并且一种或多种转基因包括TCR。例如，仅为了说明各种组合，其表达被抑制的一种或多种基因可包括TCR，并且一种或多种转基因包括TCR。在另一个实例中，其表达被抑制的一种或多种基因还可包括CTLA-4，并且一种或多种转基因包括TCR。

T细胞还可包含或可包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或更多种显性失活转基因。显性失活转基因的表达可抑制显性失活转基因的野生型对应物的表达和/或功能。因此，例如，包含显性失活转基因X的T细胞可具有与包含表达被抑制的X基因的不同T细胞相似的表型。一种或多种显性失活转基因可以是显性失活CD27、显性失活CD40、显性失活CD122、显性失活OX40、显性失活GITR、显性失活CD137、显性失活CD28、显性失活ICOS、显性失活A2AR、显性失活B7-H3、显性失活B7-H4、显性失活BTLA、显性失活CTLA-4、显性失活IDO、显性失活KIR、显性失活LAG3、显性失活PD-1、显性失活TIM-3、显性失活VISTA、显性失活PHD1、显性失活PHD2、显性失活PHD3、显性失活CISH、显性失活TCR、显性失活CCR5、显性失活HPRT、显性失活AAVS SITE(例如AAVS1、AAVS2等)、显性失活PPP1R12C或其任意组合。

还提供了包含一种或多种转基因的T细胞，该转基因编码一种或多种可抑制基因表达例如可敲低基因的核酸。抑制基因表达的RNA可包括但不限于shRNA、siRNA、RNAi和微小RNA。例如，可将siRNA、RNAi和/或微小RNA递送至T细胞以抑制基因表达。此外，T细胞可包含编码shRNA的一种或多种转基因。shRNA可对特定基因具有特异性。例如，shRNA可对本申请中所述的任何基因具有特异性，该基因包括但不限于CD27、CD40、CD122、OX40、GITR、CD137、CD28、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3、VISTA、HPRT、AAVS SITE(例如AAVS1、AAVS2等)、PHD1、PHD2、PHD3、CCR5、TCR、CISH、PPP1R12C和/或其任意组合。

一种或多种转基因可来自不同的物种。例如，一种或多种转基因可包括人基因、小鼠基因、大鼠基因、猪基因、牛基因、狗基因、猫基因、猴基因、黑猩猩基因或其任意组合。例如，转基因可来自人类，从而具有人基因序列。一种或多种转基因可包括人基因。在一些情况下，一种或多种转基因不是腺病毒基因。

如上所述，转基因可以以随机或位点特异性方式***T细胞的基因组中。例如，转基因可***T细胞基因组中的随机基因座中。这些转基因在***基因组中的任何位置时，可以是功能性的，例如，全功能性的。例如，转基因可编码其自身的启动子，或者可***处于内源启动子控制下的位置中。或者，转基因可***基因中，如基因的内含子或基因的外显子、启动子或非编码区中。可以***转基因以使该***破坏基因，例如，内源检查点。转基因***可包括内源检查点区域。可通过可位于转基因侧翼的重组臂来引导转基因***。

有时，转基因的多于一个拷贝可***基因组中的多于一个随机基因座中。例如，多个拷贝可***基因组中的随机基因座中。与转基因随机***一次时相比，这可导致整体表达增加。或者，转基因的一个拷贝可***基因中，而转基因的另一个拷贝可***不同的基因中。转基因可被靶向，使得其可***T细胞基因组中的特定基因座中。

转基因的表达可受一种或多种启动子控制。启动子可以是普遍存在的、组成型(允许连续转录相缔合的基因的不受调节的启动子)、组织特异性启动子或诱导型启动子。被***到启动子附近或周围的转基因的表达可受到调节。例如，转基因可***到普遍存在的启动子附近或旁边。一些普遍存在的启动子可以是CAGGS启动子、hCMV启动子、PGK启动子、SV40启动子或ROSA26启动子。

启动子可以是内源的或外源的。例如，一种或多种转基因可***到内源或外源ROSA26启动子附近或周围。此外，启动子可对T细胞具有特异性。例如，一种或多种转基因可***到猪ROSA26启动子附近或周围。

组织特异性启动子或细胞特异性启动子可用来控制表达的位置。例如，一种或多种转基因可***到组织特异性启动子附近或周围。组织特异性启动子可以是FABP启动子、Lck启动子、CamKII启动子、CD19启动子、角蛋白启动子、白蛋白启动子、aP2启动子、胰岛素启动子、MCK启动子、MyHC启动子、WAP启动子或Col2A启动子。

组织特异性启动子或细胞特异性启动子可用来控制表达的位置。例如，一种或多种转基因可***到组织特异性启动子附近或周围。组织特异性启动子可以是FABP启动子、Lck启动子、CamKII启动子、CD19启动子、角蛋白启动子、白蛋白启动子、aP2启动子、胰岛素启动子、MCK启动子、MyHC启动子、WAP启动子或Col2A启动子。

还可使用诱导型启动子。可通过添加或去除诱导剂，在需要时开启和关闭这些诱导型启动子。考虑到诱导型启动子可以是但不限于Lac、tac、trc、trp、araBAD、phoA、recA、proU、cst-1、tetA、cadA、nar、PL、cspA、T7、VHB、Mx和/或Trex。

细胞可被工程化以敲除内源基因。可被敲除的内源基因可包括免疫检查点基因。免疫检查点基因可以是刺激性检查点基因或抑制性检查点基因。可以使用基因组参照序列联盟人类基因组序列第38版第2次补充版(GRCh38.p2)程序集提供免疫检查点基因位置。

可以使用数据库选择将要敲除的基因。在一些情况下，某些内源基因更适合于基因组工程化。数据库可包含表观遗传学上许可的靶位点。在一些情况下，数据库可以是ENCODE(DNA元素的百科全书(encyclopedia of DNA Elements))(http://www.genome.gov/10005107)。数据库可鉴别具有可以更容许进行基因组工程化的开放染色质的区域。

T细胞可包含一种或多种被破坏的基因。例如，其表达被破坏的一种或多种基因可包括以下任一种：腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含V-set域的T细胞激活抑制物1(VTCN1)、B和T淋巴细胞相关因子(BTLA)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体三域长细胞质尾1(KIR3DL1)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、程序性细胞死亡因子1(PD-1)、甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)、V域免疫球蛋白T细胞激活阻抑物(VISTA)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT)、腺相关病毒整合位点(AAVS SITE(例如AAVS1、AAVS2等))或趋化因子(C-C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)、CD160分子(CD160)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD96分子(CD96)、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10a(TNFRSF10A)、胱天蛋白酶8(CASP8)、胱天蛋白酶10(CASP10)、胱天蛋白酶3(CASP3)、胱天蛋白酶6(CASP6)、胱天蛋白酶7(CASP7)、Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)、Fas细胞表面死亡受体(FAS)、转化生长因子β受体II(TGFBRII)、转化生长因子β受体I(TGFBR1)、SMAD家族成员2(SMAD2)、SMAD家族成员3(SMAD3)、SMAD家族成员4(SMAD4)、SKI原癌基因(SKI)、SKI样原癌基因(SKIL)、TGFB诱导因子同源框1(TGIF1)、白介素10受体亚单位α(IL10RA)、白介素10受体亚单位β(IL10RB)、血红素氧化酶2(HMOX2)、白介素6受体(IL6R)、白介素6信号转导蛋白(IL6ST)、c-src酪氨酸激酶(CSK)、鞘糖脂微域关联磷蛋白膜锚定物1(PAG1)、信号阈值调节跨膜衔接因子1(SIT1)、叉头框蛋白P3(FOXP3)、PR结构域1(PRDM1)、碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白(BATF)、可溶性鸟苷酸环化酶1,α2(GUCY1A2)、可溶性鸟苷酸环化酶1,α3(GUCY1A3)、可溶性鸟苷酸环化酶1,β2(GUCY1B2)、可溶性鸟苷酸环化酶1,β3(GUCY1B3)、细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)、脯氨酰羟化酶结构域(PHD1、PHD2、PHD3)家族蛋白、TCR或其任意组合。在一些情况下，还可敲除内源TCR。例如，仅为了说明各种组合，其表达被破坏的一种或多种基因可包括PD-1、CLTA-4、TCR和CISH。

T细胞可包含一种或多种被抑制的基因。例如，其表达被抑制的一种或多种基因可包括以下任一种：腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含V-set域的T细胞激活抑制物1(VTCN1)、B和T淋巴细胞相关因子(BTLA)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、TCR、杀伤细胞免疫球蛋白样受体三域长细胞质尾1(KIR3DL1)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、程序性细胞死亡因子1(PD-1)、甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)、V域免疫球蛋白T细胞激活阻抑物(VISTA)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT)、腺相关病毒整合位点(AAVS1)或趋化因子(C-C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)、CD160分子(CD160)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD96分子(CD96)、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10a(TNFRSF10A)、胱天蛋白酶8(CASP8)、胱天蛋白酶10(CASP10)、胱天蛋白酶3(CASP3)、胱天蛋白酶6(CASP6)、胱天蛋白酶7(CASP7)、Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)、Fas细胞表面死亡受体(FAS)、转化生长因子β受体II(TGFBRII)、转化生长因子β受体I(TGFBR1)、SMAD家族成员2(SMAD2)、SMAD家族成员3(SMAD3)、SMAD家族成员4(SMAD4)、SKI原癌基因(SKI)、SKI样原癌基因(SKIL)、TGFB诱导因子同源框1(TGIF1)、白介素10受体亚单位α(IL10RA)、白介素10受体亚单位β(IL10RB)、血红素氧化酶2(HMOX2)、白介素6受体(IL6R)、白介素6信号转导蛋白(IL6ST)、c-src酪氨酸激酶(CSK)、鞘糖脂微域关联磷蛋白膜锚定物1(PAG1)、信号阈值调节跨膜衔接因子1(SIT1)、叉头框蛋白P3(FOXP3)、PR结构域1(PRDM1)、碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白(BATF)、可溶性鸟苷酸环化酶1,α2(GUCY1A2)、可溶性鸟苷酸环化酶1,α3(GUCY1A3)、可溶性鸟苷酸环化酶1,β2(GUCY1B2)、可溶性鸟苷酸环化酶1,β3(GUCY1B3)、脯氨酰羟化酶结构域(PHD1、PHD2、PHD3)家族蛋白、细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)或其任意组合。例如，仅为了说明各种组合，其表达被抑制的一种或多种基因可包括PD-1、CLTA-4、TCR和/或CISH。

d.癌症靶标

工程化细胞可靶向抗原。工程化细胞也可靶向表位。抗原可以是肿瘤细胞抗原。表位可以是肿瘤细胞表位。这样的肿瘤细胞表位可衍生自众多的肿瘤抗原，如来自由突变引起的肿瘤的抗原(新抗原或新表位)、共有的肿瘤特异性抗原、分化抗原和在肿瘤中过表达的抗原。仅列举一些例子，这些抗原例如可衍生自α-辅肌动蛋白-4、ARTC1、BCR-ABL融合蛋白(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-连环蛋白、Cdc27、CDK4、CDKN2A、COA-1、dek-can融合蛋白、EFTUD2、延伸因子2、ETV6-AML1融合蛋白、FLT3-ITD、FN1、GPNMB、LDLR-岩藻糖基转移酶融合蛋白、HLA-A2d、HLA-Al ld、hsp70-2、KIAAO205、MART2、ME1、MUM-1f、MUM-2、MUM-3、neo-PAP、肌球蛋白I类、NFYC、OGT、OS-9、p53、pml-RARα融合蛋白、PRDX5、PTPRK、K-ras、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1融合蛋白或SYT-SSX2融合蛋白、TGF-βRII、丙糖磷酸异构酶、BAGE-1、GAGE-1,2,8、Gage 3,4,5,6,7、GnTVf、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-Al2、MAGE-C2、mucink、NA-88、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、TAG-1、TAG-2、TRAG-3、TRP2-INT2g、XAGE-1b、CEA、gp100/Pmel17、激肽释放酶4、乳腺珠蛋白-A、Melan-A/MART-1、NY-BR-1、OA1、PSA、RAB38/NY-MEL-1、TRP-1/gp75、TRP-2、酪氨酸酶、脂肪分化相关蛋白(adipophilin)、AIM-2、ALDH1A1、BCLX(L)、BCMA、BING-4、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH(hMena)、EP-CAM、EphA3、EZH2、FGF5、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、IL13Rα2、肠羧基酯酶、甲胎蛋白、M-CSFT、MCSP、mdm-2、MMP-2、MUC1、p53、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RNF43、RU2AS、分离蛋白1、SOX10、STEAP1、存活蛋白、端粒酶、VEGF和/或WT1。肿瘤相关抗原可以是并非由宿主正常表达的抗原；肿瘤相关抗原可以是由宿主正常表达的分子的突变、截短、错误折叠或其它方式的异常表现；肿瘤相关抗原可与正常表达的分子相同但以异常高的水平表达；或者肿瘤相关抗原可在异常的情形或环境中表达。肿瘤相关抗原可以是，例如，蛋白质或蛋白质片段、复合碳水化合物、神经节苷脂、半抗原、核酸、其它生物分子或其任意组合。

在一些情况下，靶标为新抗原或新表位。例如，新抗原可以是ERBB2IP中的E805G突变。在一些情况下，可以通过全外显子组测序来鉴别新抗原和新表位。在一些情况下，新抗原和新表位靶标可由胃肠癌细胞表达。新抗原和新表位可在上皮癌上表达。

e.其它靶标

表位可以是基质表位。这样的表位可以在肿瘤微环境的基质上。抗原可以是基质抗原。这样的抗原可以在肿瘤微环境的基质上。仅列举一些例子，这些抗原和这些表位例如可存在于肿瘤内皮细胞、肿瘤血管系统、肿瘤成纤维细胞、肿瘤周细胞、肿瘤基质和/或肿瘤***上。这些抗原例如可包括CD34、MCSP、FAP、CD31、PCNA、CD117、CD40、MMP4和/或腱生蛋白。

f.基因的破坏

转基因的***可在有或没有基因破坏的情况下进行。转基因可***到诸如CD27、CD40、CD122、OX40、GITR、CD137、CD28、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3、VISTA、HPRT、AAVS SITE(例如AAVS1、AAVS2等)、CCR5、PPP1R12C、TCR或CISH等基因的附近、周围或内部，以降低或消除该基因的活性或表达。例如，癌症特异性TCR转基因可***到基因(例如，CISH和/或TCR)的附近、周围或内部，以降低或消除该基因的活性或表达。转基因的***可在内源TCR基因处进行。

基因的破坏可以是任何特定基因的破坏。考虑到涵盖了本申请内的基因的遗传同源物(例如，基因的任何哺乳动物形式)。例如，被破坏的基因可与本文公开的基因，例如，CD27、CD40、CD122、OX40、GITR、CD137、CD28、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3、VISTA、HPRT、CCR5、AAVS SITE(例如AAVS1、AAVS2等)、PPP1R12C、TCR和/或CISH表现出一定的同一性和/或同源性。因此，考虑到可以破坏表现出或表现出约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同源性(在核酸或蛋白质水平上)的基因。还考虑到可以破坏表现出或表现出约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性(在核酸或蛋白质水平上)的基因。一些遗传同源物是本领域已知的，但在一些情况下，同源物是未知的。然而，可以通过使用可公开获得的数据库如NCBI BLAST对核酸(DNA或RNA)序列或蛋白质序列进行比较来找到哺乳动物之间的同源基因。

可被破坏的基因可以是基因家族的成员。例如，可被破坏的基因可提高癌症免疫疗法的治疗潜力。在一些情况下，基因可以是CISH。CISH基因可以是细胞因子诱导的STAT抑制物(CIS)(也称为细胞因子信号传导阻抑物(SOCS)或STAT诱导的STAT抑制物(SSI))蛋白家族的成员(参见，例如，Palmer等人,Cish actively silences TCR signaling in CD8+Tcells to maintain tumor tolerance,The Journal of Experimental Medicine 202(12),2095-2113(2015))。基因可以是SOCS蛋白家族的一部分，SOCS蛋白家族可形成可调节细胞因子信号转导的经典负反馈系统的一部分。待破坏的基因可以是CISH。CISH可参与通过JAK-STAT5途径传导信号的细胞因子如***、催乳素或白介素3(IL-3)受体的负调节。基因可通过抑制STAT5的酪氨酸磷酸化来抑制STAT5反式激活。已知CISH家族成员是细胞因子诱导型细胞因子信号传导负调节物。基因的表达可由造血细胞中的IL2、IL3、GM-CSF或EPO诱导。蛋白酶体介导的基因蛋白降解可参与***受体的失活。在一些情况下，待靶向的基因可在肿瘤特异性T细胞中表达。待靶向的基因可在被破坏时增加工程化细胞向抗原相关肿瘤中的浸润。在一些情况下，待靶向的基因可以是CISH。

可被破坏的基因可参与减弱TCR信号传导、功能性亲合力或对癌症的免疫力。在一些情况下，当刺激TCR时，待破坏的基因上调。基因可参与抑制细胞扩充、功能性亲合力或细胞因子多功能性。基因可参与负调节细胞因子产生。例如，基因可参与抑制效应细胞因子如IFN-γ和/或TNF的产生。基因还可参与抑制TCR刺激后支持性细胞因子如IL-2的表达。这样的基因可以是CISH。

还可通过多种方式进行基因抑制。例如，可通过敲除、改变基因的启动子和/或通过施用干扰RNA来抑制基因表达。这可在生物体水平或在组织、器官和/或细胞水平上进行。如果在细胞、组织和/或器官中敲低一种或多种基因，则可通过施用RNA干扰试剂，例如，siRNA、shRNA或微小RNA来抑制该一种或多种基因。例如，可将可表达shRNA的核酸稳定转染到细胞中以敲低表达。此外，可将可表达shRNA的核酸***T细胞的基因组中，从而敲低T细胞内的基因。

破坏方法还可包括过表达显性失活蛋白质。该方法可导致功能性野生型基因的整体功能下降。此外，表达显性失活基因可产生与敲除和/或敲低的表型类似的表型。

有时，可在一种或多种基因中***或产生终止密码子(例如，通过核苷酸替代)，这可产生无功能的转录物或蛋白质(有时称为敲除)。例如，如果在一种或多种基因的中间部分内创建终止密码子，则所得到的转录物和/或蛋白质可被截短，并且可以是无功能的。然而，在一些情况下，截短可产生活性(部分或过度活性)蛋白质。如果蛋白质是过度活性的，这可产生显性失活蛋白质。

这种显性失活蛋白质可在处于任何启动子控制内的核酸中表达。例如，启动子可以是普遍存在的启动子。启动子也可以是诱导型启动子、组织特异性启动子、细胞特异性启动子和/或发育特异性启动子。

编码显性失活蛋白质的核酸随后可***细胞中。任何方法均可使用。例如，可以使用稳定转染。此外，编码显性失活蛋白质的核酸可***T细胞的基因组中。

可用任何方法敲除或破坏T细胞中的一种或多种基因。例如，敲除一种或多种基因可包括从T细胞的基因组中删除一种或多种基因。敲除还可包括从T细胞中去除全部或部分基因序列。还考虑到敲除可包括用一个或多个核苷酸代替T细胞基因组中的全部或部分基因。敲除一种或多种基因还可包括在一种或多种基因中***序列，从而破坏该一种或多种基因的表达。例如，***序列可在一种或多种基因的中间产生终止密码子。***序列还可使一种或多种基因的开放阅读框移位。

敲除可在任何细胞、器官和/或组织中进行，例如，在T细胞、造血干细胞、骨髓和/或胸腺中进行。例如，敲除可以是全身敲除，例如，一种或多种基因的表达在人的所有细胞中均被抑制。敲除还可以特定于人的一种或多种细胞、组织和/或器官。这可通过条件敲除来实现，其中在一种或多种器官、组织或细胞类型中选择性抑制一种或多种基因的表达。可通过Cre-lox系统进行条件敲除，其中cre在细胞、组织和/或器官特异性启动子的控制下进行表达。例如，可在一种或多种组织或器官中敲除一种或多种基因(或可对表达进行抑制)，其中该一种或多种组织或器官可包括脑、肺、肝、心脏、脾、胰腺、小肠、大肠、骨骼肌、平滑肌、皮肤、骨骼、脂肪组织、毛发、甲状腺、气管、胆囊、肾、输尿管、膀胱、主动脉、静脉、食道、隔膜、胃、直肠、肾上腺、支气管、耳、眼、视网膜、生殖器、下丘脑、喉、鼻、舌、脊髓或输尿管、子宫、卵巢、睾丸和/或其任意组合。还可在一种或多种类型的细胞中敲除一种或多种基因(或可对表达进行抑制)，其中一种或多种类型的细胞包括毛细胞(trichocyte)、角质形成细胞、***细胞、促肾上腺皮质激素细胞、促甲状腺素细胞、促生长激素细胞、泌乳细胞、嗜铬细胞、滤泡旁细胞、球细胞、黑素细胞、痣细胞、梅克尔细胞、成牙本质细胞、成牙骨质细胞、角膜细胞、视网膜muller细胞、视网膜色素上皮细胞、神经元、神经胶质细胞(例如，少突胶质细胞、星形胶质细胞)、室管膜细胞、松果体细胞、肺细胞(例如，I型肺细胞和II型肺细胞)、克拉拉细胞、杯形细胞、G细胞、D细胞、肠嗜铬样细胞、胃主细胞、壁细胞、小凹细胞、K细胞、D细胞、I细胞、杯形细胞、帕内特细胞、肠上皮细胞、微皱褶细胞、肝细胞、肝星状细胞(例如，来自中胚层的枯否细胞)、胆囊细胞、泡心细胞、胰腺星状细胞、胰腺α细胞、胰腺β细胞、胰腺δ细胞、胰腺F细胞、胰腺ε细胞、甲状腺(例如，滤泡细胞)、甲状旁腺(例如，甲状旁腺主细胞)、嗜酸细胞、尿道上皮细胞、成骨细胞、骨细胞、成软骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、纤维细胞、成肌细胞、肌细胞、肌卫星细胞、腱细胞、心肌细胞、成脂肪细胞、脂肪细胞、cajal***、成血管细胞、内皮细胞、系膜细胞(例如，肾小球内系膜细胞和肾小球外系膜细胞)、近肾小球细胞、致密斑细胞、基质细胞、***、特络细胞(telocytes)简单上皮细胞、足细胞、肾近端小管刷状缘细胞、支持细胞、leydig细胞、颗粒细胞、栓细胞、生殖细胞、***、卵子、淋巴细胞、骨髓细胞、内皮祖细胞、内皮干细胞、成血管细胞、中胚层成血管细胞(mesoangioblast)、周细胞壁细胞和/或其任意组合。

在一些情况下，本公开内容的方法可包括从受试者获得一个或多个细胞。细胞通常可指包含细胞质、蛋白质、核酸和/或封闭在膜内的细胞器的任何生物学结构。在一些情况下，细胞可以是哺乳动物细胞。在一些情况下，细胞可指免疫细胞。细胞的非限制性实例可包括B细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、γδT细胞、粒细胞、辅助T细胞、朗格汉斯细胞、淋巴样细胞、先天淋巴样细胞(ILC)、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、记忆T细胞、单核细胞、骨髓细胞、自然杀伤T细胞、嗜中性粒细胞、前体细胞、浆细胞、祖细胞、调节性T细胞、T细胞、胸腺细胞、其任何分化或去分化的细胞，或其细胞的任何混合物或组合。

在一些情况下，所述细胞可以是ILC，并且该ILC是1组ILC、2组ILC或3组ILC。1组ILC通常可被描述为受T-bet转录因子控制从而响应于细胞内病原体分泌1型细胞因子如IFN-γ和TNF-α的细胞。2组ILC通常可被描述为依赖于GATA-3和ROR-α转录因子从而响应于细胞外寄生虫感染产生2型细胞因子的细胞。3组ILC通常可被描述为受ROR-γt转录因子控制并产生IL-17和/或IL-22的细胞。

