阅读说明：本技术 用于包封和可扩展递送农用化学品的组合物和方法 (Compositions and methods for encapsulated and scalable delivery of agrochemicals ) 是由 A·H·沙克尔 S·佐莫罗迪 J·T·弗兰克 Z·G·戴维斯 P·波尔塔赫里 于 2018-04-30 设计创作，主要内容包括：本公开总体上涉及用于包封和递送农业化合物的基于无核细胞的平台。本文公开了用于在无染色体和/或无核细胞内稳定靶向递送农业化合物的组合物。本公开还提供了改善无染色体和/或无核细胞中农业化合物的包封和保留的方法。(The present disclosure relates generally to an anucleated cell-based platform for encapsulating and delivering agricultural compounds. Disclosed herein are compositions for stable targeted delivery of agricultural compounds within chromosome-free and/or anucleate cells. The present disclosure also provides methods of improving the encapsulation and retention of agricultural compounds in chromosome-free and/or anucleated cells.)

用于包封和可扩展递送农用化学品的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年10月10日提交的美国临时申请第62/570,368号和2017年4月28日提交的美国临时申请第62/491,608号的优先权的权益，每个临时申请特此通过引用整体并入。

技术领域

本公开总体上涉及用于将农业化合物包封在无染色体和/或无核细胞中的平台、组合物和方法。本公开提供了包封在无染色体和/或无核细胞中的农业化合物的可扩展递送(scalable delivery)。同样，本文公开了用于包封农业化合物并以可扩展方式将其递送至靶标的方法。

关于序列表的声明

与本申请相关联的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并特此通过引用并入本说明书中。含该序列表的文本文件的名称为AGRO_002_00WO_SeqList_ST25.txt。文本文件大约63.8KB，创建于2018年4月27日，并且经由EFS-Web以电子方式提交。

背景技术

预计到2050年世界人口将增长超过90亿，人类社会将面临是否能够养活人民的最大挑战。***粮食及农业组织(FAO)估计，粮食生产必须增加80％才能与人口增长同步，预计将来自产量以及每年可以在同一块土地上种植作物的次数的增加。预计只有20％的新粮食生产将来自于农用地的扩张。为了迎接未来的挑战，需要全球努力增加未来的作物收成和粮食生产。灭害剂在农业和粮食生产方面起到重要作用用以防止大的农作物损失。灭害剂可以通过防治有害生物，诸如昆虫、啮齿动物、杂草、细菌、霉菌和真菌并且通过增加产量和每年可以在同一块土地上种植作物的次数来帮助生产粮食。

然而，存在关于灭害剂对人类健康和周围环境的负面影响的持续关注。灭害剂对人类有潜在毒性并且根据人体暴露的量和方式，具有短期和长期健康影响。一些灭害剂可以在土壤和水中保留多年，这样可使环境污染加剧且更加有害。因暴露于灭害剂而面临最大健康风险的人是那些在工作时、在其家中或花园中接触灭害剂的人。

不仅是灭害剂，而且更普遍的是，农用化学品诸如灭害剂、除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂，都具有由于在喷洒时从植物上滴落或者由于在降雨期间冲刷引起的化学药品功效降低以及化学药品流失到土壤中的问题，这可能导致地下水污染、环境破坏、生物多样性的丧失、以及人类和动物健康的后果。

因此，开发一种新的农用化学品递送系统以确保靶向递送农用化学品的需求尚未得到满足。同样，还非常需要农用化学品的包封和递送平台，以维持农用化学品的生物活性，并且以一种可扩展、靶向、有成本效益的方式实现预期目标。

发明内容

本公开涉及用于包封和递送农业化合物的基于无核细胞的平台以及该平台向预期位置诸如植物或有害生物的施加。

在一些实施方案中，提供了用于包封和递送农业化合物的基于无核细胞的平台，其包括：a)完整的无核细胞，在所述细胞内具有至少一种非表达的农业化合物。在实施方案中，基于无核细胞的平台还包括：b)至少一种农业上可接受的载剂。在实施方案中，所述完整的无核细胞源自原核细胞。在实施方案中，所述完整的无核细胞是细菌来源的微细胞(minicell)。在实施方案中，所述完整的无核细胞是由革兰氏阴性细菌属产生的。在实施方案中，所述完整的无核细胞是由选自由以下组成的组的细菌属产生的：埃希氏杆菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺菌属(Shigella)、假单胞菌属(Pseudomonas)和土壤杆菌属(Agrobacterium)。在实施方案中，所述完整的无核细胞是由选自由以下组成的组的细菌种产生的：大肠杆菌(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。在实施方案中，所述完整的无核细胞是由P678-54大肠杆菌亲本细菌细胞产生的。在实施方案中，所述完整的无核细胞是由***属产生的。在实施方案中，所述完整的无核细胞是由选自由以下组成的组的细菌属产生的：芽孢杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和乳杆菌属(Lactobacillus)。在实施方案中，所述完整的无核细胞是由选自由以下组成的组的细菌种产生的：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。在实施方案中，所述完整的无核细胞是由WprA蛋白酶缺陷的亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞。在实施方案中，所述完整的无核细胞是由蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞。在实施方案中，所述完整的无核细胞是由蛋白酶缺陷型KO7枯草芽孢杆菌亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞。在实施方案中，所述完整的无核细胞是由选自由以下组成的组的蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞：(1)CU403,DIVIVA；(2)CU403,DIVIVB,SPO-；(3)CU403,DIVIVB；及(4)CU403,DIVIVB1，其中至少一个蛋白酶编码基因已经被抑制、缺失或沉默。在实施方案中，所述完整的无核细胞是由蛋白酶缺陷型亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞。在实施方案中，所述完整的无核细胞是由有Lon和OmpT蛋白酶缺陷的亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞。在实施方案中，所述完整的无核细胞是蛋白酶缺陷型大肠杆菌亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞。在实施方案中，所述完整的无核细胞是由选自由以下组成的组的蛋白酶缺陷型大肠杆菌亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞：BL21、BL21(DE3)、BL21-AI、LPS-修饰的BL21(DE3)和B8。在实施方案中，所述完整的无核细胞源自真核细胞。

在一些实施方案中，提供了用于包封和递送农业化合物的基于无核细胞的平台，其包括完整的无核细胞，在所述细胞内具有至少一种非表达的农业化合物。在实施方案中，所述至少一种非表达的农业化合物选自由以下组成的组：灭害剂、除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、肥料和激素或化学生长剂。在实施方案中，所述至少一种非表达的农业化合物是灭害剂。在实施方案中，所述至少一种非表达的农业化合物是除草剂。在实施方案中，所述至少一种非表达的农业化合物是磺酰脲类除草剂。在实施方案中，所述至少一种非表达的农业化合物是甲酰胺磺隆。在实施方案中，所述至少一种非表达的农业化合物是杀昆虫剂。在实施方案中，所述至少一种非表达的农业化合物是新烟碱类杀昆虫剂。在实施方案中，所述至少一种非表达的农业化合物是噻虫胺。在实施方案中，所述至少一种非表达的农业化合物是酮-烯醇类杀昆虫剂。在实施方案中，所述至少一种非表达的农业化合物是螺虫乙酯。在实施方案中，所述至少一种非表达的农业化合物是杀真菌剂。在实施方案中，所述至少一种非表达的农业化合物是嗜球果伞素杀真菌剂。在实施方案中，所述至少一种非表达的农业化合物是唑菌胺酯。在实施方案中，所述至少一种非表达的农业化合物是杀线虫剂。在实施方案中，其中所述至少一种非表达的农业化合物是肥料。在实施方案中，所述至少一种非表达的农业化合物是选自由以下组成的组的肥料：氮肥、磷肥和钾肥。在实施方案中，所述至少一种非表达的农业化合物是激素或化学生长剂。在实施方案中，所述至少一种非表达的农业化合物是选自由以下组成的组的激素或化学生长剂：脱落酸、生长素、细胞***素、乙烯、赤霉素、油菜素类固醇、水杨酸、茉莉酮酸酯、聚胺、一氧化氮、独脚金内酯、卡里金(karrikin)和三十烷醇。

在一些实施方案中，提供了用于包封和递送农业化合物的基于无核细胞的平台，其包括完整的无核细胞，在所述细胞内具有至少一种非表达的农业化合物。在实施方案中，所述无核细胞在其表面上表达多肽。在实施方案中，所述无核细胞在其表面上表达异源多肽。在实施方案中，所述无核细胞表达融合蛋白。在实施方案中，所述无核细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个植物细胞粘附部分。在实施方案中，所述无核细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个植物细胞粘附部分，其中所述表面表达部分包含跨膜结构域并且选自由以下组成的组：冰成核蛋白(INP)、BrkA(博德特氏菌血清抗性杀伤蛋白(Bordetella serum-resistancekilling protein))和AIDA(扩散粘附中涉及的粘附素(Adhesion Involved in DiffuseAdherence))。在实施方案中，所述无核细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个植物细胞粘附部分，其中所述表面表达部分包含输出细菌蛋白并且选自由以下组成的组：LamB(λ受体)、OprF(铜绿假单胞菌外膜蛋白F)、OmpA(外膜蛋白A)、Lpp(脂蛋白)、MalE(麦芽糖结合蛋白)、PhoA(碱性磷酸酶)、Bla(TEM-1B-内酰胺酶)、F1或M13主要外壳蛋白(源自基因VIII)及F1或M13次要外壳蛋白(基因III)。在实施方案中，所述无核细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个植物细胞粘附部分，其中所述植物细胞粘附部分包含碳水化合物结合模块。在实施方案中，所述无核细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个植物细胞粘附部分，其中所述植物细胞粘附部分包含选自由以下组成的组的碳水化合物结合模块：纤维素结合结构域、木聚糖结合结构域、几丁质结合结构域和木质素结合结构域。在实施方案中，所述无核细胞在其表面上表达增加与植物表面的粘附的多肽。在实施方案中，所述无核细胞在其表面上表达植物粘附多肽。在实施方案中，所述无核细胞表达在其表面上展示的碳水化合物结合模块。在实施方案中，所述无核细胞表达在其表面上展示的异源碳水化合物结合模块。在实施方案中，所述无核细胞表达在其表面上展示的纤维素结合结构域。在实施方案中，所述无核细胞表达在其表面上展示的异源纤维素结合结构域。

在一些实施方案中，提供了用于包封和递送农业化合物的基于无核细胞的平台，其包括完整的无核细胞，在所述细胞内具有至少一种非表达的农业化合物。在实施方案中，基于无核细胞的平台被配制成液体、干燥组合物、粉末、粒剂、种子包衣、浇灌剂、犁沟内组合物或叶面喷雾剂。

在一些实施方案中，本公开提供了一种将农业化合物递送至某一位置的方法，其包括：将基于无核细胞的平台施加于预期位置。在实施方案中，将基于无核细胞的平台施加于植物，其中所述植物包括种子、茎、花、果实、叶、根或根茎。在实施方案中，一种将农业化合物递送至作物的方法包括将基于无核细胞的平台施加于作物或接近所述作物的位置。

在一些实施方案中，基于无核细胞的平台包含经溶剂处理的无核细胞。在一些实施方案中，根据权利要求58所述的基于无核细胞的平台，其中所述溶剂是乙醇、DMSO、聚乙二醇或甘油。在实施方案中，除所述溶剂外，还用一种剂处理无核细胞。在实施方案中，所述剂是固定剂、防腐剂或交联剂。在实施方案中，所述交联剂是戊二醛、甲醛、京尼平(genipin)或表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallat)。在实施方案中，所述溶剂增加农业化合物进入无核细胞的溶解性。在实施方案中，所述溶剂增加农业化合物进入无核细胞的溶解性，并且其中所述溶剂增加农业化合物进入无核细胞的扩散。在实施方案中，所述剂将农业化合物捕获在无核细胞的膜内。在实施方案中，所述剂将农业化合物捕获在无核细胞的膜内，并且其中所述剂使农业化合物与无核细胞交联，从而提高无核细胞的稳定性。在实施方案中，所述剂增强农业化合物进入无核细胞的装载容量。在实施方案中，所述剂增强农业化合物进入无核细胞的装载容量，并且其中所述剂控制农业化合物从无核细胞的释放速率。

在一些实施方案中，所述无核细胞表现出所述至少一种非表达的农业化合物的控释速率。在实施方案中，所述无核细胞表现出所述至少一种非表达的农业化合物的控释速率，并且其中所述至少一种非表达的农业化合物以稳定速率释放。在实施方案中，所述无核细胞表现出所述至少一种非表达的农业化合物的初期突释。在实施方案中，所述无核细胞表现出所述至少一种非表达的农业化合物的初期突释，所述突释包括释放所述至少一种非表达的农业化合物的至少约40％。在实施方案中，所述无核细胞表现出所述至少一种非表达的农业化合物的控释速率，并且其中所述控释速率是每天少于40％、少于30％、少于20％、少于15％、少于10％或少于5％的所述至少一种非表达的农业化合物从所述无核细胞中释放。在实施方案中，所述控释速率是每天少于15％的所述非表达的农业化合物从所述无核细胞中释放。在实施方案中，所述控释速率是每天少于10％的所述非表达的农业化合物从所述无核细胞中释放。在实施方案中，所述控释速率是每天约10％的所述非表达的农业化合物从所述无核细胞中释放。

附图说明

图1说明了用于minC敲除以产生蛋白酶缺陷型微细胞的示例性细菌微细胞诱导载体。为pUC57载体***有重组DNA***物，该重组DNA***物包含minC基因的5’末端核苷酸序列，带cat启动子的氯霉素抗性基因(CmR)，及minC基因的3’末端核苷酸序列。将侧接minC基因的5’和3’末端的发夹环***所述***物中以终止对其中整合了该***物的基因组中的其它相邻基因的转录调控。

图2说明了用于minD敲除以产生蛋白酶缺陷型微细胞的示例性细菌微细胞诱导载体。为pUC57载体***有重组DNA***物，该重组DNA***物包含minD基因的5’末端核苷酸序列，带cat启动子的氯霉素抗性基因(CmR)，及minD基因的3’末端核苷酸序列。将侧接minD基因的5’和3’末端的发夹环***所述***物中以终止对其中整合了该***物的基因组中的其它相邻基因的转录调控。

图3说明了用于minC/minD敲除以产生蛋白酶缺陷型微细胞的示例性细菌微细胞诱导载体。为pUC57载体***有重组DNA***物，该重组DNA***物包含minD基因的5’末端，带cat启动子的氯霉素抗性基因(CmR)，及minC基因的3’末端。将侧接minD基因的5’末端和minC基因的3’末端的发夹环***所述***物中以终止对其中整合了该***物的基因组中的其它相邻基因的转录调控。

图4A说明了具有用于在微细胞表面展示侧接6x His、GFP纳米抗体(nanobody)和Myc标签的CBM(碳水化合物结合模块)蛋白的AIDA-1表面表达系统的示例性pAIDA-1-CBM载体。图4B说明了示例性pAIDA-1脂肪酶表面表达盒，该表达盒包含编码AIDA-1自主转运蛋白信号肽、GFP纳米抗体、CBM和AIDA-1自主转运蛋白易位结构域的核苷酸序列，具有包括6xHis标签和Myc标签在内的标签以及包括HRV3C和TEV在内的两个蛋白酶裂解位点。

图5A说明了具有用于在微细胞表面展示侧接6x His、GFP纳米抗体和Myc标签的脂肪酶蛋白的AIDA-1表面表达系统的示例性pGEX-6P-1AIDA-1-CBM载体。图5B说明了示例性AIDA-1CBM表面表达盒，该表达盒包含编码AIDA-1自主转运蛋白信号肽、GFP纳米抗体、CBM和AIDA-1自主转运蛋白易位结构域的核苷酸序列，具有包括6x His标签和Myc标签在内的标签以及包括HRV3C和TEV在内的两个蛋白酶裂解位点。

图6A说明了具有用于在微细胞表面展示侧接6x His、GFP纳米抗体和Myc标签的CBM蛋白的血清抗性自主转运蛋白BrkA表面表达系统的示例性pGEX-6P-1Brk-CBM载体。图6B说明了示例性Brk-CBM表面表达盒，该表达盒包含编码Brk自主转运蛋白信号肽、GFP纳米抗体、CBM和Brk自主转运蛋白易位结构域的核苷酸序列，具有包括6x His标签和Myc标签在内的标签以及包括HRV3C和TEV在内的两个蛋白酶裂解位点。

图7A说明了具有用于在微细胞表面展示CBM蛋白的冰成核蛋白InaK表面表达系统的示例性pGEX-6P-1Inak-CBM载体。编码CBM的核苷酸序列在其5’末端与Inak连接并且在其3’末端与6x His、GFP纳米抗体和Myc标签连接。图7B说明了示例性Inak-CBM表面表达盒，该表达盒包含编码Inak自主转运蛋白易位结构域、CBM和GFP纳米抗体的核苷酸序列，具有包括6x His标签和Myc标签在内的标签以及包括HRV3C和TEV在内的两个蛋白酶裂解位点。

图8A-D显示了微细胞表面上与AIDA-1接头蛋白融合的CBM蛋白的His标签染色结果。微细胞是非透化(图8A和图8C)或透化的(图8B和图8D)。相比于没有重组AIDA-1CBM表达载体的对照微细胞(图8C和图8D)，由转化的微细胞(图8A和图8B)表面上的重组融合CBM表达载体表达融合CBM。图8A显示了由非透化的蛋白酶缺陷型微细胞表达的CBM的His标签染色。图8B显示了由透化的蛋白酶缺陷型微细胞表达的CBM的His标签染色。图8C显示由非透化对照微细胞没有或极少表达CBM。图8D也显示由透化对照微细胞没有或极少表达CBM。箭头指示表达的CBM。

图9A-B显示了在两个不同温度下用戊二醛处理的微细胞的光密度以显示持续三周的细胞保留量。图9A说明在25℃下将微细胞用1％(v/v)戊二醛处理和不进行处理(0％(v/v)戊二醛)持续15天。图9B说明与未处理的对照相比，在37℃下将微细胞用三种不同浓度的戊二醛(5％、1％和0.25％(v/v)处理持续15天。

图10A-B显示了从作为对照的无蛋白酶的野生型菌株(图10A)和含有pGEX-InaK-CBM的无蛋白酶的菌株(图10B)获得的蛋白酶缺陷型微细胞的CBM微晶纤维素测定结果。在图10A和图10B中，左上方是以40x物镜获得的无蛋白酶的野生型细胞的明视野图像。右上方是为了使纤维素上细胞内FDA(荧光素二乙酸酯)的存在可视化而用蓝色LED激发的细胞的图像。左下方是为了使纤维素的存在可视化而用绿色LED激发的细胞的图像，有PI(碘化丙啶)吸附到细胞表面并穿透到存在的任何细胞的细胞膜内。右下方是全部三种成像条件的重叠图像。箭头指示微细胞上染色的纤维素。

图11A显示了用于甲酰胺磺隆进行总包封分析的标准曲线。该标准曲线是由0至150微克甲酰胺磺隆生成的。用三个不同的起始浓度一式三份进行三次单独的甲酰胺磺隆实验。图11B显示了在三个不同的起始浓度下甲酰胺磺隆包封的量。图11C显示了甲酰胺磺隆包封分数和质量分数的比率。

图12A显示了用于螺虫乙酯进行总包封分析的标准曲线。该标准曲线是由0至300微克螺虫乙酯生成的。用三个不同的起始浓度一式三份进行三次单独的螺虫乙酯实验。图12B显示了在三个不同的起始浓度下螺虫乙酯包封的量。图12C显示了螺虫乙酯包封分数和质量分数的比率。

图13A显示了用于唑菌胺酯进行总包封分析的标准曲线。该标准曲线是由0至250微克唑菌胺酯生成的。用三个不同的起始浓度一式三份进行三次单独的唑菌胺酯实验。图13B显示了在三个不同的起始浓度下唑菌胺酯包封的量。图13C显示了唑菌胺酯包封分数和质量分数的比率。

图14A显示了用于噻虫胺进行总包封分析的标准曲线。该标准曲线是由0至150微克噻虫胺生成的。用三个不同的起始浓度一式三份进行三次单独的噻虫胺实验。图14B显示了在三个不同的起始浓度下噻虫胺包封的量。图14C显示了噻虫胺包封分数和质量分数的比率。

图15A说明了用于包封和递送农业化合物诸如灭害剂的基于无核细胞的平台。该平台可用于使用膜蛋白和目标蛋白的融合蛋白以靶向受试者诸如植物来进行农业化合物的控释与靶向递送。图15B说明了产生活性递送媒介物的方法。通过以下方式产生活性递送媒介物：1)用编辑为产生微细胞的DNA转化细菌并使其发酵，2)诱导微细胞产生，3)分离酶包被的微细胞，并且4)孵育微细胞以包封活性农业化合物。

图16说明了用于从具有WprA蛋白酶的细菌菌株进行蛋白酶WprA敲除以产生蛋白酶缺陷型微细胞的示例性pUC18载体。为pUC18载体***有重组DNA***物，该重组DNA***物包含WprA核苷酸序列基因的5’末端核苷酸序列，带cat启动子的氯霉素抗性基因(CmR)，及WprA基因的3’末端。将侧接WprA基因的5’和3’末端的发夹环***所述***物中以终止对其中整合了该***物的基因组中的其它相邻基因的转录调控。

图17A-B显示了大肠杆菌中微细胞形成(图17A)和其中敲除和/或去除了minC、minD和/或minC/D基因的蛋白酶缺陷型无核微细胞(图17B)的扫描电子显微镜图像。如图17B所示，示例性微细胞的大小小于1微米。

图18A说明了用于在有T7 RNA聚合酶的蛋白酶缺陷型菌株中表达目标蛋白的示例性pET-9a载体。图18B说明了用于在无T7 RNA聚合酶的蛋白酶缺陷型菌株中表达目标蛋白的示例性pGEX-6P-1载体。

具体实施方式

存在许多施加于受试者的农业化合物的脱靶漂移的原因。例如，植物的疏水性蜡质表面是农业化合物诸如农用化学品的靶向递送的主要障碍。高达90％施加的灭害剂在环境中流失或无法到达其目标。这些损失主要是由排放以及浸出、蒸发、沉积、被冲洗掉、光解、水解和微生物活性引起的。(Nuruzzaman,M.、Rahman,M.M.、Liu,Y.和Naidu,R.(2016).Journal of Agricultural and Food Chemistry,64(7),1447–1483)。尤其是，农业化合物的挥发是一个普遍问题，由于广泛使用特别易于挥发的农业化合物，最近加剧了这一问题。

本公开提供了用于农业化合物的包封和递送的新平台。最常用的农业化合物形式是用于为植物提供营养素的灭害剂、除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、肥料。虽然农业化合物是传统上合成的化合物，但目前在农业行业中非常感兴趣的是开始以其生物来源的对应物代替这些合成化合物中的一些。这些新的生物来源的农业化合物可以大致分类为生物防治剂和生物刺激剂。这些生物农业化合物的一些实例包括激素和生物化学生长剂。这些活性剂包括脱落酸(参与胁迫下的休眠机制)、生长素(对植物生长产生积极影响)、细胞***素(影响细胞***和成芽)、ACC脱氨酶(降低乙烯的抑制性生长作用)、赤霉素(通过使茎延长和刺激花粉管的生长对植物生长产生积极影响)和许多其它活性剂(油菜素类固醇、水杨酸、茉莉酮酸酯、植物肽激素、聚胺、一氧化氮、独脚金内酯、卡里金和三十烷醇)，这些用于正向和负向调控植物的生长。在一些实施方案中，本文公开的基于无核细胞的平台可以包封农业化合物并且以可扩展、靶向、有经济效益的方式递送农业化合物。

定义

本公开总体上涉及用于将目标酶固定在无染色体和/或无核细胞的表面上的组合物和方法。具体而言，本公开提供了用于产生在其表面上具有固定的酶活性多肽的微细胞的组合物和方法及其用途。

在一些实施方案中，本公开提供了用于固定在无染色体和/或无核细胞表面上展示的酶活性多肽的组合物和方法，所述酶活性多肽包括但不限于脂肪酶、磷脂酶、转酰酶、转氨酶、果胶酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、角质酶、酯酶、酰化酶、转化酶、异构酶、裂解酶、葡糖苷酶、氧化还原酶、转移酶、连接酶和酰胺酶。在其它实施方案中，酶活性多肽包括脂肪酶、葡萄糖异构酶、α淀粉酶、纤维素酶(内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶)、β淀粉酶、果胶裂解酶、异构酶、蛋白酶、转谷氨酰胺酶、去饱和酶、过氧化物酶、脂肪氧合酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、酪氨酸酶、脲酶、脱氢酶(例如醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、乙醛脱氢酶、醛脱氢酶、丙酮酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶)、木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶和漆酶。另外，酶活性多肽还包括淀粉葡糖苷酶、支链淀粉酶、环糊精-糖基转移酶、果胶甲基酯酶、葡萄糖氧化酶、乳糖酶、β-葡聚糖酶、乙酰乳酸脱羧酶、果胶酸裂解酶、腈水解酶和淀粉葡糖苷酶。在一些实施方案中，酶活性多肽是脂肪酶。在一些实施方案中，酶活性多肽是葡萄糖异构酶。

在一些实施方案中，无染色体和/或无核细胞源自真细菌、古细菌和/或真核细胞。在其它实施方案中，在其表面上具有固定的酶的微细胞可以用于农业、动物饲料、食品、饮料、工业酶、纺织品、纸浆和造纸、生物燃料、发酵、生物修复、生物能源、电子、国防、生物能源、家庭护理、制药和其它用途。

定义

虽然认为以下术语被本领域普通技术人员很好地理解，但是提出以下定义以利于对当前公开的主题的解释。

术语“一”或“一个(种)”是指一个或多个该实体，即可以指复数个指示物。因而，术语“一”或“一个(种)”、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。另外，除非上下文明确要求有一个要素且只有一个要素，通过不定冠词“一”或“一个(种)”提及“一个要素”并不排除存在一个以上要素的可能性。

如本文所用，术语“细胞生物”、“微生物(microorganism)”或“微生物(microbe)”应广义地理解。这些术语可以互换使用，并且包括但不限于两个原核域即细菌和古细菌，以及某些真核真菌和原生生物。

术语“原核生物”是本领域公认的，并且是指不包含细胞核或其它细胞器的细胞。通常将原核生物分类为细菌和古细菌两个域之一。古细菌域和细菌域的生物之间的确切差异是基于16S核糖体RNA中核苷酸碱基序列的基本差异。

术语“古细菌”是指疵壁菌(Mendosicute)门的一个生物分类，通常在不寻常的环境中发现，并通过几个标准与其余原核生物区别开来，所述标准包括核糖体蛋白的数量和细胞壁中胞壁酸的缺乏。根据ssrRNA分析，古细菌由两个系统发育不同的类别组成：泉古菌门(Crenarchaeota)和广古菌门(Euryarchaeota)。根据古细菌的生理学特征，可以将其分类为三种类型：产甲烷菌(产生甲烷的原核生物)；极度嗜盐菌(生活在极高盐(NaCl)浓度下的原核生物；和极度(超)嗜热菌(生活在极高温度下的原核生物)。这些原核生物除了使其与细菌区别开来的统一古细菌特征(即细胞壁中无胞壁质，酯连接的膜脂质等)外，还表现出可以使其适应特定生境的独特结构或生物化学属性。泉古菌门主要由超嗜热硫依赖性原核生物组成，并且广古菌门含有产甲烷菌和极度嗜盐菌。

“细菌”或“真细菌”是指原核生物域。细菌包括至少11个不同的类别，如下所示：(1)革兰氏阳性(革兰氏+)细菌，主要分为两个亚门：(1)高G+C类(放线菌(Actinomycete)、分枝杆菌(Mycobacteria)、微球菌(Micrococcus)等)(2)低G+C类(芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌(Clostridia)、乳杆菌(Lactobacillus)、葡萄球菌(Staphylococci)、链球菌(Streptococci)、支原体(Mycoplasma))；(2)变形菌，例如紫色光合+非光合革兰氏阴性细菌(包括大多数“常见”的革兰氏阴性细菌)；(3)蓝细菌(Cyanobacteria)，例如产氧光合自养微生物；(4)螺旋菌(Spirochete)及相关种；(5)浮霉菌(Planctomyce)；(6)拟杆菌(Bacteroide)、黄杆菌(Flavobacteria)；(7)衣原体(Chlamydia)；(8)绿色硫细菌；(9)绿色非硫细菌(也是厌氧光合自养微生物)；(10)耐辐射微球菌及其亲缘细菌；(11)热袍菌(Thermotoga)和嗜热栖热腔菌(Thermosipho thermophiles)。

“真核生物”是指其细胞含有细胞核和封闭在细胞膜内的其它细胞器的生物。真核生物属于真核域(Eukarya)或真核总界(Eukaryota)。使真核细胞不同于原核细胞(上述细菌和古细菌)的定义性特征是它们具有膜结合的细胞器，尤其是细胞核，其中含有遗传物质，并且被核膜封闭。

术语“遗传修饰的宿主细胞”、“重组宿主细胞”和“重组菌株”在本文中可互换使用，并且是指已经通过本公开的克隆和转化方法遗传修饰的宿主细胞。因此，该术语包括已经遗传改变、修饰或工程改造，使其与它所来源的天然存在的生物相比表现出改变、修饰或不同的基因型和/或表型(例如，当遗传修饰影响微生物的编码核酸序列时)的宿主细胞(例如细菌、酵母细胞、真菌细胞、CHO、人细胞等)。可以理解，在一些实施方案中，该术语不但指所讨论的特定重组宿主细胞，而且还指此类宿主细胞的后代或潜在后代。

术语“野生型微生物”或“野生型宿主细胞”描述自然界中存在的细胞，即尚未经遗传修饰的细胞。在本公开中，“野生型菌株”或“野生菌株”或“野生型细胞系”是指可以产生微细胞的细胞株/系。在一些实施方案中，野生型细菌菌株和/或细胞系诸如大肠杆菌菌株p678-54和枯草芽孢杆菌菌株CU403可以产生DNA缺陷的微型细胞。产生此类微细胞的方法是本领域已知的。参见，例如，Adler等人，1967,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 57:321-326；Inselburg J,1970J.Bacteriol.102(3):642-647；Frazer 1975,Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.69:1-84,Reeve等人1973,J.Bacteriol.114(2):860-873；和Mendelson等人1974J.Bacteriol.117(3):1312-1319。

术语“基因工程改造的”可以指对宿主细胞的基因组的任何操纵(例如通过***、缺失、突变或替换核酸来进行操纵)。

术语“对照”或“对照宿主细胞”是指用于确定遗传修饰或实验处理的作用的适当对比宿主细胞。在一些实施方案中，对照宿主细胞是野生型细胞。在其它实施方案中，除了区分处理宿主细胞的遗传修饰外，对照宿主细胞在遗传上与遗传修饰的宿主细胞相同。

如本文所用，术语“等位基因”是指基因的一种或多种替代形式中的任何一种，所有等位基因均与至少一种性状或特征有关。在二倍体细胞中，给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上相应的基因座。

如本文所用，术语“基因座”(复数个基因座)是指在染色体上发现例如基因或遗传标记的一个或多个特定位置或位点。

如本文所用，术语“遗传连锁”是指在育种期间以高比率共同遗传，使其难以通过杂交分离的两种或更多种性状。

如本文所用，“重组”或“重组事件”是指染色体交叉或独立分配。

如本文所用，术语“表型”是指个体细胞、细胞培养物、生物或生物群组的可观测特征，此可观测特征是由于该个体的基因组成(即，基因型)与环境之间的相互作用而产生的。

如本文所用，当描述核酸序列或蛋白质序列时，术语“嵌合”或“重组”是指将至少两个异源多核苷酸或两个异源多肽连接成单个大分子或将至少一个天然核酸或蛋白质序列的一个或多个元件重排的核酸或蛋白质序列。例如，术语“重组”可以指两个另外分离的序列区段的人工组合，例如通过化学合成或通过基因工程技术对分离的核酸区段进行操纵。