在一些情况下，所述细胞可以是对于给定因子呈阳性或阴性的细胞。在一些情况下，细胞可以是CD3+细胞、CD3-细胞、CD5+细胞、CD5-细胞、CD7+细胞、CD7-细胞、CD14+细胞、CD14-细胞、CD8+细胞、CD8-细胞、CD103+细胞、CD103-细胞、CD11b+细胞、CD11b-细胞、BDCA1+细胞、BDCA1-细胞、L-选择蛋白+细胞、L-选择蛋白-细胞、CD25+、CD25-细胞、CD27+、CD27-细胞、CD28+细胞、CD28-细胞、CD44+细胞、CD44-细胞、CD56+细胞、CD56-细胞、CD57+细胞、CD57-细胞、CD62L+细胞、CD62L-细胞、CD69+细胞、CD69-细胞、CD45RO+细胞、CD45RO-细胞、CD127+细胞、CD127-细胞、CD132+细胞、CD132-细胞、IL-7+细胞、IL-7-细胞、IL-15+细胞、IL-15-细胞、凝集素样受体G1阳性细胞、凝集素样受体G1阴性细胞或其分化或去分化细胞。由细胞表达的因子的实例并非意在限制，并且本领域技术人员将理解，细胞对于本领域已知的任何因子可以是阳性的或阴性的。在一些情况下，细胞对于两种或更多种因子可以是阳性的。例如，细胞可以是CD4+和CD8+。在一些情况下，细胞对于两种或更多种因子可以是阴性的。例如，细胞可以是CD25-、CD44-和CD69-。在一些情况下，细胞对于一种或多种因子可以是阳性的，并且对于一种或多种因子可以是阴性的。例如，细胞可以是CD4+和CD8-。然后可将所选择的细胞输注到受试者中。在一些情况下，可针对具有或不具有一种或多种给定因子对细胞进行选择(例如，可基于一种或多种因子的存在或不存在来分离细胞)。分离效率可影响细胞的活力以及转基因可整合到细胞基因组中和/或可被表达的效率。在一些情况下，所选择的细胞也可在体外扩充。所选择的细胞可在输注前进行体外扩充。应当理解，在本文公开的任何方法中使用的细胞可以是本文公开的任何细胞的混合物(例如，两个或更多个不同的细胞)。例如，本公开内容的方法可包括细胞，并且该细胞是CD4+细胞和CD8+细胞的混合物。在另一个实例中，本公开内容的方法可包括细胞，并且该细胞是CD4+细胞和幼稚细胞的混合物。

幼稚细胞保留了对本文公开的方法可能特别有用的几种特性。例如，幼稚细胞能够容易地进行体外扩充和T细胞受体转基因表达，幼稚细胞呈现出较少的终末分化标志物(一种可能与细胞输注后更高的功效相关的特性)，并保留较长的端粒，暗示着更大的增殖潜能(Hinrichs,C.S.等人,“Human effector CD8+T cells derived from naive ratherthan memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy,”Blood,117(3):808-14(2011))。本文公开的方法可包括对幼稚细胞特异性标志物的选择或阴性选择。在一些情况下，所述细胞可以是幼稚细胞。幼稚细胞通常可指未暴露于抗原的任何细胞。本公开内容中的任何细胞可以是幼稚细胞。在一个实例中，细胞可以是幼稚T细胞。幼稚T细胞通常可被描述为这样的细胞，其已在骨髓中分化，并且成功经历了胸腺中央选择(central selection)的阳性和阴性过程，并且/或者可通过特定标志物的表达或缺乏(例如，L-选择蛋白的表面表达，活化标志物CD25、CD44或CD69的缺乏，以及记忆CD45RO同种型的缺乏)进行表征。

在一些情况下，细胞可包括细胞系(例如，永生化细胞系)。细胞系的非限制性实例包括人BC-1细胞、人BJAB细胞、人IM-9细胞、人Jiyoye细胞、人K-562细胞、人LCL细胞、小鼠MPC-11细胞、人Raji细胞、人Ramos细胞、小鼠Ramos细胞、人RPMI8226细胞、人RS4-11细胞、人SKW6.4细胞、人树突细胞、小鼠P815细胞、小鼠RBL-2H3细胞、人HL-60细胞、人NAMALWA细胞、人巨噬细胞、小鼠RAW 264.7细胞、人KG-1细胞、小鼠M1细胞、人PBMC细胞、小鼠BW5147(T200-A)5.2细胞、人CCRF-CEM细胞、小鼠EL4细胞、人Jurkat细胞、人SCID.adh细胞、人U-937细胞或这些细胞的任意组合。

干细胞可产生多种体细胞，因此在原则上具有充当几乎任何类型治疗细胞的无限供应源的潜力。干细胞的可重编程性也允许进行额外的工程化，以增加重编程的细胞的治疗价值。在本公开内容的任何方法中，一种或多种细胞可来源于干细胞。干细胞的非限制性实例包括胚胎干细胞、成体干细胞、组织特异性干细胞、神经干细胞、同种异体干细胞、全能干细胞、多能干细胞、多潜能干细胞、诱导多潜能干细胞、造血干细胞、表皮干细胞、脐带干细胞、上皮干细胞或脂肪来源的干细胞。在一个实例中，细胞可以是造血干细胞衍生的淋巴祖细胞。在另一个实例中，细胞可以是胚胎干细胞衍生的T细胞。在又一个实例中，细胞可以是诱导多潜能干细胞(iPSC)衍生的T细胞。

条件敲除可以是可诱导的，例如可通过使用四环素诱导型启动子、发育特异性启动子诱导。这可允许在任何时间或在特定时间消除或抑制基因/蛋白质的表达。例如，在四环素诱导型启动子的情况下，可在出生后的任何时间将四环素给予T细胞。cre/lox系统也可受发育特异性启动子的控制。例如，一些启动子在出生后或者甚至在***开始后开启。这些启动子可用来控制cre表达，因此可用于发育特异性敲除。

还考虑到可以将敲除技术的任意组合进行组合。例如，组织特异性敲除或细胞特异性敲除可与诱导型技术相组合，从而产生组织特异性或细胞特异性诱导型敲除。此外，其它系统如发育特异性启动子可与组织特异性启动子和/或诱导型敲除组合使用。

敲除技术还可包括基因编辑。例如，可以使用核酸酶(包括CRISPR相关蛋白(Cas蛋白，例如Cas9)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和大范围核酸酶)进行基因编辑。核酸酶可以是天然存在的核酸酶、遗传修饰的核酸酶和/或重组的核酸酶。还可使用基于转座子的系统(例如，PiggyBac、睡美人(Sleeping beauty))进行基因编辑。例如，可以使用转座酶进行基因编辑。

在一些情况下，核酸酶或编码核酸酶的多肽向至少一种基因(例如，CISH和/或TCR)中引入断裂。在一些情况下，核酸酶或编码核酸酶的多肽包含和/或导致至少一种基因(例如，CISH和/或TCR)的失活或表达降低。在一些情况下，基因选自CISH、TCR、腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含V-set域的T细胞激活抑制物1(VTCN1)、B和T淋巴细胞相关因子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体三域长细胞质尾1(KIR3DL1)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)、V域免疫球蛋白T细胞激活阻抑物(VISTA)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT)、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)或趋化因子(C-C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)、CD160分子(CD160)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD96分子(CD96)、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10a(TNFRSF10A)、胱天蛋白酶8(CASP8)、胱天蛋白酶10(CASP10)、胱天蛋白酶3(CASP3)、胱天蛋白酶6(CASP6)、胱天蛋白酶7(CASP7)、Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)、Fas细胞表面死亡受体(FAS)、转化生长因子β受体II(TGFBRII)、转化生长因子β受体I(TGFBR1)、SMAD家族成员2(SMAD2)、SMAD家族成员3(SMAD3)、SMAD家族成员4(SMAD4)、SKI原癌基因(SKI)、SKI样原癌基因(SKIL)、TGFB诱导因子同源框1(TGIF1)、程序性细胞死亡因子1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、白介素10受体亚单位α(IL10RA)、白介素10受体亚单位β(IL10RB)、血红素氧化酶2(HMOX2)、白介素6受体(IL6R)、白介素6信号转导蛋白(IL6ST)、c-src酪氨酸激酶(CSK)、鞘糖脂微域关联磷蛋白膜锚定物1(PAG1)、信号阈值调节跨膜衔接因子1(SIT1)、叉头框蛋白P3(FOXP3)、PR结构域1(PRDM1)、碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白(BATF)、可溶性鸟苷酸环化酶1,α2(GUCY1A2)、可溶性鸟苷酸环化酶1,α3(GUCY1A3)、可溶性鸟苷酸环化酶1,β2(GUCY1B2)、脯氨酰羟化酶结构域(PHD1、PHD2、PHD3)家族蛋白或可溶性鸟苷酸环化酶1,β3(GUCY1B3)、T细胞受体α基因座(TRA)、T细胞受体β基因座(TRB)、egl-9家族缺氧诱导因子1(EGLN1)、egl-9家族缺氧诱导因子2(EGLN2)、egl-9家族缺氧诱导因子3(EGLN3)、蛋白磷酸酶1调节亚单位12C(PPP1R12C)及其任意组合或衍生物。

CRISPR系统

本文所述的方法可利用CRISPR系统。存在至少五种类型的CRISPR系统，它们均组合了RNA和Cas蛋白。I型、III型和IV型装配能够切割与crRNA互补的核酸的多Cas蛋白复合物。I型和III型均需要在将经加工的crRNA装配成多Cas蛋白复合物之前进行pre-crRNA加工。II型和V型CRISPR系统包含与至少一种指导RNA复合的单一Cas蛋白。

在以下文献中讨论了CRISPR系统的一般机制和最新进展：Cong,L.等人,“Multiplex genome engineering using CRISPR systems,”Science,339(6121):819-823(2013)；Fu,Y.等人,“High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Casnucleases in human cells,”Nature Biotechnology,31,822–826(2013)；Chu,VT等人,“Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells,”Nature Biotechnology 33,543–548(2015)；Shmakov,S.等人,“Discovery and functional characterization ofdiverse Class 2CRISPR-Cas systems,”Molecular Cell,60,1-13(2015)；Makarova,KS等人,“An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems”,NatureReviews Microbiology,13,1-15(2015)。靶DNA的位点特异性切割发生在由以下两者决定的位置：1)指导RNA与靶DNA之间的碱基配对互补性(也称为前间区)，和2)靶DNA中的短基序，其被称为前间区邻近基序(PAM)。例如，可使用CRISPR系统，例如，II型CRISPR系统，产生工程化细胞。本文公开的方法中所使用的Cas酶可以是催化DNA切割的Cas9。通过来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9或任何密切相关的Cas9进行的酶促作用可在靶位点序列处产生双链断裂，该靶位点序列与指导序列的20个核苷酸杂交，并且具有位于该靶序列的这20个核苷酸之后的前间区邻近基序(PAM)。

可以使用任何手段将CRISPR系统引入细胞或细胞群体中。在一些情况下，可以通过电穿孔或核转染引入CRISPR系统。例如，可使用转染系统(ThermoFisherScientific)进行电穿孔，或者还可使用 Nucleofector(Biosystems)将核酸递送到细胞中。可以调整电穿孔参数以优化转染效率和/或细胞活力。电穿孔装置可具有多种电波形式的脉冲设置，如指数衰减、时间常数和方波。每种细胞类型具有独特的最佳场强(E)，该最佳场强取决于施加的脉冲参数(例如，电压、电容和电阻)。最佳场强的施加通过诱导跨膜电压引起电渗透，从而使核酸穿过细胞膜。在一些情况下，可以调整电穿孔脉冲电压、电穿孔脉冲宽度、脉冲数目、细胞密度和尖端类型，以优化转染效率和/或细胞活力。

a.Cas蛋白

载体可与编码CRISPR酶如Cas蛋白(CRISPR相关蛋白)的酶编码序列可操作地连接。在一些情况下，核酸酶或编码核酸酶的多肽来自CRISPR系统(例如，CRISPR酶)。Cas蛋白的非限制性实例可包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也被称为Csn1或Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、其同源物或其修饰形式。在一些情况下，可以使用催化失效的Cas蛋白(例如，催化失效的Cas9(dCas9))。未修饰的CRISPR酶可具有DNA切割活性，如Cas9。在一些情况下，核酸酶是Cas9。在一些情况下，多肽编码Cas9。在一些情况下，核酸酶或编码核酸酶的多肽是催化失效的。在一些情况下，核酸酶是催化失效的Cas9(dCas9)。在一些情况下，多肽编码催化失效的Cas9(dCas9)。CRISPR酶可引导靶序列处，如靶序列内和/或靶序列的互补序列内，一条链或两条链的切割。例如，CRISPR酶可引导在距离靶序列的第一个或最后一个核苷酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500个或更多个碱基对或者约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500个或更多个碱基对内一条链或两条链的切割。可以使用编码CRISPR酶的载体，该CRISPR酶相对于相应的野生型酶发生突变，使得突变的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条链或两条链的能力。Cas蛋白可以是高保真Cas蛋白，如Cas9HiFi。

可以使用编码包含一个或多个核定位序列(NLS)(如多于或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个NLS)的CRISPR酶的载体。例如，CRISPR酶可包含在氨基末端或其附近的多于或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个NLS，在羧基末端或其附近的多于或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个NLS，或这些的任意组合(例如，在氨基末端的一个或多个NLS和在羧基末端的一个或多个NLS)。当存在多于一个NLS时，每一个可独立于其它NLS而被选择，使得单个NLS可存在于多于一个拷贝中并且/或者与一个或多个其它NLS组合存在于一个或多个拷贝中。

Cas9可指与野生型示例性Cas9多肽(例如，来自酿脓链球菌的Cas9)具有至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％、100％的序列同一性和/或序列相似性的多肽。Cas9可指与野生型示例性Cas9多肽(例如，来自酿脓链球菌)具有至多或至多约50％、60％、70％、80％、90％、100％的序列同一性和/或序列相似性的多肽。Cas9可指野生型Cas9蛋白或可包含氨基酸改变如缺失、***、置换、变体、突变、融合、嵌合或其任意组合的修饰形式的Cas9蛋白。

可针对在特定细胞如真核细胞中的表达，对编码核酸酶或内切核酸酶(例如，Cas蛋白如Cas9)的多核苷酸进行密码子优化。这种类型的优化可能需要外部来源(例如，重组)DNA的突变，以在编码相同蛋白质的同时模拟预期宿主生物体或细胞的密码子偏好。

所述方法中使用的CRISPR酶可包含NLS。NLS可位于多肽链内的任何位置，例如，靠近N末端或C末端。例如，NLS可处于沿多肽链从N末端或C末端开始的1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50个氨基酸或约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50个氨基酸内。有时，NLS可处于从N末端或C末端开始的50个氨基酸或更多个氨基酸或者约50个氨基酸或更多个氨基酸，例如，100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个氨基酸内。

核酸酶或内切核酸酶可包含与野生型示例性定点多肽(例如，来自酿脓链球菌的Cas9)的核酸酶结构域具有至少或至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

虽然酿脓链球菌Cas9(SpCas9)(表11)通常作为CRISPR内切核酸酶用于基因组工程化，但它可能不是每个目标切除位点的最佳内切核酸酶。例如，SpCas9(5′NGG 3′)的PAM序列在整个人类基因组中大量存在，但NGG序列可能无法正确定位以靶向所需基因以供修饰。在一些情况下，不同的内切核酸酶可用来靶向某些基因组靶标。在一些情况下，可以使用具有非NGG PAM序列的合成的SpCas9衍生变体。此外，已经鉴别了来自各种物种的其它Cas9直向同源物，并且这些“非SpCas9”结合也可用于本公开内容的多种PAM序列。例如，尺寸相对较大的SpCas9(大约4kb编码序列)意味着携带SpCas9cDNA的质粒可能无法在细胞中有效表达。相反，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9(SaCas9)的编码序列比SpCas9短大约1千碱基，从而可能允许其在细胞中有效表达。与SpCas9类似，SaCas9内切核酸酶能够在体外修饰哺乳动物细胞中的靶基因以及在体内修饰小鼠中的靶基因。

酿脓链球菌Cas9的替代物可包括在哺乳动物细胞中显示出切割活性的来自Cpf1家族的RNA指导的内切核酸酶。与Cas9核酸酶不同，Cpf1介导的DNA切割的结果是具有短3’突出端的双链断裂。Cpf1的交错切割模式可开启定向基因转移的可能性，类似于传统的限制酶克隆，这可提高基因编辑的效率。与上述Cas9变体和直向同源物一样，Cpf1也可扩大可被CRISPR靶向至富含AT的区域或富含AT的基因组(其缺乏受SpCas9青睐的NGG PAM位点)的位点的数目。

可将任何功能性浓度的Cas蛋白引入细胞中。例如，可将15微克Cas mRNA引入细胞中。在其它情况下，可以引入0.5微克至100微克Cas mRNA。可以引入0.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100微克Cas mRNA。

在一些情况下，可以使用双切口酶方法来引入双链断裂或基因组断裂。可以使Cas蛋白在任一核酸酶结构域内的已知氨基酸处突变，从而删除一个核酸酶结构域的活性并产生能够产生单链断裂的切口酶Cas蛋白。可以使用切口酶以及靶向相对链的两种不同指导RNA在靶位点内产生双链断裂(DSB)(通常称为“双切口”或“双切口酶”CRISPR系统)。这种方法可以提高靶标特异性，因为不太可能在足够接近的距离内产生两个脱靶切口以产生DSB。

b.指导多核酸(例如，gRNA或gDNA)

指导多核酸(或指导性多核酸)可以是DNA或RNA。指导多核酸可以是单链或双链的。在一些情况下，指导多核酸可包含单链区和双链区的区域。指导多核酸还可形成二级结构。在一些情况下，指导多核酸可含有核苷酸间连接，该核苷酸间连接可以是硫代磷酸酯。可存在任何数目的硫代磷酸酯。例如，1至约100个硫代磷酸酯可存在于指导多核酸序列中。在一些情况下，存在1至10个硫代磷酸酯。在一些情况下，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个硫代磷酸酯存在于指导多核酸序列中。

如本文所用的，术语“指导RNA(gRNA)”及其语法等同语可指可对靶DNA具有特异性并且可与核酸酶如Cas蛋白形成复合物的RNA。指导RNA可包含指导序列或间隔区序列，该序列指定靶位点并将RNA/Cas复合物引导至指定的靶DNA以供切割。例如，图15显示，指导RNA可将CRISPR复合物靶向至三种基因并进行靶向双链断裂。靶DNA的位点特异性切割发生在由以下两者决定的位置：1)指导RNA与靶DNA之间的碱基配对互补性(也称为前间区)，和2)靶DNA中的短基序，被称为前间区邻近基序(PAM)。类似地，指导RNA(“gDNA”)可对靶DNA具有特异性，并且可与核酸酶形成复合物以指导其核酸切割活性。

本文公开的方法还可包括向细胞或胚胎中或向细胞群体引入至少一种指导多核酸(例如，指导DNA或指导RNA)或核酸(例如，编码至少一种指导RNA的DNA)。指导RNA可与RNA指导的内切核酸酶或核酸酶相互作用，以将该内切核酸酶或核酸酶引导至特定的靶位点，在该位点处，指导RNA的5’端与染色体序列中的特定前间区序列发生碱基配对。在一些情况下，指导多核酸可以是gRNA和/或gDNA。在一些情况下，指导多核酸可具有与至少一种基因(例如，CISH和/或TCR)互补的序列。在一些情况下，CRISPR系统包含指导多核酸。在一些情况下，CRISPR系统包含指导多核酸和/或核酸酶或编码核酸酶的多肽。在一些情况下，本公开内容的方法或系统进一步包含指导多核酸和/或核酸酶或编码核酸酶的多肽。在一些情况下，在将核酸酶或编码核酸酶的多肽引入到细胞或细胞群体的同时、之前或之后引入指导多核酸。在一些情况下，在将病毒(例如，AAV)载体或非病毒(例如，微环)载体引入到细胞或细胞群体的同时、之前或之后引入指导多核酸(例如，在将包含至少一种外源转基因的AAV载体引入到细胞或细胞群体的同时、之前或之后引入指导多核酸)。

指导RNA可包括两种RNA，例如，CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。指导RNA有时可包括通过crRNA和tracrRNA的一部分(例如，功能部分)融合而形成的单指导RNA(sgRNA)。指导RNA还可以是包含crRNA和tracrRNA的双重RNA。指导RNA可包含crRNA而缺乏tracrRNA。此外，crRNA可与靶DNA或前间区序列杂交。

如上文所讨论的，指导RNA可以是表达产物。例如，编码指导RNA的DNA可以是包含编码指导RNA的序列的载体。可通过用分离的指导RNA或质粒DNA(其包含编码指导RNA的序列和启动子)转染细胞或生物体，将指导RNA转移到该细胞或生物体中。还可以以其它方式，例如使用病毒介导的基因递送，将指导RNA转移到细胞或生物体中。

可以分离指导RNA。例如，可以以分离的RNA的形式将指导RNA转染到细胞或生物体中。可通过使用任何体外转录系统的体外转录来制备指导RNA。可以以分离的RNA的形式而不是以包含指导RNA的编码序列的质粒形式将指导RNA转移到细胞中。

指导RNA可包含DNA靶向区段和蛋白质结合区段。DNA靶向区段(或DNA靶向序列或间隔区序列)包含可与靶DNA内的特定序列(例如，前间区)互补的核苷酸序列。蛋白质结合区段(或蛋白质结合序列)可与定点修饰多肽，例如，RNA指导的内切核酸酶如Cas蛋白相互作用。“区段”意指分子的区段/部分/区域，例如，RNA中的一段连续的核苷酸。区段也可意指复合物的区域/部分，使得区段可包含多于一种分子的区域。例如，在一些情况下，靶向DNA的RNA的蛋白质结合区段是一种RNA分子，因此该蛋白质结合区段包含该RNA分子的区域。在其它情况下，靶向DNA的RNA的蛋白质结合区段包含沿互补区域杂交的两个单独的分子。

指导RNA可包含两个单独的RNA分子或单个RNA分子。示例性单分子指导RNA包含DNA靶向区段和蛋白质结合区段两者。

示例性的两分子的靶向DNA的RNA可包含crRNA样(“CRISPR RNA”或“靶向物-RNA”或“crRNA”或“crRNA重复序列”)分子和相应的tracrRNA样(“反式作用CRISPR RNA”或“激活物-RNA”或“tracrRNA”)分子。第一RNA分子可以是可包含DNA靶向区段(例如，间隔区)和一段核苷酸的crRNA样分子(靶向物-RNA)，该段核苷酸可形成包含指导RNA的蛋白质结合区段的双链RNA(dsRNA)双链体的一半。第二RNA分子可以是可包含一段核苷酸的相应的tracrRNA样分子(激活物-RNA)，该段核苷酸可形成指导RNA的蛋白质结合区段的dsRNA双链体的另一半。换言之，crRNA样分子的一段核苷酸可与tracrRNA样分子的一段核苷酸互补并杂交，以形成指导RNA的蛋白质结合域的dsRNA双链体。如此，可以说每个crRNA样分子都具有相应的tracrRNA样分子。crRNA样分子可额外提供单链DNA靶向区段或间隔区序列。因此，crRNA样分子和tracrRNA样分子(作为相应的对)可杂交形成指导RNA。本发明的两分子的指导RNA可包含任何相应的crRNA和tracrRNA对。

指导RNA的DNA靶向区段或间隔区序列可与染色体序列中靶位点处的序列(例如，前间区序列)互补，使得指导RNA的DNA靶向区段可与该靶位点或前间区发生碱基配对。在一些情况下，指导RNA的DNA靶向区段可包含10个或约10个核苷酸至25个或约25个核苷酸或更多个核苷酸。例如，指导RNA的第一区域与染色体序列中的靶位点之间的碱基配对区域可以是或可以是约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25个或多于25个核苷酸的长度。有时，指导RNA的第一区域可以是或可以是约19、20或21个核苷酸的长度。

指导RNA可靶向20个核苷酸或约20个核苷酸的核酸序列。靶核酸可少于或少于约20个核苷酸。靶核酸可以是至少或至少约5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。靶核酸可以是至多或至多约5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。靶核酸序列可以是紧邻PAM的第一个核苷酸的5’的20个碱基或约20个碱基。指导RNA可靶向核酸序列。在一些情况下，指导多核酸如指导RNA可以结合距离PAM约1个碱基对至约20个碱基对的基因组区域。指导物可以结合距离PAM约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或至多约20个碱基对的基因组区域。