如本文所用，“合成核苷酸序列”或“合成多核苷酸序列”是已知自然界中不存在或非天然存在的核苷酸序列。通常，此类合成核苷酸序列与任何其它天然存在的核苷酸序列相比时，将包含至少一个核苷酸差异。

如本文所用，“合成氨基酸序列”或“合成肽”或“合成蛋白”是已知自然界中不存在或非天然存在的氨基酸序列。通常，此类合成蛋白质序列与任何其它天然存在的蛋白质序列相比时，将包含至少一个氨基酸差异。

如本文所用，术语“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。该术语是指分子的一级结构，因此包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。它还包括经修饰的核酸，诸如甲基化和/或加帽核酸，含有经修饰的碱基、骨架修饰等的核酸。术语“核酸”和“核苷酸序列”可互换使用。

如本文所用，术语“基因”是指与生物学功能相关的任何DNA区段。因此，基因包括但不限于其表达所需的编码序列和/或调控序列。基因还可以包括例如形成其它蛋白质的识别序列的非表达DNA区段。基因可以从多种来源获得，包括从目标来源克隆或由已知或预测的序列信息合成，并且可以包括设计成具有所需参数的序列。

如本文所用，术语“同源”或“同源物”或“直系同源物”在本领域中是已知的，并且是指共有共同祖先或家族成员并基于序列同一性程度而确定的相关序列。术语“同源性”、“同源”、“基本上相似”和“基本上对应”在本文可互换使用。它们是指核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基的变化不影响该核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力。这些术语还指本公开的核酸片段的修饰，诸如一个或多个核苷酸的缺失或***，其相对于未修饰的初始片段，基本上不改变所得核酸片段的功能特性。因此，如本领域技术人员将认识到的那样，应理解本公开不仅仅涵盖特定的示例性序列。这些术语描述了在一个种、亚种、品种、栽培品种或品系中发现的基因与另一个种、亚种、品种、栽培品种或品系中的相应或等效基因之间的关系。为了本公开的目的，将同源序列进行比较。认为、相信或已知“同源序列”或“同源物”或“直系同源物”在功能上相关。可以通过多种方式中的任何一种来指示功能关系，包括但不限于：(a)序列同一性的程度和/或(b)相同或相似的生物学功能。优选地，指示(a)和(b)两项。同源性可以使用本领域中容易获得的软件程序来测定，诸如在CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑，1987)增刊30，7.718节，表7.71中讨论的那些程序。一些比对程序是MacVector(Oxford Molecular Ltd,Oxford,U.K.)、ALIGN Plus(Scientific and Educational Software,Pennsylvania)和AlignX(VectorNTI,Invitrogen,Carlsbad,CA)。另一个比对程序是Sequencher(Gene Codes,Ann Arbor,Michigan)，使用默认参数。

如本文所用，术语“内源”或“内源基因”是指其在宿主细胞基因组内天然存在的位置处的天然存在的基因。在本公开的上下文中，将异源启动子可操作地连接至内源基因意指将异源启动子序列经遗传学方式在该基因天然存在的位置处***现有基因前面。如本文所述的内源基因可以包括已经根据本公开的任何方法突变的天然存在的基因的等位基因。

如本文所用，术语“外源”与术语“异源”可互换使用，并且是指来自于除其天然来源以外的一些来源的物质。例如，术语“外源蛋白质”或“外源基因”是指来自非天然来源或位置且已被人工提供给生物系统的蛋白质或基因。

如本文所用，术语“核苷酸变化”是指例如核苷酸取代、缺失和/或***，如本领域所熟知的那样。例如，突变包含产生沉默取代、添加或缺失，但不改变所编码的蛋白质的特性或活性或产生蛋白质的方式的改变。

如本文所用，术语“蛋白质修饰”是指例如氨基酸取代、氨基酸修饰、缺失和/或***，如本领域所熟知的那样。

如本文所用，术语核酸或多肽的“至少一部分”或“片段”意指具有此类序列的最小尺寸特征的部分，或全长分子的任何较大片段，最多包括全长分子。本公开的多核苷酸的片段可以编码遗传调控元件的酶活性部分。遗传调控元件的酶活性部分可以通过以下方式制备：分离包含遗传调控元件的本公开多核苷酸之一的一部分并如本文所述评估活性。类似地，多肽的一部分可以是4个氨基酸，5个氨基酸，6个氨基酸，7个氨基酸，以此类推，直至全长多肽。要使用的部分的长度将取决于特定的应用。可用作杂交探针的核酸的部分可以短至12个核苷酸；在一些实施方案中，是20个核苷酸。可用作表位的多肽的部分可以短至4个氨基酸。执行全长多肽的功能的多肽部分通常将长于4个氨基酸。

变体多核苷酸还涵盖源自诱变和重组程序诸如DNA改组的序列。此类DNA改组的策略是本领域已知的。参见，例如，Stemmer(1994)PNAS 91:10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370:389-391；Crameri等人(1997)Nature Biotech.15:436-438；Moore等人(1997)J.Mol.Biol.272:336-347；Zhang等人(1997)PNAS 94:4504-4509；Crameri等人(1998)Nature 391:288-291；和美国专利第5,605,793和5,837,458号。

对于本文公开的多核苷酸的PCR扩增，可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应，以由提取自任何目标生物的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法一般是本领域熟知的，并公开于Sambrook等人(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)中。还参见Innis等人编辑(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(AcademicPress,New York)；Innis和Gelfand编辑(1995)PCR Strategies(Academic Press,NewYork)；及Innis和Gelfand编辑(1999)PCR Methods Manual(Academic Press,New York)。已知的PCR方法包括但不限于使用配对引物、嵌套引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

如本文所用，术语“引物”是指能够与扩增靶标退火，允许DNA聚合酶附着，从而在处于诱导引物延伸产物合成的条件下时，即在核苷酸和用于聚合的剂诸如DNA聚合酶的存在下并且在合适的温度和pH下用作DNA合成的起始点的寡核苷酸。为了扩增的最大效率，(扩增)引物优选为单链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在用于聚合的剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度和引物的组成(A/T与G/C含量)。一对双向引物由在DNA扩增领域诸如PCR扩增中常用的一个正向引物和一个反向引物组成。

如本文所用，“启动子”是指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。在一些实施方案中，启动子序列由近端和更远端的上游元件组成，后一种元件通常称为增强子。因此，“增强子”是可以刺激启动子活性的DNA序列，并且可以是启动子的固有元件或***以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。启动子可以整体源自天然基因，或由源自在自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成的DNA区段。本领域技术人员应理解，不同的启动子可以指导基因在不同的组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段，或响应于不同的环境条件而表达。进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全限定，因此一些变异的DNA片段可能具有相同的启动子活性。

如本文所用，短语“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组DNA构建体”在本文可互换使用。同样，“构建体”、“载体”和“质粒”在本文可互换使用。重组构建体包含核酸片段的人工组合，例如在自然界中未发现在一起的调控和编码序列。例如，嵌合构建体可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或源自相同来源但以与自然界中发现的方式不同的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可以单独使用或者可以连同载体一起使用。如果使用载体，则载体的选择取决于将用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。技术人员充分了解为了成功地转化、选择包含本公开的任何分离的核酸片段的宿主细胞并使其增殖，载体上必须存在的遗传元件。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将产生不同的表达水平和模式(Jones等人，(1985)EMBO J.4:2411-2418；DeAlmeida等人，(1989)Mol.Gen.Genetics 218:78-86)，因此，必须筛选多个事件才能获得显示出所需表达水平和模式的细胞系。可以通过DNA的Southern分析，mRNA表达的Northern分析，蛋白质表达的免疫印迹分析或表型分析等来实现此类筛选。载体可以是质粒、病毒、噬菌体、前病毒(pro-virus)、噬菌粒、转座子、人工染色体等，它们可以自主复制或者可以整合到宿主细胞的染色体中。载体也可以是不能自主复制的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、由同一链内的DNA和RNA组成的多核苷酸、多赖氨酸偶联的DNA或RNA、肽偶联的DNA或RNA、脂质体偶联的DNA等。如本文所用，术语“表达”是指功能性终产物例如mRNA或蛋白质(前体或成熟蛋白)的产生。

在该上下文中，“可操作地连接”意指根据本公开的启动子多核苷酸与另一寡核苷酸或多核苷酸的依序排列，引起所述另一多核苷酸的转录。

如本文所用，术语“展示”意指目标多肽在微细胞的外表面上暴露。以非限制性实例的方式来说，展示的多肽可以是在微细胞膜上表达的或与微细胞膜相关的蛋白质或蛋白质结构域，使得细胞外结构域或目标结构域在微细胞的外表面暴露(在微细胞的表面表达和展示，或在亲本细胞中表达以在分离/聚集的微细胞的表面展示)。在所有情况下，“展示的”蛋白质或蛋白质结构域可用于与细胞外组件相互作用。膜相关蛋白可以具有一个以上的细胞外结构域，并且本公开的微细胞可以展示一种以上的膜相关蛋白。

如本文所用，术语“多肽”、“蛋白质”和“蛋白质结构域”是指由通过肽键连接的单链氨基酸组成的大分子。本发明的多肽可包含天然存在的氨基酸、合成氨基酸、遗传编码的氨基酸、非遗传编码的氨基酸及其组合。多肽可以包括L型和D型氨基酸。

如本文所用，术语“酶活性多肽”是指编码酶功能性蛋白的多肽。术语“酶活性多肽”包括但不限于执行生物功能的融合蛋白。示例性的酶活性多肽包括但不限于与某些受体或生物/化学底物特异性结合以实现诸如生物信号转导或化学灭活的生物功能的酶/酶部分(例如野生型、变体或工程改造的变体)。

如本文所用，术语“蛋白酶缺陷型菌株”是指有一种或多种内源蛋白酶缺陷的菌株。例如，蛋白酶缺陷可通过使至少一种内源蛋白酶缺失、去除、敲除、沉默、抑制或以其它方式下调而产生。此类蛋白酶可包括灾难性蛋白酶(catastrophic protease)。例如，BL21(DE3)大肠杆菌菌株有蛋白酶Lon和OmpT缺陷。大肠杆菌菌株具有可以显著降低蛋白质的产生和向膜的定位的细胞质蛋白酶和膜蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶缺陷型菌株可以使目标蛋白质的产生和向细胞膜的定位最大化。在本公开中，“蛋白酶缺陷型”可以互换地用作“无蛋白酶”。

如本文所用，术语“无核细胞”是指没有细胞核并且也没有染色体DNA的细胞，其也可以称为“缺核细胞”。因为真细菌和古细菌细胞与真核细胞不同，并非天然具有细胞核(含染色体的不同细胞器)，所以这些非真核细胞当然可以更准确地描述为“没有染色体”或“无染色体”。尽管如此，当提及细菌微细胞以及其它真核微细胞时，本领域技术人员常常使用术语“无核”。因此，在本公开中，术语“微细胞”涵盖没有染色体的真细菌细胞的衍生物；没有染色体的古细菌细胞的衍生物，以及没有细胞核，因此没有染色体的真核细胞的缺核衍生物。因此，在本公开中，“无核细胞”或“缺核细胞”可以与术语“无染色体细胞”互换使用。

如本文所用，术语“非表达的”农业化合物是指不是从宿主细胞内源、先天性或天然产生的农业化合物。例如，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thurigenesis)产生可以杀伤咀嚼植物的昆虫幼虫以及蚊虫幼虫的毒素。这种可以用作农业化合物的毒素是由苏云金芽孢杆菌内源表达的Cry蛋白。在本公开中，不将这种天然表达的Cry蛋白视为非表达的农业化合物。

如本文所用，术语“结合位点”意指分子结构或化合物，诸如蛋白质、多肽、多糖、糖蛋白、脂蛋白、脂肪酸、脂质或核酸，或此类分子结构或化合物中的特定区域或此类分子结构或化合物的特定构象，或此类分子结构或化合物的组合或复合物。在某些实施方案中，至少一个结合位点在完整的活体植物上。如本文所用，“完整的活体植物”意指生长时的植物，无论其生长在土壤中，水中还是人造基质中，以及无论其生长在田间、温室、院子、花园、花盆中还是水培系统中。完整的活体植物优选包括在自然界中此类植物上通常存在的所有植物部分(根、茎、枝、叶、针叶、刺、花、种子等)，但一些植物部分(例如花)在植物生命周期的某些时期可能不存在。

如本文所用，“结合结构域”意指能够使用特定的分子间相互作用与靶分子结合的蛋白质类(蛋白质、蛋白样或含蛋白的)分子的全部或一部分。结合结构域可以是天然存在的分子，它可以源自天然存在的分子，或者可以完全是人工设计的。结合结构域可以基于蛋白质中存在的结构域，包括但不限于微生物蛋白、蛋白酶抑制剂、毒素、纤连蛋白、脂质运载蛋白(lipocalin)、单链反平行卷曲螺旋蛋白或重复基序蛋白。此类结合结构域的非限制性实例是碳水化合物结合模块(CBM)，诸如靶向至植物的纤维素结合结构域。在一些实施方案中，细胞粘附部分包含结合结构域。

如本文所用，“载剂”、“可接受的载剂”或“农业上可接受的载剂”是指可以与组合物一起施用于其靶标，而不会对该组合物产生不利影响的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。

微细胞

微细胞是异常、不对称性细胞***的结果，并且含有膜、肽聚糖、核糖体、RNA、蛋白质，常常还有质粒，但没有染色体。(Frazer AC和Curtiss III,Production,Propertiesand Utility of Bacterial Minicells,Curr.Top.Microbial.Immunol.69:1-84(1975))。由于微细胞没有染色体DNA，因此微细胞无法***或生长，但它们可以继续其它细胞过程，诸如ATP合成、质粒DNA的复制和转录以及mRNA的翻译。尽管染色体不会分离到微细胞中，但是染色体外和/或游离型遗传表达元件可以分离，或者可以在从母细胞分离后引入微细胞。

在实施方案中，本文所述的微细胞是非天然存在的。

在一些实施方案中，本公开提供了包含多个微细胞的组合物，其中所述多个微细胞中的每个微细胞均包含展示在微细胞表面上的酶活性多肽，其中所述酶活性多肽具有酶活性。酶活性源自本公开中公开的酶活性多肽。在一些实施方案中，本公开提供了包含多个完整的、细菌来源的微细胞的组合物，其中所述多个微细胞中的每个微细胞均包含展示在细菌微细胞表面上的酶活性多肽，其中所述酶活性多肽具有酶活性。在一些实施方案中，所述组合物包含的微细胞还包含展示在细菌微细胞表面上的第二多肽，以增加与一个受试者和/或多个受试者的粘附力，所述受试者包括但不限于酶的底物、受体、金属、塑料、土壤、细菌、真菌、病原体、病菌、植物、动物、人等。在一些实施方案中，所述组合物包含微细胞的混合物，其中混合微细胞群体中的某些微细胞展示酶活性多肽或展示第二多肽，包括增加受试者粘附力的多肽或展示两者。

真细菌微细胞

一种类型的微细胞是真细菌微细胞。关于真细菌细胞周期和***过程的综述，参见Rothfield等人，Annu.Rev.Genet.,33:423-48,1999；Jacobs等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:5891-5893，1999年5月；Koch,Appl.and Envir.Microb.，第66卷，第9期，第3657-3663页；Bouche和Pichoff，Mol Microbiol,1998.29:19-26；Khachatourians等人，J Bacteriol,1973.116:226-229；Cooper,Res Microbiol,1990.141:17-29；及Danachie和Robinson,“Cell Division:Parameter Values and theProcess,”in:Escherichia Coli and Salmonella Typhimurium:Cellular andMolecular Biology,Neidhardt,Frederick C.主编，American Society forMicrobiology,Washington,D.C.,1987，第2卷，第1578-1592页及其中引用的参考文献；和Lutkenhaus等人，“Cell Division,”Chapter 101in:Escherichia coli and Salmonellatyphimurium:Cellular and Molecular Biology，第2版，Neidhardt,Frederick C.主编，American Society for Microbiology,Washington,D.C.,1996年第2卷，第1615-1626页及其中引用的参考文献。当DNA复制和/或染色体分配改变时，在完成染色体DNA转移之前，膜结合的囊泡会从亲代细胞中“夹断”。由于这种类型的功能失调性***，产生了微细胞，其含有完整的外膜、内膜、细胞壁和所有细胞质组分，但不含染色体DNA。

在一些实施方案中，细菌来源的微细胞是由包括但不限于以下的菌株产生的：大肠杆菌、芽孢杆菌属种、沙门氏菌属种、李斯特菌属种(Listeria spp.)、分枝杆菌属种(Mycobacterium spp.)、志贺氏菌属种或耶尔森氏菌属种(Yersinia spp.)的菌株。在一些实施方案中，细菌来源的微细胞是由天然产生微细胞的菌株产生的。此类产生微细胞的天然菌株以2:1的比率产生微细胞(每个微细胞2个细菌细胞)。在某些实施方案中，天然产生微细胞的示例性细菌菌株包括但不限于大肠杆菌菌株P678-54号，大肠杆菌遗传储备中心(CGSC)编号：4928和枯草芽孢杆菌菌株CU403。

例如，枯草芽孢杆菌smc基因中的突变引起微细胞的产生(Britton等人，1998,Genes and Dev.12:1254-1259；Moriya等人，1998,Mol Microbiol 29:179-87)。预计破坏各种细胞中的smc基因会导致由此产生微细胞。

再如，枯草芽孢杆菌的divIVA基因中的突变导致微细胞产生。当在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母即粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中表达时，DivIVA-GFP蛋白靶向其中的细胞***位点，即使在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或粟酒裂殖酵母中似乎不存在明确的DivIVA同源物(David等人，2000,EMBO J.19:2719-2727。枯草芽孢杆菌DivIVA或其同源物的过表达或表达不足可用于减少多种细胞中的微细胞产生。

在一些实施方案中，产生微细胞的细菌是革兰氏阴性细菌。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌、沙门氏菌属种(包括鼠伤寒沙门氏菌)、志贺氏菌属(种包括弗氏志贺菌)、铜绿假单胞菌、土壤杆菌、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、乳杆菌属种(Lactobacillus spp.)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)和嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)。在一些实施方案中，产生微细胞的革兰氏阴性细菌可以产生通过与细胞***和/或染色体分配相关的内源性或外源性突变天然产生的微细胞。在一些实施方案中，产生微细胞的细菌包含参与细胞***和/或染色体分配的内源性或外源性基因，其中与相应的野生型基因相比，该基因经遗传修饰，诸如通过同源重组进行遗传修饰。在一些实施方案中，产生微细胞的革兰氏阴性细菌天然地和/或通过本文公开的基因工程技术有蛋白酶和/或其活性缺陷。在一些实施方案中，所述产生微细胞的蛋白酶缺陷型革兰氏阴性细菌包含重组表达载体，所述重组表达载体包含与本公开中公开的目标蛋白有关的一个或多个基因。

在一些实施方案中，产生微细胞的细菌可以是***。***包括但不限于枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、谷氨酸棒状杆菌、嗜酸乳杆菌、葡萄球菌属种(Staphylococcus spp.)或链球菌属种(Streptococcus spp.)。在一些实施方案中，产生微细胞的***可以产生通过与细胞***和/或染色体分配相关的内源性或外源性突变天然产生的微细胞。在一些实施方案中，产生微细胞的***包含参与细胞***和/或染色体分配的内源性或外源性基因，其中与相应的野生型基因相比，该基因经遗传修饰，诸如通过同源重组进行遗传修饰。在一些实施方案中，产生微细胞的***天然地和/或通过本文公开的基因工程技术具有蛋白酶和/或其活性缺陷。在一些实施方案中，所述产生微细胞的蛋白酶缺陷型***包含重组表达载体，所述重组表达载体包含涉及与本公开中公开的目标蛋白的一个或多个基因。

产生微细胞的细菌可以是嗜极细菌(Extremophilic bacteria)。嗜极细菌包括但不限于嗜热菌(Thermophile)(包括水生嗜热菌(Thermus aquaticus))、嗜冷菌(Psychrophile)、嗜压生物(Piezophile)、嗜盐菌(Halophilic bacteria)、嗜酸菌(Acidophile)、嗜碱菌(Alkaliphile)、厌氧菌(Anaerobe)、无机自养生物(Lithoautotroph)、贫营养生物(Oligotroph)、耐金属生物(Metallotolerant)、贫营养生物、嗜旱生物(Xerophil)或多重嗜极生物(Polyextremophile)。在一些实施方案中，产生微细胞的嗜极细菌可以产生通过与细胞***和/或染色体分配相关的内源性或外源性突变天然产生的微细胞。在一些实施方案中，产生微细胞的嗜极细菌包含参与细胞***和/或染色体分配的内源性或外源性基因，其中与相应的野生型基因相比，该基因经遗传修饰，诸如通过同源重组进行遗传修饰。在一些实施方案中，产生微细胞的嗜极细菌天然地和/或通过本文公开的基因工程技术有蛋白酶和/或其活性缺陷。在一些实施方案中，所述产生微细胞的蛋白酶缺陷型嗜极细菌包含重组表达载体，所述重组表达载体包含涉及本公开中公开的目标蛋白的一个或多个基因。

真核微细胞

无染色体的真核微细胞(即，缺核细胞)在本公开的范围内。使用酵母细胞产生真菌微细胞。参见，例如，Lee等人，Ibd1p,a possible spindle pole body associatedprotein,regulates nuclear division and bud separation in Saccharomycescerevisiae,Biochim Biophys Acta3:239-253,1999；Kopecka等人，A method ofisolating anucleate yeast protoplasts unable to synthesize the glucanfibrillar component of the wall J Gen Microbiol 81:111-120,1974；和Yoo等人，Fission yeast Hrp1,a chromodomain ATPase,is required for proper chromosomesegregation and its overexpression interferes with chromatin condensation,Nucl Acids Res 28:2004-2011,2000。Gould和Simanis,The control of septumformation in fission yeast,Genes&Dev 11:2939-51,1997)综述了酵母中的细胞***。

在一些实施方案中，真核微细胞可以从酵母细胞，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和/或粟酒裂殖酵母产生。

例如，编码TRF拓扑异构酶的酵母基因中的突变导致微细胞的产生，并且已经有人指出存在酵母TRF基因的人同源物(Castano等人，1996,Nucleic Acids Res 24:2404-10)。酵母染色体结构域ATP酶Hrp1中的突变导致异常的染色体分离；(Yoo等人，2000Nuc.AcidsRes.28:2004-2011)。预计破坏TRF和/或Hrp1功能会导致各种细胞中微细胞的产生。可以以类似的方式使用参与裂变酵母中的隔膜形成的基因(参见，例如，Gould等人，1997Genesand Dev.11:2939-2951)。

血小板是真核微细胞的非限制性实例。血小板是缺核细胞，几乎没有能力进行蛋白质从头合成。对血小板中蛋白质合成的严格调控(Smith等人，1999,Vasc Med 4:165-72)可能引起外源蛋白质的过度产生，同时也引起内源蛋白质的产生不足。凝血酶活化的表达元件，诸如与Bcl-3相关的那些(Weyrich等人，Signal-dependent translation of aregulatory protein,Bcl-3,in activated human platelets,Cel Biology95:5556-5561,1998)用于调节血小板中外源基因的表达。

作为另一个非限制性实例，由肿瘤细胞系产生真核微细胞(Gyongyossy-Issa和Khachatourians,Tumour minicells:single,large vesicles released from culturedmastocytoma cells(1985)Tissue Cell17:801-809；Melton,Cell fusion-induced mouseneuroblastomas HPRT revertants with variant enzyme and elevated HPRT proteinlevels(1981)Somatic Cell Genet.7:331-344)。

使用酵母细胞产生真菌微细胞。参见，例如，Lee等人，Ibd1p,a possible spindlepole body associated protein,regulates nuclear division and bud separation inSaccharomyces cerevisiae,Biochim Biophys Acta3:239-253,1999；Kopecka等人，Amethod of isolating anucleate yeast protoplasts unable to synthesize theglucan fibrillar component of the wall J Gen Microbiol 81:111-120,1974；和Yoo等人，Fission yeast Hrp1,a chromodomain ATPase,is required for properchromosome segregation and its overexpression interferes with chromatincondensation,NuclAcids Res 28:2004-2011,2000。Gould和Simanis,The control ofseptum formation in fission yeast,Genes&Dev 11:2939-51,1997)综述了酵母中的细胞***。在一些实施方案中，本公开教导了酵母微细胞的产生。

古细菌微细胞

术语“古细菌”的定义如本领域所用，并且包括极度嗜热菌和其它古细菌(Woese,C.R.,L.Magrum.G.Fox.1978.Archaebacteria.Journal of Molecular Evolution.11:245-252)。古细菌的三种类型为嗜盐菌、嗜热菌和产甲烷菌。按照生理学定义，古细菌(非正式名称，古细菌)是单细胞极度嗜热菌(包括嗜热嗜酸菌)、硫酸盐还原菌、产甲烷菌和极度嗜盐菌。古细菌的嗜热性成员包括实验室培养的最具嗜热性的生物。需氧性嗜热菌也是嗜酸性的；它们将其环境中的硫氧化为硫酸。极度嗜盐菌是需氧或微需氧性的，并且包括已知的最耐盐的生物。在极端环境下，还原硫酸盐的古细菌将硫酸盐还原为硫化物。产甲烷菌是严格厌氧菌，但它们产生了至少两个独立的需氧类：嗜盐菌和嗜热嗜酸谱系。嗜盐菌的非限制性实例包括红皮盐杆菌(Halobacterium cutirubrum)和地中海盐富饶菌(Halogeraxmediterranei)。产甲烷菌的非限制性实例包括沃氏甲烷球菌(Methanococcus voltae)；香草甲烷球菌(Methanococcus vanniela)；嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)；沃氏甲烷球菌；炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)；和巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)。嗜热菌的非限制性实例包括维氏固氮菌(Azotobacter vinelandii)；嗜酸热原体菌(Thermoplasma acidophilum)；掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)；强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)；和泉古菌门(极度嗜热古细菌)种，诸如硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)和嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)。

古细菌微细胞在本发明的范围内。古细菌具有真细菌微细胞基因和蛋白的同源物，诸如来自强烈火球菌的MinD多肽(Hayashi等人，EMBO J.20:1819-28,2001)。因此有可能通过以非限制性实例的方式而言，诸如过表达从原核生物或古细菌分离的min基因的产物；或通过例如向其中引入其突变或反义分子而破坏目标古细菌中min基因的表达来产生古细菌微细胞。参见，例如Laurence等人，Genetics152:1315-1323,1999。

按照生理学定义，古细菌(非正式名称，古细菌)是单细胞极度嗜热菌(包括嗜热嗜酸菌)、硫酸盐还原菌、产甲烷菌和极度嗜盐菌。古细菌的嗜热性成员包括实验室培养的最具嗜热性的生物。需氧性嗜热菌也是嗜酸性的；它们将其环境中的硫氧化为硫酸。极度嗜盐菌是需氧或微需氧性的，并且包括已知的最耐盐的生物。在极端环境下，还原硫酸盐的古细菌将硫酸盐还原为硫化物。产甲烷菌是严格厌氧菌，但它们产生了至少两个独立的需氧类：嗜盐菌和嗜热嗜酸谱系。在一些实施方案中，本公开教导了古细菌微细胞的产生。

细菌微细胞的产生

微细胞是由在参与细胞***和/或染色体分配的基因中具有突变和/或使所述基因过表达或表达不足的母细胞产生的，或者来自于暴露于导致细菌细胞异常裂变和/或细胞裂变期间的异常染色体分离中的分配的某些条件的母细胞。术语“母细胞”或“亲本细胞”是指从中产生微细胞的细胞。微细胞，大多数没有染色体DNA(Mulder等人，Mol Gen Genet,221:87-93,1990)，通常但不一定比其母细胞小。通常，由大肠杆菌细胞产生的微细胞通常为球形，直径约0.1至约0.3um，而整个大肠杆菌细胞的直径为约1至约3um，长度为约2至约10um。已经用与DNA结合的化合物DAPI(4:6-二脒基-z-苯基吲哚)染色的大肠杆菌细胞和微细胞的显微照片显示，微细胞不染色而母本大肠杆菌被明亮地染色。此类显微照片证明了微细胞中染色体DNA的缺乏。(Mulder等人，Mol.Gen.Genet.221:87-93,1990)。

微细胞是无染色体的、膜包封的生物纳米颗粒(≦400nm)，其在细菌细胞的正常***器破坏后由细菌形成。微细胞大小也可为400nm至650nm。本质上，微细胞是正常细菌细胞的小型、代谢活性复制物，例外之处是它们不含染色体DNA，因而它们不可***且无活性。尽管微细胞不含染色体DNA，但已证实质粒、RNA、天然和/或重组表达的蛋白质以及其它代谢物能够分离到微细胞中。在美国专利申请序列号10/154,951(US公开号US/2003/0194798A1)中详细讨论了产生微细胞的细菌菌株的一些构建方法，所述美国专利申请特此通过引用整体并入。

染色体复制和细胞***之间协调的破坏导致由大多数杆状原核生物的极性区域形成微细胞。染色体复制和细胞***之间协调的破坏可以通过一些参与隔膜形成和二元裂变的基因的过表达来促进。替代性地，可以在调节隔膜形成和二元裂变的基因中隐匿突变的菌株中产生微细胞。如许多不同的原核生物所显示的，受损的染色体分离机制也可导致微细胞形成。

基于质粒的微细胞产生方法

在一些实施方案中，微细胞的产生可以通过参与新生染色体分离到子细胞中的基因的过表达或突变来实现。例如，已证明大肠杆菌的parC或mukB基因座中的突变会产生微细胞。两者都影响细菌中染色体分离过程中单独的必要步骤。导致微细胞的产生的任何参与染色体分离过程的给定基因的野生型水平的操纵在其它家族成员中也会产生类似的影响。

因为细胞***和染色体复制过程对于存活如此重要，所以在原核家族成员中就负责这些过程的基因而言，存在高水平的遗传和功能保守性。能够在一个家族成员中驱动微细胞产生的细胞***基因的过表达或突变可用于在另一个家族成员中产生微细胞。例如，已经证实在其它肠杆菌科(Enterobacteriacea)家族成员(诸如沙门氏菌属种和志贺菌属种)以及其它类成员(诸如假单胞菌属种)中过表达大肠杆菌ftsZ基因将引起类似水平的微细胞产生。

在一些实施方案中，可以通过过量产生蛋白质FtsZ在大肠杆菌中产生微细胞，蛋白质FtsZ是大肠杆菌通过其存活的Min***系统的重要组分。该蛋白质在细胞***期间聚合，在潜在***位点处形成环状结构。该环募集完成***的其它蛋白质。这种蛋白质在大肠杆菌中的过量产生导致该环无法在空间上限制在细胞的中部，从而导致细胞***后产生微细胞。

因为FtsZ的过量产生可产生微细胞，所以可以使用基于质粒的系统使其过表达。

在基于突变的产生微细胞的细菌菌株中也可以证明这一点。例如，任何细菌菌株中Min基因座的缺失都会导致微细胞产生。突变可导致微细胞形成的细胞***基因包括但不限于min基因(诸如minC、minD和minE)。

在一些实施方案中，大肠杆菌依赖于min系统，以便确保母细胞正确复制到子细胞中。该min系统(称为minB操纵子)由3部分即minD、minC和minE组成。这些基因共同作用，以控制由聚合FtsZ蛋白组成的Z环的放置。MinC由两个不同的结构域组成，这两个域都与FtsZ蛋白直接相互作用，以便抑制聚合(Z环形成)。MinD是一种与膜相关的蛋白质，这种蛋白质在细胞的一极形成并朝细胞的中点聚合。它结合分布在整个细胞质中的MinC。MinE是一种也与MinD结合并释放MinC的蛋白质。它聚合成环状，并在细胞中从一极振荡到另一极。

该系统导致将与FtsZ结合(使其失活)的MinC隔绝到细胞的极性末端。这样，并且由于MinE的振荡作用，该系统极有可能使FtsZ在细胞的中间聚合并形成Z环。这样将细胞的***隔膜设置在细胞的中点，在***完成后产生两个具有相同遗传信息的细胞。