指导核酸，例如指导RNA，可指可与另一核酸(例如，细胞基因组中的靶核酸或前间区)杂交的核酸。指导核酸可以是RNA。指导核酸可以是DNA。指导核酸可被编程为或设计成以位点特异性方式与核酸序列结合。指导核酸可包含一条多核苷酸链，并且可被称为单指导核酸。指导核酸可包含两条多核苷酸链，并且可被称为双指导核酸。

指导核酸可包含一种或多种修饰，从而为核酸提供新的或增强的特征。指导核酸可包含核酸亲和标签。指导核酸可包含合成的核苷酸、合成的核苷酸类似物、核苷酸衍生物和/或修饰的核苷酸。

指导核酸可包含可与靶核酸中的序列(例如，前间区)杂交的、例如位于5’端或3’端处或附近的核苷酸序列(例如，间隔区)。指导核酸的间隔区可通过杂交(即碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用。间隔区序列可与位于前间区邻近基序(PAM)的5’或3’侧的靶核酸杂交。间隔区序列的长度可以是至少或至少约5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。间隔区序列的长度可以是至多或至多约5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。

指导RNA还可包含形成二级结构的dsRNA双链体区域。例如，由指导RNA形成的二级结构可包括茎(或发夹)和环。环和茎的长度可以不同。例如，环可以在约3个至约10个核苷酸长度的范围内，而茎可以在约6个至约20个碱基对长度的范围内。茎可包含一个或多个具有1个至约10个核苷酸的凸起。第二区域的总长度可以在约16个至约60个核苷酸长度的范围内。例如，环可以是或可以是约4个核苷酸的长度，而茎可以是或可以是约12个碱基对。dsRNA双链体区域可包含可与RNA结合蛋白质，如RNA指导的内切核酸酶，例如Cas蛋白形成复合物的蛋白质结合区段。

指导RNA还可包含可以基本上为单链、位于5’或3’端的尾区。例如，尾区有时不与感兴趣的细胞中的任何染色体序列互补，并且有时不与指导RNA的其余部分互补。此外，尾区的长度可以不同。尾区可以是多于或多于约4个核苷酸的长度。例如，尾区的长度可以在5个或约5个至60个或约60个核苷酸长度的范围内。

指导RNA可作为RNA分子而引入细胞或胚胎中。例如，RNA分子可在体外转录并且/或者可以化学合成。然后指导RNA可作为RNA分子而引入细胞或胚胎中。指导RNA还可以以非RNA核酸分子，例如DNA分子的形式引入细胞或胚胎中。例如，编码指导RNA的DNA可以与启动子控制序列可操作地连接，以供在感兴趣的细胞或胚胎中表达指导RNA。RNA编码序列可以与被RNA聚合酶III(PolIII)识别的启动子序列可操作地连接。

编码指导RNA的DNA分子还可以是线性的。编码指导RNA的DNA分子还可以是环状的。

编码指导RNA的DNA序列也可以是载体的一部分。载体的一些实例可包括质粒载体、噬菌粒、粘粒、人工/微型染色体、转座子和病毒载体。例如，编码RNA指导的内切核酸酶的DNA存在于质粒载体中。合适的质粒载体的其它非限制性实例包括pUC、pBR322、pET、pBluescript及其变体。此外，载体可包含另外的表达控制序列(例如，增强子序列、Kozak序列、聚腺苷酸化序列、转录终止序列等)、选择性标记序列(例如，抗生素抗性基因)、复制起点等。

当RNA指导的内切核酸酶和指导RNA均作为DNA分子被引入细胞中时，每一者可以是不同分子的一部分(例如，含有融合蛋白编码序列的一种载体和含有指导RNA编码序列的第二载体)，或者两者可以是相同分子的一部分(例如，含有融合蛋白和指导RNA两者的编码(和调节)序列的一种载体)。

Cas蛋白如Cas9蛋白或其任何衍生物可与指导RNA预先复合，以形成核糖核蛋白(RNP)复合物。可将RNP复合物引入原代免疫细胞中。可以定时引入RNP复合物。可在细胞周期的G1、S和/或M期使细胞与其它细胞同步。可在细胞阶段递送RNP复合物，使HDR得以增强。RNP复合物可促进同源性指导的修复。

还可对指导RNA进行修饰。该修饰可包括化学改变、合成修饰、核苷酸添加和/或核苷酸减除。该修饰还可增强CRISPR基因组工程化。修饰可改变gRNA的手性。在一些情况下，手性在修饰后可以是一致的或立体纯的(stereopure)。可以合成指导RNA。合成的指导RNA可增强CRISPR基因组工程化。还可将指导RNA截短。截短可用来减少不希望的脱靶(off-target)诱变。截短可包含任何数目的核苷酸缺失。例如，截短可包括1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50个或更多个核苷酸。指导RNA可包含任何长度的目标互补性区域。例如，目标互补性区域可以是少于20个核苷酸的长度。目标互补性区域可以是多于20个核苷酸的长度。目标互补性区域可以靶向与PAM序列直接相邻的约5bp至约20bp。目标互补性区域可以靶向与PAM序列直接相邻的约13bp。

在一些情况下，可以进行GUIDE-Seq分析以确定工程化指导RNA的特异性。在Tsai,S.等人,“GUIDE-Seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage byCRISPR system nucleases,”Nature,33:187-197(2015)中讨论了通过CRISPR系统核酸酶进行的脱靶切割的GUIDE-Seq概况分析的一般机制和方案。

可以以任何功能性浓度引入gRNA。例如，可以向细胞引入10微克gRNA。在其它情况下，可以引入0.5微克至100微克gRNA。可以引入0.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100微克gRNA。

在一些情况下，方法可包括选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、其同源物或其修饰形式的核酸酶或内切核酸酶。Cas蛋白可以是Cas9。在一些情况下，方法可进一步包括至少一种指导RNA(gRNA)。gRNA可包含至少一种修饰。外源TCR可结合癌症新抗原。

本文公开了一种制备工程化细胞的方法，其包括：引入编码至少一种外源T细胞受体(TCR)受体序列的至少一种多核酸；引入包含至少一种修饰的至少一种指导RNA(gRNA)；以及引入至少一种内切核酸酶；其中所述gRNA包含与至少一个内源基因组互补的至少一种序列。在一些情况下，修饰在5’端、3’端、5’端至3’端，为单碱基修饰、2’-核糖修饰或其任意组合。修饰可选自碱基置换、***、缺失、化学修饰、物理修饰、稳定化、纯化及其任意组合。

在一些情况下，修饰为化学修饰。修饰可选自5’腺苷酸、5’鸟苷-三磷酸帽、5’N7-甲基鸟苷-三磷酸帽、5’三磷酸帽、3’磷酸、3’硫代磷酸、5’磷酸、5’硫代磷酸、Cis-Syn型胸苷二聚体、三聚体、C12间隔区、C3间隔区、C6间隔区、d间隔区、PC间隔区、r间隔区、间隔区18、间隔区9、3’-3’修饰、5’-5’修饰、脱碱基、吖啶、偶氮苯、生物素、生物素BB、生物素TEG、胆固醇TEG、脱硫生物素TEG、DNP TEG、DNP-X、DOTA、dT-生物素、双生物素、PC生物素、补骨脂素C2、补骨脂素C6、TINA、3’DABCYL、黑洞猝灭剂1、黑洞猝灭剂2、DABCYL SE、dT-DABCYL、IRDye QC-1、QSY-21、QSY-35、QSY-7、QSY-9、羧基接头、硫醇接头、2’脱氧核糖核苷类似物嘌呤、2’脱氧核糖核苷类似物嘧啶、核糖核苷类似物、2’-O-甲基核糖核苷类似物、糖修饰的类似物、摆动性/通用碱基、荧光染料标记、2’氟代RNA、2’O-甲基RNA、甲基膦酸酯、磷酸二酯DNA、磷酸二酯RNA、硫代磷酸酯DNA、硫代磷酸酯RNA、UNA、假尿苷-5’-三磷酸、5-甲基胞苷-5’-三磷酸、3硫代磷酸2-O-甲酯或其任意组合。修饰可以是如图98中所示的假尿苷(pseudouride)修饰。在一些情况下，修饰可以不影响活力，图99A和图99B。

在一些情况下，修饰为3硫代磷酸2-O-甲酯添加。可对1个碱基至150个碱基进行3硫代磷酸2-O-甲酯添加。可对1个碱基至4个碱基进行3硫代磷酸2-O-甲酯添加。可对2个碱基进行3硫代磷酸2-O-甲酯添加。可对4个碱基进行3硫代磷酸2-O-甲酯添加。修饰也可以是截短。截短可以是5个碱基的截短。

在一些情况下，5个碱基的截短可防止Cas蛋白进行切割。内切核酸酶或核酸酶或编码核酸酶的多肽可选自CRISPR系统、TALEN、锌指、基于转座子、ZEN、大范围核酸酶、Mega-TAL及其任意组合。在一些情况下，内切核酸酶或核酸酶或编码核酸酶的多肽可以来自CRISPR系统。内切核酸酶或核酸酶或编码核酸酶的多肽可以是Cas或编码Cas的多肽。在一些情况下，内切核酸酶或核酸酶或编码核酸酶的多肽可选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、其同源物或其修饰形式。如图100A和图100B所示，Cas的修饰形式可以是洁净的Cas。Cas蛋白可以是Cas9。Cas9可在所述至少一种内源基因组中产生双链断裂。在一些情况下，内切核酸酶或核酸酶或编码核酸酶的多肽可以是Cas9或编码Cas9的多肽。在一些情况下，内切核酸酶或核酸酶或编码核酸酶的多肽可以是催化失效的。在一些情况下，内切核酸酶或核酸酶或编码核酸酶的多肽可以是催化失效的Cas9或编码催化失效的Cas9的多肽。在一些情况下，内源基因组包含至少一种基因。基因可以是CISH、TCR、TRA、TRB或其组合。在一些情况下，可以使用同源性指导的修复(HR)、非同源末端连接(NHEJ)、微同源性介导的末端连接(MMEJ)或其任意组合或衍生方法来修复双链断裂。TCR可整合到双链断裂中。

c.转基因

转基因(例如，外源序列)的***可用于例如多肽的表达、突变基因的校正或用于增加野生型基因的表达。转基因通常与其所在的基因组序列不同。供体转基因可含有侧翼为两个同源区域的非同源序列，以允许在感兴趣的位置处进行有效的HDR。此外，转基因序列可包含载体分子，该载体分子含有与细胞染色质中的感兴趣区域不同源的序列。转基因可含有与细胞染色质同源的数个不连续区域。例如，对于通常不存在于感兴趣区域中的序列的靶向***，序列可存在于供体核酸分子中并且侧翼为与感兴趣区域中的序列同源的区域。

转基因多核酸可以是单链或双链的DNA或RNA，并且可以以线性或环状形式引入细胞中。转基因序列可包含在DNA微环内，其可以以环状或线性形式引入细胞中。如果以线性形式引入，则可通过任何方法来保护转基因序列的末端(例如，保护免受核酸外切降解)。例如，可将一个或多个双脱氧核苷酸残基添加至线性分子的3’末端，并且/或者可将自身互补的寡核苷酸连接至一个或两个末端。用于保护外源多核苷酸免受降解的其它方法包括但不限于添加末端氨基和使用修饰的核苷酸间连接，例如，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和O-甲基核糖或脱氧核糖残基。

转基因的侧翼可以是重组臂。在一些情况下，重组臂可包含将转基因靶向至所需整合位点的互补区域。转基因也可整合到基因组区域中，使得该***破坏内源基因。可通过任何方法，例如，非重组末端连接和/或重组定向修复来整合转基因。还可在修复双链断裂的重组事件期间整合转基因。还可使用同源重组增强子整合转基因。例如，增强子可阻断非同源末端连接，使得进行同源性指导的修复以修复双链断裂。

转基因的侧翼可以是重组臂，其中该臂与其互补序列之间的同源性程度足以允许两者之间发生同源重组。例如，该臂与其互补序列之间的同源性程度可以是50％或更高。两个同源的不相同序列可以是任何长度，并且其非同源性程度可小到单个核苷酸(例如，用于通过靶向同源重组来校正基因组点突变)或大到10个或更多个千碱基(例如，用于在染色体中的预定异常位点处***基因)。包含同源的不相同序列的两个多核苷酸无需是相同的长度。例如，具有与CCR5的重组臂的代表性转基因在图16中示出。任何其它基因，例如，本文所述的基因，可用来产生重组臂。

转基因的侧翼可以是与基因组中的靶向双链断裂区互补的工程化位点。在一些情况下，工程化位点不是重组臂。工程化位点可与双链断裂区具有同源性。工程化位点可与基因具有同源性。工程化位点可与编码基因组区域具有同源性。工程化位点可与非编码基因组区域具有同源性。在一些情况下，可从多核酸中切除转基因，以便可在不进行同源重组的情况下将该转基因***双链断裂区处。转基因可在不进行同源重组的情况下整合到双链断裂中。

可将多核苷酸引入细胞中，作为具有附加序列例如复制起点、启动子和编码抗生素抗性的基因的载体分子的一部分。此外，转基因多核苷酸可作为裸核酸、作为与诸如脂质体或泊洛沙姆等药剂复合的核酸而引入，或者可通过病毒(例如，腺病毒、AAV、疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒和整合酶缺陷型慢病毒(IDLV))进行递送。可递送转基因的病毒可以是AAV病毒。

通常***转基因，以使其表达由整合位点处的内源启动子，即驱动被***转基因的内源基因(例如，AAVS SITE(例如，AAVS1、AAVS2等)、CCR5、HPRT))的表达的启动子所驱动。转基因可包含启动子和/或增强子，例如组成型启动子或诱导型或组织/细胞特异性启动子。微环载体可编码转基因。

还可实现非编码核酸序列的靶向***。编码反义RNA、RNAi、shRNA和微小RNA(miRNA)的序列也可用于靶向***。

转基因可***内源基因中，使得全部、部分或无内源基因得到表达。例如，如本文所述的转基因可***内源基因座中，使得部分内源序列(转基因的N末端和/或C末端)或无内源序列得到表达，例如作为与转基因的融合体得到表达。在其它情况下，将转基因(例如，具有或不具有诸如内源基因的其它编码序列)整合到任何内源基因座，例如安全港基因座中。例如，TCR转基因可***内源TCR基因中。例如，图17显示，转基因可***内源CCR5基因中。转基因可***任何基因，例如，如本文所述的基因中。

当内源序列(内源或部分转基因)与转基因一起表达时，该内源序列可以是全长序列(野生型或突变型)或部分序列。该内源序列可以是功能性的。这些全长或部分序列的功能的非限制性实例包括增加由转基因(例如，治疗性基因)表达的多肽的血清半衰期和/或充当载体。

此外，虽然不是表达所需的，但外源序列还可包括转录或翻译调节序列，例如，启动子、增强子、绝缘子、内部核糖体进入位点、编码2A肽的序列和/或编码聚腺苷酸化信号的序列。

在一些情况下，外源序列(例如，转基因)包含感兴趣的蛋白质与作为其融合配偶体的膜蛋白胞外域的融合体，从而导致融合蛋白位于细胞的表面上。在一些情况下，转基因编码TCR，其中将TCR编码序列***安全港中，使得TCR得到表达。在一些情况下，将TCR编码序列***CISH和/或TCR基因座中。在其它情况下，TCR在慢病毒中递送至细胞以供随机***，而CISH和/或TCR特异性核酸酶可以以mRNA的形式提供。在一些情况下，通过病毒载体系统如逆转录病毒、AAV或腺病毒连同编码安全港(例如AAVS位点(例如，AAVS1、AAVS2等)、CCR5、白蛋白或HPRT)特异性核酸酶的mRNA来递送TCR。还可用编码PD1和/或CTLA-4特异性核酸酶的mRNA处理细胞。在一些情况下，通过病毒递送系统与编码HPRT特异性核酸酶和PD1或CTLA-4特异性核酸酶的mRNA一起来提供编码TCR的多核苷酸。可以使用6-硫代鸟嘌呤(一种可导致细胞停滞和/或在具有完整HPRT基因的细胞中引发凋亡的鸟嘌呤类似物)选择在HPRT基因座处包含整合的编码TCR的核苷酸的细胞。可与本公开内容的方法和组合物一起使用的TCR包括这些嵌合蛋白的所有类型，包括第一代、第二代和第三代设计。包含衍生自抗体的特异性结构域的TCR可能是特别有用的，但本公开内容也可设想衍生自受体、配体和工程化多肽的特异性结构域。细胞间信号传导结构域可衍生自TCR链如ζ链以及CD3复合物的其它成员如γ和E链。在一些情况下，TCR可包含额外的共刺激结构域，如来自CD28、CD137(也称为4-1BB)或CD134的细胞间结构域。在又一些情况下，可同时使用两种类型的共刺激结构域(例如，CD3ζ与CD28+CD137一起使用)。

在一些情况下，工程化细胞可以是由CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L+(L-选择蛋白)、CD27+、CD28+和IL-7Rα+组成的干细胞记忆T_SCM细胞，干细胞记忆细胞还可表达CD95、IL-2Rβ、CXCR3和LFA-1，并显示出许多与干细胞记忆细胞不同的功能属性。工程化细胞还可以是包含L-选择蛋白和CCR7的中央记忆T_CM细胞，其中该中央记忆细胞可分泌例如IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4。工程化细胞还可以是包含L-选择蛋白或CCR7的效应记忆T_EM细胞，并产生例如效应细胞因子，如IFNγ和IL-4。在一些情况下，可将细胞群体引入受试者中。例如，细胞群体可以是T细胞和NK细胞的组合。在其它情况下，群体可以是幼稚细胞和效应细胞的组合。

同源重组HR增强子的递送

在一些情况下，同源重组HR增强子可用来抑制非同源末端连接(NHEJ)。非同源末端连接可导致双链断裂末端处的核苷酸的丢失；非同源末端连接还可导致移码。因此，同源性指导的修复可以是在敲入基因时使用的更具吸引力的机制。为了抑制非同源末端连接，可递送HR增强子。在一些情况下，可递送多于一种HR增强子。HR增强子可抑制参与非同源末端连接的蛋白质，例如，KU70、KU80和/或DNA连接酶IV。在一些情况下，可递送连接酶IV抑制剂，如Scr7。在一些情况下，所述HR增强子可以是L755507。在一些情况下，可以使用不同的连接酶IV抑制剂。在一些情况下，HR增强子可以是腺病毒4蛋白，例如，E1B55K和/或E4orf6。在一些情况下，可以使用化学抑制剂。

可通过使用多种方法来抑制非同源末端连接分子，如KU70、KU80和/或DNA连接酶IV。例如，可通过基因沉默来抑制非同源末端连接分子，如KU70、KU80和/或DNA连接酶IV。例如，可在因子的转录或翻译期间通过基因沉默来抑制非同源末端连接分子KU70、KU80和/或DNA连接酶IV。还可通过因子的降解来抑制非同源末端连接分子KU70、KU80和/或DNA连接酶IV。还可抑制非同源末端连接分子KU70、KU80和/或DNA连接酶IV。KU70、KU80和/或DNA连接酶IV的抑制剂可包括E1B55K和/或E4orf6。还可通过隔离来抑制非同源末端连接分子KU70、KU80和/或DNA连接酶IV。可通过敲除、改变基因的启动子，并且/或者通过施用针对该因子的干扰RNA来抑制基因表达。

抑制非同源末端连接的HR增强子可与质粒DNA一起递送。有时，该质粒可以是双链DNA分子。该质粒分子还可以是单链DNA。该质粒还可携带至少一种基因。该质粒还可携带多于一种基因。还可使用至少一种质粒。还可使用多于一种质粒。抑制非同源末端连接的HR增强子可与质粒DNA，连同CRISPR-Cas、引物和/或修饰剂化合物一起递送。修饰剂化合物可降低质粒DNA的细胞毒性并改善细胞活力。可在基因组工程化之前将HR增强子和修饰剂化合物引入细胞中。该HR增强子可以是小分子。在一些情况下，可将该HR增强子递送至T细胞悬浮液中。HR增强子可改善用双链DNA转染的细胞的活力。在一些情况下，双链DNA的引入可以是毒性的，图81A和图81B。

抑制非同源末端连接的HR增强子可与待整合的HR底物一起递送。底物可以是多核酸。多核酸可包含TCR转基因。多核酸可作为mRNA进行递送(参见图10和图14)。多核酸可包含与基因组内源区域的重组臂，以供TCR转基因的整合。多核酸可以是载体。载体可以以有义或反义方向***另一载体(例如，病毒载体)中。在病毒基因组的5’LTR区上游，可以放置T7、T3或其它转录起始序列以供病毒盒的体外转录(参见图3)。该载体盒随后可用作mRNA体外转录的模板。例如，当该mRNA被递送至具有其同源逆转录酶(也作为mRNA或蛋白质进行递送)的任何细胞时，则单链mRNA盒可用作模板以产生双链DNA(dsDNA)形式的数百至数千个拷贝，该dsDNA可作为HR底物用于所需同源重组事件，以在基因组中的预期靶位点处整合转基因盒。该方法可避免递送用于CRISPR介导的同源重组的毒性质粒DNA的需求。此外，由于每个mRNA模板可被制成数百或数千个dsDNA拷贝，因此细胞内可获得的同源重组模板的量可以非常高。大量的同源重组模板可驱动所需的同源重组事件。此外，mRNA还可产生单链DNA。单链DNA也可用作例如利用重组AAV(rAAV)基因靶向的同源重组的模板。mRNA可在原位逆转录成DNA同源重组HR增强子。该策略可避免质粒DNA的毒性递送。此外，mRNA可将同源重组底物扩增至比质粒DNA更高的水平，并且/或者可提高同源重组的效率。

抑制非同源末端连接的HR增强子可作为化学抑制剂进行递送。例如，HR增强子可通过干扰连接酶IV-DNA结合而起作用。HR增强子还可激活内在的凋亡途径。HR增强子还可以是连接酶IV抑制剂的肽模拟物。HR增强子还可与Cas9系统共表达。HR增强子还可与病毒蛋白质如E1B55K和/或E4orf6共表达。HR增强子还可以是SCR7、L755507或其任何衍生物。HR增强子可与降低外源DNA***的毒性的化合物一起递送。

如果在细胞中仅发生单链DNA的强效逆转录，则可引入编码病毒载体的有义链和反义链两者的mRNA(参见图3)。在这种情况下，两条mRNA链均可在细胞内逆转录和/或天然退火以产生dsDNA。

HR增强子可递送至原代细胞。可通过任何合适的方式递送同源重组HR增强子。同源重组HR增强子还可作为mRNA进行递送。同源重组HR增强子还可作为质粒DNA进行递送。同源重组HR增强子还可连同CRISPR-Cas一起递送至免疫细胞。同源重组HR增强子还可连同CRISPR-Cas、包含TCR序列的多核酸以及/或者降低外源DNA***的毒性的化合物一起递送至免疫细胞。

同源重组HR增强子可递送至任何细胞，例如，免疫细胞。例如，同源重组HR增强子可递送至原代免疫细胞。同源重组HR增强子还可递送至T细胞，包括但不限于T细胞系和原代T细胞。同源重组HR增强子还可递送至CD4+细胞、CD8+细胞和/或肿瘤浸润性细胞(TIL)。同源重组HR增强子还可连同CRISPR-Cas一起递送至免疫细胞。

在一些情况下，同源重组HR增强子可用来抑制非同源末端连接。在一些情况下，同源重组HR增强子可用来促进同源性指导的修复。在一些情况下，同源重组HR增强子可用来促进CRISPR-Cas双链断裂后的同源性指导的修复。在一些情况下，同源重组HR增强子可用来促进CRISPR-Cas双链断裂后的同源性指导的修复以及多种基因中的一种的敲入和敲除。敲入的基因可以是TCR。敲除的基因也可以是任何数目的内源检查点基因。例如，内源检查点基因可选自A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3、VISTA、AAVSSITE(例如AAVS1、AAVS2等)、CCR5、HPRT、PPP1R12C、TCR和/或CISH。在一些情况下，该基因可以是CISH。在一些情况下，该基因可以是TCR。在一些情况下，该基因可以是内源TCT。在一些情况下，该基因可包含编码区。在一些情况下，该基因可包含非编码区。

采用HR增强子获得的HR效率的增加可以是或可以是约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

采用HR增强子获得的NHEJ的降低可以是或可以是约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

细胞的低毒性工程化

可以减轻对外源多核酸的细胞毒性以改善包括T细胞在内的细胞的工程化。例如，可通过改变对多核酸的细胞应答来降低细胞毒性。

多核酸可接触细胞。然后可将多核酸引入细胞中。在一些情况下，多核酸用来改变细胞的基因组。多核酸***后，细胞可能死亡。例如，多核酸的***可引起如图18所示的细胞凋亡。可通过使用修饰剂化合物来降低由多核酸诱导的毒性。

例如，修饰剂化合物可破坏细胞的免疫传感应答。修饰剂化合物还可减少细胞凋亡和焦亡。根据情况，修饰剂化合物可以是激活剂或抑制剂。修饰剂化合物可作用于图19所示的途径的任何组分。例如，修饰剂化合物可作用于胱天蛋白酶-1、TBK1、IRF3、STING、DDX41、DNA-PK、DAI、IFI16、MRE11、cGAS、2’3’-cGAMP、TREX1、AIM2、ASC或其任意组合。修饰剂可以是TBK1修饰剂。修饰剂可以是胱天蛋白酶-1修饰剂。修饰剂化合物还可作用于先天信号传导系统，因此，其可以是先天信号传导修饰剂。在一些情况下，外源核酸可以对细胞有毒性。抑制细胞的先天免疫传感应答的方法可改善工程化细胞产物的细胞活力。修饰化合物可以是布雷菲德菌素A和/或ATM途径的抑制剂，图92A、图92B、图93A和图93B。

可通过使化合物与细胞接触来降低对外源多核酸的毒性。在一些情况下，可在与多核酸接触之前用化合物对细胞进行预处理。在一些情况下，化合物和多核酸同时引入(例如，共同引入)细胞中。修饰化合物可包含在多核酸内。在一些情况下，多核酸包含修饰化合物。在一些情况下，化合物可作为包含多核酸、HR增强子和/或CRISPR-Cas的混合物而被引入。如本文公开的组合物和方法可提供有效且低毒性的方法，通过该方法可以产生细胞疗法，例如癌症特异性细胞疗法。

可在本文所述的方法和/或系统和/或组合物中使用的化合物可具有一种或多种以下特征，并且可具有本文所述的一种或多种功能。尽管其具有一种或多种功能，但本文所述的化合物可降低外源多核苷酸的毒性。例如，化合物可调节由于外源引入的多核酸而导致毒性的途径。在一些情况下，多核酸可以是DNA。多核酸还可以是RNA。多核酸可以是单链。多核酸还可以是双链。多核酸可以是载体。多核酸还可以是裸多核酸。多核酸可编码蛋白质。多核酸还可具有任何数目的修饰。多核酸修饰可以是去甲基化、CpG甲基化的添加、细菌甲基化的去除和/或哺乳动物甲基化的添加。多核酸还可作为包含额外的多核酸、任何数目的HR增强子和/或CRISPR-Cas的试剂混合物而引入细胞中。多核酸还可包含转基因。多核酸可包含具有TCR序列的转基因。

化合物还可调节参与启动对外源DNA的毒性的途径。途径可含有任何数目的因子。例如，因子可包括DNA依赖性IFN调节因子激活物(DAI)、IFN诱导蛋白16(IFI16)、DEAD盒多肽41(DDX41)、黑素瘤缺乏因子2(AIM2)、DNA依赖性蛋白激酶、环鸟苷单磷酸-腺苷单磷酸合酶(cGAS)、IFN基因的刺激物(STING)、TANK结合激酶(TBK1)、白介素-1β(IL-1β)、MRE11、减数***重组11、Trex1、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(胱天蛋白酶-1)、三种主要修复外切核酸酶、DNA依赖性IRF激活物(DAI)、IFI16、DDX41、DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)、减数***重组11同源物A(MRE11)和IFN调节因子(IRF)3和7和/或其任何衍生物。

在一些情况下，DNA传感途径通常可指任何细胞信号传导途径，其包含参与细胞内核酸和(在一些情况下)外源核酸的检测的一种或多种蛋白质(例如，DNA传感蛋白)。在一些情况下，DNA传感途径可包含干扰素刺激物(STING)。在一些情况下，DNA传感途径可包含DNA依赖性IFN调节因子激活物(DAI)。DNA传感蛋白的非限制性实例包括三种主要修复外切核酸酶1(TREX1)、DEAD盒解旋酶41(DDX41)、DNA依赖性IFN调节因子激活物(DAI)、Z-DNA结合蛋白1(ZBP1)、干扰素γ诱导蛋白16(IFI16)、富含亮氨酸重复序列(In FLII)相互作用蛋白1(LRRFIP1)、DEAH盒解旋酶9(DHX9)、DEAH盒解旋酶36(DHX36)、狼疮Ku自身抗原蛋白p70(Ku70)、中国仓鼠细胞中的X射线修复互补缺陷修复蛋白6(XRCC6)、干扰素基因的刺激物(STING)、跨膜蛋白173(TMEM173)、含有三重基序的蛋白32(TRIM32)、含有三重基序的蛋白56(TRIM56)、β-连环蛋白(CTNNB1)、髓样分化原发反应蛋白88(MyD88)、黑素瘤缺乏因子2(AIM2)、含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、胱天蛋白酶-1前体(pro-CASP1)、胱天蛋白酶-1(CASP1)、白介素1β前体(pro-IL-1β)、白介素18前体(pro-IL-18)、白介素1β(IL-1β)、白介素18(IL-18)、干扰素调节因子1(IRF1)、干扰素调节因子3(IRF3)、干扰素调节因子7(IRF7)、干扰素刺激反应元件7(ISRE7)、干扰素刺激反应元件1/7(ISRE1/7)、核因子κB(NF-κB)、RNA聚合酶III(RNA Pol III)、黑素瘤分化相关蛋白5(MDA-5)、遗传和生理学实验室蛋白2(LGP2)、视黄酸诱导基因1(RIG-I)、线粒体抗病毒信号传导蛋白(IPS-1)、TNF受体相关因子3(TRAF3)、TRAF家族成员相关NFKB激活物(TANK)、核小体装配蛋白1(NAP1)、TANK结合激酶1(TBK1)、自噬相关蛋白9A(Atg9a)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素λ-1(IFNλ1)、环状GMP-AMP合酶(cGAS)、AMP、GMP、环状GMP-AMP(cGAMP)、其蛋白质的磷酸化形式，或其任意组合或衍生物。在DNA传感途径的一个实例中，DAI激活IRF和NF-κB转录因子，从而导致产生I型干扰素和其它细胞因子。在DNA传感途径的另一个实例中，一旦感应到外源细胞内DNA，AIM2即触发炎性体的装配，最终导致白介素成熟和焦亡。在DNA传感途径的又一个实例中，RNAPolIII可将外源DNA转变为RNA以供由RNA传感器RIG-I识别。

在一些方面，本公开内容的方法包括向一个或多个细胞中引入包含编码至少一种抗DNA传感蛋白的第一转基因的核酸。

抗DNA传感蛋白通常可指改变对应于DNA传感途径的蛋白质(例如，DNA传感蛋白)的活性或表达水平的任何蛋白质。在一些情况下，抗DNA传感蛋白可降解一种或多种DNA传感蛋白(例如，降低总蛋白水平)。在一些情况下，抗DNA传感蛋白可完全抑制一种或多种DNA传感蛋白。在一些情况下，抗DNA传感蛋白可部分抑制一种或多种DNA传感蛋白。在一些情况下，抗DNA传感蛋白可将至少一种DNA传感蛋白的活性抑制至少约95％、至少约90％、至少约85％、至少约80％、至少约75％、至少约70％、至少约65％、至少约60％、至少约55％、至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约20％、至少约15％、至少约10％或至少约5％。在一些情况下，抗DNA传感蛋白可将至少一种DNA传感蛋白的量减少至少约95％、至少约90％、至少约85％、至少约80％、至少约75％、至少约70％、至少约65％、至少约60％、至少约55％、至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约20％、至少约15％、至少约10％或至少约5％。

可通过在基因组工程化程序期间引入病毒蛋白质来增加细胞活力，这可抑制细胞检测外源DNA的能力。在一些情况下，抗DNA传感蛋白可促进一种或多种DNA传感蛋白的翻译(例如，增加总蛋白质水平)。在一些情况下，抗DNA传感蛋白可保护或增加一种或多种DNA传感蛋白的活性。在一些情况下，抗DNA传感蛋白可将至少一种DNA传感蛋白的活性增加至少约95％、至少约90％、至少约85％、至少约80％、至少约75％、至少约70％、至少约65％、至少约60％、至少约55％、至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约20％、至少约15％、至少约10％或至少约5％。在一些情况下，抗DNA传感蛋白可将至少一种DNA传感蛋白的量增加至少约95％、至少约90％、至少约85％、至少约80％、至少约75％、至少约70％、至少约65％、至少约60％、至少约55％、至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约20％、至少约15％、至少约10％或至少约5％。在一些情况下，抗DNA传感抑制剂可以是一种或多种DNA传感蛋白的竞争性抑制剂或激活剂。在一些情况下，抗DNA传感蛋白可以是DNA传感蛋白的非竞争性抑制剂或激活剂。

在本公开内容的一些情况下，抗DNA传感蛋白还可以是DNA传感蛋白(例如，TREX1)。抗DNA传感蛋白的非限制性实例包括细胞FLICE抑制蛋白(c-FLiP)、人巨细胞病毒被膜蛋白(HCMV pUL83)、登革病毒特异性NS2B-NS3(DENV NS2B-NS3)、人***瘤病毒18型E7蛋白(HPV18E7)、hAd5E1A、单纯疱疹病毒立即早期蛋白ICP0(HSV1ICP0)、痘苗病毒B13(VACVB13)、痘苗病毒C16(VACVC16)、三种主要修复外切核酸酶1(TREX1)、人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、乙型肝炎病毒DNA聚合酶(HBV Pol)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、腺苷脱氨酶(ADAR1)、E3L、p202、这些蛋白质的磷酸化形式，及其任意组合或衍生物。在一些情况下，HCMV pUL83可通过与IFI16(例如，核IFI16)上的热蛋白结构域相互作用并阻断其寡聚化和随后的下游活化而抑制STING-TBK1-IRF3途径的活化，来破坏DNA传感途径。在一些情况下，DENV Ns2B-NS3可通过降解STING来破坏DNA传感途径。在一些情况下，HPV18E7可通过与STING结合而阻断cGAS/STING途径信号传导来破坏DNA传感途径。在一些情况下，hAd5E1A可通过与STING结合而阻断cGAS/STING途径信号传导来破坏DNA传感途径。例如，图104A和图104B示出了用CRISPR系统、外源多核酸和hAd5E1A或HPV18E7蛋白转染的细胞。在一些情况下，HSV1ICP0可通过降解IFI16和/或延迟IFI16向病毒基因组的募集来破坏DNA传感途径。在一些情况下，VACV B13可通过阻断胱天蛋白酶1依赖性炎性体(inflamasone)活化和胱天蛋白酶8依赖性外在凋亡来破坏DNA传感途径。在一些情况下，VACV C16可通过阻断对DNA的先天免疫应答而导致细胞因子表达下降来破坏DNA传感途径。

化合物可以是抑制剂。化合物还可以是激活剂。化合物可与第二化合物组合。化合物还可与至少一种化合物组合。在一些情况下，一种或多种化合物可协同起作用。例如，一种或多种化合物可如图20中所示在被引入细胞中时立即降低细胞毒性。

化合物可以是泛胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK和/或Z-VAD-FMK。化合物可以是任何数目的已知化合物的衍生物，该已知化合物调节参与启动对外源DNA的毒性的途径。还可对化合物进行修饰。可通过任何数目的方式对化合物进行修饰，例如，对化合物的修饰可包括氘化、脂化、糖基化、烷基化、聚乙二醇化、氧化、磷酸化、硫酸化、酰胺化、生物素化、瓜氨酸化、异构化、泛素化、质子化、小分子偶联、还原、去磷酸化、亚硝基化和/或蛋白水解。修饰还可以是翻译后的。修饰可以是翻译前的。修饰可在不同的氨基酸侧链或肽键处发生，并且可通过酶活性来介导。

修饰可在化合物合成的任何步骤中发生。例如，在蛋白质中，许多化合物在翻译进行或完成后不久被修饰，以介导正确的化合物折叠或稳定性，或将新生化合物引导至不同的细胞区室。其它修饰在折叠和定位完成后发生，以激活催化活性或使催化活性失活，或者以其它方式影响化合物的生物学活性。化合物还可与针对化合物以供降解的标签共价连接。除单一修饰外，化合物通常还通过翻译后切割和添加官能团(经由化合物成熟或活化的逐步机制)的组合进行修饰。

化合物可减少I型干扰素(IFN)，例如，IFN-α和/或IFN-β的产生。化合物还可减少促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和/或白介素-1β(IL-1β)的产生。化合物还可通过调节Janus激酶(JAK)-信号转导物和转录激活物(STAT)途径来调节抗病毒基因的诱导。化合物还可调节转录因子——活化B细胞的核因子κ轻链增强物(NF-κB)，和IFN调节因子IRF3和IRF7。化合物还可例如通过修改IκB被IκB激酶(IKK)复合物的磷酸化来调节NF-κB的活化。化合物还可调节IκB的磷酸化或防止IκB的磷酸化。化合物还可调节IRF3和/或IRF7的活化。例如，化合物可调节IRF3和/或IRF7的活化。化合物可激活TBK1和/或IKKε。化合物还可抑制TBK1和/或IKKε。化合物可防止形成由IRF3、IRF7、NF-κB和其它转录因子组成的增强体复合物，从而防止开启I型IFN基因的转录。修饰化合物可以是TBK1化合物和至少一种额外的化合物，图88A和图88B。在一些情况下，TBK1化合物和胱天蛋白酶抑制剂化合物可用来降低双链DNA的毒性，图89。

化合物可防止细胞凋亡和/或焦亡。化合物还可防止炎性体的活化。炎性体可以是细胞内的多蛋白质复合物，其介导蛋白水解酶胱天蛋白酶-1的活化和IL-1β的成熟。化合物还可调节AIM2(黑素瘤缺乏因子2)。例如，化合物可防止AIM2与衔接蛋白ASC(含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白)相缔合。化合物还可调节同型PYD:PYD相互作用。化合物还可调节同型CARD:CARD相互作用。化合物可调节胱天蛋白酶-1。例如，化合物可抑制胱天蛋白酶-1将IL-1β和IL-18的无活性前体转变为成熟细胞因子的过程。

化合物可以是用来产生与GMP兼容的细胞疗法的平台的组分。化合物可用来改善细胞疗法。化合物可用作药剂。化合物可以组合为联合疗法。化合物可离体使用。化合物可用于免疫疗法。化合物可以是产生针对有需要的患者的T细胞疗法的过程的一部分。

在一些情况下，化合物不用来降低毒性。在一些情况下，可对多核酸进行修饰以另外降低毒性。例如，可对多核酸进行修饰以减少对多核酸，例如，外源多核酸的检测。还可对多核酸进行修饰以降低细胞毒性。例如，可通过图21中描绘的一种或多种方法修饰多核酸。还可在体外或体内对多核酸进行修饰。

化合物或修饰剂化合物可将质粒DNA的细胞毒性降低或降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。修饰剂化合物可将细胞活力提高或提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

未甲基化的多核酸也可降低毒性。例如，一种未甲基化的多核酸可用来降低细胞毒性，其包含至少一种工程化抗原受体，该工程化抗原受体的侧翼为与至少一个基因组区域互补的至少两个重组臂。多核酸还可以是裸多核酸。多核酸还可具有哺乳动物甲基化，这在一些情况下也会降低毒性。在一些情况下，还可对多核酸进行修饰，以便去除细菌甲基化并引入哺乳动物甲基化。本文所述的任何修饰均可适用于如本文所述的任何多核酸。

多核酸修饰可包括去甲基化、CpG甲基化的添加、细菌甲基化的去除和/或哺乳动物甲基化的添加。修饰可以是将双链多核酸转变成单链多核酸。单链多核酸也可转变成双链多核酸。

多核酸可被甲基化(例如人甲基化)以降低细胞毒性。修饰的多核酸可包含TCR序列或嵌合抗原受体(CAR)。该多核酸还可包含工程化胞外受体。

包含至少一种工程化抗原受体的哺乳动物甲基化多核酸可用来降低细胞毒性。可将多核酸修饰成包含哺乳动物甲基化。可用哺乳动物甲基化对多核酸进行甲基化，以使该多核酸不被细胞识别为外来的。

多核酸修饰也可作为培养过程的一部分进行。可用不引入细菌甲基化的经基因组修饰的细菌培养物产生去甲基化的多核酸。这些多核酸随后可被修饰为含有哺乳动物甲基化，例如，人甲基化。

还可通过在基因组工程化程序期间引入病毒蛋白质来降低毒性。例如，病毒蛋白质可用来阻断DNA传感并降低编码外源TCR或者CRISPR系统的供体核酸的毒性。由病毒采用的、用来阻断DNA传感的逃避策略可以是隔离或修饰病毒核酸；干扰PRR或其衔接蛋白的特定翻译后修饰；降解或切割模式识别受体(PRR)或其衔接蛋白；隔离或重新定位PRR，或其任意组合。在一些情况下，可以引入病毒蛋白质，该病毒蛋白质可通过由病毒采用的任何逃避策略来阻断DNA传感。

在一些情况下，病毒蛋白质可以是或可来源于病毒，如人巨细胞病毒(HCMV)、登革病毒(DENV)、人***瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒1型(HSV1)、痘苗病毒(VACV)、人冠状病毒(HCoV)、严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(SARS-Cov)、乙型肝炎病毒、猪流行性腹泻病毒或其任意组合。

引入的病毒蛋白质可通过诱导形成可被细胞膜约束的特定复制区室来防止RIG-I样受体(RLR)接近病毒RNA，或者在其它情况下，在细胞器如内质网、高尔基体、线粒体或其任意组合上复制。例如，本公开内容的病毒可具有妨碍检测RLR或阻碍RLR活化的修饰。在其它情况下，可以抑制RLR信号传导途径。例如，可以抑制或阻断RIG-I的Lys63连接的泛素化，以防止RIG-I信号传导的活化。在其它情况下，病毒蛋白质可靶向可负责RIG-I泛素化的细胞E3泛素连接酶。病毒蛋白质还可去除RIG-I的泛素化。此外，病毒可通过调节细胞微小RNA的丰-度或通过RNA-蛋白质相互作用，在不依赖于蛋白质-蛋白质相互作用的情况下抑制RIG-I的泛素化(例如Lys63连接的泛素化)。

在一些情况下，为了防止RIG-I的活化，病毒蛋白质可对病毒RNA中的5’-三磷酸部分进行加工，或者病毒核酸酶可消化游离的双链RNA(dsRNA)。此外，病毒蛋白质可与病毒RNA结合，以抑制RIG-I对病原体相关分子模式(PAMP)的识别。一些病毒蛋白质可操控RIG-I和/或MDA5的特定翻译后修饰，从而阻断它们的信号传导能力。例如，病毒可通过编码病毒去泛素化酶(DUB)来防止RIG-I的Lys63-连接的泛素化。在其它情况下，病毒蛋白质可拮抗细胞E3泛素连接酶、三重基序蛋白25(TRIM25)和/或Riplet，从而还抑制RIG-I泛素化，因此抑制其活化。此外，在其它情况下，病毒蛋白质可与TRIM25结合，以阻断持续的RIG-I信号传导。为了抑制MDA5的活化，病毒蛋白质可阻止PP1α介导的或PP1γ介导的MDA5去磷酸化，从而使其保持在其磷酸化无活性状态。例如，中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)可靶向蛋白激酶R激活物(PACT)，以拮抗RIG-I。来自DENV病毒的NS3蛋白可靶向运输因子14-3-3ε，以防止RIG-I在线粒体处向MAVS易位。在一些情况下，病毒蛋白质可切割RIG-I、MDA5和/或MAVS。可以引入其它病毒蛋白质来破坏细胞降解途径，从而抑制RLR-MAVS依赖性信号传导。例如，来自乙型肝炎病毒(HBV)的X蛋白和来自严重急性呼吸综合征(SARS)相关冠状病毒(SARS-CoV)的9b蛋白可促进MAVS的泛素化和降解。

在一些情况下，引入的病毒蛋白质可允许cGAS、IFI16、STING或其任意组合的免疫逃避。例如，为了防止环状GMP-AMP合酶(cGAS)的活化，病毒蛋白质可使用细胞3’-修复外切核酸酶1(TREX1)来降解过量的逆转录的病毒DNA。此外，病毒衣壳可募集宿主编码的因子，如亲环蛋白A(CYPA)，该因子可防止cGAS对逆转录的DNA的感测。此外，引入的病毒蛋白质可与病毒DNA和cGAS结合，以抑制cGAS的活性。在其它情况下，为了拮抗干扰素(IFN)基因刺激物(STING)的活化，乙型肝炎病毒(HBV)的聚合酶(Pol)和人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)例如严重急性呼吸综合征(SARS)相关冠状病毒(SARS-CoV)的木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLP)可防止或去除STING的Lys63连接的泛素化。引入的病毒蛋白质还可与STING结合并抑制其活化或切割STING以使其失活。在一些情况下，可使IFI16失活。例如，病毒蛋白质可靶向IFI16以用于蛋白酶体降解，或与IFI16结合以防止其寡聚化，因此防止其活化。

例如，待引入的病毒蛋白质可以是或可来源于：HCMV pUL83、DENV NS2B-NS3、HPV18E7、hAd5E1A、HSV1ICP0、VACV B13、VACV C16、TREX1、HCoV-NL63、SARS-Cov、HBV PolPEDV或其任意组合。病毒蛋白质可以是腺病毒蛋白质。腺病毒蛋白质可以是腺病毒4E1B55K、E4orf6蛋白。病毒蛋白质可以是B13疫苗病毒蛋白质。引入的病毒蛋白质可抑制胞质DNA识别、传感或其组合。在一些情况下，当对细胞进行工程化时，可利用病毒蛋白质来概括(recapitulate)病毒整合生物学的条件。利用CRISPR，可在转基因整合或基因组修饰期间将病毒蛋白质引入细胞，图133A、图133B、图134、图135A和图135B。

在一些情况下，可以抑制RIP途径。在其它情况下，可将细胞FLICE(FADD样IL-1β转化酶)抑制蛋白(c-FLIP)途径引入细胞中。c-FLIP可在人类细胞中表达为长(c-FLIPL)、短(c-FLIPS)和c-FLIPR剪接变体。c-FLIP可表达为剪接变体。c-FLIP也可被称为Casper、iFLICE、FLAME-1、CASH、CLARP、MRIT或usurpin。c-FLIP可与FADD和/或胱天蛋白酶-8或胱天蛋白酶-10以及TRAIL受体5(DR5)结合。这种相互作用继而阻止死亡诱导信号传导复合物(DISC)形成和随后的胱天蛋白酶级联活化。还已知c-FLIPL和c-FLIPS在各种信号传导途径中以及在激活和/或上调包括Akt、ERK和NF-κB在内的数种细胞保护和促存活信号传导蛋白方面具有多功能作用。在一些情况下，可将c-FLIP引入细胞中以增加活力。

在其它情况下，可以抑制STING。在一些情况下，抑制胱天蛋白酶途径。DNA传感途径可以是基于细胞因子的炎性途径和/或干扰素α表达途径。在一些情况下，当至少一种DNA传感途径抑制剂被引入细胞时，采取多模式方法。在一些情况下，DNA传感抑制剂可减少细胞死亡并允许改善外源TCR转基因的整合。多模式方法可以是STING和胱天蛋白酶抑制剂与TBK抑制剂的组合。

为了增强HDR从而能够***精确的遗传修饰，我们通过基因沉默、连接酶IV抑制剂SCR7或腺病毒4E1B55K和E4orf6蛋白的共表达来抑制NHEJ关键分子KU70、KU80或DNA连接酶IV。

引入的病毒蛋白质可将质粒DNA的细胞毒性降低或降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。病毒蛋白质可将细胞活力提高或提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

在一些情况下，gRNA可用来降低毒性。例如，gRNA可被工程化为在载体的填充区内结合。载体可以是微环DNA载体。在一些情况下，微环载体可与病毒蛋白质组合使用。在其它情况下，微环载体可与病毒蛋白质以及至少一种其它毒性降低剂组合使用。在一些情况下，通过降低与外源DNA如双链DNA相关的毒性，可以更有效地进行基因组破坏。