在一些实施方案中，可以操纵该系统，以便在复制完成后使Z环移至细胞的不包含类核DNA的极性末端。通过使细胞不将MinC隔绝到细胞的极性末端，可以移动Z形环。在不存在MinC或MinD，或MinE过表达的情况下，大肠杆菌细胞将形成无染色体和/或缺核细胞。Piet等人，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1129-1133和Xuan-Chuan等人，2000,J.Bacteriol.182(21):6203-62138举例说明了用于引起不对称性细胞***的FtsZ和Min系统，其各自通过引用并入本文。

在一些实施方案中，本公开与所有遗传设计和克隆方法相容。即，在一些实施方案中，本公开教导了传统克隆技术，诸如聚合酶链反应、限制酶消化、连接、同源重组、RT PCR以及本领域通常已知的其它技术的使用，并且公开于例如：Sambrook等人(2001)MolecularCloning:A Laboratory Manual(第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)中，其通过引用并入本文。

可以使用同源重组以定点方式引入基因。同源重组容许内源基因中的位点特异性修饰，因此可以校正遗传或获得性突变，和/或可以将新型改变工程改造到基因组中。植物中的同源重组和定点整合在例如美国专利第5,451,513、5,501,967和5,527,695号中有论述。

在一些实施方案中，通过传统基因工程技术(包括同源重组)，通过使细菌中的minC、minD和/或minC和minD基因缺失、突变，将其敲除或破坏来生产微细胞。在其它实施方案中，通过使某些基因诸如ftsZ和/或minE在细菌中过表达来产生微细胞。

受控的微细胞产生

在一些实施方案中，本公开教导了通过引入、缺失或置换基因组DNA的选定部分来使细胞群突变。因此，在一些实施方案中，本公开教导了用于将突变靶向特定基因座，诸如ftsZ、minC、minD、minC/D和minE的方法。在其它实施方案中，本公开教导了使用基因编辑技术诸如ZFN、TALENS、CRISPR或归巢核酸内切酶来选择性编辑靶DNA区域。在一些方面，靶向的DNA区域是ftsZ、minC、minD、minC/D和minE。

工程改造的核酸酶(诸如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、工程改造的归巢内切核酸酶)以及RNA或DNA引导的内切核酸酶(诸如CRISPR/Cas，诸如Cas9或CPF1)特别适于执行本公开的某些方法。另外地或替代性地，可以使用RNA靶向系统，诸如CRISPR/Cas系统具有RNA靶向核酸酶。

在一些实施方案中，本公开教导了使用II型CRISPR系统(诸如Cas9 II型CRISPR系统或“Cas9样”系统)进行基因编辑。II型系统依赖于i)单个核酸内切酶蛋白，ii)反式活化性crRNA(tracrRNA)，和iii)crRNA，其中crRNA的5'末端的约20个核苷酸(nt)的部分(即“向导序列”或“间隔区”)与靶核酸互补。

在一些实施方案中，II型系统的tracrRNA和crRNA组件可由单向导RNA(sgRNA)代替。sgRNA可以包括例如，包含与靶DNA序列(向导序列)互补的至少12-20个核苷酸的序列的核苷酸序列，并且可以在其3'末端包括共用支架RNA序列。如本文所用，“共用支架RNA”是指模拟tracrRNA序列的任何RNA序列或充当tracrRNA的任何RNA序列。

Cas9内切核酸酶产生平末端DNA断裂，并通过crRNA和tracrRNA寡核苷酸的组合募集到靶DNA处，所述寡核苷酸通过RNA CRISPR复合物的互补性杂交而拴系内切核酸酶。crRNA/核酸内切酶复合物对DNA的识别需要与位于靶标原间隔区下游的靶DNA 3'部分中的原间隔区邻近基序(PAM)(例如，5’-NGG-3’)进行附加互补碱基配对。(Jinek,M.等人，Science.2012:337；816-821)。在一些实施方案中，Cas9识别的PAM基序因不同的Cas9蛋白而有所不同。

在一些实施方案中，本领域技术人员可以认识到，本文公开的Cas9可以是文献中描述的任何变体，包括但不限于以下文献中描述的功能性突变：Fonfara等人NucleicAcids Res.2014年2月；42(4):2577-90；Nishimasu H.等人Cell.2014年2月27日；156(5):935-49；Jinek M.等人Science.2012 337:816-21；和Jinek M.等人Science.2014年3月14日；343(6176)；还参见2013年3月15日提交的美国专利申请号13/842,859，其特此通过引用并入；进一步参见美国专利第8,697,359、8,771,945、8,795,965、8,865,406、8,871,445、8,889,356、8,895,308、8,906,616、8,932,814、8,945,839、8,993,233和8,999,641号，其全部特此通过引用并入。因此，在一些实施方案中，本文公开的系统和方法可与具有双链核酸酶活性的野生型Cas9蛋白，充当单链切口酶的Cas9突变体，无核酸酶活性的失活Cas9(dCas9)或具有修饰的核酸酶活性的其它突变体一起使用。

在一些实例中，II型核酸酶可以是催化性死亡的(例如，dCas9、“死Cas9”、“失活Cas9”)，使其与靶序列结合，但是不裂解靶序列。

在一些实施方案中，微细胞的产生是由于Min***系统的破坏而引起的。这可以通过在如上所述的基于质粒的系统中过表达FtsZ，或通过终止Min系统中的基因表达来完成。可以通过去除基因来实现终止基因的表达(非诱导型微细胞形成)，也可以通过敲低该基因来实现。敲低该基因可以允许对目标基因的可控抑制或表达。在一些实施方案中，本公开教导了将dCAS9基因整合到大肠杆菌基因组内的非必需操纵子内。dCAS9是CAS9蛋白(CRISPR)的变体，其活性位点已改变而不再能够编辑基因组，但仍然可以使用向导RNA与基因组的高度特异性区段结合。如果结合，则该蛋白质可以终止基因的转录。

在一些实施方案中，可以将dCAS9基因置于诱导控制下，以便对其表达进行控制。与Min系统内的敲除相对应的向导RNA可以包括在质粒上或切入基因组内并置于诱导控制下。在用该系统进行诱导后，向导RNA会将dCAS9蛋白引导至Min系统中的基因，以便终止其表达。该基因诸如minC、minD和minC/D表达的终止将导致微细胞的形成。

抗生素抗性敲入-敲除

在一些实施方案中，本公开教导了使用Lambda-Red重组系统的基因操纵技术的用途，以便编辑与外源表达盒整合的基因组，诸如选择标记，诸如抗生素抗性基因。在一些实施方案中，将选择标记诸如抗生素抗性基因整合到宿主基因组(例如细菌)中，以便敲除minC/D/CD基因以诱导微细胞产生。如果在成功选择敲除了靶基因(诸如minC/D/CD)的微细胞之后，不再需要具有抗生素抗性的标记，则可以使用翻转酶(flippase)从宿主基因组中去除整合的抗生素抗性基因盒。将线性DNA的片段***到基因组中，这通过该片段与基因组的同源性来指导。这可用于通过将其替换为抗生素抗性盒，诸如氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、红霉素抗性基因、博来霉素抗性基因和博来霉素抗性基因而敲入目标基因或敲除目标基因。然后选择成功的基因操纵以使用该抗生素抗性盒。如果在抗性盒中包括翻转酶重组靶(FRT)位点用于进一步的基因操纵，则在选择靶微细胞后，可将其用于去除整合到体内基因组中的抗生素抗性基因。用于此的酶是重组酶翻转酶，通常从可使用温度敏感性复制起点从细胞系中去除的质粒表达。重组酶翻转酶识别抗生素抗性盒的5'和3'末端的两个相同FRT位点，并去除这两个位点之间的DNA。在一些实施方案中，FRT位点可包括在抗生素抗性盒中，以在使用后去除抗生素抗性盒。

用于产生微细胞的菌株

从大肠杆菌遗传储备中心(CGSC)获得大肠杆菌P678-54菌株，并用于产生微细胞(Adler等人，1967,Proc.Natl.Acad.Sci.USA57:321-326；Inselburg J,1970J.Bacteriol.102(3):642-647；Frazer 1975,Curr.Topics Microbiol.Immunol.69:1-84)。

在一些实施方案中，由P678-54大肠杆菌亲本菌株产生无核细胞。由P678-54亲本细菌菌株产生的无核细胞用作用于包封和递送农业化合物的基于无核细胞的平台。

蛋白酶缺陷型细菌菌株

本公开提供了使用遗传工程技术从B菌株产生微细胞，B菌株包括有Lon蛋白酶(细胞质)和OmpT蛋白酶(外膜)缺陷的B菌株，包括BL21、BL21(DE3)和BL21-AI。因此，作为蛋白酶缺陷型菌株的B菌株可以用于产生蛋白酶缺陷型和/或蛋白酶缺陷型微细胞。DE3名称意指各个菌株均含有λDE3溶原性细菌，其携带处于lacUV5启动子控制下的T7 RNA聚合酶的基因。为了表达克隆到T7启动子下游的重组基因，需要IPTG最大限度地诱导T7 RNA聚合酶的表达。BL21(DE3)适合从T7或T7-lac启动子或被大肠杆菌RNA聚合酶识别的启动子：例如lac、tac、trc、ParaBAD、PrhaBAD以及T5启动子表达。BL21(DE3)的基因型为：fhuA2[lon]ompT gal(λDE3)[dcm]ΔhsdSλDE3＝λsBamHIoΔEcoRI-B int::(lacI::PlacUV5::T7基因1)i21Δnin5。

BL21-AI大肠杆菌含有编码T7 RNA聚合酶(RNAP)的基因向araBAD操纵子的araB基因座中的染色体***，使T7 RNAP的调控处于***糖诱导型araBAD启动子的控制下。因此，该菌株对于表达可能对其它T7 RNAP基础表达有漏洞的BL21菌株有毒性的基因特别有用。BL21-AI菌株不含Ion蛋白酶并且缺乏外膜蛋白酶OmpT。BL21-AI的基因型为F^-ompThsdS_B(r_B ^-m_B ^-)gal dcm araB::T7RNAP-tetA。BL21-AI具有控制T7 RNA聚合酶产生的***糖启动子，而BL21(DE3)具有控制T7 RNA聚合酶产生的lac启动子。这很重要，因为lac启动系统存在漏洞。因此，由于***糖启动系统，BL21-AI蛋白的产生受到更严格的调控。

本公开教导可以使用LPS(脂多糖)修饰的BL21(DE3)细胞。对大肠杆菌的LPS进行修饰，使其毒性显著降低。如有必要，可以使用这种LPS修饰的BL21(DE3)细胞。这也可以扩展到其它革兰氏阴性细菌细胞。革兰氏阴性细胞的安全使用可有益于基于无核细胞的平台。

BL21(DE3)细胞是具有经修饰的LPS(脂质IVA)的商购感受态细胞，经修饰的LPS不会在不同细胞中触发内毒素反应。例如，ClearColi细胞没有用于hTLR4/MD-2激活的外膜激动剂；因此，与大肠杆菌野生型细胞相比，对hTLR4/MD-2信号传导的激活作用低几个数量级。由制备的异源蛋白几乎没有内毒素活性。从ClearColi细胞中进行最低限度的纯化后，蛋白质或质粒(可能含有脂质IVA)可用于大多数应用，而不会在人细胞中引起内毒素反应。在ClearColi细胞中，通常六酰基化的LPS的两条二级酰基链缺失，从而消除了真核细胞中内毒性的关键决定因素。LPS的六条酰基链是触发因子，该触发因子被与髓样分化因子2(MD-2)的复合物中的Toll样受体4(TLR4)识别，从而引起NF-κB的激活和促炎细胞因子的产生。两条二级酰基链的缺失产生脂质IVA，脂质IVA不会诱导活化异四聚体TLR4/MD-2复合物的形成，因此不会触发内毒素反应。在BL21(DE3)电感受态细胞4MA145Rev.31OCT2016添加物中，寡糖链缺失，使得更容易从任何下游产物中去除所产生的脂质IVA。

在一些实施方案中，本文公开的蛋白酶缺陷型微细胞是由蛋白酶缺陷型亲本菌株产生的，所述亲本菌株包括但不限于BL21(DE3)、BL21-AI和LPS修饰的BL21(DE3)。在其它实施方案中，通过使minC、minD和/或minC和minD基因缺失、突变，将其敲除或破坏来遗传工程改造BL21(DE3)、BL21-AI和LPS修饰的BL21(DE3)菌株以诱导微细胞产生。在其它实施方案中，通过使ftsZ和/或minE基因过表达来遗传工程改造BL21(DE3)、BL21-AI和LPS修饰的BL21(DE3)菌株以诱导微细胞产生。

在其它实施方案中，本公开提供了一种新的产生微细胞的菌株，命名为B8。该菌株是没有T7 RNA聚合酶的产生蛋白酶缺陷型微细胞的菌株。该微细胞株由BL21(DE3)菌株产生。在敲除minC/D/CD的同时，由于通过Lambda Red转化引入的敲除的同源性，使T7 RNA聚合酶沉默。针对蛋白酶缺陷型微细胞的需要，可以使用该菌株，但没有T7 RNA聚合酶。在一些实施方案中，微细胞在其表面上展示酶活性多肽，诸如复杂或有毒性的蛋白质，需要所需但复杂或有毒性的蛋白质更受控制且更缓慢的表达。

本公开教导了新产生的蛋白酶缺陷型微细胞株的基因型，其包含i)minC缺失型BL21(DE3)；fhuA2[lon]ompT gal(λDE3)[dcm]ΔhsdSλDE3＝λsBamHIoΔEcoRI-B int::(lacI::PlacUV5::T7 gene1)i21Δnin5ΔminC,ii)minD缺失型BL21(DE3)；fhuA2[lon]ompT gal(λDE3)[dcm]ΔhsdSλDE3＝λsBamHIoΔEcoRI-B int::(lacI::PlacUV5::T7基因1)i21Δnin5ΔminD，iii)minC/D缺失型BL21(DE3)；fhuA2[lon]ompT gal(λDE3)[dcm]ΔhsdSλDE3＝λsBamHIoΔEcoRI-B int::(lacI::PlacUV5::T7基因1)i21Δnin5ΔminCΔminD；iv)minC缺失型BL21-AI；F^-ompT hsdS_B(r_B ^-m_B ^-)gal dcm araB::T7RNAP-tetAΔminC，v)minD缺失型BL21-AI；F^-ompT hsdS_B(r_B ^-m_B ^-)gal dcm araB::T7RNAP-tetAΔminD，vi)minC/D缺失型BL21-AI；F^-ompT hsdS_B(r_B ^-m_B ^-)gal dcm araB::T7RNAP-tetAΔminCΔminD；vii)minC缺失型LPS修饰的BL21(DE3)；msbA148ΔgutQΔkdsDΔlpxLΔlpxMΔpagPΔlpxPΔeptAΔminC，viii)minD缺失型LPS-modified BL21(DE3)；msbA148ΔgutQΔkdsDΔlpxLΔlpxMΔpagPΔlpxPΔeptAΔminD，ix)minC/D缺失型LPS修饰的BL21(DE3)；msbA148ΔgutQΔkdsDΔlpxLΔlpxMΔpagPΔlpxPΔeptAΔminC，ΔminD，x)对T7 RNA聚合酶活性有抑制的minC缺失型B8；fhuA2[lon]ompT gal(λDE3)[dcm]ΔhsdSλDE3＝λsBamHIoΔEcoRI-Bint::(lacI::PlacUV5::T7基因1)i21Δnin5ΔminC；xi)对T7 RNA聚合酶活性有抑制的minD缺失型B8；fhuA2[lon]ompT gal(λDE3)[dcm]ΔhsdSλDE3＝λsBamHIoΔEcoRI-B int::(lacI::PlacUV5::T7基因1)i21Δnin5ΔminD；和xii)对T7 RNA聚合酶活性有抑制的minC/D缺失型B8；fhuA2[lon]ompT gal(λDE3)[dcm]ΔhsdSλDE3＝λsBamHIoΔEcoRI-B int::(lacI::PlacUV5::T7基因1)i21Δnin5ΔminCΔminD。

已经与母细胞分离的微细胞没有染色体和/或核组分，但保留了细胞质及其内容物，包括蛋白质表达所需的细胞机器。在一些实施方案中，微细胞为蛋白酶缺陷型，因为母细胞是蛋白酶缺陷型菌株。尽管染色体不会分离到微细胞中，但是染色体外和/或游离型遗传表达元件可以分离，或者可以在从母细胞分离后引入微细胞。在一些实施方案中，本公开涉及包含表达元件的蛋白酶缺陷型微细胞，所述表达元件可以是诱导型表达元件。可将诱导型表达元件诸如诱导型启动子引入用于同源重组以使参与细胞***和/或染色体分配的基因，诸如minC、minD和minC/D敲除和/或缺失的重组质粒中，引入用于过表达参与细胞***和/或染色体分配的基因诸如ftsZ和minE的重组表达载体中，以及引入用于表达酶活性多肽(包括本文公开的目标蛋白质)的重组表达载体中。在其它实施方案中，诱导型表达元件包括与编码本文公开的目标蛋白质的开放阅读框(ORF)可操作地连接的表达序列。任选地，在该方法的任何时候，提供诱导剂以诱导编码本文公开的目标蛋白的ORF的表达。

在一些实施方案中，本公开教导了制备蛋白酶缺陷型细菌微细胞的方法，所述蛋白酶缺陷型细菌微细胞包含非天然存在于亲本细胞中的重组融合蛋白。在一些实施方案中，本公开教导了由宿主细胞制备蛋白酶缺陷型微细胞的方法。

在其它实施方案中，本公开教导了通过使编码WprA蛋白酶的基因缺失、突变，将其敲除或破坏，由枯草芽孢杆菌菌株诸如CU403DIVIVA、CU403,DIVIVB,SPO-、CU403,DIVIVB和CU403,DIVIVB1产生蛋白酶缺陷型微细胞。图16说明了用于抑制和/或去除WprA蛋白酶活性的这个目的以在枯草芽孢杆菌中产生蛋白酶缺陷状态的示例性重组载体。

枯草芽孢杆菌基因操纵的作用与大肠杆菌中的基因操纵略有不同。已知如果***与现有基因组具有同源性的DNA，则枯草芽孢杆菌容易进行同源重组。这与大肠杆菌不同；大肠杆菌具有在原位降解存在的任何非天然线性DNA的机制。可以利用这种差异，以便通过设计侧接对应于期望敲除的基因的起始和末端的同源臂的抗生素抗性盒来敲除基因。

本公开提供了使用基因工程技术由枯草芽孢杆菌产生微细胞。在一些实施方案中，枯草芽孢杆菌菌株，包括但不限于CU403 DIVIVA(BGSC No.1A196)、CU403,DIVIVB,SPO-(BGSC编号1A197)、CU403,DIVIVB(BGSC编号1A292)、CU403,DIVIVB1(BGSC编号1A513)、KO7，可以用作亲本细菌细胞用于产生微细胞。枯草芽孢杆菌菌株是可商购的，并且可以从芽孢杆菌遗传储备中心(BGSC)获得。菌株目录可在公开可访问的BGSC网页(www.bgsc.org/_catalogs/Catpart1.pdf)上提供的文档中获得。

在一些实施方案中，枯草芽孢杆菌菌株，包括但不限于CU403DIVIVA、CU403,DIVIVB,SPO-、CU403,DIVIVB和CU403,DIVIVB1，可以通过敲除这些菌株中编码WprA蛋白酶的基因进行遗传修饰。WprA蛋白酶被认为是最苛刻的蛋白酶之一。

为了使编码WprA的基因从枯草芽孢杆菌菌株中敲除、缺失和/或去除，如图16所示使用pUC18 WprA-CamR载体。该载体具有对应于编码WprA细胞壁蛋白酶的基因的同源臂，该基因天然存在于枯草芽孢杆菌中，这对于蛋白质表面表达是不希望的。这些同源臂侧接氯霉素抗性盒，以便进行选择。通过宿主细胞内的同源臂进行同源重组后，除同源臂外的WprA编码核苷酸用氯霉素选择标记基因置换。该质粒由于其复制起点才可以在大肠杆菌内复制，因此当转化到枯草芽孢杆菌中时，它无法复制。转化后，选择菌落以使用氯霉素以便分离成功进行WprA敲除的菌落。因为该质粒无法在枯草芽孢杆菌中复制，所以如果具有氯霉素抗性标记基因的重组盒通过同源重组整合到枯草芽孢杆菌细胞的基因组中，则只有所述细胞可以抵抗氯霉素的存在而存活。

枯草芽孢杆菌在营养生长和静止期分泌不少于7种蛋白酶。已证明其中多个蛋白酶基因已经失活的菌株在产生外源蛋白方面优于野生型菌株。KO7是原养型，不含分泌的蛋白酶，并且在PY79遗传背景中具有无标记的缺失。这种KO7可以根据登录号1A1133从BGSC获得。KO7基因型：ΔnprEΔaprEΔeprΔmprΔnprBΔvprΔbpr

在一些实施方案中，通过使用本公开中描述的基因工程技术敲除DIV-IVA和DIV-IVB，可以将缺失七种蛋白酶的菌株即枯草芽孢杆菌KO7用于产生枯草芽孢杆菌微细胞。

在一些实施方案中，由P678-54大肠杆菌野生菌株产生无核细胞。在其它实施方案中，由蛋白酶缺陷型大肠杆菌菌株(包括BL21、BL21(DE3)、BL21-AI、LPS修饰的BL21(DE3)和B8)产生无核细胞。在一些实施方案中，由有WprA蛋白酶缺陷的亲本细菌细胞产生无核细胞。在一些实施方案中，由蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌亲本细菌细胞产生无核细胞。在一些实施方案中，由蛋白酶缺陷型KO7枯草芽孢杆菌亲本细菌细胞产生无核细胞。在其它实施方案中，由选自由以下组成的组的蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌亲本细菌细胞产生无核细胞：(1)CU403,DIVIVA；(2)CU403,DIVIVB,SPO-；(3)CU403,DIVIVB；及(4)CU403,DIVIVB1，其中至少一个蛋白酶编码基因已经被抑制、缺失或沉默。在其它实施方案中，由真核细胞产生无核细胞。在另外的实施方案中，如上所述产生的无核细胞用作用于包封和递送农业化合物的基于无核细胞的平台。

微细胞分离和纯化

在母细胞和微细胞的混合物中，使用多种方法将微细胞与母细胞(即，由其产生微细胞的细胞)分离。一般而言，此类方法是物理的、生物化学的和遗传的，并且可以组合使用。

微细胞与母细胞的物理分离

以非限制性实例的方式而言，通过玻璃纤维过滤(Christen等人，Gene 23:195-198,1983)，及差速离心和区带离心(Barker等人，J.Gen.Microbiol.111:387-396,1979)、尺寸排阻色谱法，例如凝胶过滤、差速超声处理(Reeve,J.N.和N.H.Mendelson.1973.Biochem.Biophys.Res.Commun.53:1325-1330)和紫外光辐射(Tankersley,W.G.和J.M.Woodward.1973.Proc Soc Exp Biol Med.1974Mar；145(3):802–805)将微细胞与母细胞分离。

一些技术涉及不同的离心技术，例如，差速离心和区带离心。以非限制性实例的方式而言，微细胞可以通过Frazer和Curtiss，Curr.Topics Microbiol.Immunol.69:1-84,1975描述的双蔗糖梯度纯化技术来纯化。第一次离心涉及差速离心，差速离心基于大小和/或密度的差异将母细胞与微细胞分离。将梯度中的蔗糖(从约5％递增到约20％)、Ficol或甘油的百分比设计为仅允许母细胞通过该梯度。

然后将富含微细胞的上清液与沉淀分离，并以更高的速率(例如≧11,000g)旋转。这样会使微细胞以及在第一次旋转中未沉淀出的任何母细胞沉淀。然后使沉淀重新悬浮并在蔗糖梯度上分层。

收集含有微细胞的条带，通过离心使其沉淀，并装载到另一梯度上。重复该程序，直到微细胞制剂中的母细胞基本耗尽，或母细胞浓度足够低，以致不会干扰所选的微细胞应用或活性。以非限制性实例的方式而言，这些梯度和重新悬浮步骤中使用的缓冲液和培养基可以是LB、限定的基本培养基(例如具有限定的碳、氮、磷酸盐、镁和硫酸盐含量的M63盐)、复杂的基本培养基(例如具有酪蛋白氨基酸补充剂的限定的基本培养基)，和/或用作渗透保护剂、稳定剂和/或能源的其它缓冲液或培养基，或者可以含有限制污染性亲本细胞生长的剂，例如叠氮化物、抗生素或缺乏营养缺陷型补充需求的剂，例如硫胺素。

也可以使用其它物理方法从微细胞制剂中去除母细胞。以非限制性实例的方式而言，将母细胞和微细胞的混合物冷冻至-20℃，然后缓慢解冻(Frazer和Curtiss,Curr.Topics Microbiol.Immunol.69:1-84,1975)。

微细胞与母细胞的生物化学分离

可以通过在一种剂的存在下或在一组选择性杀伤***细胞的条件下进行孵育来从微细胞制剂中消除污染性亲本细胞。因为微细胞既不能生长也不能***，所以它们对此类处理有抗性。

防止或杀伤***的亲本细胞的生物化学条件的实例是用抗菌剂诸如青霉素或青霉素的衍生物处理。青霉素有两个潜在作用。第一，青霉素防止细胞壁形成并导致***细胞裂解。第二，在裂解之前，***细胞形成丝状体，这些丝状体可以有助于上述物理分离步骤。除青霉素及其衍生物外，其它剂也可用于防止亲本细胞***。此类剂可以包括叠氮化物。叠氮化物是电子传输的可逆性抑制剂，因此防止细胞***。再如，D-环丝氨酸或噬菌体MS2裂解蛋白也可以用作消除或抑制***的亲本细胞的生物化学方法。(Markiewicz等人，FEMSMicrobiol.Lett.70:119-123,1992)。Khachatourians(美国专利第4,311,797号)指出在添加青霉素G和进一步孵育之前，将微细胞/母细胞混合物在脑心浸液肉汤中在36℃至38℃下孵育可能是可取的。

微细胞与母细胞的遗传分离

替代性地或另外地，可以使用各种技术选择性杀伤，优选裂解母细胞。例如，尽管微细胞可以在M13生命周期的质粒期在内部保留M13噬菌体，但它们对M13噬菌体的感染和裂解具有耐受性(Staudenbauer等人，Mol.Gen.Genet.138:203-212,1975)。相反，母细胞受M13感染并裂解，因此从包含母细胞和微细胞的混合物中选择性地去除。用M13噬菌体以M.O.I.＝5(噬菌体细胞)处理包含母细胞和微细胞的混合物。允许感染继续进行到≥50％的母细胞被裂解，优选≥75％，更优选≥95％，最优选≥99％的母细胞被裂解；并且≤25％的微细胞被裂解或杀伤，优选≤15％，最优选≤1％的微细胞被裂解或杀伤的点。

作为可以选择性杀伤并优选裂解母细胞的方法的另一非限制性实例，母细胞的染色体可以包括条件致死基因。染色体致死基因的诱导将导致母细胞的毁坏，但不会影响微细胞，因为它们没有携带条件致死基因的染色体。例如，母细胞可以含有包含条件致死基因的染色体整合噬菌体。此类噬菌体的一个实例是具有温度敏感性阻遏基因(例如，λcI857)的整合λ噬菌体。通过简单地升高生长培养基的温度而实现对该噬菌体的诱导，从而导致母细胞的毁坏，而不毁坏无染色体的微细胞。用于该方法的优选噬菌体是杀伤和/或裂解母细胞但不产生感染性颗粒的噬菌体。这种类型的噬菌体的一个非限制性实例是裂解细胞但已经被工程改造为不产生在感染性颗粒中包围并保护噬菌体DNA的衣壳蛋白的噬菌体。即，对于感染性颗粒的产生需要衣壳蛋白。

作为可以选择性杀伤或裂解母细胞的方法的另一个非限制性实例，可以表达导致亲本细胞裂解的毒性蛋白。以非限制性实例的方式而言，这些诱导型构建体可以采用控制噬菌体holing基因表达的系统。Holin基因属于至少35个不同家族，没有可检测的直系同源关系(Grundling,A.等人2001.Proc.Natl.Acad.Sci.98:9348-9352)，其中每个及任何家族均可用于裂解亲本细胞以提高微细胞制剂的纯度。

在一些实施方案中，微细胞与包含微细胞的组合物中产生微细胞的母细胞基本上分离。分离后，包含微细胞的组合物至少约99.9％、约99.8％、约99.7％、约99.6％、约99.5％、约99.4％、约99.3％、约99.2％、约99.1％、约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约94％、约93％、约92％、约91％、约90％、约89％、约88％、约87％、约86％、约85％、约84％、约83％、约82％、约81％、约80％、约79％、约78％、约77％、约76％、约75％、约74％、约73％、约72％、约71％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％或约20％不含产生微细胞的母细胞。因此，本公开的组合物可以包含基本上不含亲本细胞的微细胞。

在一些方面，本发明提供了制备微细胞的方法，该方法包括(a)培养产生微细胞的母细胞，其中母细胞包含重组构建体，其中所述重组构建体包含与调控细胞***相关的靶基因同源的核苷酸序列，和(b)从母细胞中分离微细胞，从而产生包含微细胞的组合物。在一些实施方案中，该方法还包括(c)通过离心和/或过滤从组合物中纯化微细胞。在一些实施方案中，可以将一种或多种附加表达构建体引入产生微细胞的母细胞中，所述母细胞包含与细胞***相关的基因。在此类情况下，表达构建体可以在诱导微细胞形成之前同时或依序引入母细胞中，并且可以包含一种或多种选择标记(例如，抗生素抗性基因)和/或报告基因，以允许选择和/或可视化表达目标蛋白质的微细胞。在其它实施方案中，表达构建体可以表达一种或多种附加蛋白质，其由相同或不同启动子(包括诱导型启动子)驱动。在其它实施方案中，与细胞***相关的基因是minC、minD和/或minC和minD两者。

真细菌细胞和微细胞以内膜为边界，内膜被细胞壁包围，其中细胞壁本身被封闭在外膜内。即，从外部环境进入微细胞的细胞质，分子首先遇到外膜(OM)，然后是细胞壁，最后是内膜(IM)。

在一些实施方案中，本公开教导了真细菌微细胞的OM、细胞壁或IM的破坏或降解。以非限制性实例的方式而言，使用此类处理以便增加或降低微细胞的免疫原性和/或改变渗透性特征。

在一些实施方案中，微细胞是(i)完好无缺的，(ii)原生质体(去除了外膜和细胞壁)，或(iii)原生质孔(poroplast)(去除了外膜或经透化)，其中发现了表面表达部分诸如膜相关蛋白、跨膜蛋白/结构域，和接头蛋白/结构域。在一些实施方案中，表面表达部分可以与酶活性多肽融合，所述酶活性多肽包括但不限于脂肪酶、磷脂酶、转酰酶、转氨酶、果胶酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、角质酶、酯酶、酰化酶、转化酶、异构酶、裂解酶、葡糖苷酶、氧化还原酶、转移酶、连接酶和酰胺酶。在其它实施方案中，酶活性多肽包括脂肪酶、葡萄糖异构酶、α淀粉酶、纤维素酶(内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶)、β淀粉酶、果胶裂解酶、异构酶、蛋白酶、转谷氨酰胺酶、去饱和酶、过氧化物酶、脂肪氧合酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、酪氨酸酶、脲酶、脱氢酶(例如醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、乙醛脱氢酶、醛脱氢酶、丙酮酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶)、木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶和漆酶。另外，酶活性多肽还包括淀粉葡糖苷酶、支链淀粉酶、环糊精-糖基转移酶、果胶甲基酯酶、葡萄糖氧化酶、乳糖酶、β-葡聚糖酶、乙酰乳酸脱羧酶、果胶酸裂解酶、腈水解酶和淀粉葡糖苷酶。在一些实施方案中，酶活性多肽是脂肪酶。在一些实施方案中，酶活性多肽是葡萄糖异构酶。