在一些情况下，可以使用酶来降低DNA毒性。例如，可以使用酶如DpnI来去除DNA载体或转基因上的甲基化靶标。可在电穿孔之前用DpnI对载体或转基因进行预处理。IIM型限制性内切核酸酶如DpnI能够识别并切割甲基化DNA。在一些情况下，用DpnI处理微环DNA。天然存在的限制性内切核酸酶分为四类(I型、II型、III型和IV型)。在一些情况下，使用限制性内切核酸酶如DpnI或CRISPR系统内切核酸酶来制备工程化细胞。

本文公开了一种制备工程化细胞的方法，其包括：引入至少一种工程化腺病毒蛋白质或其功能部分；引入编码至少一种外源受体序列的至少一种多核酸；以及用至少一种内切核酸酶或其部分对至少一种基因组进行基因组破坏。在一些情况下，腺病毒蛋白质或其功能部分为E1B55K、E4orf6、Scr7、L755507、NS2B3、HPV18E7、hAd5E1A或其组合。腺病毒蛋白质可选自血清型1至57。在一些情况下，腺病毒蛋白质血清型为血清型5。

在一些情况下，工程化腺病毒蛋白质或其部分具有至少一种修饰。修饰可以是置换、***、缺失或所述腺病毒蛋白质序列的修饰。修饰可以是***。***可以是AGIPA***。在一些情况下，修饰为置换。置换可以是在蛋白质序列的氨基酸位置373处将H置换成A。多核酸可以是DNA或RNA。多核酸可以是DNA。DNA可以是微环DNA。在一些情况下，外源受体序列可选自T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、嵌合抗原受体(CAR)的序列及其任何部分或衍生物。外源受体序列可以是TCR序列。内切核酸酶可选自CRISPR、TALEN、基于转座子、ZEN、大范围核酸酶、Mega-TAL及其任何部分或衍生物。内切核酸酶可以是CRISPR。CRISPR可包含至少一种Cas蛋白。Cas蛋白可选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、其同源物或其修饰形式。Cas蛋白可以是Cas9。

在一些情况下，CRISPR在基因组中产生双链断裂。基因组可包含至少一种基因。在一些情况下，将外源受体序列引入至少一种基因中。引入可破坏至少一种基因。基因可以是CISH、TCR、TRA、TRB或其组合。细胞可以是人类细胞。人类细胞可以是免疫细胞。免疫细胞可以是CD3+、CD4+、CD8+或其任意组合。方法可进一步包括对细胞进行扩充。

本文公开了一种制备工程化细胞的方法，其包括：以病毒方式引入编码至少一种外源T细胞受体(TCR)序列的至少一种多核酸；以及用至少一种内切核酸酶或其功能部分对至少一种基因进行基因组破坏。在一些情况下，病毒可选自逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或其任何衍生物。病毒可以是腺相关病毒(AAV)。AAV可以是血清型5。AAV可以是血清型6。AAV可包含至少一种修饰。修饰可以是化学修饰。多核酸可以是DNA、RNA或其任何修饰物。多核酸可以是DNA。在一些情况下，DNA为微环DNA。在一些情况下，多核酸可进一步包含至少一个侧翼为TCR序列的同源臂。同源臂可包含至少一种基因的互补序列。基因可以是内源基因。内源基因可以是检查点基因。

在一些情况下，根据本公开内容的任何实施方案的方法或系统可进一步包括至少一种毒性降低剂。在一些情况下，AAV载体可以与至少一种另外的毒性降低剂组合使用。在其它情况下，微环载体可以与至少一种另外的毒性降低剂组合使用。毒性降低剂可以是病毒蛋白质或胞质DNA传感途径的抑制剂。病毒蛋白质可以是E1B55K、E4orf6、Scr7、L755507、NS2B3、HPV18E7、hAd5E1A或其组合。方法可进一步包括细胞的扩充。在一些情况下，可以使用胞质DNA传感途径的抑制剂，该胞质DNA传感途径的抑制剂可以是细胞FLICE(FADD样IL-1β转化酶)抑制蛋白(c-FLIP)。

可以使用本领域已知的任何方法测量细胞活力和/或转基因整合到一个或多个细胞的基因组中的效率。在一些情况下，可以使用台盼蓝排除法、末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口端标记(TUNEL)、给定的细胞表面标志物(例如，CD4或CD8)的存在或缺乏、端粒长度、荧光激活细胞分选术(FACS)、实时PCR或小液滴数字PCR来测量细胞活力和/或整合效率。例如，可以使用FACS来检测电穿孔后转基因的整合效率。在另一个实例中，可以使用TUNEL测量凋亡。在一些情况下，毒性可通过细胞的基因组操作而发生，D.R.Sen等人,Science10.1126/science.aae0491(2016)。毒性可导致细胞衰竭，这可影响针对肿瘤靶标的细胞毒性。在一些情况下，衰竭的T细胞可占据与功能性记忆T细胞不同的分化状态。在一些情况下，对改变的细胞状态进行鉴别以及将其恢复至基线的方法可以如本文的方法所描述。例如，在衰竭的T细胞中定位状态特异性增强子能够实现改善的基因组编辑以用于过继T细胞疗法。在一些情况下，使T细胞耐受衰竭的基因组编辑可改善过继T细胞疗法。在一些情况下，与功能性记忆T细胞相比，衰竭的T细胞可具有改变的染色质景观。改变的染色质景观可包括表观遗传变化。

载体向细胞膜中的递送

可通过任何合适的手段将核酸酶和转录因子、编码它们的多核苷酸和/或任何转基因多核苷酸以及包含本文所述的蛋白质和/或多核苷酸的组合物递送至靶细胞。

合适的细胞可包括但不限于真核和原核细胞和/或细胞系。此类细胞或由此类细胞产生的细胞系的非限制性实例包括COS、CHO(例如，CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NSO、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如，HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)和perC6细胞以及昆虫细胞如草地夜蛾(Spodopterafugiperda，Sf)或真菌细胞如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。在一些情况下，该细胞系为CHO-K1、MDCK或HEK293细胞系。在一些情况下，细胞或细胞群体是原代细胞或原代细胞群体。在一些情况下，原代细胞或原代细胞群体是原代淋巴细胞或原代淋巴细胞群体。在一些情况下，合适的原代细胞包括外周血单核细胞(PBMC)、外周血淋巴细胞(PBL)和其它血细胞亚群，例如但不限于T细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、自然杀伤T细胞、单核细胞前体细胞、造血干细胞或非多潜能干细胞。在一些情况下，该细胞可以是任何免疫细胞，包括任何T细胞如肿瘤浸润性细胞(TIL)，如CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或任何其它类型的T细胞。该T细胞还可包括记忆T细胞、记忆性干细胞T细胞(memory stem T cells)或效应T细胞。还可从混合群体中选择T细胞，例如从全血中选择T细胞。还可从混合群体中扩充T细胞。T细胞也可偏向特定的群体和表型。例如，T细胞可在表型上有所偏向，包括CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L(+)、CD27(+)、CD28(+)和/或IL-7Rα(+)。可以选择包含选自以下列表的一种或多种标志物的合适的细胞，该列表包括：CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L(+)、CD27(+)、CD28(+)和/或IL-7Rα(+)。合适的细胞还包括干细胞，如举例而言，胚胎干细胞、诱导多潜能干细胞、造血干细胞、神经元干细胞和间质干细胞。合适的细胞可包括任何数目的原代细胞，如人细胞、非人细胞和/或小鼠细胞。合适的细胞可以是祖细胞。合适的细胞可来源于待治疗的受试者(例如，患者)。合适的细胞可来源于人类供体。合适的细胞可以是由CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L+(L-选择蛋白)、CD27+、CD28+和IL-7Rα+组成的干细胞记忆T_SCM细胞(stem memory T_SCM cell)，记忆干细胞还可表达CD95、IL-2Rβ、CXCR3和LFA-1，并显示出记忆干细胞所特有的许多功能属性。合适的细胞可以是包含L-选择蛋白和CCR7的中央记忆T_CM细胞，中央记忆细胞可分泌例如IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4。合适的细胞还可以是包含L-选择蛋白或CCR7的效应记忆T_EM细胞，并可产生例如效应细胞因子，如IFNγ和IL-4。在一些情况下，原代细胞可以是原代淋巴细胞。在一些情况下，原代细胞群体可以是淋巴细胞群体。

获得合适的细胞的方法可包括选择细胞。在一些情况下，细胞可包含可用于细胞的选择的标志物。例如，这样的标志物可包括GFP、抗性基因、细胞表面标志物、内源标签。可以使用任何内源标志物选择细胞。可以使用任何技术选择合适的细胞。这样的技术可包括流式细胞术和/或磁性柱。然后可将所选择的细胞输注到受试者中。还可将所选择的细胞扩充到较大的数目。可在输注前扩充所选择的细胞。

可以使用例如含有编码一种或多种蛋白质的序列的载体来递送如本文所述的转录因子和核酸酶。可类似地递送编码多核苷酸的转基因。可以使用任何载体系统，包括但不限于质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体和腺相关病毒载体等。此外，这些载体中的任何一种均可包含转录因子、核酸酶和/或转基因中的一种或多种。因此，当将CRISPR、TALEN、基于转座子、ZEN、大范围核酸酶或Mega-TAL分子和/或转基因中的一种或多种引入细胞中时，CRISPR、TALEN、基于转座子、ZEN、大范围核酸酶或Mega-TAL分子和/或转基因可携带于相同的载体或不同的载体上。当使用多种载体时，每种载体可包含编码CRISPR、TALEN、基于转座子、ZEN、大范围核酸酶或Mega-TAL分子和/或转基因中的一种或多种的序列。

常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法可用来在细胞(例如，哺乳动物细胞)和靶组织中引入编码工程化CRISPR、TALEN、基于转座子、ZEN、大范围核酸酶或Mega-TAL分子和/或转基因的核酸。这类方法还可用来在体外将编码CRISPR、TALEN、基于转座子、ZEN、大范围核酸酶或Mega-TAL分子和/或转基因的核酸施用于细胞。在一些实例中，可以施用编码CRISPR、TALEN、基于转座子、ZEN、大范围核酸酶或Mega-TAL分子和/或转基因的核酸以用于体内或离体免疫疗法应用。非病毒载体递送系统可包括DNA质粒、裸核酸以及与递送媒介物如脂质体或泊洛沙姆复合的核酸。病毒载体递送系统可包括DNA和RNA病毒，该DNA和RNA病毒在递送至细胞后具有附加型或整合型基因组。

核酸的病毒或非病毒递送方法包括电穿孔、脂质转染、核转染、金纳米颗粒递送、显微注射、生物射弹、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质-核酸偶联物、裸DNA、mRNA、人工病毒粒子和试剂增强的DNA摄入(agent-enhanced uptake of DNA)。使用例如Sonitron 2000系统(Rich-Mar)进行的声致穿孔也可用于核酸的递送。

其它的示例性核酸递送系统包括由 Biosystems(Cologne，德国)、Life Technologies(Frederick,Md.)、MAXCYTE,Inc.(Rockville,Md.)、BTX DeliverySystems(Holliston,Mass.)和Copernicus Therapeutics Inc.提供的核酸递送系统(参见例如美国专利6,008,336)。脂质转染试剂在商业上出售(例如和)。递送可以是递送至细胞(离体施用)或靶组织(体内施用)。其它递送方法包括将待递送的核酸包装到EnGeneIC递送媒介物(EDV)中的应用。使用双特异性抗体将这些EDV特异性递送至靶组织，其中该抗体的一个臂对靶组织具有特异性，而另一个臂对EDV具有特异性。该抗体将EDV带至靶细胞表面，然后通过内吞作用将EDV带入细胞中。

含有编码工程化CRISPR、TALEN、基于转座子、ZEN、大范围核酸酶或Mega-TAL分子、转座子和/或转基因的核酸的载体，包括病毒和非病毒载体，也可直接施用于生物体以供在体内转导细胞。或者，可以施用裸DNA或mRNA。通过通常用于引入分子以便与血液或组织细胞最终接触的任何途径进行施用，该途径包括但不限于注射、输注、局部施用和电穿孔。可以使用多于一种途径来施用特定的组合物。药学上可接受的载体部分地地取决于所施用的特定组合物以及用来施用该组合物的特定方法。

在一些情况下，编码外源TCR的载体可穿梭至细胞核酸酶。例如，载体可含有核定位序列(NLS)。载体也可通过蛋白质或蛋白质复合物穿梭。在一些情况下，Cas9可用作穿梭微环载体的手段。Cas可包含NLS。在一些情况下，可在电穿孔之前将载体与Cas蛋白预先复合。可用于穿梭的Cas蛋白可以是核酸酶缺陷型Cas9(dCas9)蛋白。可用于穿梭的Cas蛋白可以是有核酸酶活性的Cas9。在一些情况下，Cas蛋白可与指导RNA以及编码外源TCR的质粒预先混合。

本文公开的某些方面可以利用载体。例如，可以使用的载体包括但不限于细菌载体：pBs、pQE-9(Qiagen)、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR54O、pRIT5(Pharmacia)；真核载体：pWL-neo、pSv2cat、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPv、pMSG、pSVL(Pharmiacia)。此外，可以使用任何其它质粒和载体，只要它们在选择的宿主中是可复制的并存活。任何载体和可商购的载体(及其变体或衍生物)可被工程化为包含用于该方法的一个或多个重组位点。这类载体可获自，例如，Vector Laboratories Inc.、Invitrogen、Promega、Novagen、NEB、Clontech、Boehringer Mannheim、Pharmacia、EpiCenter、OriGenesTechnologies Inc.、Stratagene、PerkinElmer、Pharmingen和Research Genetics。其它感兴趣的载体包括真核表达载体，如pFastBac、pFastBacHT、pFastBacDUAL、pSFV和pTet-Splice(Invitrogen)、pEUK-C1、pPUR、pMAM、pMAMneo、pBI101、pBI121、pDR2、pCMVEBNA和pYACneo(Clontech)、pSVK3、pSVL、pMSG、pCH110和pKK232-8(Pharmacia,Inc.)、p3'SS、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMClneo和pOG44(Stratagene,Inc.)和pYES2、pAC360、pBlueBa-cHis A、B和C、pVL1392、pBlueBac111、pCDM8、pcDNA1、pZeoSV、pcDNA3、pREP4、pCEP4和pEBVHis(Invitrogen,Corp.)及其变体或衍生物。其它载体包括pUC18、pUC19、pBlueScript、pSPORT、粘粒、噬菌粒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)、P1(大肠杆菌噬菌体)、pQE70、pQE60、pQE9(quagan)、pBS载体、PhageScript载体、BlueScript载体、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、pcDNA3(Invitrogen)、pGEX、pTrsfus、pTrc99A、pET-5、pET-9、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)、pSPORT1、pSPORT2、pCMVSPORT2.0和pSYSPORT1(Invitrogen)及其变体或衍生物。其它感兴趣的载体还可包括来自Invitrogen的pTrxFus、pThioHis、pLEX、pTrcHis、pTrcHis2、pRSET、pBlueBa-cHis2、pcDNA3.1/His、pcDNA3.1(-)/Myc-His、pSecTag、pEBVHis、pPIC9K、pPIC3.5K、pA081S、pPICZ、pPICZA、pPICZB、pPICZC、pGAPZA、pGAPZB、pGAPZC、pBlue-Bac4.5、pBlueBacHis2、pMelBac、pSinRep5、pSinHis、pIND、pIND(SP1)、pVgRXR、pcDNA2.1、pYES2、pZEr01.1、pZErO-2.1、pCR-Blunt、pSE280、pSE380、pSE420、pVL1392、pVL1393、pCDM8、pcDNA1.1、pcDNA1.1/Amp、pcDNA3.1、pcDNA3.1/Zeo、pSe、SV2、pRc/CMV2、pRc/RSV、pREP4、pREP7、pREP8、pREP9、pREP 10、pCEP4、pEBVHis、pCR3.1、pCR2.1、pCR3.1-Uni和pCRBac；来自Pharmacia的X ExCell、X gt11、pTrc99A、pKK223-3、pGEX-1XT、pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-4T-3、pGEX-3X、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2、pGEX-5X-3、pEZZ18、pRIT2T、pMC1871、pSVK3、pSVL、pMSG、pCH110、pKK232-8、pSL1180、pNEO和pUC4K；来自Novagen的pSCREEN-lb(+)、pT7Blue(R)、pT7Blue-2、pCITE-4-abc(+)、pOCUS-2、pTAg、pET-32L1C、pET-30LIC、pBAC-2cp LIC、pBACgus-2cp LIC、pT7Blue-2LIC、pT7Blue-2、XSCREEN-1、XB1ueSTAR、pET-3abcd、pET-7abc、pET9abcd、pET11abcd、pET12abc、pET-14b、pET-15b、pET-16b、pET-17b-pET-17xb、pET-19b、pET-20b(+)、pET-21abcd(+)、pET-22b(+)、pET-23abcd(+)、pET-24abcd(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28abc(+)、pET-29abc(+)、pET-30abc(+)、pET-31b(+)、pET-32abc(+)、pET-33b(+)、pBAC-1、pBACgus-1、pBAC4x-1、pBACgus4x-1、pBAC-3cp、pBACgus-2cp、pBACsurf-1、plg、Signal plg、pYX、Selecta Vecta-Neo、Selecta Vecta-Hyg和Selecta Vecta-Gpt；来自Clontech的pLexA、pB42AD、pGBT9、pAS2-1、pGAD424、pACT2、pGAD GL、pGAD GH、pGAD10、pGilda、pEZM3、pEGFP、pEGFP-1、pEGFPN、pEGFP-C、pEBFP、pGFPuv、pGFP、p6xHis-GFP、pSEAP2-Basic、pSEAP2-Contral、pSEAP2-启动子、pSEAP2-增强子、p I3gal-Basic、pl3gal-Control、pI3gal-启动子、pI3gal-增强子、pCMV、pTet-Off、pTet-On、pTK-Hyg、pRetro-Off、pRetro-On、pIRES1neo、pIRES1hyg、pLXSN、pLNCX、pLAPSN、pMAMneo、pMAMneo-CAT、pMAMneo-LUC、pPUR、pSV2neo、pYEX4T-1/2/3、pYEX-S1、pBacPAK-His、pBacPAK8/9、pAcUW31、BacPAK6、pTriplEx、2Xgt10、Xgt11、pWE15和X TriplEx；来自Stratagene的Lambda ZAP II、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescript II KS+/-、pBluescript II SK+/-、pAD-GAL4、pBD-GAL4Cam、pSurfscript、Lambda FIX II、Lambda DASH、Lambda EMBL3、Lambda EMBL4、SuperCos、pCR-Scrigt Amp、pCR-Script Cam、pCR-Script Direct、pBS+/-、pBC KS+/-、pBC SK+/-、Phag-escript、pCAL-n-EK、pCAL-n、pCAL-c、pCAL-kc、pET-3abcd、pET-llabcd、pSPUTK、pESP-1、pCMVLacI、pOPRSVI/MCS、pOPI3CAT、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMClneo、pMClneo Poly A、pOG44、p0G45、pFRTI3GAL、pNE0I3GAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415和pRS416；pPC86、pDBLeu、pDBTrp、pPC97、p2.5、pGAD1-3、pGAD10、pACt、pACT2、pGADGL、pGADGH、pAS2-1、pGAD424、pGBT8、pGBT9、pGAD-GAL4、pLexA、pBD-GAL4、pHISi、pHISi-1、placZi、pB42AD、pDG202、pJK202、pJG4-5、pNLexA、pYESTrp，及其变体或衍生物。

这些载体可用来表达基因，例如转基因，或感兴趣的基因的一部分。可通过使用任何方法***基因的一部分或基因，例如方法可以是基于限制酶的技术。

如下所述，可通过向个体患者施用而在体内递送载体，该施用一般是通过全身施用(例如，静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下或颅内输注)或局部施用。或者，可将载体离体递送至细胞，如从个体患者移植出的细胞(例如，淋巴细胞、T细胞、骨髓抽吸物、组织活检物)，然后通常在对已并入载体的细胞进行选择后将细胞重新植入患者中。在选择之前或之后，可以扩充细胞。载体可以是微环载体，图43。

可用微环载体和CRISPR系统转染细胞。在一些情况下，在将CRISPR系统和/或核酸酶或编码核酸酶的多肽引入到细胞或细胞群体的同时、之前或之后将微环载体引入到细胞或细胞群体。微环载体浓度可以是0.5纳克至50微克。在一些情况下，可通过电穿孔引入细胞中的核酸(例如，ssDNA、dsDNA、RNA)的量可以改变，以优化转染效率和/或细胞活力。在一些情况下，可将少于约100皮克的核酸添加至每个细胞样品(例如，一个或多个电穿孔的细胞)中。在一些情况下，可将至少约100皮克、至少约200皮克、至少约300皮克、至少约400皮克、至少约500皮克、至少约600皮克、至少约700皮克、至少约800皮克、至少约900皮克、至少约1微克、至少约1.5微克、至少约2微克、至少约2.5微克、至少约3微克、至少约3.5微克、至少约4微克、至少约4.5微克、至少约5微克、至少约5.5微克、至少约6微克、至少约6.5微克、至少约7微克、至少约7.5微克、至少约8微克、至少约8.5微克、至少约9微克、至少约9.5微克、至少约10微克、至少约11微克、至少约12微克、至少约13微克、至少约14微克、至少约15微克、至少约20微克、至少约25微克、至少约30微克、至少约35微克、至少约40微克、至少约45微克或至少约50微克的核酸添加至每个细胞样品(例如，一个或多个电穿孔的细胞)中。例如，可将1微克dsDNA添加至每个用于电穿孔的细胞样品中。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞活力所需的核酸(例如，dsDNA)的量对细胞类型可以是特定的。在一些情况下，用于每个样品的核酸(例如，dsDNA)的量可直接对应于转染效率和/或细胞活力。例如，微环转染的浓度范围在图70A、图70B和图73中示出。示出了5微克和20微克浓度下转染的微环载体的整合效率的总结的代表性流式细胞术实验在图74、图78和图79中示出。由微环载体编码的转基因可整合到细胞基因组中。在一些情况下，由微环载体编码的转基因的整合为正向方向，图75。在其它情况下，由微环载体编码的转基因的整合为反向方向。在一些情况下，在将CRISPR系统或将核酸酶或编码核酸酶的多核酸引入到细胞或细胞群体之后约、至少约或至多约1-3小时、3-6小时、6-9小时、9-12小时、12-15小时、15-18小时、18-21小时、21-23小时、23-26小时、26-29小时、29-31小时、31-33小时、33-35小时、35-37小时、37-39小时、39-41小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、14天、16天、20天或超过20天，将非病毒系统(例如，微环)引入到所述细胞或所述细胞群体。

采用本文所述的任何核酸递送平台，例如核转染或电穿孔，细胞的转染效率可以是或可以是约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或大于99.9％。

使用例如转染系统(ThermoFisher Scientific)或Nucleofector( Biosystems)进行的电穿孔也可用于向细胞中递送核酸。可以调整电穿孔参数以优化转染效率和/或细胞活力。电穿孔装置可具有多种电波形式的脉冲设置，如指数衰减、时间常数和方波。每种细胞类型具有独特的最佳场强(E)，该最佳场强取决于施加的脉冲参数(例如，电压、电容和电阻)。最佳场强的施加通过诱导跨膜电压引起电渗透，从而使核酸穿过细胞膜。在一些情况下，可以调整电穿孔脉冲电压、电穿孔脉冲宽度、脉冲数目、细胞密度和尖端类型，以优化转染效率和/或细胞活力。