膜和/或细胞壁改变的真细菌细胞和微细胞称为“原生质孔”、“原生质球形体”和“原生质体”。在本文中，术语“原生质球形体”和“原生质体”是指由微细胞制备的原生质球形体和原生质体。相反，“细胞原生质球形体”和“细胞原生质体”是指由细胞制备的原生质球形体和原生质体。同样，如本文所用，术语“微细胞”不仅涵盖微细胞本身，而且还涵盖原生质孔、原生质球形体和原生质体。

在原生质孔中，已去除了真细菌外膜(OM)和LPS。在原生质球形体中，破坏的真细菌OM和/或破坏的细胞壁的一部分可能仍与微细胞的内膜相关，但是由于破坏的OM和细胞壁的渗透性已经增加，因此膜和细胞壁还是多孔的。当膜结构已经用剂处理或在一定条件下孵育，导致膜部分降解，从而增加其渗透性时，称膜被“破坏”。相反，出于适用的意图和目的，基本上去除了已经“降解”的膜。在优选的实施方案中，不管OM和细胞壁的状况如何，真细菌内膜都不会被破坏，并且内膜上展示的膜蛋白可接近与微细胞、原生质孔、原生质球形体、原生质体或细胞原生质孔接触的化合物。

包封

包封是将物质封闭在惰性材料中的过程，该惰性材料可以保护免受环境的影响，并控制活性化合物的释放。两种包封类型已得到很好的研究；1)纳米包封，即在另一种材料中涂覆纳米级大小的各种物质，和2)微包封，即与纳米包封类似，除了涉及更大的颗粒，并且比纳米包封进行了更长时间以外。包封是一种广泛应用于制药业、农业化学、食品业和化妆品中的新技术。

在一些实施方案中，利用包含真细菌、古细菌和真核细胞的基于无核细胞的平台来产生包封农业化合物。包括革兰氏阴性细菌、革兰氏阴性细菌和嗜极细菌在内的细菌细胞可以产生可以包封所需农业化合物的平台。无核细胞包括由本文公开的亲本细菌细胞天然地和/或通过本文教导的基因工程技术产生的微细胞。

本公开教导了使用细菌微细胞的益处，使用细菌微细胞简化了基于无核细胞的平台的纯化并降低了其包封成本。通过对农业化合物进行包封，保护化合物免受导致化合物降解并缩短化合物使用寿命的外部因素的影响。

当前的农业化学包封技术包括油、反相悬浮液、基于聚合物的纳米材料、基于脂质的纳米材料、多孔无机纳米材料和基于粘土的纳米材料。

使用COC(作物油浓缩物)和MSO(甲基化种子油)技术进行油包封。它们起到保湿剂的作用以使活性成分小滴移动通过喷嘴，并在外部重构小滴以防止活性成分蒸发。

反相悬浮液是一种油的亚类，提供包封在油壳中的水或被油涂层包围的水的悬浮液，该悬浮液用于在通过喷嘴头进行喷涂后将漂移性细屑(小于105微米)的产生减到最少。该技术在减少活性成分的漂移性细屑方面起作用。

基于聚合物的纳米材料由具有分散在聚合物基质内的纳米颗粒或纳米填料的聚合物组成。通常，聚合物是对比性的(一种疏水性，一种亲水性)，以保持两亲性。合成或天然聚合物(瓜尔胶)均可通过产生较大的喷雾颗粒来增加喷雾溶液的粘度并影响流变特性。基于聚合物的助剂增加了喷雾颗粒破碎的可能性，从而增加了漂移。但是，不建议将基于聚合物的漂移减少技术佐剂用于活性成分的空中应用。尽管它们具有有效的装载能力，但所需的聚合物昂贵，从而限制了可扩展性。

基于脂质的纳米材料具有包封亲水性、疏水性和亲脂性活性成分的巨大潜力，并且常用于制药领域。但是，可扩展的生产受到成本的极大限制。

多孔无机纳米材料，诸如二氧化硅纳米颗粒，可以有效地包封生物活性分子，但是在生物降解性和可扩展性方面面临局限性。这些聚合物包被的纳米颗粒受到各种限制，诸如热和化学稳定性差，被植物酶系统快速消除以及某些聚合物的降解，导致在聚合物基质中形成酸性单体和降低的pH值。粘土纳米颗粒在经济上可行，并为开发多功能纳米载体材料提供了巨大机遇，但是能源密集型的，需要高热量才能进行生产。这些替代方案无法进行轻易修改以提供向植物的靶向递送。

在一些实施方案中，基于无核细胞的微细胞平台在成本和生物降解性方面具有优势。通过常见的工业发酵实践，可以容易地扩展微细胞平台。一经扩展，就可以通过一系列离心和/或过滤步骤对其纯化。碳水化合物结合模块向微细胞表面的自组装显著降低了制备靶向生物颗粒的成本。另外，就对于植物和环境使用的生物相容性方面，基于无核细胞的微细胞平台与其它包封技术相比具有优势；这是因为基于无核细胞的微细胞平台是由施加区域天然的安全、常见微生物衍生而来的，并且可以安全地生物降解以供生态系统再利用。这种适于可扩展、无毒递送的平台可以在农业领域发挥重要作用。

为了解决常规农用化学品在到达其预期靶标之前容易降解或蒸发的问题，本公开提供了一种用于包封和递送农业化合物的基于无核细胞的平台，目的是保护生物活性免受外界因素的影响，直到将化合物施加至靶标并缓慢释放至预期靶标。使用所公开的基于微细胞的包封和递送平台避开了农用化学品通常损失到环境中的各种机制。这是因为微细胞的脂质双层充当抵抗恶劣环境条件的有效保护层。具体而言，微细胞内部活性物质的内化保护化合物免受温度、pH值的急剧变化或强光暴露的影响。换句话说，微细胞保护化合物免于挥发、光解降解和水解。因此，农业化合物可以保持受到保护免受不利的外部因素影响，并且可以通过包封目标农业化合物的基于微细胞的平台向预期靶标逐渐和/或受控释放。

此外，本公开的另一个益处提供了用于包封和递送农业化合物的基于无核细胞的平台，即该平台提供了针对植物及其微环境改进和增强的靶向能力。由于降解和蒸发，农用化学品损失严重。另一方面，农用化学品也会通过从植物中漂流并浸入土壤和地下水系统，然后通过雾化离去，从而损失甚至污染环境。基于微细胞的生物颗粒的外膜的固有表面化学性质天然模拟细菌外膜的固有表面化学性质。这很重要，因为在植物叶片、茎的表面及其根系中的微生物组中，有许多类型的共生细菌。通过使用基于微细胞的平台，微细胞的生物膜可以对植物的各个表面具有天然粘附力。该特征允许递送靶向粘附于植物表面和植物根系周围的土壤微环境的微细胞底盘(chassis)中包封的农用化学品。除了依赖基于微细胞的生物颗粒对植物的天然粘附力之外，本公开教导了使用遗传工程来产生与微细胞膜上的特异性结合结构域融合的表面表达部分。以这种方式，其靶向植物或有害生物的能力得以显著增强。

在一些实施方案中，本公开提供了遗传工程技术，以制备具有使微细胞表面的结合结构域/基序功能化的基于微细胞的平台。包含特异性结合结构域和/或基序的蛋白质在微细胞表面表达，并特异性靶向植物或有害生物表面存在的结合位点。

在一些实施方案中，基于微细胞的平台可以通过具有碳水化合物结合模块(CBM)的蛋白质进行功能化，这些碳水化合物结合模块可以靶向并结合碳水化合物，诸如纤维素、木聚糖、几丁质和木质素，这些碳水化合物是植物细胞壁的重要且普遍存在的结构组分。因为CBM可以识别其存在于受试者(例如植物或有害生物)上的结合位点，所以包含功能化结合结构域的基于微细胞的平台允许以高特异性进行靶向。

在一些实施方案中，CBM的使用不限于农业用途。CBM可用于通过纤维素柱的方式纯化活性成分或生物分子。作为基于微细胞的平台的表面化学的补充，生物颗粒的相对质量还可以显著减轻由于雾化和浸出而导致的活性化合物的脱靶暴露。通过在喷雾之前将活性物质浓缩并包封在相对较大的微细胞底盘中，与喷洒自由漂浮的化合物相比，该化合物不易受到风引起的雾化或漂移的影响。此外，微细胞包封和递送平台的较大尺寸可以减轻活性物质通过土壤向地下水源的浸出。

农业化合物

本公开提供了用于包封和递送农业化合物的基于无核细胞的平台。在一些实施方案中，农业化合物包括农用化学品。

如本文所用，术语“农用化学品”意指天然或合成获得的化学物质，将其施加至植物、有害生物或其某一位置以引起表达所需的生物活性。如本文所用，术语“生物活性”意指在植物中或在植物中或植物上存在的有害生物诸如病原体、寄生虫或取食生物中引发刺激、抑制、调节、治疗、毒性或致死反应，或在植物、有害生物或结构的某一位置引发此类反应。术语“植物”包括但不限于所有粮食、纤维、饲料和饲料作物(收获前和收获后，种子和种子处理)、树木、草皮和观赏植物。农用化学品的实例包括但不限于化学灭害剂(诸如除草剂、杀藻剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀病毒剂、杀昆虫剂、杀螨剂、杀疥虫剂、杀线虫剂和杀软体动物剂)、除草剂安全剂、植物生长调节剂(诸如激素和细胞生长剂)、肥料和营养素、杀配子剂、脱叶剂、干燥剂、其混合物等。

在一些实施方案中，农业化合物包括但不限于灭害剂、除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、肥料、营养素、植物生长调节剂诸如激素或化学生长剂，及其组合。

灭害剂/杀昆虫剂

在一些实施方案中，用于稳定和靶向递送农业化合物的组合物包含根据本文所述的方法产生的和/或具有至少一种如本文所述的非表达的农业化合物的无核细胞。所述组合物包括一种或多种杀昆虫剂/灭害剂。灭害剂/杀昆虫剂包括但不限于碳酸铵、硅酸钾水溶液、硼酸、硫酸铜、元素硫、石硫合剂、蔗糖辛酸酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、阿维菌素(abamectin)、notenone、喹螨醚(fenazaquin)、唑螨酯(fenpyroximate)、哒螨灵(pyridaben)、嘧螨醚(pyrimedifen)、替布吡螨胺(tebufenpyrad)、唑虫酰胺(tolfenpyrad)、乙酰甲胺磷(acephate)、苯甲酸甲胺基阿维菌素酯(emamectin benzoate)、雷皮菌素(lepimectin)、密灭汀(milbemectin)、烯虫乙酯(hdroprene)、烯虫炔酯(kinoprene)、甲氧普林(methoprene)、苯氧威(fenoxycarb)、吡丙醚(pyriproxyfen)、甲基溴和其它烷基卤、氟酰氟(fulfuryl fluoride)、氯化苦(chloropicrin)、硼砂(borax)、八硼酸二钠、硼酸钠、偏硼酸钠、吐酒石(tartar emetic)、棉隆(dazomet)、威百亩(metam)、新喹唑啉(pyrifluquinazon)、氟苯氧噻嗪(flofentezine)、氟螨嗪(diflovidazin)、噻螨酮(hexythiazox)、联苯肼酯(bifenazate)、噻虫嗪(thiamethoxam)、唑螨酯(fenpyroximate)、印楝素(azadirachtin)、苄氯菊酯(permethrin)、高氰戊菊酯(esfenvalerate)、啶虫脒(acetamiprid)、印楝素、除虫菊酯(pyrethrin)、吡虫啉(imidicloprid)、高效氟氯氰菊酯(beta-cyfluthrin)、硫特普(sulfotep)、丁基嘧啶磷(tebupirimfos)、双硫磷(temephos)、特丁硫磷(terbufos)、杀虫畏(tetrachlorvinphos)、甲基乙拌磷(thiometon)、***磷(triazophos)、棉铃威(alanycarb)、涕灭威(aldicarb)、恶虫威(bendiocarb)、丙硫克百威(benfluracarb)、丁酮威(butocarboxim)、丁酮砜威(butoxycarboxim)、西维因(carbaryl)、克百威(carbofuran)、丁硫克百威(carbosulfan)、乙硫苯威(ethiofencarb)、仲丁威(fenobucarb)、伐虫脒(formetanate)、呋线威(furathiocarb)、异丙威(isoprocarb)、甲硫威(methiocarb)、灭多威(methymyl)、速灭威(metolcarb)、杀线威(oxamyl)、抗蚜威(primicarb)、残杀威(propoxur)、硫双威(thiodicarb)、久效威(thiofanox)、唑蚜威(triazamate)、三甲威(trimethacarb)、XMC、灭杀威(xylylcarb)、乙酰甲胺磷(acephate)、甲基吡啶磷(azamethiphos)、乙基谷硫磷(azinphos-ethyl)、甲基谷硫磷(azinphos-methyl)、硫线磷(cadusafos)、chlorethoxyfox、敌百虫(trichlorfon)、蚜灭多(vamidothion)、氯丹(chlordane)、硫丹(endosulfan)、乙虫腈(ethiprole)、氟虫腈(fipronil)、阿纳宁(acrinathrin)、丙烯菊酯(allethrin)、生物丙烯菊酯(bioallethrin)、X-环戊烯基生物丙烯菊酯(bioalletherin X-cyclopentenyl)、生物苄呋菊酯(bioresmethrin)、乙氰菊酯(cyclorothrin)、氟氯氰菊酯(cyfluthrin)、三氟氯氰菊酯(cyhalothrin)、氯氰菊酯(cypermethrin)、苯氰菊酯(cyphenothrin)[(1R)-反式异构体]、溴氰菊酯(deltamethrin)、烯炔菊酯(empenthrin)[(EZ)-(1R)-异构体]、高氰戊菊酯、醚菊酯(etofenprox)、甲氰菊酯(fenpropathrin)、氰戊菊酯(fenvalerate)、氟氰戊菊酯(flucythrinate)、氟氯苯菊酯(flumethrin)、苄螨醚(halfenprox)、kadathrin、苯醚菊酯(phenothrin)[(1R)-反式异构体]炔丙菊酯(prallethrin)、除虫菊素(pyrethrins)(除虫菊(pyrethrum))、苄呋菊酯(resmethrin)、氟硅菊酯(silafluofen)、七氟菊酯(tefluthrin)、胺菊酯(tetramethrin)、胺菊酯[(1R)-异构体]、四溴菊酯(tralomethrin)、四氟苯菊酯(transfluthrin)、α-氯氰菊酯(alpha-cypermethrin)、β-氟氯氰菊酯(beta-cyfluthrin)、β-氯氰菊酯(beta-cypermethrin)、d-顺-反式丙烯菊酯(d-cis-transallethrin)、d-反式丙烯菊酯(d-trans allethrin)、γ-三氟氯氰菊酯(gamma-cyhalothrin)、λ-三氟氯氰菊酯(lamda-cyhalothrin)、τ-氟胺氰菊酯(tau-fluvalinate)、θ-氯氰菊酯(theta-cypermethrin)、ζ-氯氰菊酯(zeta-cypermethrin)、甲氧氯(methoxychlor)、尼古丁(nicotine)、砜虫啶(sulfoxaflor)、啶虫脒(acetamiprid)、噻虫胺(clothianidin)、呋虫胺(dinotefuran)、烯啶虫胺(nitenpyram)、噻虫啉(thiacloprid)、噻虫嗪(thiamethoxan)、丁基嘧啶磷(tebuprimphos)、β-氟氯氰菊酯(beta-cyfluthrin)、噻虫胺(clothianidin)、氟啶虫酰胺(flonicamid)、氟蚁腙(hydramethylnon)、双甲脒(amitraz)、氟虫双酰胺(flubendiamide)、blorantraniliprole、λ-三氟氯氰菊酯(lambda cyhalothrin)、多杀菌素(spinosad)、γ-三氟氯氰菊酯(gamma cyhalothrin)、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、辣椒油树脂提取物(capsicum oleoresin)、大蒜油、西维因(carbaryl)、毒死蜱(chlorpyrifos)、砜虫啶(sulfoxaflor)、λ-三氟氯氰菊酯、毒虫畏(Chlorfenvinphos)、氯甲磷(Chlormephos)、毒死蜱、甲基毒死蜱、蝇毒磷(Coumaphos)、杀螟腈(Cyanophos)、甲基内吸磷(Demeton-S-methyl)、二嗪农(Diazinon)、敌敌畏(Dichlorvos)/DDVP、百治磷(Dicrotophos)、乐果(Dimethoate)、甲基毒虫畏(Dimethylvinphos)、乙拌磷(Disulfoton)、EPN、乙硫磷(Ethion)、灭线磷(Ethoprophos)、伐灭磷(Famphur)、苯线磷(Fenamiphos)、杀螟硫磷(Fenitrothion)、倍硫磷(Fenthion)、噻唑磷(Fosthiazate)、庚烯磷(Heptenophos)、Imicyafos、异柳磷(Isofenphos)、O-(甲氧基氨基硫-磷酰基)水杨酸异丙酯、异噁唑磷(Isoxathion)、马拉硫磷(Malathion)、灭蚜磷(Mecarbam)、甲胺磷(Methamidophos)、杀扑磷(Methidathion)、速灭磷(Mevinphos)、久效磷(Monocrotophos)、二溴磷(Naled)、氧化乐果(Omethoate)、乙酰甲胺磷(Oxydemeton-methyl)、对硫磷(Parathion)、甲基对硫磷(Parathion-methyl)、稻丰散(Phenthoate)、甲拌磷(Phorate)、伏杀磷(Phosalone)、亚胺硫磷(Phosmet)、磷胺(Phosphamidon)、辛硫磷(Phoxim)、甲基嘧啶磷(Pirimiphos-methyl)、丙溴磷(Profenofos)、胺丙畏(Propetamphos)、丙硫磷(Prothiofos)、吡唑硫磷(Pyraclofos)、哒嗪硫磷(Pyridaphenthion)、喹硫磷嘧螨酯(Quinalphosfluacrypyrim)、虫酰肼(tebufenozide)、氯虫苯甲酰胺(chlorantraniliprole)、苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subs.Kurstaki)、特丁硫磷(terbufos)、矿物油、甲氰菊酯(fenpropathrin)、四聚乙醛(metaldehyde)、溴氰菊酯(deltamethrin)、二嗪农、乐果、除虫脲(diflubenzuron)、吡丙醚(pyriproxyfen)、迷迭香油、薄荷油、香叶醇(geraniol)、印楝素、胡椒基丁醚(piperonyl butoxide)、溴氰虫酰胺(cyantraniliprole)、α-氯氰菊酯(alpha cypermethrin)、七氟菊酯(tefluthrin)、马拉硫磷(malathion)、苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp.israelensis)、三氯杀螨醇(dicofol)、溴螨酯(bromopropylate)、苯螨特(benzoximate)、印楝素、氟啶虫酰胺(flonicamid)、大豆油、紫色细菌(Chromobacterium subtsugae)菌株PRAA4-1、ζ-氯氰菊酯(zeta cypermethrin)、亚胺硫磷(phosmet)、甲氧虫酰肼(methoxyfenozide)、石蜡油、螺虫乙酯(spirotetramat)、灭多虫(methomyl)、绿僵菌(Metarhizium anisopliae)菌株F52、灭线磷、三氯杀螨砜(tetradifon)、克螨特(propargite)、苯丁锡、***锡(azocyclotin)、三环锡(cyhexatin)、丁醚脲(diafenthiuron)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、乙螨唑(etoxazole)、氟吡呋喃酮(flupyradifurone)、印楝素、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、丁氟螨酯(cyflumetofen)、印楝素、灭螨猛(chinomethionat)、高灭磷(acephate)、玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)Apopka菌株97、十水四硼酸钠(sodium tetraborohydratedecahydrate)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(emamectin benzoate)、冰晶石(cryolite)、乙基多杀菌素(spinetoram)、土荆芥(Chenopodium ambrosioides)提取物、呋虫胺(dinotefuran)、西维因(carbaryl)、灭螨醌(acequinocyl)、氟吡呋喃酮(flupyradifurone)、磷酸铁、高岭土、噻嗪酮、灭蝇胺(cyromazine)、环虫酰肼(chromafenozide)、氯虫酰肼(halofenozide)、甲氧虫酰肼(methoxyfenozide)、虫酰肼(tebufenozide)、双三氟虫脲(bistrifluron)、定虫隆(chlorfluazuron)、除虫脲(diflubenzuron)、氟环脲(flucycloxuron)、氟虫脲、氟铃脲(hexaflumuron)、氯芬奴隆(lufenuron)、双苯氟脲(nocaluron)、多氟脲(noviflumuron)、氟苯脲(teflubenzuron)、杀铃脲(triflumuron)、杀虫磺(bensultap)、杀螟丹盐酸盐(cartap hydrochloride)、杀虫环(thiocyclam)、杀虫双(thiosultap-sodium)、DNOC、溴虫腈(chlorfenapyr)、氟虫胺(sulfuramid)、甲拌磷(phorate)、唑虫酰胺(tolfenpyrad)、砜虫啶(sulfoxaflor)、印楝油(neem oil)、苏云金芽孢杆菌拟步甲亚种(Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis)菌株SA-10、灭蝇胺(cyromazine)、热灭活伯克霍尔德菌(Burkholderia spp.)、溴氰虫酰胺(cyantraniliprole)、腈吡螨酯(cyenopyrafen)、丁氟螨酯(cyflumetofen)、***、***、氰化钙、磷化铝、磷化钙、磷化氢(phosphine)、磷化锌、螺螨酯(spriodiclofen)、螺甲螨酯(spiromesifen)、螺虫乙酯(spirotetramat)、氰氟虫腙(metaflumizone)、氟虫双酰胺(flubendiamide)、pyflubumide、杀线威(oxamyl)、苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种(Bacillusthuringiensis subsp.aizawai)、乙螨唑(etoxazole)和高氰戊菊酯。

除草剂

在一些实施方案中，用于稳定和靶向递送农业化合物的组合物包含根据本文所述的方法产生的和/或具有至少一种如本文所述的非表达的农业化合物的无核细胞。所述组合物包括一种或多种除草剂。除草剂包括但不限于2,4-D、2,4-DB、乙草胺(acetochlor)、三氟羧草醚(acifluorfen)、甲草胺(alachlor)、阿灭净(ametryn)、莠灭净(atrazine)、氯氨吡啶酸(aminopyralid)、氟草胺(benefin)、苄嘧磺隆(bensulfuron)、地散磷(bensulide)、苯达松(bentazon)、除草定(bromacil)、溴草腈(bromoxynil)、丁草特(butylate)、唑草酮(carfentrazone)、氯嘧磺隆(chlorimuron)、氯磺隆(chlorsulfuron)、烯草酮(clethodim)、异噁草松(clomazone)、二氯吡啶酸(clopyralid)、氯酯磺草胺(cloransulam)、环草敌(cycloate)、DCPA、甜菜安(desmedipham)、麦草畏(dicambia)、敌草腈(dichlobenil)、禾草灵(diclofop)、双氯磺草胺(diclosulam)、氟吡草腙(diflufenzopyr)、二甲吩草胺(dimethenamid)、敌草快(diquat)、敌草隆(diuron)、DSMA、草多索(endothall)、EPTC、丁氟消草(ethalfluralin)、甜菜呋(ethofumesate)、噁唑禾草灵(fenoxaprop)、精吡氟禾草(fluazifop-P)、氟酮磺隆(flucarbzone)、氟噻草胺(flufenacet)、唑嘧磺草胺(flumetsulam)、氟烯草酸(flumiclorac)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、伏草隆(fluometuron)、使它隆(fluroxypyr)、氟磺胺草醚(fomesafen)、甲酰胺磺隆(foramsulfuron)、草铵膦(glufosinate)、草甘膦(glyphosate)、氯吡嘧磺隆(halosulfuron)、环嗪酮(hexazinone)、咪草酯(imazamethabenz)、甲氧咪草烟(imazamox)、甲基咪草烟(imazapic)、灭草喹(imazaquin)、咪草烟(imazethapyr)、异噁唑草酮(isoxaflutole)、乳氟禾草灵(lactofen)、利谷隆(linuron)、MCPA、MCPB、硝磺草酮(mesotrione)、S-异丙甲草胺(metolachlor-s)、嗪草酮(metribuzin)、茚嗪氟草胺(indaziflam)、甲磺隆(metsulfuron)、草达灭(molinate)、MSMA、敌草胺(napropamide)、抑草生(naptalam)、烟嘧磺隆(nicosulfuron)、达草灭(norflurazon)、黄草消(oryzalin)、噁草酮酸(oxadiazon)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、百草枯(paraquat)、壬酸(pelargonicacid)、二甲戊乐灵(pendimethalin)、甜菜宁(phenmedipham)、毒莠定(picloram)、氟嘧磺隆(primisulfuron)、氨氟乐灵(prodiamine)、扑草净(prometryn)、拿草特(pronamide)、敌稗(propanil)、氟磺隆(prosulfuron)、吡唑啉(pyrazon)、嘧草硫醚(pyrithioac)、快杀稗(quinclorac)、喹禾灵(quizalofop)、玉嘧磺隆(rimsulfuron)、烯禾啶(sethoxydim)、环草隆(siduron)、西玛津(simazine)、甲磺草胺(sulfentrazone)、甲嘧磺隆(sulfometuron)、磺酰磺隆(sulfosulfuron)、特丁噻草隆(tebuthiuron)、特草定(terbacil)、噻草定(thiazopyr)、噻吩磺隆(thifensulfuron)、禾草丹(thiobencarb)、肟草酮(tralkoxydim)、野麦畏(triallate)、醚苯磺隆(triasulfuron)、苯磺隆(tribenuron)、绿草定(triclopyr)、氟乐灵(trifluralin)和氟胺磺隆(triflusulfuron)。

杀真菌剂

在一些实施方案中，用于稳定和靶向递送农业化合物的组合物包含根据本文所述的方法产生的和/或具有至少一种如本文所述的非表达的农业化合物的无核细胞。所述组合物包括一种或多种杀真菌剂。杀真菌剂包括但不限于克菌丹(captan)、萎锈灵(carboxin)、噻唑菌胺(ethaboxam)、咯菌腈(fludioxonil)、精甲霜灵(mefenoxam)、咯菌腈、噻苯咪唑(thiabendazole)、噻苯达唑(thiabendaz)、种菌唑(ipconazole)、氰霜唑(cyazofamid)、氯氧菌胺(zoxamide)、甲霜灵(metalaxyl)、PCNB、甲环唑(metaconazole)、唑菌胺酯(pyraclostrobin)、枯草芽孢杆菌菌株QST 713、氟唑环菌胺(sedaxane)、噻虫嗪(thiamethoxam)、咯菌腈(fludioxonil)、福美双(thiram)、甲基立枯磷(tolclofos-methyl)、肟菌酯(trifloxystrobin)、枯草芽孢杆菌菌株MBI 600、唑菌胺酯(pyraclostrobin)、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株QST 2808、百菌清(chlorothalonil)、铜、粉唑醇(flutriafol)、氟唑菌酰胺(fluxapyroxad)、gludioxonil、吡噻菌胺(penthiopyrad)、***(triazole)、丙环唑(propiconaozole)、戊唑醇(tebuconazole)、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、唑菌胺酯(pyraclostrobin)、啶氧菌酯(picoxystrobin)、(qols)、四氟醚唑(tetraconazole)、肟菌酯(trifloxystrobin)、环丙唑醇(cyproconazole)、粉唑醇、SDHI、EBDC、氟唑环菌胺(sedaxane)、MAXIM QUATTRO(gludioxonil、精甲霜灵(mefenoxam)和噻苯达唑)、RAXIL(戊唑醇、甲霜灵和乙氧基化牛脂基伯胺)和苯丙烯氟菌唑(benzovindiflupyr)。

在一些实例中，杀真菌剂可以包括化学或生物的，可以抑制真菌生长或杀伤真菌的化合物或剂。在一些实例中，杀真菌剂可包括具有抑真菌或杀真菌作用的化合物。在一些实例中，杀真菌剂可以是保护剂，或主要在种子表面上有效的剂，提供针对种子表面传播的病原体的保护并提供对土壤传播的病原体的一定水平的控制。保护剂杀真菌剂的非限制性实例包括克菌丹、代森锰(maneb)、福美双或咯菌腈。

在一些实例中，杀真菌剂可以是系统性杀真菌剂，包括但不限于以下：萎锈灵、精甲霜灵、甲霜灵、噻苯咪唑、肟菌酯，和各种***类杀真菌剂，包括苯醚甲环唑(difenoconazole)、种菌唑(ipconazole)、戊唑醇(tebuconazole)和灭菌唑(triticonazole)。精甲霜灵和甲霜灵主要用于靶向水霉真菌腐霉属(Pythium)和疫霉属(Phytophthora)。根据植物种类，一些杀真菌剂比其它杀真菌剂更优选，这是因为病原真菌种类的敏感性存在细微差异，或者是因为植物的杀真菌剂分布或敏感性存在差异。在一些实例中，杀真菌剂可以是生物防治剂，诸如细菌或真菌。此类生物可以寄生于病原真菌，或者分泌毒素或可以杀伤或以其它方式阻止真菌生长的其它物质。

杀线虫剂

在一些实施方案中，用于稳定和靶向递送农业化合物的组合物包含根据本文所述的方法产生的和/或具有至少一种如本文所述的非表达的农业化合物的无核细胞。所述组合物可包括一种或多种杀线虫剂。杀线虫剂包括但不限于D-D、1,3-二氯丙烯、二溴化乙烯、1,2-二溴-3-氯丙烷、甲基溴、氯化苦(chloropicrin)、威百亩(metam sodium)、棉隆(dazomet)、甲基异硫氰酸酯、四硫代碳酸钠、涕灭威、涕灭砜威(aldoxycarb)、克百威(carbofuran)、杀线威、灭线磷、苯线磷、硫线磷、噻唑磷、特丁硫磷、丰索磷(fensulfothion)、甲拌磷、DiTera、壳多糖(clandosan)、(sincocin)、甲基碘、炔丙基溴、2,5-二羟基甲基-3,4-二羟基吡咯烷酮(DMDP)、任何一种或多种阿维菌素、叠氮化钠、糠醛、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、阿巴菌素(abamectrin)、噻虫嗪(thiamethoxam)、咯菌腈、clothiandin、水杨酸和苯并-(1,2,3)-噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯。

肥料

在一些实施方案中，用于稳定和靶向递送农业化合物的组合物包含根据本文所述的方法产生的和/或具有至少一种如本文所述的非表达的农业化合物的无核细胞。所述组合物可包括一种或多种肥料。例如，肥料可用于帮助促进生长或为种子、幼苗或植株提供营养素。肥料的非限制性实例包括氮、磷、钾、钙、硫、镁、硼、氯化物、锰、铁、锌、铜、钼和硒(或其盐)。肥料的其它实例包括一种或多种氨基酸、盐、碳水化合物、维生素、葡萄糖、NaCl、酵母提取物、NH₄H₂PO₄、(NH₄)₂SO₄、甘油、缬氨酸、L-亮氨酸、乳酸、丙酸、琥珀酸、苹果酸酸、柠檬酸、酒石酸氢钾、木糖、山梨糖和卵磷脂。可用于实施方案中的肥料的其它实例包括硝酸铵、硫酸铵、无水氨、硝酸钙/尿素、草酰胺(oxamide)、硝酸钾、尿素、硫酸脲、氨化过磷酸钙、磷酸二铵、硝酸磷肥、碳酸钾、偏磷酸钾、氯化钙、磷酸镁铵、硫酸镁、硫酸铵、硫酸钾和本文公开的其它肥料。

生长调节剂

在一些实施方案中，用于稳定和靶向递送农业化合物的组合物包含根据本文所述的方法产生的和/或具有至少一种如本文所述的非表达的农业化合物的无核细胞。所述组合物可包括一种或多种生长调节剂。生长调节剂包括但不限于脱落酸、先甲草胺(amidochlor)、嘧啶醇(ancymidol)、6-苄氨基嘌呤、芸苔甾内酯(brassinolide)、仲丁灵(butralin)、矮壮素(chlormequat)(氯化矮壮素)、氯化胆碱、环丙酰草胺(cyclanilide)、丁酰肼(daminozide)、调呋酸(dikegulac)、噻节因(dimethipin)、2,6-二甲基吡啶、乙烯利(ethephon)、氟节胺(flumetralin)、氟嘧醇(flurprimidol)、嗪草酸(fluthiacet)、氯吡脲(forchlorfenuron)、赤霉酸(gibberellic acid)、抗倒胺(inabenfide)、吲哚-3-乙酸、马来酰肼、氟磺酰草胺(mefluidide)、助壮素(mepiquat)(氯化助壮素)、萘乙酸、N-6-苄基腺嘌呤、多效唑(paclobutrazol)、调环酸三硫代磷酸酯(prohexadionephosphorotrithioate)、2,3,5-三-碘苯甲酸、抗倒酯(trinexapac-ethyl)和烯效唑(uniconazole)。生长调节剂的其它非限制性实例包括油菜素类固醇、细胞***素(例如，激动素(kinetin)和玉米素(zeatin))、生长素(例如，吲哚乙酸和吲哚基乙酰天冬氨酸)、类黄酮和异类黄酮(例如，刺芒柄花素(formononetin)和香叶木素(diosmetin))、植保素(例如，glyceolline)和诱导植物抗毒素的寡糖(例如，果胶、几丁质、壳聚糖、聚半乳糖醛酸和低聚半乳糖醛酸)和吉贝素(gibellerin)。此类剂与施加调配物的农业种子或幼苗理想相容(例如，它不应对植物的生长或健康有害)。此外，所述剂理想地是不会引起人、动物或工业使用的安全性问题的剂(例如，没有安全问题，或者该化合物足够不稳定以致源自该植物的商品植物产品包含可忽略不计的量的化合物)。

营养素的一些实例可以选自氮肥，包括但不限于尿素、硝酸铵、硫酸铵、无压氮溶液、氨水、无水氨、硫代硫酸铵、裹硫尿素、尿素-甲醛、IBDU、聚合物包膜尿素、硝酸钙、脲醛和亚甲脲；磷肥诸如磷酸氢二铵、磷酸一铵、多磷酸铵、浓缩过磷酸钙和三过磷酸钙；以及钾肥诸如氯化钾、硫酸钾、硫酸钾镁、硝酸钾。此类组合物可以在种衣组合物中作为游离盐或离子存在。替代性地，营养素/肥料可以复合或螯合以随时间推移提供持续释放。

其它农业化合物

在一些实施方案中，灭鼠剂的一些实例可以包括选自由以下组成的物质的组：2-异戊酰茚满-1,3-二酮、4-(喹喔啉-2-基氨基)苯磺酰胺、α-氯代醇、磷化铝、安妥(antu)、氧化砷、碳酸钡、双鼠脲(bisthiosemi)、溴鼠灵(brodifacoum)、溴敌隆(bromadiolone)、溴鼠胺(bromethalin)、氰化钙、氯醛糖(chloralose)、氯鼠酮(chlorophacinone)、胆钙化醇(cholecalciferol)、氯杀鼠灵(coumachlor)、克鼠灵(coumafuryl)、杀鼠迷(coumatetralyl)、鼠立死(crimidine)、鼠得克(difenacoum)、噻鼠酮(difethialone)、敌鼠(diphacinone)、麦角钙化醇(ergocalciferol)、氟鼠灵(flocoumafen)、氟乙酰胺(fluoroacetamide)、氟鼠啶(flupropadine)、氟鼠啶盐酸盐、氰化氢、碘甲烷、林丹(lindane)、磷化镁、甲基溴、鼠特灵(norbormide)、毒鼠磷(phosacetim)、磷化氢(phosphine)、磷、杀鼠酮(pindone)、***、灭鼠优(pyrinuron)、海葱葡苷(scilliroside)、***、***、氟乙酸钠、***(strychnine)、硫酸铊、华法林(warfarin)和磷化锌。

在一些实施方案中，防治剂具有抗细菌性。具有抗细菌性的防治剂包括但不限于链霉素(Streptomycin)、土霉素(oxytetracycline)、欧索林酸(oxolinic acid)或庆大霉素(gentamicin)。抗细菌化合物的其它实例包括基于菌霉净(dichlorophene)和苄醇半缩醛的抗细菌化合物(来自ICI的或来自Thor Chemie的 RS和来自Rohm&Haas的 MK 25)以及异噻唑啉酮(isothiazolinone)衍生物，诸如烷基异噻唑啉酮和苯并异噻唑啉酮(来自Thor Chemie的 MBS)。

示例性农业化合物包括：水果/蔬菜除草剂：莠灭净、除草定、敌草隆、草甘膦、利谷隆、嗪草酮、西玛津、氟乐灵、吡氟禾草、草铵膦、氯吡嘧磺隆Gowan、百草枯、戊炔草胺(Propyzamide)、烯禾啶、氟丙嘧草酯(Butafenacil)、氯吡嘧磺隆、茚嗪氟草胺；水果/蔬菜杀昆虫剂：涕灭威、苏云金芽孢杆菌、西维因、克百威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、二嗪农、马拉硫磷、阿维菌素、氟氯氰菊酯/高效氟氯氰菊酯、高氰戊菊酯、λ-三氟氯氰菊酯、灭螨醌、联苯肼酯、甲氧虫酰肼、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、嘧螨酯、唑虫酰胺、噻虫胺、螺螨酯、γ-三氟氯氰菊酯、螺甲螨酯、多杀菌素、氯虫酰胺(Rynaxypyr)、溴氰虫酰胺(Cyazypyr)、乙基多杀菌素(Spinoteram)、杀铃脲、螺虫乙酯、氟虫双酰胺、硫双威、氰氟虫腙、砜虫啶、丁氟螨酯、腈吡螨酯(Cyanopyrafen)、噻虫胺、噻虫嗪、乙基多杀菌素(Spinotoram)、硫双威、氟啶虫酰胺、甲硫威、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、噻唑膦(Forthiazate)、苯线磷、硫线磷(Cadusaphos)、吡丙醚(Pyriproxifen)、苯丁锡、噻螨酮(Hexthiazox)、灭多虫、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮；水果蔬菜杀真菌剂：多菌灵(Carbendazim)、百菌清、EBDC、硫、甲基硫菌灵、霜脲氰(Cymoxanil)、氟啶胺(Fluazinam)、三乙膦酸(Fosetyl)、异菌脲(Iprodione)、醚菌酯(Kresoxim-methyl)、甲霜灵/精甲霜灵、肟菌酯、噻唑菌胺、异丙菌威(Iprovalicarb)、肟菌酯、环酰菌胺(Fenhexamid)、噁咪唑富马酸盐(Oxpoconazole fumarate)、氰霜唑、咪唑菌酮(Fenamidone)、氯氧菌胺、啶氧菌酯、唑菌胺酯、环氟菌胺(Cyflufenamid)、啶酰菌胺(Boscalid)；谷物除草剂：异丙隆(Isoproturon)、溴草腈、碘苯腈(loxynil)、Phenoxies、氯磺隆、炔草酯(Clodinafop)、禾草灵、吡氟酰草胺(Diflufenican)、噁唑禾草灵、双氟磺草胺(Florasulam)、氟草定(Fluoroxypyr)、甲磺隆、醚苯磺隆、氟唑磺隆(Flucarbazone)、lodosulfuron、丙苯磺隆(Propoxycarbazone)、氟吡酰草(Picolin-afen)、甲基二磺隆(Mesosulfuron)、氟丁酰草胺(Beflubutamid)、唑啉草酯(Pinoxaden)、酰嘧磺隆(Amidosulfuron)、噻吩磺隆(Thifensulfuron Methyl)、苯磺隆、氟啶嘧磺隆(Flupyrsulfuron)、磺酰磺隆、磺酰草吡唑(Pyrasulfotole)、啶磺草胺(Pyroxsulam)、氟噻草胺、肟草酮、砜吡草唑(Pyroxasulfon)；谷物杀真菌剂：多菌灵、百菌清、环丙唑醇、嘧菌环胺(Cyprodinil)、丁苯吗啉(Fenpropimorph)、氟环唑(Epoxiconazole)、醚菌酯(Kresoxim-methyl)、喹氧灵(Quinoxyfen)、戊唑醇、肟菌酯、硅氟唑(Simeconazole)、啶氧菌酯、唑菌胺酯、醚菌胺(Dimoxystrobin)、氟嘧菌酯；谷物杀昆虫剂：乐果、λ-三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、α-氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺(Dinetofuran)、Clorphyriphos、甲胺磷(Metamidophos)、乙酰甲胺磷(Oxidemethon methyl)、抗蚜威(Pirimicarb)、甲硫威；玉米除草剂：莠灭净、甲草胺、溴草腈、乙草胺(Acetochlor)、麦草畏(Dicamba)、二氯吡啶酸、S-二甲吩草胺(S-Dimethenamid)、草铵膦、草甘膦、异噁唑草酮、S-异丙甲草胺、硝磺草酮、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、玉嘧磺隆、磺草酮(Sulcotrione)、甲酰胺磺隆、苯吡唑草酮(Topramezone)、环磺酮(Tembotrione)、苯嘧磺草胺(Saflufenacil)、噻酮磺隆(Thiencarbazone)、氟噻草胺、砜吡草唑；玉米杀昆虫剂：克百威、毒死蜱、氟虫腈、λ-三氟氯氰菊酯、七氟菊酯、特丁硫磷、噻虫嗪、噻虫胺、螺甲螨酯、氟虫双酰胺、杀铃脲、氯虫酰胺、溴氰菊酯、硫双威、β-氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氯芬奴隆、杀虫隆(Triflumoron)、七氟菊酯、丁基喃啶磷(Tebupirim-phos)、乙虫腈、溴氰虫酰胺、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、阿维菌素、甲硫威、螺螨酯、螺虫乙酯；玉米杀真菌剂：种衣酯(Fenitropan)、福美双、戊唑醇、肟菌酯；水稻除草剂：丁草胺(Butachlor)、敌稗、四唑嘧磺隆(Azimsulfuron)、苄嘧磺隆、氰氟草酯(Cyhalo-fop)、杀草隆(Daimuron)、四唑酰草胺(Fentrazamide)、唑吡嘧磺隆(Imazosulfuron)、苯噻草胺(Mefenacet)、嗪草酮(Oxaziclomefone)、吡嘧磺隆(Pyrazosulfuron)、稗草畏(Pyributicarb)、快杀稗、禾草丹、茚草酮(Indanofan)、氟噻草胺、四唑草胺(Fentrazamide)、氯吡嘧磺隆、嗪草酮、苯并双环酮(Benzobicyclon)、环酯草醚(Pyriftalid)、五氟磺草胺(Penoxsulam)、双草醚(Bispyribac)、丙炔噁草酮(Oxadiargyl)、乙氧嘧磺隆(Ethoxysulfuron)、丙草胺(Pretilachlor)、硝磺草酮、特呋三酮(Tefuryltrione)、噁草酮(Oxadiazone)、噁唑禾草酮(Fenoxaprop)、吡丙醚(Pyrimisulfan)；水稻杀昆虫剂：二嗪农、杀螟硫磷(Fenitrothion)、仲丁威(Fenobucarb)、久效磷(Monocrotophos)、丙硫克百威(Benfuracarb)、噻嗪酮(Buprofezin)、呋虫胺、氟虫腈、异丙威(Isoprocarb)、噻虫啉、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、噻虫胺、乙虫腈、氟虫双酰胺、氯虫酰胺、溴氰菊酯、啶虫脒、噻虫嗪、溴氰虫酰胺、多杀菌素、乙基多杀菌素、苯甲酸甲胺基阿维菌素酯、氯氰菊酯(Cypermethrin)、毒死蜱(Chlorpyriphos)、杀螟丹(Cartap)、甲胺磷、醚菊酯(Etofenprox)、***磷、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、克百威、丙硫克百威(Benfuracarb)；水稻杀真菌剂：甲基硫菌灵、环丙酰菌胺(Carpropamid)、克瘟散(Edifenphos)、嘧菌腙(Ferimzone)、异稻瘟净(Iprobenfos)、稻瘟灵(Isoprothiolane)、戊菌隆(Pencycuron)、噻菌灵(Probenazole)、咯喹酮(Pyroquilon)、三环唑(Tricyclazole)、肟菌酯、双氯氰菌胺(Diclocymet)、稻瘟酰胺(Fenoxanil)、硅氟唑(Simeconazole)、噻酰菌胺(Tiadinil)；棉花除草剂：敌草隆、伏草隆、MSMA、乙氧氟草醚、扑草净、氟乐灵、唑草酮、烯草酮、吡氟禾草灵、草甘膦、达草灭、二甲戊乐灵、嘧草硫醚(Pyrithiobac-sodium)、三氟啶磺隆(Trifloxysulfuron)、吡喃草酮(Tepraloxydim)、草铵膦、丙炔氟草胺、噻苯隆(Thidiazuron)；棉花杀昆虫剂：乙酰甲胺磷、涕灭威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、马拉硫磷、久效磷、阿维菌素、啶虫脒、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、λ-三氟氯氰菊酯、多杀菌素、硫双威、γ-三氟氯氰菊酯、螺甲螨酯、啶虫丙醚(Pyridalyl)、氟啶虫酰胺、氟虫双酰胺、杀铃脲、氯虫酰胺、β-氟氯氰菊酯、螺虫乙酯、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、呋虫胺、氟虫双酰胺、溴氰虫酰胺、多杀菌素、乙基多杀菌素、γ-三氟氯氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、硫双威、阿维菌素、氟啶虫酰胺、啶虫丙醚、螺甲螨酯、砜虫啶、丙溴磷(Profenophos)、***磷(Thriazophos)、硫丹；棉花杀真菌剂：土菌灵(Etridiazole)、甲霜灵、五氯硝基苯(Quintozene)；大豆除草剂：甲草胺、灭草松(Bentazone)、氟乐灵、氯嘧磺隆(Chlorimuron-Ethyl)、氯酯磺草胺(Cloransulam-Methyl)、噁唑禾草灵、氟磺胺草醚、啦氟禾草灵(Fluazifop)、草甘膦、甲氧咪草烟、灭草喹、咪草烟、(S-)异丙甲草胺、嗪草酮、二甲戊乐灵、吡喃草酮(Tepraloxydim)、草铵膦大豆杀昆虫剂：λ-三氟氯氰菊酯、灭多虫、对硫磷(Parathion)、呋线威、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、氟虫双酰胺、氯虫酰胺、溴氰虫酰胺、多杀菌素、乙基多杀菌素、苯甲酸甲胺基阿维菌素酯、氟虫腈、乙虫腈、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ和λ三氟氯氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、螺虫乙酯、Spinodiclofen、杀铃脲、氟啶虫酰胺、硫双威、β-氟氯氰菊酯；大豆杀真菌剂：环丙唑醇、氟环唑(Epoxiconazole)、粉唑醇、唑菌胺酯、戊唑醇、肟菌酯、四氟醚唑；甜菜除草剂：氯草敏(Chloridazon)、甜菜安、甜菜呋、甜菜宁、野麦畏、二氯吡啶酸、吡氟禾草、环草定(Lenacil)、苯嗪草酮(Metamitron)、氯甲喹啉酸(Quinmerac)、噻草酮(Cycloxydim)、氟胺磺隆、吡喃草酮(Tepraloxydim)、喹禾灵；甜菜杀昆虫剂：噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ/λ-三氟氯氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、七氟菊酯、氯虫酰胺、Cyaxypyr、氟虫腈、克百威；油菜除草剂：二氯吡啶酸、禾草灵、吡氟禾草、草铵膦、草甘膦、氟乐灵胺苯磺隆、氯甲喹啉酸、喹禾灵、烯草酮、吡喃草酮；油菜杀真菌剂：嘧菌酯(Azox-ystrobin)、多菌灵、咯菌腈、异菌脲(Iprodione)、乙烯菌核利(Vinclozolin)；油菜杀昆虫剂：克百威有机磷、拟除虫菊酯(Pyrethroids)、噻虫啉、溴氰菊酯、噻虫胺、噻虫嗪、啶虫脒、呋虫胺、β-氟氯氰菊酯、γ和λ-三氟氯氰菊酯、τ-氟胺氰菊酯、乙虫腈、多杀菌素、乙基多杀菌素、氟虫双酰胺、氯虫酰胺、溴氰虫酰胺、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮。

表1.各种作用模式相关的示例性农业化合物-杀昆虫剂

农业上可接受的载剂

本文所述的组合物可包含农业上可接受的载剂。可用于这些实施方案的组合物可包括选自由以下组成的组的至少一个成员：增粘剂、微生物稳定剂、杀真菌剂、抗细菌剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、抗复合剂、除草剂、杀线虫剂、杀昆虫剂、植物生长调节剂、肥料、灭鼠剂、干燥剂、杀细菌剂、营养素或其任意组合。在一些实例中，组合物可以是贮存稳定的。例如，本文所述的任何组合物可包含农业上可接受的载剂(例如，以下的一种或多种：肥料诸如非天然存在的肥料；粘着剂诸如非天然存在的粘着剂；和灭害剂诸如非天然存在的灭害剂)。非天然存在的粘着剂可以是例如聚合物、共聚物或合成蜡。例如，本文所述的任何包衣种子、幼苗或植物可在种子包衣中包含此类农业上可接受的载剂。在本文所述的任何组合物或方法中，农业上可接受的载剂可以是或可以包括非天然存在的化合物(例如，非天然存在的肥料、非天然存在的粘着剂(诸如聚合物、共聚物或合成蜡)或非天然存在的灭害剂)。

在一些实施方案中，本文所述的基于无核细胞的平台可与农业上可接受的载剂混合。载剂可以是固体载剂或液体载剂，并且可以是各种形式，包括微球、粉剂、乳剂等。载剂可以是赋予多种特性，诸如增加的稳定性、润湿性或分散性的多种载剂中的任何一种或多种。组合物中可以包括润湿剂，诸如天然或合成表面活性剂(可以是非离子或离子表面活性剂)或其组合。油包水乳剂也可用于配制包含分离的细菌的组合物(参见，例如，美国专利第7,485,451号)。可以制备的合适的调配物包括可湿性粉剂、粒剂、凝胶剂、琼脂条或球粒、增稠剂、液体(诸如水性流动剂)、水性悬浮液、油包水乳剂等。调配物可以包括例如谷物或豆类产品，例如磨碎的谷物或豆类，源自谷物或豆类的肉汤或面粉，淀粉、糖或油。

在一些实施方案中，农业载剂可以是土壤或植物生长培养基。可以使用的其它农业载剂包括水、肥料、植物油、保湿剂或其组合。替代性地，农业载剂可以是固体，诸如硅藻土、壤土、二氧化硅、藻酸盐、粘土、膨润土、蛭石、种壳、其它动植物产物或组合，包括颗粒、球粒或悬浮液。也可以将任何上述成分的混合物考虑作为载剂，例如但不限于pesta(面粉和高岭土泥)，在壤土、砂土或粘土中的基于琼脂或面粉的颗粒。调配物可包括细菌的食物来源，诸如大麦、水稻或其它生物材料，诸如种子、植物部分、蔗渣、来自谷物加工的壳或秆、来自建筑工地垃圾中的地面植物材料或木材、来自纸张回收的锯屑或细纤维、织物或木材。

农业上可接受的载剂的其它实例包括分散剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯PVPIVA S-630)、表面活性剂、粘合剂和填充剂。

用于细胞粘附的结合结构域

在一些实施方案中，同此描述的基于无核细胞的平台表达结合结构域。这些结构域允许更好地将微细胞保留在植物表面，从而防止包封在微细胞内的农用化学品流失或漂移。它们还可以提高对靶向有害生物的粘附力，以确保施用有效剂量的农用化学品。一旦微细胞处于植物上，则化学品将缓慢释放到环境中。

在一些实施方案中，同此描述的无核细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个植物细胞粘附部分。植物细胞粘附部分包含碳水化合物结合模块，包括选自由以下组成的组的碳水化合物结合模块：纤维素结合结构域、木聚糖结合结构域、几丁质结合结构域和木质素结合结构域。

在一些实施方案中，所述无核细胞在其表面上表达增加与植物表面的粘附的多肽。所述多肽是其表面的植物粘附多肽。在一些实施方案中，所述多肽是在其表面上展示的碳水化合物结合模块。在其它实施方案中，所述多肽是在其表面上展示的碳水化合物结合模块。

碳水化合物结合模块(CBM)是在碳水化合物活性酶(例如糖苷水解酶)上发现的蛋白质结构域。这些结构域中的大多数具有碳水化合物结合活性。这些结构域中的一些发现于纤维素体支架蛋白上。CBM也称为纤维素结合结构域。基于氨基酸序列相似性，将CBM分为多个家族。微生物糖苷水解酶的CBM通过与特定植物结构多糖结合，在光合作用固定碳的循环中起着核心作用。CBM可以识别结晶和非晶形纤维素形式。CBM是最常见的与植物细胞壁水解中的活性酶相关的非催化模块。已经通过氨基酸序列比对鉴定出许多推定的CBM，但实验证实只有少数代表具有碳水化合物结合功能。通过与多糖结合，CBM使附加的催化结构域与靶底物紧密接触，从而增强催化作用。具有结合纤维素的能力的CBM与水解纤维素和其它细胞壁聚合物(诸如木聚糖、甘露聚糖、果胶和非纤维素β-葡聚糖)的酶相关。

已经将纤维素结合结构域(CBDs)描述为用于将分子物质附接至纤维素的有用剂(美国专利第5,738,984和6,124,117号)。实际上，由于棉花由90％的纤维素组成，因此已证明CBD可用于将所谓的“有益剂”递送到棉织物上，如WO9800500中所述，其中利用CBD与棉织物结合的亲和力，而利用了CBD和酶之间的直接融合。WO03031477要求保护类似的多功能融合蛋白用于递送包封的有益剂的用途，其中多功能融合蛋白由第一结合结构域(其为纤维素结合结构域)和第二结合结构域组成，其中第一结合结构域或第二结合结构域可以与微粒结合。WO03031477使用由CBD和与微粒结合的抗RR6抗体片段组成的双功能融合蛋白进行举例说明，所述复合物沉积到棉胎面(cotton tread)或切割的草上。

在一些实施方案中，本发明的微细胞展示的酶活性多肽包含CBM。使用了在本公开范围内的来自纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)的示例性CBM。在一些实施方案中，细胞粘附部分与表面表达部分融合。在其它实施方案中，CBM与表面表达部分融合并且展示在微细胞的表面上。

表面表达系统

在一些实施方案中，本公开教导了与细胞粘附部分融合的表面表达部分。所述表面表达部分可以是跨膜蛋白和/或跨膜结构域，其充当接头蛋白以在细胞表面上展示具有细胞粘附部分的酶活性多肽。

在一些实施方案中，表面表达部分可以是膜相关蛋白，包括但不限于跨膜蛋白、膜锚定蛋白、接头蛋白和/或其结构域。

在一些实施方案中，本发明涉及在微细胞表面上展示产生的与本文公开的目标蛋白融合的膜相关蛋白。以非限制性实例的方式来说，这种结构可以是要***微细胞膜中或与微细胞膜相关的内部表达的膜蛋白或嵌合构建体，使得细胞外结构域或目标结构域在微细胞的外表面暴露(在微细胞的表面表达和展示，或在亲本细胞中表达以在分离的微细胞的表面展示)。

所展示的与膜相关接头蛋白融合的结构域可以是包括碳水化合物结合模块的细胞粘附结构域。在其它实施方案中，

使此类微细胞与酶的适当底物接触使底物转化为反应物。当底物或反应物可检测时，可以定量由膜结合酶催化的反应。在后一种情况下，微细胞可用于从化合物库中鉴定和分离一种或多种抑制或刺激由所展示的酶部分所表现的酶活性的化合物。

在一些实施方案中，膜相关蛋白可以是融合蛋白，即包含具有第一氨基酸序列的第一多肽和具有第二氨基酸序列的第二多肽的蛋白，其中所述第一和第二氨基酸序列不天然存在于相同的多肽中。膜融合蛋白中的至少一种多肽是“跨膜蛋白/结构域”、“膜锚定蛋白/结构域”或“接头蛋白/结构域”。融合蛋白的跨膜结构域和膜锚定结构域可以选自原核生物(诸如细菌)、真核生物(诸如真菌)、单细胞真核生物、植物和动物(诸如哺乳动物，包括人)中天然存在的膜蛋白。此类结构域可以来自天然发现于病毒(诸如噬菌体)或真核病毒(例如腺病毒或逆转录病毒)中的病毒膜蛋白。此类结构域可以来自天然发现于古细菌(诸如嗜热菌)中的膜蛋白。

示例性的表面表达部分包括但不限于冰成核蛋白(INP)、博德特氏菌血清抗性杀伤蛋白(BRK)、扩散粘附中涉及的粘附素蛋白(AIDA)和/或输出细菌蛋白。“输出细菌蛋白”通常是指穿过质膜转运并起到膜蛋白锚点的作用的细菌蛋白。"本发明涵盖的示例性输出细菌蛋白包括但不限于LamB(GenBank登录号AMC96895)、OprF(GenBank登录号NP_792118)、OmpA(GenBank登录号AIZ93785)、Lpp(GenBank登录号P69776)、MalE(GenBank登录号P0AEX9)、PhoA(GenBank登录号AIZ92470.1)、Bla(GenBank登录号P62593)、Fl或M13主要外壳蛋白(J7I0P6–Uniprot编号)和Fl或M13次要外壳蛋白(P69168–Uniprot编号)。

在一些实施方案中，对于革兰氏阴性细菌表达系统而言，本文公开的目标酶通过野生型或突变体形式的输出细菌蛋白诸如LamB(λ受体)、OprF(铜绿假单胞菌外膜蛋白F)、OmpA(外膜蛋白A)、Lpp(脂蛋白)、MalE(麦芽糖结合蛋白)、PhoA(碱性磷酸酶)、Bla(TEM-1B-内酰胺酶)、F1或M13主要外壳蛋白(源自基因VIII)、F1或M13次要外壳蛋白(基因III)固定到微细胞表面。

在其它实施方案中，可以使用野生型和/或截短形式的冰成核蛋白(INP)将酶固定在细菌表面上。

表面展示系统

细菌表面展示技术能够使外源蛋白或多肽展示在细菌表面，同时保持它们相对独立的空间结构和生物活性。该技术使重组细菌具有预期功能，随后直接用于许多应用。许多蛋白质可用于实现细菌表面展示，其中，自主转运蛋白(革兰氏阴性细菌的V型分泌系统的成员)由于其模块化结构和明显的简单性而受到广泛研究。然而，由于缺乏便利的遗传载体系统，自主转运蛋白目前尚未被广泛使用。

本公开教导了目标蛋白/多肽的自主展示需要自主转运蛋白才能在革兰氏阴性细菌表面展示蛋白或肽。自主转运蛋白分成3个不同的亚类，经典自主转运蛋白(Va型)、三聚体自主转运蛋白粘附素(Vb型)和双伴侣分泌系统(Vc型)。

人们认为经典自主转运蛋白(Va型)都具有常见的通用结构，该结构由与乘客蛋白融合的N端信号肽组成，乘客蛋白代替自主转运前体蛋白，从而提供了穿过细胞质膜的转运。N端信号肽通常利用分泌机制来提供转运。一旦蛋白质穿过内膜，该信号肽就会被裂解。自主转运蛋白的C端结构域促进外膜易位。该结构域称为易位结构域，在外膜内形成β-桶。由于将桶闭合的β-链指向周质，这种自主转运蛋白需要附加接头结构域。利用这种机制，超过30种不同的蛋白质已经表达为乘客蛋白。

三聚体自主转运蛋白(Vb型)与经典自主转运蛋白相似，除了它们不能仅将一种蛋白质转运到表面，而是将3种(三聚体)蛋白质转运到表面以外。

Vc型自主转运蛋白由乘客和易位结构域组成，然而两个结构域是在单独的基因中表达的。两个结构域均通过分泌机制转运穿过内膜，但通过多肽转运相关结构域(POTRA)与周质相互作用。由于这种转运机制与叶绿体和线粒体中存在的转运系统之间存在相似性，因此预计该系统能够转运极其复杂的蛋白质结构，但很少使用Vb或Vc自主转运系统。

酶通过蛋白质介导的膜定位机制固定到微细胞表面，所述机制包括但不限于以下连接蛋白和机制。在一些实施方案中，这些系统包括BrkA蛋白和AIDA-1蛋白。通过引用整体并入本文的Yang等人，Progress in Biochemistry and Biophysics 40(12):1209-1219报告了将自主转运蛋白和冰成核蛋白作为载体蛋白进行比较在大肠杆菌细胞表面上进行蛋白展示。

AIDA-I自主转运蛋白系统

最广泛研究的自主转运蛋白之一是大肠杆菌中天然存在的AIDA-1。它最初是在大肠杆菌的致病菌株中发现的，但随后使用pAIDA-1质粒和pDT1质粒转移到实验室大肠杆菌菌株中。

在一些实施方案中，本公开提供了pAIDA-1表达载体，其中多核苷酸序列编码包括CBM的目标蛋白。例如，图4A和图4B说明了具有CBM编码基因的重组pAIDA-1表达载体。AIDA-I自主转运系统由N端5kDa的信号肽、5kDa的接头区和47kDA的C端转运单元组成。乘客结构域位于信号肽和接头结构域之间。这种在其乘客结构域中没有蛋白质的自主转运蛋白总共63kDa。将目标蛋白***乘客结构域中，以便实现表面表达。从基因上讲，这对应于位于NdeI和SaII之间的蛋白质的信号肽区，介于KpnI和SacI之间的乘客结构域，介于XbaI和NotI限制位点之间的肽接头区以及该蛋白的与C端易位单元相对应的其余部分。

pAIDA-1-CBM表达载体含有在lacUV5启动子的诱导型控制下的AIDA-I基因，并且包含2个蛋白质标签(6x His标签和Myc标签)和2个蛋白酶裂解位点(HRV3C和TEV)以便实现表面表达分析。图4A和图4B说明了pAIDA-1CBM表达载体。TEV位点是被烟草蚀蚊病毒识别的氨基酸序列。它是公知的高特异性蛋白酶。HRV3C位点是位于6x His标签C端的另一个高度特异性蛋白酶裂解位点。如果需要，将这两个蛋白酶裂解位点都用于去除蛋白质标签以用于分析目的。6x His标签位于SaII和KpnI位点之间。该6x his标签用于用来自的THE^TM His标签抗体[FITC]进行免疫荧光染色，也用于钴固定金属亲和色谱法以纯化蛋白质进行存在性测定确认。TEV位点是Myc标签的N端，并且位于AIDA-I基因(位于pAIDA-I质粒中)内的SacI和XbaI限制位点之间。质粒上存在的Myc标签可用于免疫荧光染色，但是这种能力未加以利用。

质粒的其它组件包括lac操纵子和处于lacI启动子控制下的lacI阻遏基因。这三个组件连同lacUV启动子一起作用，以便调控AIDA-I基因的表达。pAIDA-1质粒通过p15a复制起点在体内保持，p15a复制起点是中等拷贝复制起点。这与低拷贝或高拷贝复制起点的不同仅在于细胞内保持的质粒的相对拷贝数。该质粒的抗生素抗性基因是受其自身启动子控制的氯霉素(CmR)。

Brk自主展示

最近发现Brk是自转运(自主展示)蛋白。自主转运蛋白结构域是在一些细菌外膜蛋白中发现的结构域。该结构域位于蛋白质的C末端并且形成β桶结构。桶在膜上定向，使得称为乘客结构域的蛋白质的N端部分呈现在细胞表面。利用最近表征的来自百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的自主转运蛋白BrkA(博德特氏菌血清抗性杀伤蛋白A)，BrkAutoDisplay系统与诸如使用冰成核蛋白(INP)的其它系统相比，对于表面展示起到更好的作用。通过引用整体并入本文的Sun等人2015,Microb.Cell Fact.14:129举例说明了使用BrkA自主转运蛋白在大肠杆菌表面功能性展示多种外源蛋白的BrkAutoDisplay系统。

发现BrkA蛋白(GenBank WP_010931506.1)是其天然形式的1010个氨基酸链长的蛋白。前59个氨基酸代表信号肽，并且β桶是在氨基酸693-1010之间形成的。易位结构域对应于氨基酸545-1010。乘客结构域对应于氨基酸60-544，乘客结构域被目标蛋白质诸如脂肪酶和/或葡萄糖异构酶置换。前59个氨基酸和β桶区即693-1010代表最小的易位结构域。