在一些情况下，可以改变电穿孔脉冲电压以优化转染效率和/或细胞活力。在一些情况下，电穿孔电压可小于约500伏。在一些情况下，电穿孔电压可以是至少约500伏、至少约600伏、至少约700伏、至少约800伏、至少约900伏、至少约1000伏、至少约1100伏、至少约1200伏、至少约1300伏、至少约1400伏、至少约1500伏、至少约1600伏、至少约1700伏、至少约1800伏、至少约1900伏、至少约2000伏、至少约2100伏、至少约2200伏、至少约2300伏、至少约2400伏、至少约2500伏、至少约2600伏、至少约2700伏、至少约2800伏、至少约2900伏或至少约3000伏。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞活力所需的电穿孔脉冲电压对细胞类型可以是特定的。例如，1900伏的电穿孔电压对于巨噬细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在另一个实例中，约1350伏的电穿孔电压对于Jurkat细胞或原代人类细胞如T细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在一些情况下，一定范围的电穿孔电压对于给定的细胞类型可能是最佳的。例如，约1000伏至约1300伏的电穿孔电压对于人578T细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在一些情况下，原代细胞可以是原代淋巴细胞。在一些情况下，原代细胞群体可以是淋巴细胞群体。

在一些情况下，可以改变电穿孔脉冲宽度以优化转染效率和/或细胞活力。在一些情况下，电穿孔脉冲宽度可小于约5毫秒。在一些情况下，电穿孔宽度可以是至少约5毫秒、至少约6毫秒、至少约7毫秒、至少约8毫秒、至少约9毫秒、至少约10毫秒、至少约11毫秒、至少约12毫秒、至少约13毫秒、至少约14毫秒、至少约15毫秒、至少约16毫秒、至少约17毫秒、至少约18毫秒、至少约19毫秒、至少约20毫秒、至少约21毫秒、至少约22毫秒、至少约23毫秒、至少约24毫秒、至少约25毫秒、至少约26毫秒、至少约27毫秒、至少约28毫秒、至少约29毫秒、至少约30毫秒、至少约31毫秒、至少约32毫秒、至少约33毫秒、至少约34毫秒、至少约35毫秒、至少约36毫秒、至少约37毫秒、至少约38毫秒、至少约39毫秒、至少约40毫秒、至少约41毫秒、至少约42毫秒、至少约43毫秒、至少约44毫秒、至少约45毫秒、至少约46毫秒、至少约47毫秒、至少约48毫秒、至少约49毫秒或至少约50毫秒。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞活力所需的电穿孔脉冲宽度对细胞类型可以是特定的。例如，30毫秒的电穿孔脉冲宽度对于巨噬细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在另一个实例中，约10毫秒的电穿孔宽度对于Jurkat细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在一些情况下，一定范围的电穿孔宽度对于给定的细胞类型可能是最佳的。例如，约20毫秒至约30毫秒的电穿孔宽度对于人578T细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。

在一些情况下，可以改变电穿孔脉冲的数目以优化转染效率和/或细胞活力。在一些情况下，电穿孔可包括单个脉冲。在一些情况下，电穿孔可包括多于一个脉冲。在一些情况下，电穿孔可包括2个脉冲、3个脉冲、4个脉冲、5个脉冲、6个脉冲、7个脉冲、8个脉冲、9个脉冲或10个或更多个脉冲。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞活力所需的电穿孔脉冲的数目对细胞类型可以是特定的。例如，具有单个脉冲的电穿孔对于巨噬细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在另一个实例中，具有3个脉冲的电穿孔对于原代细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在一些情况下，一定范围的电穿孔宽度对于给定的细胞类型可能是最佳的。例如，具有约1个至约3个脉冲的电穿孔对于人类细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。

在一些情况下，可以改变电穿孔的起始细胞密度以优化转染效率和/或细胞活力。在一些情况下，电穿孔的起始细胞密度可小于约1x10⁵个细胞。在一些情况下，电穿孔的起始细胞密度可以是至少约1x10⁵个细胞、至少约2x10⁵个细胞、至少约3x10⁵个细胞、至少约4x10⁵个细胞、至少约5x10⁵个细胞、至少约6x10⁵个细胞、至少约7x10⁵个细胞、至少约8x10⁵个细胞、至少约9x10⁵个细胞、至少约1x10⁶个细胞、至少约1.5x10⁶个细胞、至少约2x10⁶个细胞、至少约2.5x10⁶个细胞、至少约3x10⁶个细胞、至少约3.5x10⁶个细胞、至少约4x10⁶个细胞、至少约4.5x10⁶个细胞、至少约5x10⁶个细胞、至少约5.5x10⁶个细胞、至少约6x10⁶个细胞、至少约6.5x10⁶个细胞、至少约7x10⁶个细胞、至少约7.5x10⁶个细胞、至少约8x10⁶个细胞、至少约8.5x10⁶个细胞、至少约9x10⁶个细胞、至少约9.5x10⁶个细胞、至少约1x10⁷个细胞、至少约1.2x10⁷个细胞、至少约1.4x10⁷个细胞、至少约1.6x10⁷个细胞、至少约1.8x10⁷个细胞、至少约2x10⁷个细胞、至少约2.2x10⁷个细胞、至少约2.4x10⁷个细胞、至少约2.6x10⁷个细胞、至少约2.8x10⁷个细胞、至少约3x10⁷个细胞、至少约3.2x10⁷个细胞、至少约3.4x10⁷个细胞、至少约3.6x10⁷个细胞、至少约3.8x10⁷个细胞、至少约4x10⁷个细胞、至少约4.2x10⁷个细胞、至少约4.4x10⁷个细胞、至少约4.6x10⁷个细胞、至少约4.8x10⁷个细胞或至少约5x10⁷个细胞。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞活力所需的电穿孔的起始细胞密度对细胞类型可以是特定的。例如，1.5x10⁶个细胞的电穿孔起始细胞密度对于巨噬细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在另一个实例中，5x10⁶个细胞的电穿孔起始细胞密度对于人类细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在一些情况下，一定范围的电穿孔起始细胞密度对于给定的细胞类型可能是最佳的。例如，5.6x10⁶至5x10⁷个细胞的电穿孔起始细胞密度对于人类细胞如T细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。

采用例如CRISPR系统将编码外源TCR的核酸序列整合到细胞基因组中的效率可以是或可以是约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或大于99.9％。

可以使用任何技术来检测外源多核酸如TCR的整合。例如，可通过流式细胞术、surveyor核酸酶测定(图56)、通过分解追踪***缺失(TIDE)(图71和图72)、接合PCR(junction PCR)或其任意组合来检测整合。示出了代表性TIDE分析的针对PD-1和CTLA-4指导RNA所显示的基因编辑效率百分比，图35和图36。CISH指导RNA的代表性TIDE分析在图62至图67A和图67B中示出。在其它情况下，可通过PCR检测转基因整合，图77、图80和图95。还可对被工程化为表达外源TCR的细胞进行TIDE分析，该工程化是通过rAAV转导，然后对内源检查点基因进行CRISPR敲除，图146A和图146B。

离体细胞转染也可用于诊断、研究或基因疗法(例如，通过将转染的细胞重新输注到宿主生物体中)。在一些情况下，从受试者生物体中分离细胞，将该细胞用核酸(例如，基因或cDNA)进行转染，并重新输注到受试者生物体(例如，患者)中。

在患者中达到治疗有效所必需的细胞的量可根据细胞的活力和细胞被遗传修饰的效率(例如，转基因被整合到一个或多个细胞中的效率)而不同。在一些情况下，遗传修饰后的细胞活力与转基因整合效率的乘积(例如，乘法)可对应于可用于施用至受试者的细胞的治疗性等份。在一些情况下，遗传修饰后细胞活力的增加可对应于在患者中施用达到治疗有效所必需的细胞量的减少。在一些情况下，转基因被整合到一个或多个细胞中的效率的增加可对应于在患者中施用达到治疗有效所必需的细胞量的减少。在一些情况下，确定达到治疗有效所必需的细胞的量可包括确定与细胞活力随时间推移的变化相对应的函数。在一些情况下，确定达到治疗有效所必需的细胞的量可包括确定与转基因可被整合到一个或多个细胞中的效率关于时间相关变量(例如，细胞培养时间、电穿孔时间、细胞刺激时间)的变化相对应的函数。

如本文所述，病毒颗粒，如rAAV，可用来将包含感兴趣的基因或转基因的病毒载体递送至离体或体内的细胞中，图105。在一些情况下，本文公开的病毒载体可以以pfu(噬斑形成单位)为单位来测量。在一些情况下，本公开内容的组合物和方法的重组病毒或病毒载体的pfu可以是约10⁸至约5×10¹⁰pfu。在一些情况下，本公开内容的重组病毒为至少约1×10⁸、2×10⁸、3×10⁸、4×10⁸、5×10⁸、6×10⁸、7×10⁸、8×10⁸、9×10⁸、1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹、9×10⁹、1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、4×10¹⁰和5×10¹⁰pfu。在一些情况下，本公开内容的重组病毒为至多约1×10⁸、2×10⁸、3×10⁸、4×10⁸、5×10⁸、6×10⁸、7×10⁸、8×10⁸、9×10⁸、1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹、9×10⁹、1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、4×10¹⁰和5×10¹⁰pfu。在一些方面，本公开内容的病毒载体可以以载体基因组的方式来测量。在一些情况下，本公开内容的重组病毒为1×10¹⁰至3×10¹²个载体基因组，或1×10⁹至3×10¹³个载体基因组，或1×10⁸至3×10¹⁴个载体基因组，或至少约1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³、1×10¹⁴、1×10¹⁵、1×10¹⁶、1×10¹⁷和1×10¹⁸个载体基因组，或者为1×10⁸至3×10¹⁴个载体基因组，或者为至多约1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³、1×10¹⁴、1×10¹⁵、1×10¹⁶、1×10¹⁷和1×10¹⁸个载体基因组。

在一些情况下，可以使用感染复数(MOI)来测量本公开内容的病毒载体(例如，AAV或修饰的AAV)。在一些情况下，MOI可以指载体或病毒基因组与核酸可递送至的细胞的比率或倍数。在一些情况下，MOI可以是1×10⁶。在一些情况下，MOI可以是1×10⁵至1×10⁷。在一些情况下，MOI可以是1×10⁴至1×10⁸。在一些情况下，本公开内容的重组病毒为至少约1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³、1×10¹⁴、1×10¹⁵、1×10¹⁶、1×10¹⁷和1×10¹⁸MOI。在一些情况下，本公开内容的重组病毒为1×10⁸至3×10¹⁴MOI，或者为至多约1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³、1×10¹⁴、1×10¹⁵、1×10¹⁶、1×10¹⁷和1×10¹⁸MOI。在一些情况下，以每个细胞约1x10⁵、2x10⁵、3x10⁵、4x10⁵、5x10⁵、6x10⁵、7x10⁵、8x10⁵、9x10⁵、1x10⁶、2x10⁶、3x10⁶、4x10⁶、5x10⁶、6x10⁶、7x10⁶、8x10⁶、9x10⁶、1x10⁷、2x10⁷、3x10⁷或最多约9x10⁹个基因组拷贝/病毒颗粒的感染复数(MOI)引入AAV和/或修饰的AAV载体。

在一些方面，非病毒载体或核酸可以在不使用病毒的情况下递送，并且可以根据核酸的量来测量。通常，任何合适量的核酸可与本公开内容的组合物和方法一起使用。在一些情况下，核酸可以是至少约1pg、10pg、100pg、1pg、10pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1μg、10μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1ng、10ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1mg、10mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、2g、3g、4g或5g。在一些情况下，核酸可以是至多约1pg、10pg、100pg、1pg、10pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1μg、10μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1ng、10ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1mg、10mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、2g、3g、4g或5g。

在一些情况下，将病毒(AAV或修饰的AAV)或非病毒载体引入到细胞或细胞群体。在一些情况下，在将病毒载体或非病毒载体引入到细胞或细胞群体后测量细胞毒性。在一些情况下，使用修饰的AAV时的细胞毒性低于将野生型AAV或非病毒载体(例如，微环)引入到可比细胞或可比细胞群体时的细胞毒性。在一些情况下，通过流式细胞术测量细胞毒性。在一些情况下，与使用野生型或未修饰的AAV或微环时相比，使用修饰的AAV时的细胞毒性降低约、至少约或至多约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些情况下，与使用微环载体或非病毒载体时相比，使用AAV载体时的细胞毒性降低约、至少约或至多约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或100％。

a.功能性移植

在移植之前、之后和/或期间，细胞(例如，工程化细胞或工程化原代T细胞)可以是功能性的。例如，移植的细胞可以在移植后至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、6、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90或100天是功能性的。移植的细胞可以在移植后至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月是功能性的。移植的细胞可以在移植后至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30年是功能性的。在一些情况下，移植的细胞可在接受者的终生是功能性的。

此外，移植的细胞可发挥其正常预期操作的100％的功能。移植的细胞也可发挥其正常预期操作的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的功能。

移植的细胞也可发挥其正常预期操作的大于100％的功能。例如，移植的细胞可发挥其正常预期操作的110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更大百分比的功能。

药物组合物和制剂

全文所述的组合物可配制成药物，并用来治疗被诊断为患有疾病例如癌症的有需要的人或哺乳动物。这些药物可与一种或多种T细胞(例如，工程化T细胞)连同一种或多种化疗剂或化疗化合物一起共施用于人或哺乳动物。

如本文所用的“化疗剂”或“化疗化合物”及其语法等同语可以是用于治疗癌症的化学化合物。可与所公开的T细胞联合使用的化疗癌症药剂包括但不限于有丝***抑制剂(长春花生物碱)。这些抑制剂包括长春新碱、长春花碱、长春地辛和Navelbine^TM(长春瑞滨，5’-去甲脱水长春碱(5’-noranhydroblastine))。在其它情况下，化疗癌症药剂包括拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱化合物。如本文所用的，“喜树碱化合物”包括Camptosar^TM(盐酸伊立替康)、Hycamtin^TM(盐酸拓扑替康)和其它衍生自喜树碱及其类似物的化合物。可在本文公开的方法和组合物中使用的另一类化疗癌症药剂是鬼臼毒素衍生物，如依托泊苷、替尼泊苷和米托鬼臼肼。本公开内容进一步涵盖被称为烷化剂的其它化疗癌症药剂，该药剂使肿瘤细胞中的遗传物质烷基化。这些癌症药剂包括但不限于顺铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、洛莫司汀(beusterine)、乌拉莫司汀、chlomaphazin和达卡巴嗪。本公开内容涵盖作为化疗剂的抗代谢物。这些类型的药剂的实例包括阿糖胞苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯基嘌呤、硫唑嘌呤和丙卡巴肼(procarbazine)。可以在本文公开的方法和组合物中使用的另一类化疗癌症药剂包括抗生素。实例包括但不限于多柔比星、博来霉素、放线菌素D、柔红霉素(daunorubicin)、光神霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C和道诺霉素。存在这些化合物的许多可商购脂质体制剂。本公开内容进一步涵盖其它化疗癌症药剂，包括但不限于抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮杂胞苷、安吖啶、美法仑、异环磷酰胺和米托蒽醌。

本文公开的T细胞可与包括细胞毒性剂/抗肿瘤药和抗血管生成剂在内的其它抗肿瘤剂联合施用。细胞毒性剂/抗肿瘤药可被定义为攻击并杀死癌细胞的药剂。一些细胞毒性剂/抗肿瘤药可以是烷化剂，其使肿瘤细胞中的遗传物质烷基化，例如，顺铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、洛莫司汀、乌拉莫司汀、chlomaphazin和达卡巴嗪。其它细胞毒性剂/抗肿瘤药可以是肿瘤细胞的抗代谢物，例如，阿糖胞苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯基嘌呤、硫唑嘌呤和丙卡巴肼。其它细胞毒性剂/抗肿瘤药可以是抗生素，例如多柔比星、博来霉素、放线菌素D、柔红霉素、光神霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C和道诺霉素。存在这些化合物的许多可商购脂质体制剂。另一些细胞毒性剂/抗肿瘤药可以是有丝***抑制剂(长春花生物碱)。这些抑制剂包括长春新碱、长春花碱和依托泊苷。其它细胞毒性剂/抗肿瘤药包括紫杉醇及其衍生物、L-天冬酰胺酶、抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮杂胞苷、安吖啶、美法仑、VM-26、异环磷酰胺、米托蒽醌和长春地辛。

还可使用抗血管生成剂。供所公开的方法和组合物使用的合适的抗血管生成剂包括抗VEGF抗体，包括人源化和嵌合抗体、抗VEGF适体和反义寡核苷酸。其它血管生成抑制剂包括血管抑素、内皮抑素、干扰素、白介素1(包括α和β)、白介素12、视黄酸以及金属蛋白酶-1和-2的组织抑制剂(TIMP-1和TIMP-2)。还可使用小分子，包括拓扑异构酶如雷佐生、具有抗血管生成活性的拓扑异构酶II抑制剂。

可与所公开的T细胞联合使用的其它抗癌剂包括但不限于：阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿可达佐；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美蒽醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；安曲霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿瓦斯汀；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苄替哌；比卡鲁胺；盐酸比生群；双奈法德；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡鲁睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡米诺霉素；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克里斯奈托(crisnatol mesylate)；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；盐酸柔红霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌；多西他赛；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；艾托卜宁；盐酸法曲唑；法扎拉滨；芬维A胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸依达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；白介素II(包括重组白介素II或rIL2)；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-I a；干扰素γ-I b；异丙铂；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；洛莫司汀；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美伦孕酮；美法仑；美诺立尔；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星(mitocarcin)；丝裂红素(mitocromin)；米托洁林；丝裂马菌素；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达唑；诺加霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；泊非霉素；泼尼莫司汀；盐酸丙卡巴肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠(sparfosate sodium)；司帕霉素；盐酸螺旋锗；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链脲霉素；磺氯苯脲；他利霉素；替可加兰钠；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫卟吩；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；硫代鸟嘌呤；噻替哌；噻唑羧胺核苷；替拉扎明；柠檬酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；磷酸曲西瑞宾；三甲曲沙；葡萄糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；乌拉莫司汀；乌瑞替哌；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春花碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸长春罗新；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星。其它抗癌药包括但不限于：20-表-1,25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；腺环戊醇；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；amidox；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗背侧化形态发生蛋白-1(anti-dorsalizing morphogenetic protein-1)；抗雄激素(***癌)；抗***；抗瘤酮；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素；凋亡基因调节剂；凋亡调节剂；无嘌呤酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；asulacrine；阿他美坦；阿莫司汀；axinastatin 1；axinastatin 2；axinastatin 3；阿扎司琼；阿扎毒素；重氮酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；balanol；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟吩；苯甲酰基星状孢菌素；β-内酰胺衍生物；β-alethine；βclamycin B；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双吖丙啶基精胺；双奈法德；比曲亭A(bistratene A)；比折来新；breflate；溴匹立明；布朵替坦；丁硫氨酸亚砜亚胺；卡泊三醇；钙磷酸蛋白C；喜树碱衍生物；金丝雀痘IL-2；卡培他滨；甲酰胺-氨基-***；羧胺***；CaRest M3；CARN 700；软骨来源的抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；栗树精胺；天蚕抗菌肽B；西曲瑞克；二氢卟酚；氯喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺式卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；碰撞霉素A(collismycin A)；碰撞霉素B(collismycin B)；康普瑞汀A4；康普瑞汀类似物；conagenin；crambescidin 816；克雷斯托；念珠藻素8；念珠藻素A衍生物；curacin A；环戊蒽醌；环铂(cycloplatam)；塞匹霉素(cypemycin)；阿糖胞苷烷磷酯(cytarabine ocfosfate)；溶细胞因子；磷酸己烷雌酚(cytostatin)；达昔单抗；地西他滨；脱氢膜海鞘素B；德舍瑞林；***；右异环磷酰胺；右丙亚胺；右维拉帕米；地吖醌；膜海鞘素B；didox；二乙基去甲精胺；二氢-5-氮杂胞苷；9-二氢紫杉醇；二氧杂霉菌素(dioxamycin)；二苯基螺莫司汀；多西他赛；廿二醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈***酚；度卡霉素SA(duocarmycin SA)；依布硒啉；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗(edrecolomab)；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；爱普列特；雌莫司汀类似物；***激动剂；***拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法曲唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；夫拉平度；氟卓斯汀；fluasterone；氟达拉滨；盐酸氟道诺霉素(fluorodaunorunicin hydrochloride)；福酚美克；福美司坦；福司曲星；福莫司汀；德卟啉钆(gadolinium texaphyrin)；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；hepsulfam；调蛋白；六亚甲基双乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；咪唑并吖啶酮(imidazoacridone)；咪喹莫特；免疫刺激肽；***-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白介素；碘苄胍；碘代多柔比星；4-甘薯苦醇；伊罗普拉；伊索拉定；异邦格唑(isobengazole)；异高软海绵素B(isohomohalicondrin B)；伊他司琼；加斯普拉诺利得(jasplakinolide)；卡哈拉里德F(kahalalide F)；三乙酸片螺素-N(lamellarin-Ntriacetate)；兰瑞肽；雷那霉素；来格司亭；硫酸香菇多糖；雷波斯他汀(leptolstatin)；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+***+***；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；线性多胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；lissoclinamide 7；洛铂；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛索立宾；勒托替康；德卟啉镥(lutetiumtexaphyrin)；lysofylline；裂解肽；美坦辛；曼诺他汀A；马立马司他；马索罗酚；乳腺丝抑蛋白；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；美巴龙(merbarone)；meterelin；蛋氨酸酶(methioninase)；胃复安；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；错配的双链RNA；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；迈托毒素成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；人绒毛膜***单克隆抗体；单磷酰脂质A+分枝杆菌细胞壁sk；莫哌达醇；多重耐药基因抑制剂；基于多肿瘤抑制基因1的治疗；芥末抗癌剂(mustard anticancer agent)；印度洋海绵B(mycaperoxide B)；分枝杆菌细胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰地那林；N-取代苯甲酰胺；那法瑞林；nagrestip；纳洛酮+喷他佐辛；napavin；naphterpin；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性内肽酶；尼鲁米特；尼萨霉素；一氧化氮调节剂；硝基氧抗氧化剂；nitrullyn；O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；oracin；口服细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；oxaunomycin；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；palauamine；palmitoylrhizoxin；帕米膦酸；人参炔三醇；帕诺米芬；parabactin；泊泽尼普定；培门冬酶；培得星(peldesine)；戊糖多硫酸钠；喷司他丁；喷曲唑(pentrozole)；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏醇；吩嗪霉素(phenazinomycin)；苯乙酸盐；磷酸酶抑制剂；溶链菌制剂(picibanil)；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；placetin A；placetin B；纤溶酶原激活物抑制剂；铂络合物；铂化合物；铂-三胺络合物；卟吩姆钠；紫菜霉素；强的松；丙基双吖啶酮；***素J2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；微藻蛋白激酶C抑制剂；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；红紫素；甲氧基吡唑啉吖啶；吡哆酸化血红蛋白聚氧乙烯缀合物(pyridoxylated hemoglobin polyoxyethyleneconjugate)；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法尼基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；去甲基化瑞替普汀；依替膦酸铼Re 186；根霉素；核酶；RII维甲酰胺(RIIretinamide)；罗谷亚胺；罗希吐碱；罗莫肽；罗喹美克；rubiginone B1；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；SarCNU；sarcophytol A；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老衍生的抑制剂1；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐喃；索布佐生；硼卡钠；苯乙酸钠；solverol；生长调节素结合蛋白；索纳明；斯帕磷酸；穗霉素D(spicamycin D)；螺莫司汀；斯耐潘定；海绵抑素1(spongistatin 1)；角鲨胺；干细胞抑制剂；干细胞***抑制剂；stipiamide；基质溶素抑制剂(stromelysin inhibitor)；sulfinosine；强效血管活性肠肽拮抗剂；suradista；苏拉明；苦马豆素；合成的糖胺聚糖；他莫司汀；它莫西芬甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；替加氟；tellurapyrylium；端粒酶抑制剂；替莫卟吩；替莫唑胺；替尼泊苷；四氯十氧化物(tetrachlorodecaoxide)；四氮脉(tetrazomine)；菌体胚素(thaliblastine)；噻可拉林(thiocoraline)；血小板生成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；乙基锡初紫红素(tin ethyl etiopurpurin)；替拉扎明；二氯二茂钛(titanocene bichloride)；topsentin；托瑞米芬；全能干细胞因子；翻译抑制剂；维甲酸；三乙酰尿苷；曲西瑞宾；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦源性生长抑制因子(urogenital sinus-derived growth inhibitory factor)；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；variolin B；红细胞基因治疗载体系统；维拉雷琐；藜芦胺；verdins；维替泊芬；长春瑞滨；维萨汀(vinxaltine)；vitaxin；伏罗唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C(zilascorb)；和净司他丁斯酯。在一种情况下，抗癌药物是5-氟尿嘧啶、紫杉酚或甲酰四氢叶酸。