本公开教导用于表达融合蛋白的重组表达载体/构建体具有两个多核苷酸序列，其编码BrkA蛋白的i)前228个氨基酸(信号肽和5'部分乘客结构域)和ii)694-1010氨基酸(β桶结构域)序列。在该重组表达载体中，将编码目标蛋白(诸如脂肪酶)的多核苷酸序列***这两个区段之间，(i)一个是信号肽和5'部分乘客结构域的区段，和ii)另一个是BrkA蛋白的β桶结构域)的区段。一旦将融合蛋白运输到膜上，它就会在对应于野生型BrkA蛋白的位置的Asn731和Ala732残基之间裂解，之后位于信号肽和B-桶易位结构域之间的目标蛋白(包括脂肪酶)呈其成熟构象并在细胞表面外部显示。图6A和图6B中说明了本文使用的重组表达载体。pGEX-6P-1Brk-脂肪酶表达载体含有在tac启动子控制下的AIDA-I基因，并且包含蛋白质标签(6x His标签和Myc标签)和两个蛋白酶裂解位点(HRV3C和TEV)以便实现表面表达分析。上面对6x His标签和Myc标签的用途进行了详细描述。

在其它实施方案中，大肠杆菌B菌株(包括但不限于BL21、BL21(DE3)、LPS修饰的BL21(DE3)、B8和BL21-AI)中的BrkAutodisplay系统显示出朝向细胞膜极性末端的更多聚集，因为微细胞从母细胞的极性末端出芽，因此导致更多保留在微细胞中。然而，在其它产生微细胞的细胞系诸如野生型P678-54菌株中未观察到这种现象。本公开教导这种自主转运蛋白与大肠杆菌B菌株衍生物的应用提供了在最终微细胞产物中更多保留表面展示的目标蛋白/酶的优点。

载体

在一些实施方案中，pUC-57载体用于敲除包括minC、minD和minC/D在内的靶标基因，以诱导从蛋白酶缺陷型菌株产生微细胞。从靶基因的5’和3’末端，将与基因组内的靶基因相对应的约50个碱基对的核苷酸序列(同源臂)用于同源重组以敲除靶基因。这将目标基因引导至基因组中的位置，以置换旨在敲除的靶标基因。仅仅在同源臂的内部，***发夹环。这些发夹环当转录为mRNA时，不允许在发夹环外开始翻译的环之间所含物质的任何翻译。这些发夹环是在DNA翻译成RNA时形成的，也称为茎环。这使得***物不会干扰min系统中其它基因的天然启动。由于发夹环，***物中所含的氯霉素盒(CmR)置于其自身启动子即cat启动子的控制之下。因包括发夹环，该启动子也不会影响任何基因的调控。

在一些实施方案中，当其中可以表达目标蛋白的蛋白酶缺陷型菌株具有其自身的T7 RNA聚合酶活性时，pET-9a质粒可用于表达目标蛋白。图18A中说明了pEF-9a表达载体。该质粒在T7启动系统下操作，该系统包括目标基因上游的启动子区。该启动子序列基本上是T7 RNA聚合酶的识别位点，该T7 RNA聚合酶位于其中转化了载体的细胞系的基因组内的诱导型控制下。因此，目标蛋白的产生受到控制T7的启动子而不是质粒上存在的启动子的控制。因为质粒处于T7启动子的控制下，所以在该基因之后直接是T7终止子区。这是为了确保仅目标基因被过表达。目标蛋白的C端是可用于免疫荧光染色目的的T7表位标签。该质粒通过pBR322复制起点在体内保持，pBR322复制起点通常是高拷贝复制起点。然而，具有高拷贝复制起点的T7启动是不可取的(蛋白质的毒性水平)，因此还包含rop基因以便保持拷贝数较低。该质粒含有处于其自身启动子控制下的卡那霉素抗性盒(KanR)，因此用卡那霉素进行选择。

在一些实施方案中，当其中可以表达目标蛋白的蛋白酶缺陷型菌株不具有T7 RNA聚合酶活性时，pGEX-6P-1质粒可用于表达目标蛋白。图18B中说明了pGEX-6P-1表达载体。pGEX-6P-1在tac启动系统下操作。tac启动系统是trp启动子和lac启动子之间的杂交启动系统。通过使启动系统杂交，结合/释放lacI蛋白(抑制剂)是启动系统的调节机制，但它通过改变诱导剂(通常为IPTG)的浓度而允许表达水平可调。质粒中包含lacI基因及其启动子，以便减低基因表达的任何基础水平，从而增强由tac启动子引起的表达控制的程度。

该pGEX质粒通常含有谷胱甘肽S-转移酶标签(GST)，使得蛋白质纯化或免疫化学应用成为可能。然而，鉴于本公开的目的，从pGEX-6P-1质粒中去除了GST标签的起始密码子(ATG)，以便减小总目标蛋白的大小以确保充分过表达。该质粒还含有GST标签的HRV3C裂解位点C端，以便在纯化后去除标签。

该质粒通过pBR322复制起点在体内保持，pBR322复制起点是高拷贝复制起点。与T7启动系统不同，由于使用天然RNA聚合酶产生mRNA，使用具有高拷贝质粒的tac启动系统积聚的蛋白质水平无毒。该pGEX质粒含有处于其自身启动子控制下的氨苄青霉素抗性盒(AmpR)。

***衍生物表面上的酶固定

酶通过蛋白质介导的膜定位机制固定到微细胞表面，所述机制包括但不限于以下连接蛋白和机制：分选酶连接机制。分选酶是在***细胞如枯草芽孢杆菌中特异性作用的用于酶固定的自主转运蛋白之一。该分选酶受D(+)木糖诱导。分选酶是将表面蛋白附接于细胞壁的转肽酶；它在LPXTG基序的Gly和Thr之间裂解并催化苏氨酸的羧基和细胞壁肽聚糖的氨基之间形成酰胺键。在一些实施方案中，LPXTG基序可以***目标酶活性多肽的C端末端内以在***细胞表面表达。分选酶可以识别该基序，并将酶促活性多肽与***细胞的表面共价结合。

同样，可以从嗜极生物中工程改造微细胞，使其保留母体物种的弹性物理和化学特性。例如，来自嗜热菌的微细胞将保持耐高温性。荧光蛋白融合，ATP合酶介导的蛋白定位，琥珀酸脱氢酶介导的蛋白定位。通过引用整体并入本文的Mitra SD等人2016,Trendsin Microbiology,24(8):611-621报告了***中膜蛋白的聚焦作用和连接机制。

酵母衍生物表面上的酶固定

酶可以通过表面展示蛋白固定到酵母微细胞的表面。微细胞可以由酵母菌株产生，包括但不限于酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和粟酒裂殖酵母。

源自重组来源的哺乳动物膜蛋白的晶体结构是由酵母细胞中表达的蛋白：来自兔的Ca²⁺-ATP酶(SERCA1a)解析得到的。该蛋白在酿酒酵母中过表达。而且，在巴斯德毕赤酵母中产生大鼠电压依赖性钾离子通道Kv1.2以了解其结构。从此以后，将其它几种宿主细胞用于产生真核膜蛋白，包括大肠杆菌、杆状病毒感染的昆虫细胞和哺乳动物细胞系。虽然所有宿主系统都有优点和缺点，但酵母一直是真核膜蛋白领域中始终受欢迎的选择。作为微生物，它们培养快速、容易且成本低；作为真核生物，它们能够翻译后加工真核膜蛋白。酵母中产生的重组跨膜蛋白的最新晶体结构包括使用巴斯德毕赤酵母来源的样品产生的人水通道蛋白2、鸡卵黄状黄斑病蛋白-1(bestrophin-1)、人TRAAK通道、人白三烯C₄合酶、藻类P-糖蛋白同源物和小鼠P-糖蛋白的晶体结构；使用酿酒酵母中产生的重组蛋白对拟南芥(Arabidopsis thaliana)NRT1.1硝酸盐转运蛋白、真菌植物病原体TMEM16脂质混杂酶和酵母线粒体ADP/ATP载体的结构进行了解析。由于其作为真核细胞的特征，酵母细胞可用于酶固定化微细胞生产的目的。

酵母膜的组成不同于哺乳动物膜的组成。这与酵母中产生的重组膜蛋白的后续结构和功能研究有关，因为脂质通过促进膜流动性而在膜蛋白的正常功能方面具有特别重要的作用，并且可以直接与膜蛋白相互作用。

为了使酵母膜“人性化”，已开发出合成胆固醇而不是天然酵母固醇(麦角固醇)的酵母菌株。这是通过分别用哺乳动物基因DHRC24和DHRC7置换麦角固醇生物合成途径的ERG5和ERG6基因来实现的。DHRC7和DHRC24的基因产物经鉴定是在胆固醇(但不是麦角固醇)合成中使C7和C24位置的固醇中间体饱和的关键酶。Erg5p在麦角固醇生物合成途径中在C22位置引入双键并且在Erg6p C24位置添加甲基，因此与DHRC24的基因产物竞争其底物。

除了目标基因的开放阅读框(ORF)外，典型的表达质粒通常在其表达盒中并入许多其它序列。酿酒酵母α-交配因子信号序列是商业表达质粒的常见添加物，因为据信它会使重组膜蛋白正确地靶向酵母膜。例如，它的存在对小鼠5-HT_5A羟色胺受体的产率具有积极影响，但是大大降低了组胺H₁受体的表达。已经使用了替代信号序列(尽管频率要低得多)，诸如真菌GPCR的STE2前导序列Ste2p。酵母中的已知信号序列可能是运输与膜相关蛋白/结构域融合的目标蛋白并将目标蛋白固定在酵母细胞表面的另一个优势。

由微细胞包封的农业化合物的释放

本公开教导农业化合物保留在微细胞内并且随时间推移而释放。本公开教导了包封至少一种农业化合物和/或表达具有至少一个表面表达部分和至少细胞粘附部分的融合蛋白的无核微细胞的高价值、小体积产品。在一些实施方案中，基于无核细胞的产品与其它可商购的农用化学产品相比喷雾量要少得多，并且还可以在更长的时间内保持活性化合物的预期效果。

如本文所用的术语“控释”意指由本公开描述的无核细胞所包封的一种或多种农用化学品随时间推移以受控方式释放。出于本公开的目的，控释意指农业化合物一旦从调配物中释放，就以受控的速率释放，使得化合物的水平和/或浓度从化合物释放开始长期得以持续和/或延迟，例如在一段时间内以延长的间隔提供释放。

当前农用化学品的控释机制主要基于肥料(例如Agrium、ICL、Kingenta和Ekompany)或灭害剂(例如Adama、Syngenta、Bayer)的完全包封。肥料的完全包封通常基于树脂(例如聚氨酯)或硫基混合物。将灭害剂装入微型聚合物胶囊中。由于需要厚壁来抵抗高内压，因此包封肥料的产品限于毫克级的干燥肥料。这种压力由于溶解肥料的负渗透势驱动水进入胶囊而积聚。随着包封更多的肥料，将积聚更多的压力，并且需要更厚的壁。肥料量与壁厚之间的可行比率在几十毫克的范围内。然而，包封的肥料仍然非常昂贵，其成本高达肥料价格的四倍。

而且，释放机制是基于通过套管中分布的断层和裂缝进行转运。意味着，涂层在整个表面积上必须均匀，这又是制造上的挑战。最重要的是，用于涂层的材料对温度敏感，并且在很小的温度范围内(17℃-25℃)会极大地改变其结构特性，从而导致释放速率发生根本性变化(高达两倍的速率)。因此，常规的农用化学品包封具有均匀涂层和温度依赖性的挑战。

如果需要在叶或类似表面上的调配物干燥期间使包封的组合物快速释放，则必须具有薄壁微胶囊。通常，平均直径约2微米的微胶囊在调配物中需要约3重量％的聚合物壁浓度。聚合物的量越高会降低释放速率。胶囊的直径和成壁聚合物的量可用于调节胶囊的性能，这取决于所需的灭害剂和使用条件。

诸如灭害剂、除草剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、肥料等农用化学品的使用日益增加，带来了严重的健康和环境问题，必须对这些问题加以控制，以便将这些产品的有害影响减到最少。除草剂(诸如甲草胺、异丙甲草胺、达草灭和甲嘧磺隆)经常遇到的一个问题是浸出和迁移，这会导致除草效率降低，并且可对其它作物产生损害并污染水质。

本公开教导由本文公开的微细胞包封的农业化合物可以以受控方式释放。在一些实施方案中，化合物的控释由剂诸如戊二醛、甲醛，以及天然化合物诸如京尼平(genipin)和表没食子儿茶素没食子酸酯、乙二醇二(甲基)丙烯酸酯衍生物、亚甲基双丙烯酰胺衍生物和无甲醛的交联剂DVB(二乙烯基苯)的处理而决定。在一些实施方案中，不同浓度的剂(例如戊二醛)可以在不同程度上防止包封农业化合物的微细胞的降解。

在其它实施方案中，所述剂包括但不限于戊二醛、甲醛，以及天然化合物诸如京尼平(genipin)和表没食子儿茶素没食子酸酯、乙二醇二(甲基)丙烯酸酯衍生物、亚甲基双丙烯酰胺衍生物和无甲醛的交联剂DVB(二乙烯基苯)。

在一些实施方案中，由本文公开的微细胞包封的农业化合物以每天1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％所需微细胞单位/输入量的速率释放。在其它实施方案中，所需微细胞单位/输入量的量构成包封的农业化合物。农业化合物的包封量可以计算包封分数和质量分数，从而确定每天所需的微细胞单位和/或输入量。

所需的包封农用化学品最终产品是总质量分数高的产品。改善的包封与高包封效率有关。因此，期望使用更高浓度的农用化学品来最大化农用化学品装载效率。质量分数可用于测量农用化学品的包封效率。通过将包封的农用化学品的总质量除以包封的农用化学品的总质量加上用于包封的生物颗粒的总质量来计算质量分数。例如，如果在80微克生物颗粒中包封20微克，则质量分数为20％，因为(20/(20+80)*100)＝20％。在活性成分昂贵的其它行业中，尤其是制药业中，包封效率也是重要量度。该值是包封的总质量除以起始总质量。因此，如果包封20微克且起始质量为200微克，则将达到10％的包封效率(20/200*100(％))。图11C-14C是本公开中公开的四种灭害剂的质量分数的示例性结果。

在一些实施方案中，未用剂(例如戊二醛)处理的微细胞最初快速释放其每天所需单位/输入量的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％，与以上相比较低的是经不同浓度的剂(例如戊二醛)处理的微细胞的控释，引起每天所需输入量的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的控释。在一些实施方案中，不同浓度的剂(例如戊二醛)可以在不同程度上防止包封农业化合物的微细胞的降解。在一些实施方案中，所述剂包括但不限于戊二醛、甲醛，以及天然化合物诸如京尼平和表没食子儿茶素没食子酸酯、乙二醇二(甲基)丙烯酸酯衍生物、亚甲基双丙烯酰胺衍生物和无甲醛的交联剂DVB(二乙烯基苯)。

改善的包封和保留量

为了改善包封和保留量，本公开教导可以在农用化学细胞包封溶液中使用溶剂以增加亲水性较低的农用化学品的溶解度。这些溶剂包括但不限于乙醇、DMSO、聚乙二醇和甘油。这些溶剂不但可以用于增加某些农用化学品的溶解度，而且可以用于增加活性成分通过某些蛋白质通道或通过外膜的脂质双层向细胞内的扩散。除了使用溶剂增强基于无核细胞的平台的包封过程外，某些固定剂、防腐剂和交联剂也可用于将活性成分截留在微细胞膜内，使某些活性化合物与微细胞本身交联，并提高微细胞的稳定性。可以调节这些稳定剂/交联剂的相对浓度，以获得针对活性成分的所需装载容量以及活性成分从细胞中释放的动力学性质。这些剂包括但不限于合成化合物诸如戊二醛、甲醛，以及天然化合物诸如京尼平和表没食子儿茶素没食子酸酯。

农业化合物递送量

在一些实施方案中，将农业化合物包封在本文所述的无核细胞内，并递送至所需位置。本文提供了目标农业化合物的量，以及用于制备包封和递送农业化合物的无核细胞的各种组分的重量百分比比例。

可以根据需要改变用于制备包封和递送农业化合物的无核细胞的各种组分的重量百分比比例。在一些实施方案中，农用化学化合物，包括但不限于灭害剂、除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、肥料和激素或化学生长剂，按其中包封了目标农用化学化合物的无核细胞的总重量计，以约0.1重量％至约90重量％的量存在，以约0.5重量％至约80重量％、1重量％至约70重量％、2重量％至约60重量％、3重量％至约55重量％、5重量％至约50重量％、10重量％至约45重量％和15重量％至约40重量％的量存在。根据一个实施方案，当在本文公开的无核细胞的制备中使用聚合物时，按本文公开的无核细胞的总重量计，聚合物以约0.01重量％至约10重量％的量存在。根据一个实施方案，当在本文公开的无核细胞的制备中使用助溶剂时，按本文公开的无核细胞的总重量计，助溶剂以约0.1重量％至约30重量％的量存在。还可以设想替代性的重量百分比比例。例如，按本文公开的无核细胞的总重量计，目标农业化合物可以高达约50重量％的量存在；溶剂可以高达约70重量％的量存在；表面活性剂可以高达约40重量％的量存在并且水可以约1重量％至约90重量％的量存在。

在本公开的各个方面中，按无核细胞内农业化合物的重量计，无核细胞呈包封至少约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％的目标农业化合物的形式。

在其它实施方案中，无核细胞内的农业化合物以至少约0.01、约0.02、约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09、约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90或约100g/L的量存在。

在另一实施方案中，目标农业化合物和无核细胞以至少1:200、1:195、1:190、1:185、1:180、1:175、1:170、1:165、1:160、1:155、1:150、1:145、1:140、1:135、1:130、1:125、1:120、1:115、1:110、1:105、1:100、1:95、1:90、1:85、1:80、1:75、1:70、1:65、1:60、1:55、1:50、1:45、1:40、1:35、1:30、1:25、1:20、1:15、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1,7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1、100:1、110:1、120:1、130:1、140:1、150:1、160:1、170:1、180:1、190:1或200:1的重量比存在于本公开的组合物中。在另一实施方案中，目标农业化合物和无核细胞以约1:50至约50:1，约1:40至约40:1，约1:30至约30:1，约1:20至约20:1，约1:10至约10:1，或约1:5至约5:1的重量比存在。

在其它实施方案中，包封农业化合物的无核细胞的调配物的密度为至少0.1、至少约0.2、至少约0.3、至少约0.4、至少约0.5、至少约0.6、至少约0.7、至少约0.8、至少约0.9、至少约1.0、至少1.1、至少约1.2、至少约1.3、至少约1.4、至少约1.5、至少约1.6、至少约1.7、至少约1.8、至少约1.9、至少约2.0、至少2.1、至少约2.2、至少约2.3、至少约2.4、至少约2.5、至少约2.6、至少约2.7、至少约2.8、至少约2.9、至少约3.0、至少3.1、至少约3.2、至少约3.3、至少约3.4、至少约3.5、至少约3.6、至少约3.7、至少约3.8、至少约3.9、至少约4.0、至少4.1、至少约4.2、至少约4.3、至少约4.4、至少约4.5、至少约4.6、至少约4.7、至少约4.8、至少约4.9、至少约5.0、至少约5.5、至少约6.0、至少约6.5、至少约7.0、至少约7.5、至少约8.0、至少约8.5、至少约9.0、至少约9.5或至少约10.0克/升。

在一些实施方案中，例如，目标农业化合物以配制产品总质量的至少约20％存在。在其它实施方案中，本文公开的农业化合物提供了配制产品总质量的约20％至40％，而其余约60％至80％的质量来自于无核细胞。

在一些实施方案中，可以将一种以上非表达的农业化合物包封在无核细胞内。在另一实施方案中，配制的产品包含两种农业化合物，这两种农业化合物以至少1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1的重量比存在于本公开的组合物中。

就农业化合物的量而言，为配制的产品提供了约0.01-20、约0.1-15、约0.2-10、约0.3-9、约0.3-8、约0.5-5、约1-3g/L的大致浓度。

在一些实施方案中，本文公开的靶向递送和控释可以提高农业化合物的功效，从而可以减少农业化合物的用量。基于无核细胞的平台的调配物可以是液体或固体形式。在一些实施方案中，配制的产品是液体形式，诸如溶液。在一些实施方案中，配制的产品是固体形式，诸如粉剂。

实施例

给出以下实施例是为了说明本公开的各种实施方案，并非意在以任何方式限制本公开。本领域的技术人员将会想到，如权利要求书的范围所限定的，本公开的精神范围内涵盖的其中的变化和其它用途。

实施例1.蛋白酶缺陷型微细胞的产生

通过PCR扩增(Eppendorf Mastercycler 5333)和使用Laxco LMC4000显微镜(40x物镜、明视野和荧光LED光源)连同Zeiss Sigma VP HD视野SEM(UVA Advanced MicroscopyCore)进行形态表征来确定这些敲除的成功。根据图17A和图17B中所示的结果，确定minC、minD和/或minC/D敲除产生在形态特征方面与产生微细胞的原始野生型P678-54菌株最接近的微细胞(Adler等人，1967,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 57:321-326；Inselburg J,1970J.Bacteriol.102(3):642-647；Frazer 1975,Curr.Topics Microbiol.Immunol.69:1-10)。例如，图17B显示了其中minC基因缺失的微细胞。

为了进一步研究哪些基因敲除是产生与产生微细胞的野生型p678-54菌株最接近的微细胞的原因，使用了Lambda Red同源重组系统。这种lambda red重组工程改造系统依赖于三种不同的蛋白质(Beta、Gam和Exo)，这三种蛋白质是促进通过与已经存在的基因组的同源性引导双链线性DNA向基因组内***所需的，如Murphy KC,2011MethodsMol.Biol.765:27-42举例说明的那样。所有这些蛋白质均通过具有含RepA蛋白质的pSC101复制起点的质粒表达，该复制起点仅允许在30℃下进行质粒复制。因此，一旦完成基因操纵，就通过使其在37℃下生长从细胞系中去除质粒。

将***基因组的基因设计成与要敲除的靶基因的5'和3'末端具有50个碱基对的同源性。同源性分别对应于minC的5’(SEQ ID NO:1)和3'末端(SEQ ID NO:2)的50个碱基对以便敲除minC，对应于minD的5’(SEQ ID NO:3)和3'末端(SEQ ID NO:4)以便敲除minD，或对应于minD的5’末端(SEQ ID NO:3)和minC的3’末端(SEQ ID NO:2)以便敲除minCD。***启动子侧接两个发夹环的氯霉素盒，以代替minC、minD或minC/D。发夹环包含在***物中，以便不干扰对基因组同一区域中其它基因的调控，因为它们具有终止转录的能力。

如图1-3所示，将这些基因***pUC57主链中。该质粒用作模板，然后扩增出目标基因，以在将其整合到宿主基因组中之前验证序列信息的准确性。所有扩增均在6种不同的退火温度下用如表3和表4所示的以下组分和条件进行。表2显示根据每个基因敲除扩增，设计了两组不同的引物。所有引物均由服务提供商Integrated DNA Technologies(IDT)合成。

表2.关于用于测试min基因敲除的引物组的信息

表3.PCR反应的组分

内容物
			组分	体积(uL)	最终浓度
无核酸酶的水	17.5	N/A
			模板DNA(5ng/uL)	1	5ng
10uM正向引物	2.5	500nM
			10uM反向引物	2.5	500nM
DMSO	1.5	3％
			Phusion HF主要混合物	25	1X

表4.PCR反应的条件

用表5中显示的以下每个退火温度，进行从A到F的六个系列扩增(表2)。字母后面的数字与PCR板上的位置相对应，每个孔之间有间隙，因为孔与孔之间温度略有升高。(例如：孔号A2是以Tm 1进行的A系列扩增；A4-以Tm 2进行的A系列扩增；A6-以Tm 3进行的A系列扩增；A8-以Tm 4进行的A系列扩增；A10-以Tm 5进行的A系列扩增；A12-以Tm 6进行的A系列扩增；A1、A3、A5、A7、A9和A11是空孔)

表5.关于PCR反应的退火温度的信息

退火温度
		Tm编号	Tm℃
1	59.8
		2	60.8
3	62.8
		4	65.1
5	66.9
		6	67.6

根据其标准方案，使用 PCR和DNA纯化试剂盒纯化所有扩增产物。用足够的洗脱缓冲液洗脱所有DNA，以提供充分的DNA定量和质量测定。纯化后，使所有扩增物均在凝胶上针对来自的1kB plus梯电泳，以确定PCR反应是否成功。约1080个碱基对的单个条带的可视化表示，在所有退火温度下进行的所有扩增都成功。使用用1xTAE和SYBR安全染剂制备的1％琼脂糖(w/v)凝胶，连同Invitrogen Safe Imager 2.0一起实现所有DNA可视化。

使用一次性手术刀和 DNA凝胶提取试剂盒根据其标准方案从凝胶中提取这些条带。提取后，量化DNA，对DNA定量，测定其质量，然后从Eton Biosciences送去进行测序。用于扩增的引物(表2)用于测序测定。所有具有约99％同一性的序列都返回，因此将其认为适合***基因组中。

通过热休克法将lambda red质粒转化到具有化学活性的蛋白酶缺陷型大肠杆菌中(参见实施例；Rahimzadeh等人2016,Mol.Boil.Res.Commun.5(4):257-261)。将其接种在选择性LB琼脂板上，并在第二天重新划线以确保分离出单个菌落用于lambda red重组。

为了将PCR产生的DNA引入基因组中，使用修改的方案，使用来自ThermonScientific^TM的TransformAid细菌转化试剂盒。

使单个菌落在30℃的C培养基中生长过夜。第二天，将1:100稀释的培养细胞接种到新鲜的C培养基中。使其在30℃下生长，直至达到约0.2的光密度(在600nm下测量的)。用1mM IPTG诱导该培养物20分钟，以充分产生和积聚对该程序至关重要的三种蛋白质(Beta、Gam和Exo)。在每1.5mL接种的培养物体积诱导后，以10,000rcf下使细胞沉淀1分钟，并使其重新悬浮于300uL的冷T溶液中并孵育5分钟。然后使细胞再次沉淀，并重新悬浮于120uL的冷T溶液中5分钟。在最后的孵育步骤后，每次转化合并50uL细胞和50ng的PCR扩增物，并在冰上孵育5分钟。从此，向每种转化物中添加250uL的SOC培养基，并使其在37℃下生长90分钟。在90分钟的生长后，将300uL转化物全部接种在氯霉素LB琼脂板上(10ug/mL)，并使转化细胞生长过夜。

该方案导致几乎所有尝试的基因(每个系列3个)都成功转化。在Laxco LMC4000(40x物镜，明视野)上从每个成功的转化株中检查了转化细胞的形态，并确定minC敲除(A和B)产生了与从中发现了微细胞的对照p678-54菌株形态最相似的微细胞。这些BL21和BL21-AI菌株是两个用于蛋白酶缺陷型微细胞并进行遗传分析的菌株。

为了确认基因组中敲除的存在，设计了引物以扩增出minC和/或minD的敲除的特定部分。通过使引物跨越***物内部和外部的区域，确认***物的5'和3'末端。表6中的引物根据以下表7-9中的条件使用。

表6.关于用于测试min基因敲除的引物组的信息

名称	退火序列	名称
			3'minCKO_1	GGCCGGATAAAACTTGTGCT	1
3'minCKO_2	AGTCTTCGGAACATCATCGC	2
			5'minCKO_1	CCCTTTGCCCGAAGTAACAA	3
5'minCKO_2	ACGGTGAAAACCTGGCCTAT	4
			minC_check_4_1	TCAATTTAACGGTTGAACGGTCA	5
minC_check_4_2	ATGTCAAACACGCCAATCGA	6
			minD_check_2_1	TTATCCTCCGAACAAGCGTTTGA	7
minD_check_2_2	ATGGCACGCATTATTGTTGTTAC	8

表7.PCR反应的组分

组分	50uL反应	最终浓度
			10uM正向引物	2.5uL	0.5uM
10uM反向引物	2.5uL	0.5uM
			DMSO	1.5uL	3％
2X Phusion主要混合物	25uL	1x
			基因组DNA	1uL	2ng/uL
无核酸酶的水	17.5uL	N/A

表8.PCR反应的条件

表9.关于PCR反应的退火温度的信息

退火温度
		Tm编号	Tm℃
1	59.9
		2	61.3
3	63.8
		4	66.6
5	69.7
		6	67.6

PCR扩增后，使用 PCR和DNA纯化试剂盒或DNA纯化和浓缩试剂盒^TM-5与Zymo-Spin IC柱纯化所有产物。然后使纯化的PCR扩增物在上述条件下在DNA琼脂糖凝胶中电泳，并以相同的方式使其可视化。对于A系列和B系列，使用一对引物1-2和另一对引物3-4的反应分别主要产生了适当大小的单个条带。用一组引物7-8的反应仅产生对应于minD基因的单个条带。进行使用一组引物5-6的反应以检查minC的存在，并且该反应产生条带分层，指示敲除minC后存在预期的非特异性PCR产物。也对野生型基因组进行所有这些反应以便比较。使用多组引物1-2和3-4的反应产生了条带分层，这是从具有min C和/或D敲除系统***物的BL21和/或BL21-AI菌株，而不是在野生型中所预期的，因为重组***物不存在于野生型基因组中。使用多组引物5-6和7-8的反应分别产生指示特异性PCR产物的单个条带。

使用凝胶提取试剂盒从凝胶中提取所有指示特异性PCR产物的条带，并由Eton Biosciences分析DNA序列。所有DNA测序结果均显示与其中min C和/或D被敲除的预期序列几乎同一(99％)的序列同源性。

为了从亲本细胞中分离微细胞，将包括母细胞和微细胞在内的整个培养物以2,000rcf离心10分钟以使亲本细胞沉淀。然后收集上清液，并以10,000rcf再次离心10分钟以使微细胞沉淀。丢弃上清液，然后将沉淀的微细胞根据其预期用途重新悬浮在PBS或任何其它缓冲液中。

表10.序列文件中的序列的列表

实施例2.CBM表达盒转化到微细胞中

用融合了接头蛋白的CBM表达质粒转化产生遗传修饰的微细胞的细菌菌株。

使用KpnI和SacI限制切位点将CBM编码基因***pAIDA-1载体的AIDA-1表面表达盒中，从而允许CBM蛋白表达并通过与跨膜自主转运蛋白AIDA-1(扩散粘附中涉及的粘附素)融合而展示，如图4B所示。这种构建用最初设计的pAIDA-1质粒(来自Addgene,Cambirdge,MA)进行，其中使用KpnI和SacI位点将CBM编码基因连接到AIDA-I自主转运蛋白内的乘客结构域中，如图4A所示。先前存在于pAIDA-1质粒上的标签用于对CBM表达进行进一步分析。连接完成后，6x His标签和HRV3C位点位于CBM编码基因的N端，而Myc标签和TEV位点位于CBM编码基因的C端。在表面表达的融合CBM蛋白的5'末端的6x His标签，用于钴固定金属亲和色谱法(IMAC)并且用来自Genscript的THE His标签抗体[FITC]进行免疫荧光染色。pAIDA-1载体具有氯霉素抗性基因，使得可以将重组pAIDA-CBM表达载体转化到p567-48野生型菌株、BL21(DE3)菌株和BL21-AI菌株中。为了诱导从BL21(DE3)菌株和BL21-AI菌株产生微细胞，本公开通过用氯霉素抗性基因置换min基因座来使用minC、minD和/或minC/D敲除系统。在这种情况下，由于在载体和产生微细胞的菌株中都存在相同的氯霉素抗性基因，所以无法用重组pAIDA-1CBM表达载体转化产生新的蛋白酶缺陷型微细胞的菌株(例如，minC、D或C/D耗竭型BL21(DE3)菌株和/或minC、D或C/D耗竭型BL21-AI菌株)。