在一些情况下，例如，在治疗癌症的组合物、制剂和方法中，所施用的组合物或制剂的单位剂量可以是5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg。在一些情况下，所施用的组合物或制剂的总量可以是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100g。

在一些情况下，本公开内容提供了包含可通过任何途径单独或与药学上可接受的载体或赋形剂一起施用的T细胞的药物组合物，并且可以以单剂量和多剂量进行这样的施用。更具体地，该药物组合物可与各种药学上可接受的惰性载体以片剂、胶囊、锭剂、糖锭、手糖(hand candies)、粉末、喷雾剂、水性悬浮液、可注射溶液、酏剂、糖浆等形式进行组合。这类载体包括固体稀释剂或填充剂、无菌水性介质和各种无毒有机溶剂等。此外，可借助通常用于此类目的的各种类型的试剂将这样的口服药物制剂适当地甜化和/或调味。

例如，细胞可与任何数目的相关治疗方式(包括但不限于采用诸如抗病毒疗法、西多福韦和白介素-2或阿糖胞苷(也称为ARA-C)等药剂进行的治疗)联合(例如，在该相关治疗方式之前、同时或之后)施用于患者。在一些情况下，工程化细胞可与化疗、放疗、免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗体或其它免疫消融剂(immunoablative agent)如CAMPATH、抗CD3抗体或其它抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐射联合使用。工程化细胞组合物还可与骨髓移植，使用化疗剂如氟达拉滨、外线束放疗(XRT)、环磷酰胺或抗体如OKT3或CAMPATH进行的T细胞消融疗法联合(例如，在该疗法之前、同时或之后)施用于患者。在一些情况下，可在B细胞消融疗法如与CD20反应的药剂(例如，Rituxan)之后施用本公开内容的工程化细胞组合物。例如，受试者可经历采用高剂量化疗的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些情况下，在移植之后，受试者可接受本公开内容的工程化细胞例如扩充的工程化细胞的输注。此外，可在手术前或手术后施用扩充的工程化细胞。通过本文所述的任何一种方法获得的工程化细胞可在本公开内容的特定方面用于治疗有需要的患者的宿主抗移植物(HvG)排斥和移植物抗宿主病(GvHD)。因此，涉及一种治疗有需要的患者的宿主抗移植物(HvG)排斥和移植物抗宿主病(GvHD)的方法，其包括通过向患者施用有效量的包含灭活的TCRα和/或TCRβ基因的工程化细胞来治疗患者。

使用方法

如本文所述，可从人提取细胞。细胞可经离体遗传改变并相应地被使用。这些细胞可用于基于细胞的疗法。这些细胞可用来治疗接受者(例如，人)的疾病。例如，这些细胞可用来治疗癌症。

本文描述了一种治疗接受者的疾病(例如，癌症)的方法，其包括向该接受者移植包括工程化细胞的一个或多个细胞(包括器官和/或组织)。通过细胞内基因组移植制备的细胞可用来治疗癌症。

本文描述了一种治疗接受者的疾病(例如，癌症)的方法，其包括向该接受者移植包括工程化细胞的一个或多个细胞(包括器官和/或组织)。在一些情况下，将向患者施用5x10¹⁰个细胞。在其它情况下，将向患者施用5x10¹¹个细胞。

在一些情况下，向受试者施用约5x10¹⁰个细胞。在一些情况下，约5x10¹⁰个细胞代表施用于受试者的细胞的中值量。在一些情况下，约5x10¹⁰个细胞是实现受试者中的治疗反应所必需的。在一些情况下，至少约1x10⁷个细胞、至少约2x10⁷个细胞、至少约3x10⁷个细胞、至少约4x10⁷个细胞、至少约5x10⁷个细胞、至少约6x10⁷个细胞、至少约6x10⁷个细胞、至少约8x10⁷个细胞、至少约9x10⁷个细胞、至少约1x10⁸个细胞、至少约2x10⁸个细胞、至少约3x10⁸个细胞、至少约4x10⁸个细胞、至少约5x10⁸个细胞、至少约6x10⁸个细胞、至少约6x10⁸个细胞、至少约8x10⁸个细胞、至少约9x10⁸个细胞、至少约1x10⁹个细胞、至少约2x10⁹个细胞、至少约3x10⁹个细胞、至少约4x10⁹个细胞、至少约5x10⁹个细胞、至少约6x10⁹个细胞、至少约6x10⁹个细胞、至少约8x10⁹个细胞、至少约9x10⁹个细胞、至少约1x10¹⁰个细胞、至少约2x10¹⁰个细胞、至少约3x10¹⁰个细胞、至少约4x10¹⁰个细胞、至少约5x10¹⁰个细胞、至少约6x10¹⁰个细胞、至少约6x10¹⁰个细胞、至少约8x10¹⁰个细胞、至少约9x10¹⁰个细胞、至少约1x10¹¹个细胞、至少约2x10¹¹个细胞、至少约3x10¹¹个细胞、至少约4x10¹¹个细胞、至少约5x10¹¹个细胞、至少约6x10¹¹个细胞、至少约6x10¹¹个细胞、至少约8x10¹¹个细胞、至少约9x10¹¹个细胞或至少约1x10¹²个细胞。例如，可向受试者施用约5x10¹⁰个细胞。在另一个实例中，以3x10⁶个细胞开始，这些细胞可扩充至约5x10¹⁰个细胞并施用于受试者。在一些情况下，将细胞扩充至足以用于治疗的数目。例如，5x10⁷个细胞可经历快速扩充以生成足以用于治疗应用的数目。在一些情况下，足以用于治疗应用的数目可以是5x10¹⁰个。任何数目的细胞均可被输注以用于治疗应用。例如，可向患者输注数目为1x10⁶至5x10¹²(包括两端值)的细胞。可向患者输注可针对这些细胞生成的尽可能多的细胞。在一些情况下，输注到患者中的细胞并不全是工程化的。例如，至少90％的输注到患者中的细胞可以是工程化的。在其它情况下，至少40％的输注到患者中的细胞可以是工程化的。

在一些情况下，本公开内容的方法包括计算实现受试者中的治疗反应所必需的工程化细胞的量，并且/或者向受试者施用所述量的工程化细胞。在一些情况下，计算实现治疗反应所必需的工程化细胞的量包括细胞的活力和/或转基因整合到细胞基因组中的效率。在一些情况下，为了实现受试者中的治疗反应，施用于受试者的细胞可以是活细胞。在一些情况下，为了在受试者中实现治疗反应，至少约95％、至少约90％、至少约85％、至少约80％、至少约75％、至少约70％、至少约65％、至少约60％、至少约55％、至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约20％、至少约15％、至少约10％的细胞是活细胞。在一些情况下，为了实现受试者中的治疗反应，施用于受试者的细胞可以是已经具有成功整合到细胞基因组中的一种或多种转基因的细胞。在一些情况下，为了在受试者中实现治疗反应，至少约95％、至少约90％、至少约85％、至少约80％、至少约75％、至少约70％、至少约65％、至少约60％、至少约55％、至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约20％、至少约15％、至少约10％的细胞已经具有成功整合到细胞基因组中的一种或多种转基因。

本文公开的方法可用于治疗或预防疾病，包括但不限于癌症、心血管疾病、肺病、肝病、皮肤病或神经学疾病。

移植可以是任何类型的移植。部位可包括但不限于肝包膜下空间、脾包膜下空间、肾包膜下空间、网膜、胃或肠粘膜下层、小肠血管节段、静脉囊、睾丸、脑、脾或角膜。例如，移植可以是包膜下移植。移植还可以是肌肉内移植。移植可以是门静脉内移植。

移植可以是来自人的一个或多个细胞的移植。例如，所述一个或多个细胞可来自器官，该器官可以是脑、心脏、肺、眼、胃、胰腺、肾、肝、肠、子宫、膀胱、皮肤、毛发、指甲、耳、腺体、鼻、嘴、嘴唇、脾、牙龈、牙齿、舌、唾液腺、扁桃体、咽、食管、大肠、小肠、直肠、***、甲状腺、胸腺、骨骼、软骨、肌腱、韧带、肾上腺囊、骨骼肌、平滑肌、血管、血液、脊髓、气管、输尿管、尿道、下丘脑、垂体、幽门、肾上腺、卵巢、输卵管、子宫、***、乳腺、睾丸、精囊、***、淋巴、***或***。所述一个或多个细胞还可来自脑、心脏、肝、皮肤、肠、肺、肾、眼、小肠或胰腺。所述一个或多个细胞可来自胰腺、肾、眼、肝、小肠、肺或心脏。所述一个或多个细胞可来自胰腺。所述一个或多个细胞可以是胰岛细胞，例如，胰腺β细胞。所述一个或多个细胞可以是任何血细胞，如外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞。所述一个或多个细胞可以是任何免疫细胞，如淋巴细胞、B细胞或T细胞。

本文公开的方法还可包括移植一个或多个细胞，其中所述一个或多个细胞可以是任何类型的细胞。例如，所述一个或多个细胞可以是上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B和T)、巨噬细胞、单核细胞、单个核细胞、心肌细胞、其它肌细胞、颗粒细胞、丘细胞、表皮细胞、内皮细胞、胰岛细胞、血细胞、血液前体细胞、骨细胞、骨前体细胞、神经元干细胞、原始干细胞、肝细胞、角质形成细胞、脐静脉内皮细胞、主动脉内皮细胞、微血管内皮细胞、成纤维细胞、肝星状细胞、主动脉平滑肌细胞、心肌细胞、神经元、枯否细胞(Kupffer cell)、平滑肌细胞、施万细胞(Schwann cell)和上皮细胞、红细胞、血小板、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、脂肪细胞、软骨细胞、胰岛细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、腮腺细胞、肿瘤细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞、红细胞、白细胞、巨噬细胞、上皮细胞、体细胞、垂体细胞、肾上腺细胞、毛细胞、膀胱细胞、肾细胞、视网膜细胞、视杆细胞、视锥细胞、心脏细胞、起搏细胞、脾细胞、抗原呈递细胞、记忆细胞、T细胞、B细胞、浆细胞、肌肉细胞、卵巢细胞、子宫细胞、***细胞、***上皮细胞、***、睾丸细胞、生殖细胞、***、莱迪希细胞(leydig cell)、管周细胞、支持细胞(sertoli cell)、黄体细胞、子宫颈细胞、子宫内膜细胞、***细胞、滤泡细胞、粘液细胞、纤毛细胞、非角化上皮细胞、角化上皮细胞、肺细胞、杯形细胞、柱状上皮细胞、多巴胺能细胞(dopamiergic cell)、鳞状上皮细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、多巴胺能细胞、胚胎干细胞、成纤维细胞和胎儿成纤维细胞。此外，所述一个或多个细胞可以是胰岛细胞和/或细胞簇等，包括但不限于胰腺α细胞、胰腺β细胞、胰腺δ细胞、胰腺F细胞(例如，PP细胞)或胰腺ε细胞。在一种情况下，所述一个或多个细胞可以是胰腺α细胞。在另一种情况下，所述一个或多个细胞可以是胰腺β细胞。

供体可处于任何发育阶段，包括但不限于胎儿期、新生儿期、幼年期和成年期。例如，可从成人中分离供体T细胞。供体人类T细胞可以是10、9、8、7、6、5、4、3、2或1岁以下的年龄。例如，可从6岁以下年龄的人中分离T细胞。还可从3岁以下年龄的人中分离T细胞。供体可超过10岁。

a.移植

本文公开的方法可包括移植。移植可以是自体移植、异体移植、异种移植或任何其它移植。例如，移植可以是异种移植。移植还可以是异体移植。

如本文所用的“异种移植”及其语法等同语可包括涉及将细胞、组织或器官移植、植入或输注到接受者中的任何程序，其中接受者和供体是不同的物种。本文所述的细胞、器官和/或组织的移植可用于向人类中的异种移植。异种移植包括但不限于血管化异种移植、部分血管化异种移植、非血管化异种移植、异种敷料(xenodressings)、异种绷带(xenobandages)和异种结构。

如本文所用的“异体移植”及其语法等同语(例如，同种异体移植)可包括涉及将细胞、组织或器官移植、植入或输注到接受者中的任何程序，其中接受者和供体是相同的物种但为不同的个体。本文所述的细胞、器官和/或组织的移植可用于向人类中的异体移植。异体移植包括但不限于血管化异体移植、部分血管化异体移植、非血管化异体移植、异体敷料(allodressings)、异体绷带(allobandages)和异体结构。

如本文所用的“自体移植”及其语法等同语(例如，自体的移植)可包括涉及将细胞、组织或器官移植、植入或输注到接受者中的任何程序，其中接受者和供体是同一个体。本文所述的细胞、器官和/或组织的移植可用于向人类中的自体移植。自体移植包括但不限于血管化自体移植、部分血管化自体移植、非血管化自体移植、自体敷料(autodressings)、自体绷带(autobandages)和自体结构。

治疗(例如，如本文所公开的任何治疗)后，移植排斥反应与将一个或多个野生型细胞移植到接受者中相比可得到改善。例如，移植排斥反应可以是超急性排斥反应。移植排斥反应还可以是急性排斥反应。其它类型的排斥反应可包括慢性排斥反应。移植排斥反应还可以是细胞介导的排斥反应或T细胞介导的排斥反应。移植排斥反应还可以是自然杀伤细胞介导的排斥反应。

如本文所用的“改善”及其语法等同语可意指本领域技术人员所认识到的任何改善。例如，改善移植可意指减轻超急性排斥反应，其可包括不希望的效应或症状的减少、减轻或削弱。

移植之后，移植的细胞在接受者中可以是功能性的。在一些情况下，功能性可决定移植是否成功。例如，移植的细胞可在至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天是功能性的。这可指示移植是成功的。这还可指示移植的细胞、组织和/或器官没有排斥反应。

在某些情况下，移植的细胞可在至少1天是功能性的。移植的细胞还可在至少7天是功能性的。移植的细胞可在至少14天是功能性的。移植的细胞可在至少21天是功能性的。移植的细胞可在至少28天是功能性的。移植的细胞可在至少60天是功能性的。

成功移植的另一指示可以是接受者不需要免疫抑制治疗的天数。例如，在本文提供的治疗(例如，移植)之后，接受者可在至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天不需要免疫抑制治疗。这可指示移植是成功的。这还可指示移植的细胞、组织和/或器官没有排斥反应。

在一些情况下，接受者可在至少1天不需要免疫抑制治疗。接受者还可在至少7天不需要免疫抑制治疗。接受者可在至少14天不需要免疫抑制治疗。接受者可在至少21天不需要免疫抑制治疗。接受者可在至少28天不需要免疫抑制治疗。接受者可在至少60天不需要免疫抑制治疗。此外，接受者可在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年不需要免疫抑制治疗。

成功移植的另一指示可以是接受者需要减少的免疫抑制治疗的天数。例如，在本文提供的治疗之后，接受者可在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天需要减少的免疫抑制治疗。这可指示移植是成功的。这还可指示移植的细胞、组织和/或器官没有排斥反应或仅有最小的排斥反应。

在一些情况下，接受者可在至少1天不需要免疫抑制治疗。接受者还可在至少或至少约7天不需要免疫抑制治疗。接受者可在至少或至少约14天不需要免疫抑制治疗。接受者可在至少或至少约21天不需要免疫抑制治疗。接受者可在至少或至少约28天不需要免疫抑制治疗。接受者可在至少或至少约60天不需要免疫抑制治疗。此外，接受者可在至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年不需要免疫抑制治疗。

成功移植的另一指示可以是接受者需要减少的免疫抑制治疗的天数。例如，在本文提供的治疗之后，接受者可在至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天需要减少的免疫抑制治疗。这可指示移植是成功的。这还可指示移植的细胞、组织和/或器官没有排斥反应或仅有最小的排斥反应。

如本文所用的“减少的”及其语法等同语可指与将一个或多个野生型细胞移植到接受者中时所需的免疫抑制治疗相比更少的免疫抑制治疗。

免疫抑制治疗可包括抑制免疫系统的任何治疗。免疫抑制治疗可帮助缓解、最小化或消除接受者的移植排斥反应。例如，免疫抑制治疗可包括免疫抑制药物。可在移植之前、期间和/或之后使用的免疫抑制药物包括但不限于MMF(霉酚酸酯(Cellcept))、ATG(抗胸腺细胞球蛋白)、抗CD154(CD4OL)、抗CD40(2C10、ASKP1240、CCFZ533X2201)、阿仑单抗(Campath)、抗CD20(利妥昔单抗)、抗IL-6R抗体(托珠单抗，Actemra)、抗IL-6抗体(sarilumab、奥鲁凯珠单抗(olokizumab))、CTLA4-Ig(阿巴西普/Orencia)、贝拉西普(LEA29Y)、西罗莫司(Rapimune)、依维莫司、他克莫司(Prograf)、达利珠单抗(Ze-napax)、巴利昔单抗(Simulect)、英夫利昔单抗(Remicade)、环孢菌素、脱氧精胍菌素、可溶性补体受体1、眼镜蛇毒因子、compstatin、抗C5抗体(依库珠单抗/Soliris)、甲基强的松龙、FTY720、依维莫司、来氟米特、抗IL-2R-Ab、雷帕霉素、抗CXCR3抗体、抗ICOS抗体、抗OX40抗体和抗CD122抗体。此外，一种或多于一种免疫抑制剂/药物可一起使用或依次使用。一种或多于一种免疫抑制剂/药物可用于诱导治疗或用于维持治疗。可在诱导和维持阶段使用相同或不同的药物。在一些情况下，达利珠单抗(Zenapax)可用于诱导治疗，而他克莫司(Prograf)和西罗莫司(Rapimune)可用于维持治疗。达利珠单抗(Zenapax)还可用于诱导治疗，而低剂量的他克莫司(Prograf)和低剂量的西罗莫司(Rapimune)可用于维持治疗。还可使用非药物方案来实现免疫抑制，该非药物方案包括但不限于全身照射、胸腺照射和全部和/或部分脾切除术。这些技术还可与一种或多种免疫抑制药物联合使用。

实施例

实施例1：确定各种核酸递送平台的转染效率

从LeukoPak中分离外周血单核细胞(PBMC)

本文使用从正常外周血收集的leukopak。用冷冻的1X PBS以3比1稀释血细胞。在50mL锥形瓶中的15mL LYMPHOPREP(Stem Cell Technologies)上逐滴(例如，非常缓慢地)添加稀释的血液。以400x G在无制动的情况下将细胞离心25分钟。缓慢取出血沉棕黄层，并将其置于无菌锥形瓶中。用冷冻的1X PBS洗涤细胞，并将细胞以400x G离心10分钟。去除上清液，将细胞重悬于培养基中，计数，并且存活地冷冻在冷冻培养基(45mL热灭活的FBS和5mL DMSO)中。

CD3+T细胞的分离

将PBMC解冻，并在培养基(RPMI-1640(不含酚红)，20％FBS(热灭活的)和1XGluta-MAX)中接种1-2小时。收集细胞并计数；将细胞密度调整至5x 10⁷个细胞/mL并转移至无菌14mL聚苯乙烯圆底管中。使用EasySep人CD3细胞分离试剂盒(Stem CellTechnologies)，将50uL/mL的分离混合物添加至细胞。通过用移液管吸移将混合物混合，并在室温下孵育5分钟。孵育后，将RapidSpheres涡旋30秒，并以50μL/mL添加至样品中；通过用移液管吸移进行混合。对于少于4mL的样品，将混合物加满至5mL，或者对于超过4mL的样品，将混合物加满至10mL。将无菌聚苯乙烯管添加至“Big Easy”磁体；在室温下孵育3分钟。在一次连续动作中将磁体和管倒置，从而将所富集的细胞悬浮液倒入新的无菌管中。

CD3+T细胞的活化和刺激

对分离的CD3+T细胞进行计数，并在24孔板中以2x 10⁶个细胞/mL的密度进行接种。在使用dynamagnet用含有0.2％BSA的1X PBS洗涤Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28珠(Gibco,Life Technologies)后，以3:1(珠子:细胞)将该珠添加至细胞。以300IU/mL的浓度添加IL-2(Peprotech)。将细胞孵育48小时，然后使用dynamagnet去除珠子。细胞在电穿孔或核转染前再培养6-12小时。

CD3+T细胞的Amaxa转染

使用Amaxa Human T Cell Nucleofector Kit(Lonza,瑞士)对未刺激或刺激的T细胞进行核转染，图82A和图82B。对细胞进行计数，并以1-8x 10⁶个细胞的密度重悬浮于100μL室温Amaxa缓冲液中。将1-15ug的mRNA或质粒添加至细胞混合物中。使用U-014程序对细胞进行核转染。核转染后，将细胞接种在6孔板中的2mL培养基中。

CD3+T细胞的Neon转染

使用Neon Transfection System(10uL试剂盒，Invitrogen,Life Technologies)对未刺激或刺激的T细胞进行电穿孔。对细胞进行计数，并以2x 10⁵个细胞的密度重悬浮于10μL T缓冲液中。将1μg的GFP质粒或mRNA或1μg Cas9和1μg的gRNA质粒添加至细胞混合物中。以1400V、10ms、3个脉冲对细胞进行电穿孔。转染后，将细胞接种在48孔板中的200uL培养基中。

RNA的脂质转染和CD3+T细胞的质粒DNA转染

以5x 10⁵个细胞/mL的密度将未刺激的T细胞接种在24孔板中。对于RNA转染，使用TransIT-mRNA Transfection Kit(Mirus Bio)，按照制造商的方案，用500ng的mRNA对T细胞进行转染。对于质粒DNA转染，使用TransIT-X2Dynamic Delivery System(Mirus Bio)，按照制造商的方案，用500ng质粒DNA对T细胞进行转染。将细胞在37℃下孵育48小时，然后通过流式细胞术进行分析。

金纳米颗粒SmartFlares的CD3+T细胞摄入

将未刺激或刺激的T细胞以1-2x 10⁵个细胞/孔的密度接种在48孔板中的200μL培养基中。在添加至细胞之前，将与Cy5或Cy3复合的金纳米颗粒SmartFlared(Millipore，德国)涡旋30秒。将1uL的金纳米颗粒SmartFlares添加至每个孔的细胞。在通过流式细胞术分析Cy5或Cy3表达之前，将板振摇1分钟并在37℃下孵育24小时。

流式细胞术

在转染后24-48小时通过流式细胞术分析电穿孔并核转染的T细胞的GFP表达。通过用冷冻的含有0.5％FBS的1X PBS洗涤并用APC抗人CD3ε(eBiosciences，San Diego)和可固定活力染料(Fixable Viability Dye)eFlour 780(eBiosciences，San Diego)进行染色来准备细胞。使用LSR II(BD Biosciences，San Jose)和FlowJo v.9分析细胞。

结果

如表2中所示，使用四种示例性转染平台测试总共六种细胞和DNA/RNA组合。这六种细胞和DNA/RNA组合为：将EGFP质粒DNA添加至未刺激的PBMC；将EGFP质粒DNA添加至未刺激的T细胞；将EGFP质粒DNA添加至刺激的T细胞；将EGFP mRNA添加至未刺激的PBMC；将EGFPmRNA添加至未刺激的T细胞；以及将EGFP mRNA添加至刺激的T细胞。这四种示例性转染平台为：AMAXA核转染、NEON电穿孔、基于脂质的转染和金纳米颗粒递送。表1中列出了各种条件下的转染效率(转染细胞的百分比)结果，使用AMAXA平台将mRNA添加至刺激的T细胞提供了最高的效率。

表2.各种核酸递送平台的转染效率

在未来将使用类似的方法测试包括外来体介导的转染在内的其它转染条件。此外，还将使用类似的方法测试其它递送组合，包括DNA Cas9/DNA gRNA、mRNA Cas9/DNAgRNA、蛋白Cas9/DNA gRNA、DNA Cas9/gRNA的PCR产物、DNA Cas9/gRNA的PCR产物、mRNACas9/gRNA的PCR产物、蛋白Cas9/gRNA的PCR产物、DNA Cas9/修饰的gRNA、mRNA Cas9/修饰的gRNA和蛋白Cas9/修饰的gRNA。具有高递送效率的组合可在本文公开的方法中使用。