为了表达AIDA-1CBM融合蛋白，在pGEX-6P-1载体的骨架中构建了另一种重组AIDA-CBM表达质粒。从pAIDA-1CBM表达载体切出AIDA-1CBM表面表达盒，并将其克隆到pGEX-6P-1载体中，如图5A所示。这样，因为pGEX-6P-1AIDA-1-CBM载体具有氨苄青霉素抗性基因，所以可以用氯霉素来选择具有氯霉素抗性基因的新的蛋白酶缺陷型微细胞。

对于基于自主转运蛋白结构的细菌表面展示系统(称为BrkAutoDisplay)，使用BrkA(博德特氏菌血清抗性杀伤蛋白A)作为编码CBM的外源基因的宿主。为了构建重组Brk-CBM表达载体，首先将Brk自主转运蛋白基因克隆到pGEX-6P-1质粒中。使用BamHI和EcoRI限制位点，使CBM编码基因与Brk自主转运蛋白基因连接，如图6A所示。如图6B所示，将CBM编码基因***BrkA自主转运蛋白基因的乘客结构域中。表达盒的前177个核苷酸对应于Brk自主转运蛋白的信号肽部分。这是融合蛋白最N-端的部分。该部分在易位过程中被裂解。用于纯化和染色的6x His标签就位于信号肽的C-端。该6x His标签是切掉信号肽之后表面表达的融合蛋白的N-末端。His标签的C-端与CBM编码基因融合，其后依次是Myc标签和TEV位点。然后，BrkA自主转运蛋白的易位结构域刚好位于TEV位点之后。融合蛋白的这种易位结构域是该蛋白嵌入膜内的最C-端的区域。

另一细菌表面展示蛋白即冰成核蛋白K(InaK)用于表达与锚定接头蛋白(基序)融合的重组CBM蛋白，重组CBM蛋白指导微细胞表面并入的融合蛋白。和BrkAutoDisplay一样，将编码InaK跨膜蛋白的多核苷酸和CBM编码基因***pGEX-6P-1载体中用于产生细菌表面展示CBM蛋白，如图7A所示。对于所有InaK-CBM融合物而言，CBM编码基因在C-端具有6x His标签和Myc标签，而TEV位点与CBM编码基因的N-端融合。在这种构建体中，编码InaK的多核苷酸序列位于TEV位点的N-端前面。由于InaK蛋白的C-端在表面表达并且N-末端嵌入膜中，因此在编码InaK的多核苷酸序列后***CBM编码基因，这使得CBM展示在表面上，而InaK可以充当膜锚点。6x His标签用于钴固定金属亲和色谱法(IMAC)并且用于用来自的THE His标签抗体[FITC]进行免疫荧光染色。Myc标签可用于免疫荧光染色。TEV位点可用于消化掉目标蛋白诸如CBM，以进行表面表达确认。

使用AIDA-1、BrkA和InaK系统完成用于细菌表面展示融合蛋白的细菌表达载体的构建后，使用TransformAid细菌转化试剂盒(Thermo Scientific^TM)根据其标准方案，进行每种表达载体向蛋白酶缺陷型细胞系BL21和/或BL21-AI菌株内的转化。将CBM融合到每个接头蛋白AIDA-1、BrkA和InaK上，以确保CBM的表面表达。可以将这些表达质粒转化到野生型p678-54菌株和通过本公开教导的方法产生的产生微细胞的蛋白酶缺陷型细菌菌株(例如minC、D或C/D耗竭型BL21(DE3)菌株和/或minC、D或C/D耗竭型BL21-AI菌株)中。

为了确认经转化的细菌菌株中质粒的存在，使用GeneJet Plasmid MiniPrep试剂盒对来自菌株的培养物进行了微量制备，并提交纯化的质粒用于DNA测序分析。所有测序都证实经转化的细菌菌株中存在表面表达CBM质粒。

实施例3.CBM的产生

使经转化的菌株在5mL具有适当抗生素的培养物中生长。第二天，在加上适当抗生素的2x YT培养基中进行1:100接种(4.5mL过夜培养物在550mL 2x YT培养基中)。2x YT培养基提供了过剩的蛋白质有效产生所需的营养素。一旦培养物达到指数生长期(OD约0.4)，就将其用1mM IPTG诱导，并在30℃下孵育过夜。第二天分析培养物的CBM产量。

过夜IPTG诱导后，将样品从培养箱振荡器中取出，并倒入三个250mL的离心瓶(各150mL样品)中。将瓶子以2,000rcf离心以使细菌细胞沉淀。将上清液转移至三个干净的250mL离心瓶中。将上清液以10,000rcf离心以使微细胞沉淀。使微细胞重新悬浮在PBS中。体积取决于包封变量的数量，每种变量3mL微细胞和另外3mL微细胞用于对照。对于每个微量离心管，测量的微细胞OD为1.0左右。对于每个变量，在3支离心管中使用3mL微细胞(在1.0的OD下，每支管1mL)。

实施例4.CBM染色

对培养的细胞进行染色以便确定表面表达的CBM的存在。针对表达CBM的产生微细胞的细菌BL21和/或BL21-AI菌株以及尚未用重组接头蛋白融合的CBM表达质粒转化的产生微细胞的细菌p678-54菌株，使载玻片显色。持续15分钟将250uL的聚L-赖氨酸移吸至载玻片上。用500uL PBS洗涤3次后，持续15分钟将500uL正确的细胞类型移吸到载玻片。用500uLPBS洗涤3次后，持续15分钟将750uL的4％多聚甲醛移液到载玻片上，以便将细胞样品固定在载玻片上。用PBS洗涤3次后，持续10分钟将500uL的.1％triton x-100PBS添加到作为透化样品分配的载玻片上。对于非透化样品，在该步骤期间将500uL PBS添加到载玻片上。用PBS洗涤3次后，将100uL的2％牛血清白蛋白移吸到所有载玻片上作为封闭剂。用PBS洗涤3次后，在载玻片上移吸100uL的1mg/mL THE^TM His标签抗体[FITC]，mAb即小鼠抗体，该抗体与CBM融合蛋白的6x-HIS标签组分结合。然后，将载玻片与抗体在室温下孵育1小时，同时避光。用PBS洗涤5-10次后，在将盖玻片封固到载玻片上之前，添加3-4滴含DAPI的Fluoroshield封固介质。然后可以实施荧光显微镜检查以分析明视野细胞和荧光探针之间的定位，该定位指示细胞的存在和表面表达的蛋白质的存在。

在透化和非透化的微细胞中，用His-标签抗体进行染色在大多数表达AIDA-1-CBM融合蛋白的细胞群中显示强信号(图8A和图8B)。然而，His-标签抗体在对照样品中几乎没有检测到信号(图8C和图8D)。对照样品是野生型p678-54微细胞，它们不含表达重组CBM的质粒，使得无法检测到融合蛋白。因此，His标签染色结果表明融合CBM的表达来自用重组CBM表达质粒转化的微细胞，而不是对照细胞。非透化的微细胞(图8A)显示了表面表达的CBM蛋白，表明CBM通过AIDA-1接头蛋白固定在微细胞的表面上。然而，从非透化细胞与透化细胞的比较来看，重组CBM并非全部是表面表达的(图8B)，表明内源性CBM和/或重组融合CBM微细胞也可以在微细胞内表达。另一方面，如对照微细胞中所示(图8C和图8D)，可以检测到通过对经转化的微细胞内任何内源性产生的CBM染色而产生的假阳性。

实施例5.细胞保留量试验

为了测试两周内的细胞保留量，使用两个变量：1)温度依赖性，2)戊二醛处理。在一种条件下，在室温下将微细胞用1％(v/v)戊二醛处理和不处理，持续15天。在另一种条件下，与未处理的对照相比，将微细胞用三种不同浓度的戊二醛(5％、1％和0.25％(v/v)处理，在37℃下持续15天。如图9A所示，未处理的微细胞的光密度比经处理的微细胞的光密度下降更显著。然而，经1％(v/v)戊二醛处理的微细胞未降解和/或死亡。这表明戊二醛有助于防止微细胞在室温下的早期降解持续15天，这确保活性成分在微细胞内的保留延长。同样，如图9B所示的未处理的微细胞的光密度显示在高温下，经戊二醛处理的微细胞维持其活力，无降解。

结果表明，可以通过产生其中某一部分的微细胞经戊二醛处理而另一部分的微细胞未经处理的调配物来控制农用化学品从微细胞中的释放。这将允许未处理的微细胞更快地降解并且最初释放更多的活性成分，而经处理的细胞将更慢地降解并且随时间推移而释放活性成分。

实施例6.结晶纤维素研究

为了阐明使用微晶纤维素和表面表达的纤维素结合模块截留微细胞的功效，开发了一种结合了定性和定量测量的测定法。如图7所示，用于测试功效的两个细胞系是无蛋白酶的野生型细胞系和含有pGEX-Inak-CBM的无蛋白酶的细胞系。选择无蛋白酶的野生型细胞系作为该实验的对照，以解释微细胞与纤维素的任何非酶促结合。所有微细胞都是在我们的标准蛋白质表达方案之后，使用我们的标准微细胞纯化方案从其母细胞中分离的。然后将这些细胞与荧光素二乙酸酯(FDA，0.08mg/mL)一起孵育1小时，以进行荧光显微镜染色。将5mL来自每个细胞系的那些细胞与100mg微晶纤维素(Avicel PH-101)一起在37℃以180rpm振荡孵育20分钟。孵育后，将碘化丙啶(添加到溶液中，由于其对DNA的结合亲和力而有助于标记细胞。碘化丙啶因观察到的它对纤维素的吸附性能而有用；本质上它有助于在荧光图像上将纤维素标记为红色。孵育后，基于较大的尺寸(约50uM)将微晶纤维素与细胞离心分离(100rcf)。在此，从对照和实验细胞系中取出纤维素用于成像，并对细胞与纤维素的结合进行成像。将来自每种条件的纤维素和细胞溶液添加到空的色谱柱(Bio-radEconopac，20mL)中。使细胞溶液通过该柱，留下大部分纤维素。通过该柱后，将细胞通过1uM过滤器进行注射器过滤，以去除所有残留的纤维素。

获得起始光密度(600nM)和过滤柱通过物的光密度(600nM)之间的差值，以便确定具有表面表达的CBM的实验细胞是否比没有表面表达的CBM的对照细胞更多地被纤维素保持。因为存在过滤步骤，所以通过过滤器过滤了来自两个起始群的细胞，并测量了起始和最终OD600’。从该实验中，确定过滤后约35.6％的细胞通过过滤器损失。为了在CBM测定中解决这个问题，在获得起始和最终OD600’之间的差值之前，将最终细胞计数(通过所述柱后)乘以1.356。对于无蛋白酶的野生型，这导致通过含纤维素的柱的OD600损失为0.11，对于具有表面表达的CBM的无蛋白酶的菌株，通过含纤维素的柱的OD600损失为0.169。这表明与不表达CBM的细胞相比，表达CBM的细胞的保留量增加大于15％。

图10显示了从作为对照的无蛋白酶的野生型菌株(图10A)和含有pGEX-InaK-CBM的无蛋白酶的菌株(图10B)获得的蛋白酶缺陷型微细胞的CBM微晶纤维素测定结果。当重叠图10A中左下方图像(PI图像)与右上方图像(FDA图像)时，证明在纤维素上不存在染色的细胞。右下方是所有三个成像条件的重叠图像，重叠图像证明细胞未与纤维素结合。然而，在图10B中，右上方图像清楚地显示了来自结合的细胞表面的FDA信号，而且左下方图像显示了相同内容，但是PI信号由于来自结合细胞的FDA信号而模糊。然而，这些图像证明可以清楚地看到细胞与纤维素结合。

实施例7.通过微细胞技术进行包封

i)建立标准曲线

在天平上称取预定质量的农用化学品(约100mg)诸如灭害剂、除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂，然后基于其溶解度溶解在PBS或乙醇中。一旦制成灭害剂的液体溶液(1mg/mL)，就在PBS或Milli Q Water中进行稀释，以建立标准曲线。灭害剂的检测限值不同，因此制成一系列浓度(0ug/mL、1ug/mL、5ug/mL、10ug/mL、20ug/mL、25ug/mL、50ug/mL、75ug/mL、100ug/mL、150ug/mL、200ug/mL、250ug/mL、300ug/mL、500ug/mL、750ug/mL和1000ug/mL)以建立强标准曲线。尝试标准曲线，直到获得大于0.95的R平方值。

ii)准备包封

从琼脂板上挑取一个产生微细胞的菌落并接种在Luria肉汤培养基(约450mL)中。将该样品置于培养箱振荡器中过夜生长。过夜生长过程中，细菌细胞产生微细胞。第二天，将样品从培养箱振荡器中取出，倒入三个250mL的离心瓶(各150mL样品)中。将瓶子以2,000rcf离心以使细菌细胞沉淀。将上清液转移至三个干净的250mL离心瓶中。将上清液以10,000rcf离心以使微细胞沉淀。使微细胞重新悬浮在PBS中。体积取决于包封变量的数量，每个变量3mL微细胞并且另3mL微细胞用于对照。确保每支微量离心管，微细胞的OD为1.0左右。对于每个一个变量，将在3支离心管中使用3mL微细胞(在1.0的OD下，每支管1mL)。

iii)包封过程

可以使用各种方法将农用化学品包封在微细胞中。这些方法可以是被动的或主动的。被动方法依靠通过单独孵育，使农用化学品沿浓度梯度向下通过微细胞的通道/孔扩散。农用化学品的浓度可以根据所需装载量而改变。增加农用化学品的浓度，允许更多可用的农用化学品分子，从而导致更高的包封量。平均而言，两个小时的孵育时间将满足这些实验的需要。一旦获得了微细胞(OD为1.0，每支管1mL)，就通过以最大速度(约15,000rcf)离心使其沉淀下来，并弃去上清液。对于被动包封，将微细胞重新悬浮在农用化学品中进行孵育。将农用化学品溶解在pH为7的磷酸盐缓冲盐水中。分析前，微细胞将在农用化学品溶液中在37℃下孵育并振荡两小时。对于对照，将微细胞重新悬浮在pH为7的磷酸盐缓冲盐水中，并将不含微细胞的农用化学品溶液在37℃下孵育并振荡2小时。

对于主动包封，使用技术来提高农用化学品的溶解度，增加微细胞膜的渗透性或两者。这些方法包括改变农用化学品溶液的pH，使细胞热休克或电穿孔，使用Tris/EDTA/蔗糖缓冲液，使用氯化钙或氯化镁，使用不同重量的聚乙二醇，表达蛋白质通道来改善农用化学品流入量以及使细胞在所需农用化学品中生长。一旦使用这些方法中的一种，则在37℃下孵育2小时以获得更高的包封量。

实施例8.总包封量分析

总封装量可以通过分光光度计进行分析，并且可以通过质谱仪进行更准确的分析。两种分析方法都需要标准曲线。一旦两小时的孵育期结束，就将孵育的样品以最大速度离心以进行前端分析。在这些溶液中对上清液进行分析。当与不含微细胞的灭害剂样品相比，含微细胞的实验样品中灭害剂浓度的相对下降是包封在微细胞内的灭害剂的直接量度。然后，使微细胞沉淀裂解以进行后端分析。从理论上讲，上清液和裂解的沉淀应占可用农用化学品总量的100％。当在高于分光光度计的定量范围的浓度下工作时，在分析之前必须进行稀释。

如下呈现了将灭害剂包封到微细胞中的方案：

(1)在500ml的LB培养基中挑取产生微细胞的细菌菌株的菌落。使其生长过夜。

(2)使用2步离心纯化法从母细胞中纯化微细胞。以2000g进行的第一离心步骤去除了沉淀中的大部分母细胞；然后将来自该第一步的上清液再次以10000g离心。然后将这第二块纯化的微细胞沉淀重新悬浮于PBS(pH 7.4)中，以达到约2.0的OD600。

(3)将3-5ml的细胞溶液等分到50ml管中。将等体积的灭害剂溶液引入实验样品的细胞溶液中。灭害剂溶液是含有25％乙醇和25％PEG600(v/v％)的水溶液。将细胞溶液和灭害剂溶液混合后，溶液中细胞的有效浓度变成8x10^8个细胞/ml(OD600：约1)并且PEG600和乙醇的有效浓度均变成12.5％(v/v％)。对于对照样品，将细胞溶液与等体积的含25％PEG600和25％乙醇(v/v％)的PBS混合，以达到与实验样品相同的溶剂有效浓度。

(4)然后使细胞和灭害剂溶液孵育2小时(rpm 180，37℃)。然后，从孵育中取出1ml溶液样品并离心(15000g，10分钟)以将其准备用于分析。如果要用固定剂(例如戊二醛)处理细胞，则从孵育中取出1ml溶液样品并以2.5％的有效浓度用戊二醛处理。允许戊二醛处理在室温下进行过夜；然后离心细胞和灭害剂溶液以将其准备用于分析。

(5)通过去除灭害剂溶液上清液并将沉淀重新悬浮于PBS中以洗掉任何未被包封的残留游离灭害剂来分析细胞。然后，将细胞再次离心(15000g，10分钟)，并将沉淀重新悬浮于850ul来自GeneJET质粒微量制备试剂盒的裂解液中。

(6)然后将裂解的溶液离心(15000g，10分钟)，并使用分光光度计分析上清液在对灭害剂化合物有特异性的波长下的吸光度。从实验样品的信号中减去来自作为背景的对照样品(未用灭害剂孵育，但经过洗涤和裂解的细胞)的信号。这样确保分析准确地表示溶液中灭害剂的浓度。

农用化学品实施例1.通过微细胞技术包封甲酰胺磺隆

本文描述了包封甲酰胺磺隆的无核微细胞平台。甲酰胺磺隆或2-[(4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)氨基甲酰氨磺酰基]-4-甲酰胺基-N,N-二甲基苯甲酰胺是磺酰脲类的除草剂。甲酰胺磺隆的吸收波长为233纳米；因此，将Corning UV-透明板连同分光光度计一起用于收集包封数据。通过使用如图11A所示的标准曲线，将吸光度量度转化为甲酰胺磺隆浓度。

甲酰胺磺隆分子

从0至150微克建立标准曲线。对于实验1稀释是必需的，因为评估的浓度高于分光光度计的灵敏度。实验2和3不需要稀释。三个实验如以上方法部分中描述的那样进行。浓度是唯一修改的变量。对于全部三个实验而言，每个样品使用1mL的微细胞(OD约1.0)。分析之前将微细胞用甲酰胺磺隆孵育两小时。标准曲线的R²值>0.99。用三种不同的起始浓度进行三次单独的甲酰胺磺隆实验，一式三份。图11B和图11C中呈现了关于包封质量、包封分数和质量分数的结果。

农用化学品实施例2.通过微细胞技术包封螺虫乙酯

本文描述了用于包封螺虫乙酯的微细胞技术。螺虫乙酯或[3-(2,5-二甲基苯基)-8-甲氧基-2-氧代-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-4-基]碳酸乙酯是酮-烯醇类的杀昆虫剂。螺虫乙酯的吸收波长为250纳米；因此，将Corning UV-透明板连同分光光度计一起用于收集包封数据。通过使用如图12A所示的标准曲线，将吸光度量度转化为螺虫乙酯浓度。

螺虫乙酯分子

从0至300微克建立标准曲线。对于实验2和3，稀释是必需的，因为评估的浓度高于分光光度计的灵敏度。实验1不需要稀释。三个实验如以上方法部分中描述的那样进行。浓度和孵育时间是唯一修改的变量。对于全部三个实验而言，每个样品使用1mL的微细胞(OD约1.0)。分析之前将微细胞与螺虫乙酯一起孵育两小时，除了实验3，孵育两个半小时外。标准曲线的R²>0.99。用三种不同的起始浓度进行三次单独的螺虫乙酯实验，一式三份。实验1和2显示随着增加原材料的浓度而包封量增加。由于目标是提高质量分数，因此在实验3中，增加了螺虫乙酯的浓度，并将孵育时间从两小时增加至两个半小时。图12B和图12C中呈现了关于包封质量、包封分数和质量分数的结果。

农用化学品实施例3.通过微细胞技术包封唑菌胺酯

本文描述了用于包封唑菌胺酯的微细胞技术。唑菌胺酯或N-[2-[[1-(4-氯苯基)吡唑-3-基]氧基甲基]苯基]-N-甲氧基氨基甲酸甲酯是嗜球果伞素类的杀真菌剂。唑菌胺酯的吸收波长为275纳米；因此，将Corning UV-透明板连同分光光度计一起用于收集包封数据。通过使用如图13A所示的标准曲线，将吸光度量度转化为唑菌胺酯浓度。

唑菌胺酯分子

从0至250微克建立标准曲线。这些实验不需要稀释。三个实验如以上方法部分中描述的那样进行。浓度和孵育时间是唯一修改的变量。对于全部三个实验而言，每个样品使用1mL的微细胞(OD约1.0)。分析之前将微细胞与唑菌胺酯一起孵育两小时，除了实验3，孵育两个半小时外。标准曲线的R²>0.97。用三种不同的起始浓度进行三次单独的唑菌胺酯实验，一式三份。实验1和2显示了在原材料的不同浓度下的包封量。由于目标是提高质量分数，因此在实验3中，将唑菌胺酯孵育时间从两小时增加至两个半小时。图13B和图13C中呈现了关于包封质量、包封分数和质量分数的结果。

农用化学品实施例4.通过微细胞技术包封噻虫胺

本文描述了用于包封噻虫胺的微细胞技术。噻虫胺或1-[(2-氯-1,3-噻唑-5-基)甲基]-2-甲基-3-硝基胍是新烟碱类的杀昆虫剂。噻虫胺的吸收波长为270纳米；因此，将Corning UV-透明板连同分光光度计一起用于收集包封数据。通过使用图14A中的标准曲线，将吸光度量度转化为噻虫胺浓度。

噻虫胺分子

从0至20微克建立标准曲线。这些实验不需要稀释。三个实验如以上方法部分中描述的那样进行。对于全部三个实验而言，每个样品使用1mL的微细胞(OD约1.0)。分析之前将微细胞用噻虫胺孵育两小时。标准曲线的R²值>0.99。用三种不同的起始浓度进行三次单独的噻虫胺实验，一式三份。三个相同实验在噻虫胺的包封量方面显示出相似的结果。图14B和图14C中呈现了关于包封质量、包封分数和质量分数的结果。

实施例9.包封农业化合物的微细胞平台的应用

如实施例7和8所述，微细胞可以包封农业化合物和/或农用化学品。包封农用化学品的微细胞可以被配制成液体、干燥组合物、粉末、粒剂、种子包衣、浇灌剂、犁沟内组合物或叶面喷雾剂。配制的包封农用化学品的微细胞可以施加至植物。将进行将配制的包封农业化合物的微细胞直接和/或间接地施加到目标植物上的实验，目标植物的一部分包括种子、茎、花、果实、叶、根或根茎。

第一，可以将包封在微细胞中的其中一种除草剂(例如甲酰胺磺隆)施加于农业作物，包括但不限于高粱、油菜、番茄、草莓、大麦、水稻、玉米和小麦。第二，可以将包封在微细胞中的其中一种杀昆虫剂(例如螺虫乙酯)施加于农业作物，包括但不限于高粱、油菜、番茄、草莓、大麦、水稻、玉米和小麦。第三，可以将包封在微细胞中的另一类型的杀昆虫剂(例如噻虫胺)施加于农业作物，包括但不限于高粱、油菜、番茄、草莓、大麦、水稻、玉米和小麦。第四，可以将包封在微细胞中的其中一种杀真菌剂(例如唑菌胺酯)施加于农业作物，包括但不限于高粱、油菜、番茄、草莓、大麦、水稻、玉米和小麦。

本公开的编号的实施方案

尽管有所附权利要求，但是本公开提出了以下编号的实施方案：

平台

1.一种用于包封和递送农业化合物的基于无核细胞的平台，其包含：

a.完整的无核细胞，在所述细胞内具有至少一种非表达的农业化合物。

2.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其还包含：

b.至少一种农业上可接受的载剂。

3.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整的无核细胞源自原核细胞。

4.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整的无核细胞是细菌来源的微细胞。

5.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整的无核细胞是由革兰氏阴性细菌属产生的。

6.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整的无核细胞是由选自由以下组成的组的细菌属产生的：埃希氏杆菌属、沙门氏菌属、志贺菌属、假单胞菌属和土壤杆菌属。

7.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整的无核细胞是由选自由以下组成的组的细菌种产生的：大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺菌和铜绿假单胞菌。

8.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整的无核细胞是由P678-54大肠杆菌亲本细菌细胞产生的。

9.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整的无核细胞是由***属产生的。

10.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整的无核细胞是由选自由以下组成的组的细菌属产生的：芽孢杆菌属、棒状杆菌属和乳杆菌属。

11.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整的无核细胞是由选自由以下组成的组的细菌种产生的：枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和嗜酸乳杆菌。

12.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整的无核细胞是由有WprA蛋白酶缺陷的亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞。

13.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整的无核细胞是由蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞。

14.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整的无核细胞是由蛋白酶缺陷型KO7枯草芽孢杆菌亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞。

15.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整的无核细胞是由选自由以下组成的组的蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞：(1)CU403,DIVIVA；(2)CU403,DIVIVB,SPO-；(3)CU403,DIVIVB；及(4)CU403,DIVIVB1，其中至少一个蛋白酶编码基因已经被抑制、缺失或沉默。

16.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整的无核细胞是由蛋白酶缺陷型亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞。

17.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整的无核细胞是由有Lon和OmpT蛋白酶缺陷的亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞。

18.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整的无核细胞是由蛋白酶缺陷型大肠杆菌亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞。

19.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整的无核细胞是由选自由以下组成的组的蛋白酶缺陷型大肠杆菌亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞：BL21、BL21(DE3)、BL21-AI、LPS-修饰的BL21(DE3)和B8。

20.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整的无核细胞源自真核细胞。

21.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种非表达的农业化合物选自由以下组成的组：灭害剂、除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、肥料和激素或化学生长剂。

22.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种非表达的农业化合物是灭害剂。

23.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种非表达的农业化合物是除草剂。

24.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种非表达的农业化合物是磺酰脲类除草剂。

25.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种非表达的农业化合物是甲酰胺磺隆。

26.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种非表达的农业化合物是杀昆虫剂。

27.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种非表达的农业化合物是新烟碱类杀昆虫剂。

28.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种非表达的农业化合物是噻虫胺。

29.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种非表达的农业化合物是酮-烯醇类杀昆虫剂。

30.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种非表达的农业化合物是螺虫乙酯。

31.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种非表达的农业化合物是杀真菌剂。

32.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种非表达的农业化合物是嗜球果伞素杀真菌剂。

33.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种非表达的农业化合物是唑菌胺酯。

34.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种非表达的农业化合物是杀线虫剂。

35.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种非表达的农业化合物是肥料。

36.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种非表达的农业化合物是选自由以下组成的组的肥料：氮肥、磷肥和钾肥。

37.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种非表达的农业化合物是激素或化学生长剂。

38.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种非表达的农业化合物是选自由以下组成的组的激素或化学生长剂：脱落酸、生长素、细胞***素、乙烯、赤霉素、油菜素类固醇、水杨酸、茉莉酮酸酯、聚胺、一氧化氮、独脚金内酯、卡里金和三十烷醇。

39.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞在其表面上表达多肽。

40.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞在其表面上表达异源多肽。

41.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞表达融合蛋白。

42.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个植物细胞粘附部分。

43.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个植物细胞粘附部分，

其中所述表面表达部分包含跨膜结构域并且选自由以下组成的组：冰成核蛋白(INP)、BrkA(博德特氏菌血清抗性杀伤蛋白)和AIDA(扩散粘附中涉及的粘附素)。

44.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个植物细胞粘附部分，

其中所述表面表达部分包含输出细菌蛋白并且选自由以下组成的组：LamB(λ受体)、OprF(铜绿假单胞菌外膜蛋白F)、OmpA(外膜蛋白A)、Lpp(脂蛋白)、MalE(麦芽糖结合蛋白)、PhoA(碱性磷酸酶)、Bla(TEM-1B-内酰胺酶)、F1或M13主要外壳蛋白(源自基因VIII)及F1或M13次要外壳蛋白(基因III)。

45.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个植物细胞粘附部分，

其中所述植物细胞粘附部分包含碳水化合物结合模块。

46.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个植物细胞粘附部分，

其中所述植物细胞粘附部分包含选自由以下组成的组的碳水化合物结合模块：纤维素结合结构域、木聚糖结合结构域、几丁质结合结构域和木质素结合结构域。

47.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞在其表面上表达增加与植物表面的粘附的多肽。

48.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞在其表面上表达植物粘附多肽。

49.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞表达在其表面上展示的碳水化合物结合模块。

50.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞表达在其表面上展示的异源碳水化合物结合模块。

51.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞表达在其表面上展示的纤维素结合结构域。

52.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞表达在其表面上展示的异源纤维素结合结构域。

53.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其被配制成液体、干燥组合物、粉末、粒剂、种子包衣、浇灌剂、犁沟内组合物或叶面喷雾剂。

54.一种将农业化合物递送至某一位置的方法，其包括：将如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台施加于预期位置。

55.一种将农业化合物递送至植物的方法，其包括：将如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台施加于植物。

56.一种将农业化合物递送至植物的方法，其包括：将如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台施加于植物，其中所述植物包括种子、茎、花、果实、叶、根或根茎。

57.一种将农业化合物递送至作物的方法，其包括：将如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台施加于作物或接近所述作物的位置。

58.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞经溶剂处理。

59.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述溶剂是乙醇、DMSO、聚乙二醇或甘油。

60.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中除所述溶剂外，还用一种剂处理所述无核细胞。

61.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述剂是固定剂、防腐剂或交联剂。

62.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述交联剂是戊二醛、甲醛、京尼平或表没食子儿茶素没食子酸酯。

63.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述溶剂增加进入所述无核细胞的所述农业化合物的溶解性。

64.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述溶剂增加进入所述无核细胞的所述农业化合物的溶解性，并且其中所述溶剂增加进入所述无核细胞的所述农业化合物的扩散。

65.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述剂将所述农业化合物捕获在所述无核细胞的膜内。

66.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述剂将所述农业化合物捕获在所述无核细胞的膜内，并且其中所述剂使所述农业化合物与所述无核细胞交联，从而提高所述无核细胞的稳定性。

67.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述剂增强所述农业化合物进入所述无核细胞的装载容量。

68.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述剂增强所述农业化合物进入所述无核细胞的装载容量，并且其中所述剂控制所述农业化合物从所述无核细胞的释放速率。

69.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞表现出所述至少一种非表达的农业化合物的控释速率。

70.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞表现出所述至少一种非表达的农业化合物的控释速率，并且其中所述至少一种非表达的农业化合物以稳定速率释放。

71.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞表现出所述至少一种非表达的农业化合物的初期突释。

72.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞表现出所述至少一种非表达的农业化合物的初期突释，所述突释包括释放所述至少一种非表达的农业化合物的至少约40％。

73.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞表现出所述至少一种非表达的农业化合物的控释速率，并且其中所述控释速率是每天少于40％、少于30％、少于20％、少于15％、少于10％或少于5％的所述至少一种非表达的农业化合物从所述无核细胞中释放。

74.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述控释速率是每天少于15％的所述非表达的农业化合物从所述无核细胞中释放。

75.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述控释速率是每天少于10％的所述非表达的农业化合物从所述无核细胞中释放。

76.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述控释速率是每天约10％的所述非表达的农业化合物从所述无核细胞中释放。

农业组合物

1.一种用于稳定和靶向递送农业化合物的组合物，其包含：

a.完整的无核细胞，在所述细胞内具有至少一种非表达的农业化合物；和

b.至少一种农业上可接受的载剂。

2.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述完整的无核细胞源自原核细胞。

3.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述完整的无核细胞是细菌来源的微细胞。

4.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述完整的无核细胞是由革兰氏阴性细菌属产生的。

5.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述完整的无核细胞是由选自由以下组成的组的细菌属产生的：埃希氏杆菌属、沙门氏菌属、志贺菌属、假单胞菌属和土壤杆菌属。