实施例2：确定GFP质粒在T细胞中的转染效率

使用GFP质粒用Amaxa核转染确定原代T细胞的转染效率。图4示出了为该实验所制备的四种质粒的结构：Cas9核酸酶质粒、HPRT gRNA质粒(靶向人HPRT基因的CRISPR gRNA)、Amaxa EGFPmax质粒和HPRT靶载体。HPRT靶载体具有0.5kb的靶向臂(图5)。样品制备、流式细胞术和其它方法与实验1类似。使用无内毒素试剂盒(Qiagen)制备质粒。测试不同的条件(在表3中示出)，包括细胞数目和质粒组合。

表3.实验中使用的不同条件

结果

图7证明，Cas9+gRNA+靶质粒共转染在混合群体中具有良好的转染效率。图8示出了CD3+T细胞的EGFP FACS分析的结果。使用上述条件证明了不同的转染效率。图40A和图40B示出了用供体转基因进行CRISPR转染后第6天的活力和转染效率(％GFP+)。

实施例3：鉴别在每个基因位点处具有最高双链断裂(DSB)诱导的gRNA

指导RNA的设计和构建：

使用CRISPR设计程序(Zhang Lab，MIT 2015)，针对所需的基因区域设计指导RNA(gRNA)。基于由脱靶位置所确定的最高排名值来选择用于生成gRNA的多种引物(在表4中示出)。gRNA按以下寡核苷酸对定制：5’-CACCG-gRNA序列-3’和5’-AAAC-反向互补gRNA序列-C-3’(寡核苷酸对的序列在表4中列出)。

表4.用于生成gRNA的引物(出于克隆的目的，将CACCG序列添加至有义链并将AAAC添加至反义链)。

使用靶序列克隆方案(Zhang Lab，MIT)将gRNA克隆在一起。简言之，使用T4PNK(NEB)和10X T4连接缓冲液(NEB)，在热循环仪中采用以下方案对寡核苷酸对进行磷酸化并退火在一起：37℃30分钟，95℃ 5分钟，然后以5℃/分钟斜降至25℃。用FastDigest BbsI(Fermentas)消化pENTR1-U6-Stuffer-gRNA载体(自制)，FastAP(Fermentas)和10X FastDigest缓冲液用于连接反应。使用T4DNA连接酶和缓冲液(NEB)将所消化的pENTR1载体与来自先前步骤的磷酸化并退火的寡核苷酸双链体(稀释度1:200)连接在一起。将连接反应在室温下孵育1小时，然后转化，随后使用GeneJET Plasmid Miniprep Kit(ThermoScientific)进行小量制备。对质粒进行测序以确认正确的***。

表5工程化CISH指导RNA(gRNA)靶序列

被工程化gRNA靶向的基因组序列在表5和表6中示出。图44A和图44B示出了靶向CISH基因的经修饰的gRNA。

表6 AAVS1gRNA靶序列

SEQ ID	基因	gRNA序列(5’至3’)
			87	AAVS1	GTCACCAATCCTGTCCCTAG-

gRNA的验证

以1x 10⁵个细胞/孔的密度将HEK293T细胞接种在24孔板中。将150uL的Opti-MEM培养基与1.5ug的gRNA质粒、1.5ug的Cas9质粒合并。将另外150uL的Opti-MEM培养基与5μl的Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)合并。将这些溶液合并在一起并在室温下孵育15分钟。将DNA-脂质复合物逐滴添加至24孔板的孔中。将细胞在37℃下孵育3天，并使用GeneJET Genomic DNA Purification试剂盒(Thermo Scientific)收集基因组DNA。通过Surveyor Digest、凝胶电泳和密度测定对gRNA的活性进行定量(图60和图61)(Guschin,D.Y.,等人,“A Rapid and General Assay for Monitoring Endogenous GeneModification,”Methods in Molecular Biology,649:247-256(2010))。

质粒靶向载体的构建

从整个数据库获得靶整合位点的序列。使用Primer3软件基于这些序列设计PCR引物，以生成承载长度为1kb、2kb和4kb大小的靶向载体。然后使用Accuprime Taq HiFi(Invitrogen)按照制造商的说明书对靶向载体臂进行PCR扩增。然后使用TOPO-PCR-BluntII克隆试剂盒(Invitrogen)对所得到的PCR产物进行亚克隆，并进行序列验证。代表性靶向载体构建体在图16中示出。

结果

Cas9在不同gRNA序列的辅助下产生双链断裂(DSB)的效率在表7中列出。表7中的百分数指示样品中基因修饰的百分比。

表7.Cas9/gRNA对在各个靶基因位点处产生双链断裂(DSB)的效率

	HPRT	AAVS1	CCR5	PD1	CTLA4
						gRNA#1	27.85％	32.99％	21.47％	10.83％	40.96％
gRNA#2	30.04％	27.10％	>60％	>60％	56.10％
						gRNA#3	<1％	39.82％	55.98％	37.42％	39.33％
gRNA#4	<5％	25.93％	45.99％	20.87％	40.13％
						gRNA#5	<1％	27.55％	36.07％	30.60％	15.90％
gRNA#6	<5％	39.62％	33.17％	25.91％	36.93％

在所有五个测试的靶基因位点处均产生DSB。在这些位点中，CCR5、PD1和CTLA4提供了最高的DSB效率。将使用本文所述的相同方法测试其它靶基因位点，包括hRosa26。

Cas9与不同的gRNA序列一起产生双链断裂的比率在图15中示出。列出了与供体对照和仅Cas9的对照相比的双链断裂百分比。测试了***性靶基因位点(即CCR5、PD1和CTLA4)。

实施例4：包含还破坏免疫检查点基因的工程化TCR的T细胞的生成

为了生成表达还破坏免疫检查点基因的工程化TCR的T细胞群体，使用CRISPR、TALEN、基于转座子、ZEN、大范围核酸酶或Mega-TAL基因编辑方法。PD-1和其它内源检查点的总结在表9中示出。细胞(例如，PBMC，T细胞如TIL、CD4+或CD8+细胞)从癌症患者(例如，转移性黑素瘤)中纯化，并根据标准程序进行培养和/或扩充。(例如，使用抗CD3和抗CD28珠)刺激细胞或不刺激细胞。用携带TCR转基因的靶载体转染细胞。例如，通过IDT获得并合成MBVb22的TCR转基因序列作为gBLOCK。gBLOCK被设计成具有侧翼attB序列，并通过LRClonase反应(Invitrogen)按照制造商的说明书克隆到pENTR1中，并进行序列验证。对以三种不同方式表达TCR转基因的三种转基因构型(参见图6)进行测试：1)外源启动子：TCR转基因由外源启动子转录；2)SA框内转录：TCR转基因通过剪接由内源启动子转录；和3)融合框内翻译：TCR转基因通过框内翻译由内源启动子转录。

当使用CRISPR基因编辑方法时，还用具有携带TCR转基因的靶载体的DNA质粒转染Cas9核酸酶质粒和gRNA质粒(与图4中所示的质粒类似)。可以采用10微克gRNA和15微克Cas9mRNA。该gRNA将Cas9核酸酶引导至整合位点，例如，内源检查点基因，如PD-1。或者，使用gRNA或经修饰RNA的PCR产物(如在Hendel,Nature biotechnology,2015中所述的)。还测试具有Cas9核酸酶基因和gRNA两者的另一质粒。这些质粒被一起转染或分别转染。或者，使用Cas9核酸酶或编码Cas9核酸酶的mRNA来替代Cas9核酸酶质粒。

为了优化同源重组的比率以使用CRISPR基因编辑方法整合TCR转基因，测试不同长度的靶载体臂，包括0.5kbp、1kbp和2kbp。例如，具有0.5kbp臂长度的靶载体在图5中示出。此外，还测试几种CRISPR增强剂如SCR7药物和DNA连接酶IV抑制剂(例如，腺病毒蛋白质)的作用。

除了使用质粒递送携带转基因的同源重组HR增强子之外，还测试mRNA的使用。鉴别能够在原位将mRNA同源重组HR增强子高效转变成DNA的最佳逆转录平台。还优化并实施用于造血干细胞和原代T细胞的工程化的逆转录平台。

当使用基于转座子的基因编辑方法(例如，PiggyBac、睡美人(Sleeping Beauty))时，还用具有携带TCR转基因的靶载体的DNA质粒转染转座酶质粒。图2示出了用于TCR转基因整合和表达的一些基于转座子的构建体。

然后用编码PD1特异性核酸酶的mRNA处理工程化细胞，并通过Cel-I测定来分析该群体(图28至图30)以验证PD1破坏和TCR转基因***。在验证之后，使工程化细胞在体外生长并扩充。T7内切核酸酶I(T7E1)测定可用来检测培养细胞中的中靶CRISPR事件，图34和图39。双测序缺失在图37和图38中示出。

一些工程化细胞在自体移植中使用(例如，回输给其细胞用来生成该工程化细胞的癌症患者)。一些工程化细胞在同种异体移植中使用(例如，回输给不同的癌症患者)。确定T细胞在治疗患者方面的功效和特异性。可用抗原或抗CD3和抗CD28再刺激已被遗传工程化的细胞，以驱动内源检查点基因的表达，图90A和图90B。

结果

生成具有工程化TCR和免疫检查点基因破坏的T细胞的代表性示例在图17中示出。阳性PCR结果证明了CCR5基因处的成功重组。免疫检查点敲除的效率在图23A、图23B、图24A和图24B中的代表性实验中示出。图25中示出了代表性实验的流式细胞术数据。图26A和图26B示出了用CRISPR处理后原代人T细胞中的双敲除百分比。用CRISPR和抗PD-1指导RNA转染后第14天的流式细胞术结果的代表性示例在图45、图51和图52中示出。对于用CRISPR系统和靶向CTLA-4和PD-1的gRNA转染的细胞，转染后14天的细胞活力和基因编辑效率在图53、图54和图55中示出。

实施例5：T细胞中的同源重组的检测

为了生成表达还破坏基因的工程化TCR的工程化T细胞群体，使用CRISPR、TALEN、基于转座子、ZEN、大范围核酸酶或Mega-TAL基因编辑方法。为了确定使用同源重组增强子是否促进同源重组，以下实例体现了代表性实验。使用NEON转染系统(Invitrogen)对刺激的CD3+T细胞进行电穿孔。对细胞进行计数，并以1.0-3.0x 10⁶个细胞的密度重悬浮于100μL T缓冲液中。使用15μg mRNA Cas9(TriLink BioTechnologies)、10μg mRNA gRNA(TriLink BioTechnologies)和10μg的同源重组(HR)靶向载体来检查HR。单独的10μg HR靶向载体或15μg Cas9与10μg mRNA gRNA用作对照。电穿孔后，将细胞分成四种条件以测试提示促进HR的两种药物：1)仅DMSO(媒介物对照)，2)SCR7(1uM)，3)L755507(5uM)，和4)SCR7和L755507。使用Countess II自动细胞计数器(Thermo Fisher)每三天对细胞进行一次计数，以监测在这些不同条件下的生长。为了监测HR，通过流式细胞术分析细胞并通过PCR对细胞进行测试。对于流式细胞术，每周分析一次细胞，持续三周。用APC抗小鼠TCRβ(eBiosciences)和可固定活力染料eFluor 780(eBiosciences)对T细胞进行染色。使用LSRII(BD Biosciences)和FlowJo v.9分析细胞。为了通过PCR测试HR，从T细胞中分离gDNA并使用高保真accuprime taq DNA聚合酶(Thermo Fisher)通过PCR进行扩增。将引物设计成针对CCR5基因和HR靶向载体的两端，以发现5’和3’两端的正确的同源重组。

实施例6：预防由外源质粒DNA诱导的毒性

外源质粒DNA在T细胞中诱导毒性。图19和图69的先天免疫传感途径描述了毒性发生的机制。为了确定是否可通过添加改变对外源多核酸的应答的化合物来降低细胞毒性，完成了以下代表性实验。使用NEON转染系统(Invitrogen)，采用逐渐增加量的质粒DNA(0.1ug至40ug)对CD3+T细胞进行电穿孔，图91。电穿孔后，将细胞分成四种条件以测试能够阻断由双链DNA诱导的凋亡的两种药物：1)仅DMSO(媒介物对照)，2)BX795(1uM，Invivogen)，3)Z-VAD-FMK(50μM，R&D Systems)，和4)BX795和Z-VAD-FMK。在流动48小时后分析细胞。用可固定活力染料eFluor 780(eBiosciences)对T细胞进行染色，并使用LSR II(BD Biosciences)和FlowJo v.9对T细胞进进行分析。

结果

图18、图27、图32和图33中示出了用质粒DNA转染的T细胞所经受的毒性的代表性示例。图86中示出了由细胞计数得到的活力。在添加先天免疫途径抑制剂后，经历死亡的T细胞的百分比降低。举例而言，图20示出了用两种不同抑制剂处理的T细胞培养物的凋亡减少的图示。

实施例7：具有与基因组区域的重组臂、包含至少一种工程化抗原受体的未甲基化多核酸

可以如图21中所示对多核酸进行修饰。为了确定未甲基化的多核酸是否可降低由外源质粒DNA诱导的毒性并改善基因组工程化，可以采用以下实验实例。为了开始大量制备，挑取含有同源重组靶向载体的细菌菌落，并将该菌落接种在含有卡那霉素(1:1000)的5mL LB肉汤中，并使其在37℃下生长4-6小时。然后将起子培养物添加至含有卡那霉素的250mL LB肉汤的较大培养物中，并在37℃下在SssI酶的存在下生长12-16小时。使用HiSpeed Plasmid Maxi试剂盒(Qiagen)按照制造商的方案进行大量制备，但有一个例外。在裂解并中和制备物后，将2.5mL的内毒素毒素去除缓冲液添加至制备物中并在冰上孵育45分钟。在层流超净台中完成该制备以保持无菌性。使用Nanodrop确定制备物的浓度。

实施例8：GUIDE-Seq文库制备

从转染的、对照(未转染的)和CRISPR转染的具有携带外源TCR的微环DNA的细胞中分离基因组DNA，表10。将使用固相可逆固定化磁珠(Agencourt DNAdvance)分离的人T细胞用Covaris S200仪器剪切至500bp的平均长度，进行末端修复，进行A加尾，并与合并了8-nt随机分子指标物的半功能性衔接子连接。使用两轮巢式锚定PCR(其中引物与寡核苷酸标签互补)进行靶标富集。末端修复热循环仪程序：12℃ 15min；37℃ 15min；72℃ 15min；保持在4℃。

定位回基因组的GUIDE-Seq读取的起始位点能够使DSB定位在几个碱基对内。使用Illumina Library Quantification试剂盒的Kapa Biosystems试剂盒，按照制造商的说明书对文库进行定量。使用对每个样品运行qPCR所给出的分子数目/uL的平均数量估计值，继续将全套文库相对于1.2X 10¹⁰个分子进行归一化，除以待合并在一起以供测序的文库的数目。这将给出每个样品的按分子输入，并且还给出每个样品的按体积输入。示出了通过GUIDE-Seq评估的由截短gRNA引导的三种RGN的中靶和脱靶位点的定位读取。在所有情况下，显示出了靶位点序列，前间区序列在x轴的左侧而PAM序列在x轴的右侧。根据Illumina的标准方案将文库变性并加载到Miseq上，以便采用Illumina Miseq Reagent Kit V2–300循环(2x 150bp配对末端)进行测序。图76A和图76B示出了代表性GUIDE-Seq实验的数据。

实施例9：腺病毒血清型5突变蛋白质的生成

对突变cDNA(表8)进行密码子优化，并通过整合DNA技术(IDT)将其合成为gBlock片段。将合成的片段亚克隆至mRNA生产载体中以用于体外mRNA合成。

表8：腺病毒蛋白质的突变cDNA序列

实施例10.对TIL的基因组工程化以敲除PD-1、CTLA-4和CISH

将来自符合条件的IIIc-IV期癌症患者的合适的肿瘤切除并切成3–5mm²的小碎片，并置于含有生长培养基和高剂量(HD)IL-2的培养板或小培养瓶中。在此“预快速扩充方案(pre-rapid expansion protocol)”(pre-REP)阶段，初始将TIL扩充3-5周，达到至少50×10⁶个细胞。使用Neon Transfection System(100uL或10ul试剂盒，Invitrogen，LifeTechnologies)对TIL进行电穿孔。使TIL沉淀并用T缓冲液洗涤一次。对于10ul尖端，将TIL以2x 10⁵个细胞的密度重悬浮在10μL T缓冲液中，而对于100ul尖端，将TIL以3x 10⁶个细胞的密度重悬浮在100ul T缓冲液中。然后使用15ug Cas9mRNA和10-50ug PD-1、CTLA-4和CISH gRNA-RNA(100mcl尖端)以1400V、10ms、3个脉冲对TIL进行电穿孔。转染后，将TIL以1000个细胞/μl接种在不含抗生素的培养基中，并在30℃、5％CO₂下孵育24hr。24hr恢复后，可将TIL转移至含抗生素的培养基中，并在37℃、5％CO₂下进行培养。

然后通过在PBMC饲养细胞和IL-2的存在下使用抗CD3刺激TIL，使细胞在两周内经受快速扩充方案(REP)。对扩充的TIL(当前为数十亿个细胞)进行洗涤，合并，并输注到患者中，然后进行一或两个周期的HD IL-2治疗。在TIL转移之前，可采用使用环磷酰胺(Cy)和氟达拉滨(Flu)的预备方案治疗患者，该预备方案短暂地消耗宿主淋巴细胞，从而为输注的TIL“腾出空间(making room)”，并去除细胞因子汇集和调节性T细胞以便促进TIL存续。受试者经30分钟接受其自身的修饰TIL细胞的输注，并留在医院中以监测不良事件，直到他们从治疗中恢复。图102A和图102B示出了两个不同受试者的TIL的细胞扩充。图103A和图103B示出了用CRISPR系统和抗PD-1指导物进行了电穿孔并在添加饲养细胞(A)或不添加饲养细胞(B)的情况下进行了培养的TIL的细胞扩充。

表9.内源检查点总结

表10工程化T细胞受体(TCR)

表11酿脓链球菌Cas9(SpCas9)

实施例11：gRNA修饰

修饰的指导RNA的设计和构建：

使用CRISPR设计程序(Zhang Lab，MIT 2015)，针对所需的基因区域设计指导RNA(gRNA)。基于由脱靶位置所确定的最高排名值来选择多种gRNA(在表12中示出)。将靶向PD-1、CTLA-4和CISH基因序列的gRNA修饰成含有3硫代磷酸2-O-甲酯添加，图44和图59。

实施例12：rAAV靶向载体构建和病毒产生

通过同源臂的DNA合成和mTCR表达盒的PCR扩增来产生图138中描述的靶向载体。通过限制酶消化并连接到pAAV-MCS骨架质粒(Agilent)中AAV-2ITR序列的两个拷贝之间来克隆合成的片段和mTCR盒，以促进病毒包装。将连接的质粒转化到One Shot TOP10化学感受态大肠杆菌(Thermo fisher)中。使用EndoFree Plasmid Maxi试剂盒(Qiagen)从细菌中纯化每种载体的1mg质粒DNA，并送至Vigene Biosciences，MD USA，以用于产生传染性rAAV。测定纯化的病毒的滴度，每ml超过1x10¹³个病毒基因组拷贝，并制备冷冻储备物。

实施例13：采用rAAV的T细胞感染

以每个细胞1x10⁶个基因组拷贝/病毒颗粒的感染复数(MOI)，用纯化的rAAV感染人T细胞。在含有10％人AB血清(Sigma)、300单位/ml人重组IL-2、5ng/ml人重组IL-7和5ng/ml人重组IL-15(Peprotech)的X-VIVO15培养基(Lonza)中稀释适当体积的病毒。在用CRISPR试剂进行电穿孔后2小时，将稀释的病毒添加至6孔培养皿中的T细胞。将细胞在30℃下在具有5％CO₂的潮湿培养箱中孵育大约18小时，然后用如上所述的无病毒新鲜培养基替换含有病毒的培养基。将T细胞继续在37℃下培养另外14天，在此期间在常规时间点分析细胞，以通过流式细胞术测量mTCR表达，图151、图152、图153，并通过数字小液滴PCR(ddPCR)测量mTCR表达盒向T细胞DNA中的整合，图145A、图145B、图147A、图147B、图148A、图148B、图149、图150A和图150B。

实施例14：进入人T细胞中的mTCR盒的ddPCR检测

使用位于mTCR盒内的正向引物和位于基因组DNA区域内的右侧同源臂外部的反向引物，通过ddPCR检测并量化mTCR表达盒向T细胞靶基因座中的***。使用制造商指定的条件，用ddPCR supermix(BIO-RAD，Cat-no#186-3024)进行所有PCR反应。使用以下PCR循环条件在20μl总体积的小液滴内进行PCR反应：1个循环的96℃ 10分钟；40个循环的96℃ 30秒、55℃-61℃ 30秒、72℃ 240秒；1个循环的98℃ 10分钟。使用Quantasoft(BIO-RAD)分析数字PCR数据。

实施例15：单细胞RT-PCR

通过单细胞实时RT-PCR评估培养物中单个T淋巴细胞中的TCR敲入表达。收集来自CRISPR(CISH KO)/rAAV工程化细胞的单细胞内容物。简言之，用来自Ambion Single Cell-to-CT试剂盒(Life Technologies，Grand Island，NY)的裂解缓冲液填充预灭菌的玻璃电极，然后用其获得培养物中淋巴细胞的全细胞膜片。通过施加负压将细胞内的内容物(约4-5μl)吸入膜片移液管的尖端，然后将其转移至不含RNA酶/DNA酶的管中。通过添加单细胞DNA酶I/单细胞裂解溶液使每个管中的体积达到10μl，然后将该内容物在室温下孵育5分钟。在通过在热循环仪中进行逆转录(25℃ 10分钟，42℃ 60分钟，85℃ 5分钟)而合成cDNA后，按照试剂盒的说明书使TCR基因表达引物与预扩增反应混合物混合(95℃ 10分钟，14个循环的95℃ 15秒，60℃ 4分钟，和60℃ 4分钟)。将来自预扩增阶段的产物用于实时RT-PCT反应(50℃ 2分钟，95℃ 10分钟，以及40个循环的95℃ 5秒和60℃ 1分钟)。通过在含有1μl/ml溴化乙锭的3％琼脂糖凝胶上电泳来分离来自实时RT-PCR的产物。

结果

单细胞RT-PCR数据显示，在CRISPR和rAAV修饰后，T淋巴细胞在电穿孔和转导后第7天以25％(图159A)表达外源TCR，图156、图157A、图157B、图158和图159B。

实施例16：GUIDE-Seq文库制备

从转染的、对照(未转染的)和CRISPR转染的具有携带外源TCR的rAAV的细胞中分离基因组DNA。比较利用8pm dsTCR供体或16pmol dsTCR供体进行的转导。将使用固相可逆固定化磁珠(Agencourt DNAdvance)分离的人T细胞用Covaris S200仪器剪切至500bp的平均长度，进行末端修复，进行A加尾，并与合并了8-nt随机分子指标物的半功能性衔接子连接。使用两轮巢式锚定PCR(其中引物与寡核苷酸标签互补)进行靶标富集。末端修复热循环仪程序：12℃15min；37℃ 15min；72℃ 15min；保持在4℃。

定位回基因组的GUIDE-Seq读取的起始位点能够使DSB定位在几个碱基对内。使用Illumina Library Quantification试剂盒的Kapa Biosystems试剂盒，按照制造商的说明书对文库进行定量。使用对每个样品运行qPCR所给出的分子数目/uL的平均数量估计值，继续将全套文库相对于1.2X 10¹⁰个分子进行归一化，除以待合并在一起以供测序的文库的数目。这给出了每个样品的按分子输入，并且还给出了每个样品的按体积输入。示出了通过GUIDE-Seq评估的由截短gRNA引导的三种RGN的中靶和脱靶位点的定位读取。在所有情况下，显示出了靶位点序列，前间区序列在x轴的左侧而PAM序列在x轴的右侧。根据Illumina的标准方案将文库变性并加载到Miseq上，以便采用Illumina Miseq Reagent Kit V2-300循环(2x 150bp配对末端)进行测序。图154示出了代表性GUIDE-Seq实验的数据。

表12.靶向PD-1、CTLA-4、AAVS1或CISH基因的经修饰gRNA的序列表。

表13.载体构建体