6.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述完整的无核细胞是由选自由以下组成的组的细菌种产生的：大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺菌和铜绿假单胞菌。

7.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述完整的无核细胞是由P678-54大肠杆菌亲本细菌细胞产生的。

8.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述完整的无核细胞是由***属产生的。

9.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述完整的无核细胞是由选自由以下组成的组的细菌属产生的：芽孢杆菌属、棒状杆菌属和乳杆菌属。

10.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述完整的无核细胞是由选自由以下组成的组的细菌种产生的：枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和嗜酸乳杆菌。

11.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述完整的无核细胞是由有WprA蛋白酶缺陷的亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞。

12.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述完整的无核细胞是由蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞。

13.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述完整的无核细胞是由蛋白酶缺陷型KO7枯草芽孢杆菌亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞。

14.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述完整的无核细胞是由选自由以下组成的组的蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞：(1)CU403,DIVIVA；(2)CU403,DIV IVB,SPO-；(3)CU403,DIVIVB；及(4)CU403,DIVIVB1，其中至少一个蛋白酶编码基因已经被抑制、缺失或沉默。

15.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述完整的无核细胞是由蛋白酶缺陷型亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞。

16.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述完整的无核细胞是由有Lon和OmpT蛋白酶缺陷的亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞。

17.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述完整的无核细胞是有蛋白酶缺陷型大肠杆菌亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞。

18.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述完整的无核细胞是由选自由以下组成的组的蛋白酶缺陷型大肠杆菌亲本细菌细胞产生的细菌来源的微细胞：BL21、BL21(DE3)、BL21-AI、LPS-修饰的BL21(DE3)和B8。

19.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述完整的无核细胞源自真核细胞。

20.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述至少一种非表达的农业化合物选自由以下组成的组：灭害剂、除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、肥料和激素或化学生长剂。

21.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述至少一种非表达的农业化合物是灭害剂。

22.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述至少一种非表达的农业化合物是除草剂。

23.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述至少一种非表达的农业化合物是磺酰脲类除草剂。

24.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述至少一种非表达的农业化合物是甲酰胺磺隆。

25.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述至少一种非表达的农业化合物是杀昆虫剂。

26.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述至少一种非表达的农业化合物是新烟碱类杀昆虫剂。

27.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述至少一种非表达的农业化合物是噻虫胺。

28.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述至少一种非表达的农业化合物是酮-烯醇类杀昆虫剂。

29.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述至少一种非表达的农业化合物是螺虫乙酯。

30.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述至少一种非表达的农业化合物是杀真菌剂。

31.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述至少一种非表达的农业化合物是嗜球果伞素杀真菌剂。

32.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述至少一种非表达的农业化合物是唑菌胺酯。

33.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述至少一种非表达的农业化合物是杀线虫剂。

34.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述至少一种非表达的农业化合物是肥料。

35.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述至少一种非表达的农业化合物是选自由以下组成的组的肥料：氮肥、磷肥和钾肥。

36.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述至少一种非表达的农业化合物是激素或化学生长剂。

37.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述至少一种非表达的农业化合物是选自由以下组成的组的激素或化学生长剂：脱落酸、生长素、细胞***素、乙烯、赤霉素、油菜素类固醇、水杨酸、茉莉酮酸酯、聚胺、一氧化氮、独脚金内酯、卡里金和三十烷醇。

38.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞在其表面上表达多肽。

39.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞在其表面上表达异源多肽。

40.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞表达融合蛋白。

41.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个植物细胞粘附部分，

42.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个植物细胞粘附部分，

其中所述表面表达部分包含跨膜结构域并且选自由以下组成的组：冰成核蛋白(INP)、BrkA(博德特氏菌血清抗性杀伤蛋白)和AIDA(扩散粘附中涉及的粘附素)。

43.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个植物细胞粘附部分，

其中所述表面表达部分包含输出细菌蛋白并且选自由以下组成的组：LamB(λ受体)、OprF(铜绿假单胞菌外膜蛋白F)、OmpA(外膜蛋白A)、Lpp(脂蛋白)、MalE(麦芽糖结合蛋白)、PhoA(碱性磷酸酶)、Bla(TEM-1B-内酰胺酶)、F1或M13主要外壳蛋白(源自基因VIII)及F1或M13次要外壳蛋白(基因III)。

44.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个植物细胞粘附部分，

其中所述植物细胞粘附部分包含碳水化合物结合模块。

45.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个植物细胞粘附部分，

其中所述植物细胞粘附部分包含选自由以下组成的组的碳水化合物结合模块：纤维素结合结构域、木聚糖结合结构域、几丁质结合结构域和木质素结合结构域。

46.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞在其表面上表达增加与植物表面的粘附的多肽。

47.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞在其表面上表达植物粘附多肽。

48.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞表达在其表面上展示的碳水化合物结合模块。

49.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞表达在其表面上展示的异源碳水化合物结合模块。

50.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞表达在其表面上展示的纤维素结合结构域。

51.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞表达在其表面上展示的异源纤维素结合结构域。

52.如前述条款中任一项所述的组合物，其被配制成液体、干燥组合物、粉末、粒剂、种子包衣、浇灌剂、犁沟内组合物或叶面喷雾剂。

53.一种将农业化合物递送至某一位置的方法，其包括：将如前述条款中任一项所述的组合物施加于预期位置。

54.一种将农业化合物递送至植物的方法，其包括：将如前述条款中任一项所述的组合物施加于植物。

55.一种将农业化合物递送至植物的方法，其包括：将如前述条款中任一项所述的组合物施加于植物，其中所述植物包括种子、茎、花、果实、叶、根或根茎。

56.一种将农业化合物递送至作物的方法，其包括：将根据权利要求1所述的组合物施加于作物或接近所述作物的位置。

57.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞经溶剂处理。

58.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述溶剂是乙醇、DMSO、聚乙二醇或甘油。

59.如前述条款中任一项所述的组合物，其中除所述溶剂外，还用一种剂处理所述无核细胞。

60.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述剂是固定剂、防腐剂或交联剂。

61.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述交联剂是戊二醛、甲醛、京尼平或表没食子儿茶素没食子酸酯。

62.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述溶剂增加进入所述无核细胞的所述农业化合物的溶解性。

63.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述溶剂增加进入所述无核细胞的所述农业化合物的溶解性，并且其中所述溶剂增加进入所述无核细胞的所述农业化合物的扩散。

64.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述剂将所述农业化合物捕获在所述无核细胞的膜内。

65.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述剂将所述农业化合物捕获在所述无核细胞的膜内，并且其中所述剂使所述农业化合物与所述无核细胞交联，从而提高所述无核细胞的稳定性。

66.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述剂增强所述农业化合物进入所述无核细胞的装载容量。

67.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述剂增强所述农业化合物进入所述无核细胞的装载容量，并且其中所述剂控制所述农业化合物从所述无核细胞的释放速率。

68.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞表现出所述至少一种非表达的农业化合物的控释速率。

69.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞表现出所述至少一种非表达的农业化合物的控释速率，并且其中所述至少一种非表达的农业化合物以稳定速率释放。

70.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞表现出所述至少一种非表达的农业化合物的初期突释。

71.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞表现出所述至少一种非表达的农业化合物的初期突释，所述突释包括释放所述至少一种非表达的农业化合物的至少约40％。

72.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞表现出所述至少一种非表达的农业化合物的控释速率，并且其中所述控释速率是每天少于40％、少于30％、少于20％、少于15％、少于10％或少于5％的所述至少一种非表达的农业化合物从所述无核细胞中释放。

73.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述控释速率是每天少于15％的所述非表达的农业化合物从所述无核细胞中释放。

74.如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述控释速率是每天少于10％的所述非表达的农业化合物从所述无核细胞中释放。

如前述条款中任一项所述的组合物，其中所述控释速率是每天约10％的所述非表达的农业化合物从所述无核细胞中释放。

通过引用并入

本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请均通过引用整体并入以用于所有目的。然而，对本文中引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请的提及不视为，也不应视为对它们在世界上任何国家构成有效的现有技术或形成一部分常识的承认或任何形式的暗示。

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序列表

<110> AgroSpheres公司(AgroSpheres, Inc.)

沙克尔•埃米尔•哈姆扎(Shakeel , Ameer Hamza)

佐摩罗迪•瑟菲(Zomorodi, Sepehr)

弗兰克•约瑟夫•托马斯(Frank, Joseph Thomas)

戴维斯•扎克里•乔治(Davis, Zachery George)

波特哈瑞•帕亚姆(Pourtaheri, Payam)

<120> 用于包封和可扩展递送农用化学品的组合物和方法

<130> AGRO-002/00WO 330377-2006

<150> US 62/570,368

<151> 2017-10-10

<150> US 62/491,608

<151> 2017-04-28

<160> 37

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

cgaagtaaca acaataatgc gtgccataga aattccttgt taaaaaggga 50

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 2

cctggcctta ctcaattagc tattaatcat cgccagcgcg cgatgatgtt 50

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 3

ttggctgtgt ttttcttccg cgagagaaag aaatcgagta atgccataac 50

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 4

agaaattcct tgttaaaaag ggatcaattt aacggttgaa cggtcaaagc 50

<210> 5

<211> 1773

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AIDA-1注释

<400> 5

atgaataagg cctacagtat catttggagc cactccagac aggcctggat tgtggcctca 60

gagttagcca gaggacatgg ttttgtcctt gcaaaaaata cactgctggt attggcggtt 120

gtttccacaa tcggaaatgc atttgcagtc gaccaccatc accatcacca tctggaagcg 180

ctgttccagg gtccgggtac ccagaaacag cgtaccgagc tcgaaaacct gtacttccag 240

ggtgaacaga aactgattag cgaagaagat ctgtctagag tgaataacaa tggaagcatt 300

gtcattaata acagcattat aaacgggaat attacgaatg atgctgactt aagttttggt 360

acagcaaagc tgctctctgc tacagtgaat ggtagtcttg ttaataacaa aaatatcatt 420

cttaatccta caaaagaaag tgcggccgct ataggtaata ctcttaccgt gtcaaattat 480

actgggacac cgggaagtgt tatttctctt ggtggtgtgc ttgaaggaga taattcactt 540

acggaccgtc tggtggtgaa aggtaatacc tctggtcaaa gtgacatcgt ttatgtcaat 600

gaagatggca gtggtggtca gacgagagat ggtattaata ttatttctgt agagggaaat 660

tctgatgcag aattctctct gaagaaccgc gtagttgccg gagcttatga ttacacactg 720

cagaaaggaa acgagagtgg gacagataat aagggatggt atttaaccag tcatcttccc 780

acatctgata cccggcaata cagaccggag aacggaagtt atgctaccaa tatggcactg 840

gctaactcac tgttcctcat ggatttgaat gagcgtaagc aattcagggc catgagtgat 900

aatacacagc ctgagtctgc atccgtgtgg atgaagatca ctggaggaat aagctctggt 960

aagctgaatg acgggcaaaa taaaacaaca accaatcagt ttatcaatca gctcgggggg 1020

gatatttata aattccatgc tgaacaactg ggtgatttta ccttagggat tatgggagga 1080

tacgcgaatg caaaaggtaa aacgataaat tacacgagca acaaagctgc cagaaacaca 1140

ctggatggtt attctgtcgg ggtatacggt acgtggtatc agaatgggga aaatgcaaca 1200

gggctctttg ctgaaacttg gatgcaatat aactggttta atgcatcagt gaaaggtgac 1260

ggactggaag aagaaaaata taatctgaat ggtttaaccg cttctgcagg tgggggatat 1320

aacctgaatg tgcacacatg gacatcacct gaaggaataa caggtgaatt ctggttacag 1380

cctcatttgc aggctgtctg gatgggggtt acaccggata cacatcagga ggataacgga 1440

acggtggtgc agggagcagg gaaaaataat attcagacaa aagcaggtat tcgtgcatcc 1500

tggaaggtga aaagcaccct ggataaggat accgggcgga ggttccgtcc gtatatagag 1560

gcaaactgga tccataacac tcatgaattt ggtgttaaaa tgagtgatga cagccagttg 1620

ttgtcaggta gccgaaatca gggagagata aagacaggta ttgaaggggt gattactcaa 1680

aacttgtcag tgaatggcgg agtcgcatat caggcaggag gtcacgggag caatgccatc 1740

tccggagcac tggggataaa atacagcttc tga 1773

<210> 6

<211> 3033

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Brk自主转运蛋白_注释

<400> 6

atgtatctgg atcgctttcg ccagtgcccg agcagcctgc agattccgcg cagcgcgtgg 60

cgcctgcatg cgctggcggc ggcgctggcg ctggcgggca tggcgcgcct ggcgccggcg 120

gcggcgcagg cgccgcagcc gccggtggcg ggcgcgccgc atgcgcagga tgcgggccag 180

gaaggcgaat ttgatcatcg cgataacacc ctgattgcgg tgtttgatga tggcgtgggc 240

attaacctgg atgatgatcc ggatgaactg ggcgaaaccg cgccgccgac cctgaaagat 300

attcatatta gcgtggaaca taaaaacccg atgagcaaac cggcgattgg cgtgcgcgtg 360

agcggcgcgg gccgcgcgct gaccctggcg ggcagcacca ttgatgcgac cgaaggcggc 420

attccggcgg tggtgcgccg cggcggcacc ctggaactgg atggcgtgac cgtggcgggc 480

ggcgaaggca tggaaccgat gaccgtgagc gatgcgggca gccgcctgag cgtgcgcggc 540

ggcgtgctgg gcggcgaagc gccgggcgtg ggcctggtgc gcgcggcgca gggcggccag 600

gcgagcatta ttgatgcgac cctgcagagc attctgggcc cggcgctgat tgcggatggc 660

ggcagcatta gcgtggcggg cggcagcatt gatatggata tgggcccggg ctttccgccg 720

ccgccgccgc cgctgccggg cgcgccgctg gcggcgcatc cgccgctgga tcgcgtggcg 780

gcggtgcatg cgggccagga tggcaaagtg accctgcgcg aagtggcgct gcgcgcgcat 840

ggcccgcagg cgaccggcgt gtatgcgtat atgccgggca gcgaaattac cctgcagggc 900

ggcaccgtga gcgtgcaggg cgatgatggc gcgggcgtgg tggcgggcgc gggcctgctg 960

gatgcgctgc cgccgggcgg caccgtgcgc ctggatggca ccaccgtgag caccgatggc 1020

gcgaacaccg atgcggtgct ggtgcgcggc gatgcggcgc gcgcggaagt ggtgaacacc 1080

gtgctgcgca ccgcgaaaag cctggcggcg ggcgtgagcg cgcagcatgg cggccgcgtg 1140

accctgcgcc agacccgcat tgaaaccgcg ggcgcgggcg cggaaggcat tagcgtgctg 1200

ggctttgaac cgcagagcgg cagcggcccg gcgagcgtgg atatgcaggg cggcagcatt 1260

accaccaccg gcaaccgcgc ggcgggcatt gcgctgaccc atggcagcgc gcgcctggaa 1320

ggcgtggcgg tgcgcgcgga aggcagcggc agcagcgcgg cgcagctggc gaacggcacc 1380

ctggtggtga gcgcgggcag cctggcgagc gcgcagagcg gcgcgattag cgtgaccgat 1440

accccgctga aactgatgcc gggcgcgctg gcgagcagca ccgtgagcgt gcgcctgacc 1500

gatggcgcga ccgcgcaggg cggcaacggc gtgtttctgc agcagcatag caccattccg 1560

gtggcggtgg cgctggaaag cggcgcgctg gcgcgcggcg atattgtggc ggatggcaac 1620

aaaccgctgg atgcgggcat tagcctgagc gtggcgagcg gcgcggcgtg gcatggcgcg 1680

acccaggtgc tgcagagcgc gaccctgggc aaaggcggca cctgggtggt gaacgcggat 1740

agccgcgtgc aggatatgag catgcgcggc ggccgcgtgg aatttcaggc gccggcgccg 1800

gaagcgagct ataaaaccct gaccctgcag accctggatg gcaacggcgt gtttgtgctg 1860

aacaccaacg tggcggcggg ccagaacgat cagctgcgcg tgaccggccg cgcggatggc 1920

cagcatcgcg tgctggtgcg caacgcgggc ggcgaagcgg atagccgcgg cgcgcgcctg 1980

ggcctggtgc atacccaggg ccagggcaac gcgacctttc gcctggcgaa cgtgggcaaa 2040

gcggtggatc tgggcacctg gcgctatagc ctggcggaag atccgaaaac ccatgtgtgg 2100

agcctgcagc gcgcgggcca ggcgctgagc ggcgcggcga acgcggcggt gaacgcggcg 2160

gatctgagca gcattgcgct ggcggaaagc aacgcgctgg ataaacgcct gggcgaactg 2220

cgcctgcgcg cggatgcggg cggcccgtgg gcgcgcacct ttagcgaacg ccagcagatt 2280

agcaaccgcc atgcgcgcgc gtatgatcag accgtgagcg gcctggaaat tggcctggat 2340

cgcggctgga gcgcgagcgg cggccgctgg tatgcgggcg gcctgctggg ctatacctat 2400

gcggatcgca cctatccggg cgatggcggc ggcaaagtga aaggcctgca tgtgggcggc 2460

tatgcggcgt atgtgggcga tggcggctat tatctggata ccgtgctgcg cctgggccgc 2520

tatgatcagc agtataacat tgcgggcacc gatggcggcc gcgtgaccgc ggattatcgc 2580

accagcggcg cggcgtggag cctggaaggc ggccgccgct ttgaactgcc gaacgattgg 2640

tttgcggaac cgcaggcgga agtgatgctg tggcgcacca gcggcaaacg ctatcgcgcg 2700

agcaacggcc tgcgcgtgaa agtggatgcg aacaccgcga ccctgggccg cctgggcctg 2760

cgctttggcc gccgcattgc gctggcgggc ggcaacattg tgcagccgta tgcgcgcctg 2820

ggctggaccc aggaatttaa aagcaccggc gatgtgcgca ccaacggcat tggccatgcg 2880

ggcgcgggcc gccatggccg cgtggaactg ggcgcgggcg tggatgcggc gctgggcaaa 2940

ggccataacc tgtatgcgag ctatgaatat gcggcgggcg atcgcattaa cattccgtgg 3000

agctttcatg cgggctatcg ctatagcttt tga 3033

<210> 7

<211> 2343

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Brk自主转运蛋白_CBM

<400> 7

atgtatctgg atcgctttcg ccagtgcccg agcagcctgc agattccgcg cagcgcgtgg 60

cgcctgcatg cgctggcggc ggcgctggcg ctggcgggca tggcgcgcct ggcgccggcg 120

gcggcgcagg cgccgcagcc gccggtggcg ggcgcgccgc atgcgcagga tgcgggccac 180

catcaccatc accatgttca gctggttgaa agcggtggtg cactggttca gcctggtggt 240

agcctgcgtc tgagctgtgc agcaagcggt tttccggtta atcgttatag catgcgttgg 300

tatcgtcagg caccgggtaa agaacgtgaa tgggttgcag gtatgagcag tgccggtgat 360

cgtagcagct acgaagatag cgttaaaggt cgttttacca tcagccgtga tgatgcacgt 420

aataccgttt atctgcaaat gaatagcctg aaaccggaag ataccgcagt gtattattgc 480

aacgttaacg tgggctttga atattggggt cagggcaccc aggttaccgt tagcagcaaa 540

ctcgagcggc cgcatcgtga cgcgtcgtct ggtcctgccg gctgccaagt cctttggggc 600

gtgaatcagt ggaacacagg tttcacggcg aatgttaccg tcaagaatac gtcctccgct 660

cctgttgacg gctggacctt gaccttcagt ttcccatcag gacaacaagt cactcaagcc 720

tggtcatcta ccgtgaccca gagtggatct gcggtcacag tacgtaacgc tccgtggaac 780

ggttcgattc ccgcgggcgg gactgctcag ttcgggttta acggaagcca cactggcact 840

aatgctgcac caactgcctt ctcacttaac ggcacgccgt gcaccgtagg cgaacagaaa 900

ctgattagcg aagaagatct ggaaaacctg tacttccagg gtgcgggcat tagcctgagc 960

gtggcgagcg gcgcggcgtg gcatggcgcg acccaggtgc tgcagagcgc gaccctgggc 1020

aaaggcggca cctgggtggt gaacgcggat agccgcgtgc aggatatgag catgcgcggc 1080

ggccgcgtgg aatttcaggc gccggcgccg gaagcgagct ataaaaccct gaccctgcag 1140

accctggatg gcaacggcgt gtttgtgctg aacaccaacg tggcggcggg ccagaacgat 1200

cagctgcgcg tgaccggccg cgcggatggc cagcatcgcg tgctggtgcg caacgcgggc 1260

ggcgaagcgg atagccgcgg cgcgcgcctg ggcctggtgc atacccaggg ccagggcaac 1320

gcgacctttc gcctggcgaa cgtgggcaaa gcggtggatc tgggcacctg gcgctatagc 1380

ctggcggaag atccgaaaac ccatgtgtgg agcctgcagc gcgcgggcca ggcgctgagc 1440

ggcgcggcga acgcggcggt gaacgcggcg gatctgagca gcattgcgct ggcggaaagc 1500

aacgcgctgg ataaacgcct gggcgaactg cgcctgcgcg cggatgcggg cggcccgtgg 1560

gcgcgcacct ttagcgaacg ccagcagatt agcaaccgcc atgcgcgcgc gtatgatcag 1620

accgtgagcg gcctggaaat tggcctggat cgcggctgga gcgcgagcgg cggccgctgg 1680

tatgcgggcg gcctgctggg ctatacctat gcggatcgca cctatccggg cgatggcggc 1740

ggcaaagtga aaggcctgca tgtgggcggc tatgcggcgt atgtgggcga tggcggctat 1800

tatctggata ccgtgctgcg cctgggccgc tatgatcagc agtataacat tgcgggcacc 1860

gatggcggcc gcgtgaccgc ggattatcgc accagcggcg cggcgtggag cctggaaggc 1920

ggccgccgct ttgaactgcc gaacgattgg tttgcggaac cgcaggcgga agtgatgctg 1980

tggcgcacca gcggcaaacg ctatcgcgcg agcaacggcc tgcgcgtgaa agtggatgcg 2040

aacaccgcga ccctgggccg cctgggcctg cgctttggcc gccgcattgc gctggcgggc 2100

ggcaacattg tgcagccgta tgcgcgcctg ggctggaccc aggaatttaa aagcaccggc 2160

gatgtgcgca ccaacggcat tggccatgcg ggcgcgggcc gccatggccg cgtggaactg 2220

ggcgcgggcg tggatgcggc gctgggcaaa ggccataacc tgtatgcgag ctatgaatat 2280

gcggcgggcg atcgcattaa cattccgtgg agctttcatg cgggctatcg ctatagcttt 2340

tga 2343

<210> 8

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CBM

<400> 8

gcgtcgtctg gtcctgccgg ctgccaagtc ctttggggcg tgaatcagtg gaacacaggt 60

ttcacggcga atgttaccgt caagaatacg tcctccgctc ctgttgacgg ctggaccttg 120

accttcagtt tcccatcagg acaacaagtc actcaagcct ggtcatctac cgtgacccag 180

agtggatctg cggtcacagt acgtaacgct ccgtggaacg gttcgattcc cgcgggcggg 240

actgctcagt tcgggtttaa cggaagccac actggcacta atgctgcacc aactgccttc 300

tcacttaacg gcacgccgtg caccgtaggc 330

<210> 9

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GFP-纳米抗体CBM

<400> 9

gttcagctgg ttgaaagcgg tggtgcactg gttcagcctg gtggtagcct gcgtctgagc 60

tgtgcagcaa gcggttttcc ggttaatcgt tatagcatgc gttggtatcg tcaggcaccg 120

ggtaaagaac gtgaatgggt tgcaggtatg agcagtgccg gtgatcgtag cagctacgaa 180

gatagcgtta aaggtcgttt taccatcagc cgtgatgatg cacgtaatac cgtttatctg 240

caaatgaata gcctgaaacc ggaagatacc gcagtgtatt attgcaacgt taacgtgggc 300

tttgaatatt ggggtcaggg cacccaggtt accgttagca gcaaactcga gcggccgcat 360

cgtgacgcgt cgtctggtcc tgccggctgc caagtccttt ggggcgtgaa tcagtggaac 420

acaggtttca cggcgaatgt taccgtcaag aatacgtcct ccgctcctgt tgacggctgg 480

accttgacct tcagtttccc atcaggacaa caagtcactc aagcctggtc atctaccgtg 540

acccagagtg gatctgcggt cacagtacgt aacgctccgt ggaacggttc gattcccgcg 600

ggcgggactg ctcagttcgg gtttaacgga agccacactg gcactaatgc tgcaccaact 660

gccttctcac ttaacggcac gccgtgcacc gtaggc 696

<210> 10

<211> 537

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> InaK

<400> 10

atggtcttag acaaggcgct agttctacgt acctgcgcta ataatatggc cgatcactgc 60

ggcttgattt ggcctgcctc agggaccgtc gagtcaaggt attggcaatc tacacgtcgt 120

cacgagaacg gactggtagg tcttctttgg ggagcaggaa cttctgcttt cttgtcagtc 180

catgcagacg cccgctggat cgtgtgcgaa gtggctgttg ccgatattat ctccctagag 240

gagcccggaa tggttaaatt tcctcgggcc gaagtggtgc atgtgggcga tcgaatcagc 300

gcttctcatt ttatttcggc gcggcaggca gatcccgcga gtacgagtac ttcaacgtcg 360

acaagtactc ttactcccat gcccacggca atccccaccc ctatgccagc ggtggcgtca 420

gtgacgttac cggtggctga gcaagcgcgg catgaggtgt ttgatgtagc tagtgtgagc 480

gccgcggctg ctcccgtgaa cactttacct gtcacgacac cccaaaacct ccagacg 537

<210> 11

<211> 1305

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> InaK-TEV-CBM-His-Myc-GFPNB

<400> 11

atggtcttag acaaggcgct agttctacgt acctgcgcta ataatatggc cgatcactgc 60

ggcttgattt ggcctgcctc agggaccgtc gagtcaaggt attggcaatc tacacgtcgt 120

cacgagaacg gactggtagg tcttctttgg ggagcaggaa cttctgcttt cttgtcagtc 180

catgcagacg cccgctggat cgtgtgcgaa gtggctgttg ccgatattat ctccctagag 240

gagcccggaa tggttaaatt tcctcgggcc gaagtggtgc atgtgggcga tcgaatcagc 300

gcttctcatt ttatttcggc gcggcaggca gatcccgcga gtacgagtac ttcaacgtcg 360

acaagtactc ttactcccat gcccacggca atccccaccc ctatgccagc ggtggcgtca 420

gtgacgttac cggtggctga gcaagcgcgg catgaggtgt ttgatgtagc tagtgtgagc 480

gccgcggctg ctcccgtgaa cactttacct gtcacgacac cccaaaacct ccagacggaa 540

aacctgtact tccagggtgc gtcgtctggt cctgccggct gccaagtcct ttggggcgtg 600

aatcagtgga acacaggttt cacggcgaat gttaccgtca agaatacgtc ctccgctcct 660

gttgacggct ggaccttgac cttcagtttc ccatcaggac aacaagtcac tcaagcctgg 720

tcatctaccg tgacccagag tggatctgcg gtcacagtac gtaacgctcc gtggaacggt 780

tcgattcccg cgggcgggac tgctcagttc gggtttaacg gaagccacac tggcactaat 840

gctgcaccaa ctgccttctc acttaacggc acgccgtgca ccgtaggcca ccatcaccat 900

caccatgttc agctggttga aagcggtggt gcactggttc agcctggtgg tagcctgcgt 960

ctgagctgtg cagcaagcgg ttttccggtt aatcgttata gcatgcgttg gtatcgtcag 1020

gcaccgggta aagaacgtga atgggttgca ggtatgagca gtgccggtga tcgtagcagc 1080

tacgaagata gcgttaaagg tcgttttacc atcagccgtg atgatgcacg taataccgtt 1140

tatctgcaaa tgaatagcct gaaaccggaa gataccgcag tgtattattg caacgttaac 1200

gtgggctttg aatattgggg tcagggcacc caggttaccg ttagcagcaa actcgagcgg 1260

ccgcatcgtg acgaacagaa actgattagc gaagaagatc tgtga 1305

<210> 12

<211> 5561

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pAIDA-1

<400> 12

tttacacttt atgcttccgg ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca 60

cacaggaaag cttcatatga ataaggccta cagtatcatt tggagccact ccagacaggc 120

ctggattgtg gcctcagagt tagccagagg acatggtttt gtccttgcaa aaaatacact 180

gctggtattg gcggttgttt ccacaatcgg aaatgcattt gcagtcgacc accatcacca 240

tcaccatctg gaagcgctgt tccagggtcc gggtacccag aaacagcgta ccgagctcga 300

aaacctgtac ttccagggtg aacagaaact gattagcgaa gaagatctgt ctagagtgaa 360

taacaatgga agcattgtca ttaataacag cattataaac gggaatatta cgaatgatgc 420

tgacttaagt tttggtacag caaagctgct ctctgctaca gtgaatggta gtcttgttaa 480

taacaaaaat atcattctta atcctacaaa agaaagtgcg gccgctatag gtaatactct 540

taccgtgtca aattatactg ggacaccggg aagtgttatt tctcttggtg gtgtgcttga 600

aggagataat tcacttacgg accgtctggt ggtgaaaggt aatacctctg gtcaaagtga 660

catcgtttat gtcaatgaag atggcagtgg tggtcagacg agagatggta ttaatattat 720

ttctgtagag ggaaattctg atgcagaatt ctctctgaag aaccgcgtag ttgccggagc 780

ttatgattac acactgcaga aaggaaacga gagtgggaca gataataagg gatggtattt 840

aaccagtcat cttcccacat ctgatacccg gcaatacaga ccggagaacg gaagttatgc 900

taccaatatg gcactggcta actcactgtt cctcatggat ttgaatgagc gtaagcaatt 960

cagggccatg agtgataata cacagcctga gtctgcatcc gtgtggatga agatcactgg 1020

aggaataagc tctggtaagc tgaatgacgg gcaaaataaa acaacaacca atcagtttat 1080

caatcagctc gggggggata tttataaatt ccatgctgaa caactgggtg attttacctt 1140

agggattatg ggaggatacg cgaatgcaaa aggtaaaacg ataaattaca cgagcaacaa 1200

agctgccaga aacacactgg atggttattc tgtcggggta tacggtacgt ggtatcagaa 1260

tggggaaaat gcaacagggc tctttgctga aacttggatg caatataact ggtttaatgc 1320

atcagtgaaa ggtgacggac tggaagaaga aaaatataat ctgaatggtt taaccgcttc 1380

tgcaggtggg ggatataacc tgaatgtgca cacatggaca tcacctgaag gaataacagg 1440

tgaattctgg ttacagcctc atttgcaggc tgtctggatg ggggttacac cggatacaca 1500

tcaggaggat aacggaacgg tggtgcaggg agcagggaaa aataatattc agacaaaagc 1560

aggtattcgt gcatcctgga aggtgaaaag caccctggat aaggataccg ggcggaggtt 1620

ccgtccgtat atagaggcaa actggatcca taacactcat gaatttggtg ttaaaatgag 1680

tgatgacagc cagttgttgt caggtagccg aaatcaggga gagataaaga caggtattga 1740

aggggtgatt actcaaaact tgtcagtgaa tggcggagtc gcatatcagg caggaggtca 1800

cgggagcaat gccatctccg gagcactggg gataaaatac agcttctgat aatgatcctg 1860

gcacgcggcg cgccccttgg tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1920

ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1980

ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 2040

cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 2100

gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 2160

actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 2220

aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 2280

caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccttaa taagatgatc 2340

ttcttgagat cgttttggtc tgcgcgtaat ctcttgctct gaaaacgaaa aaaccgcctt 2400

gcagggcggt ttttcgaagg ttctctgagc taccaactct ttgaaccgag gtaactggct 2460

tggaggagcg cagtcaccaa aacttgtcct ttcagtttag ccttaaccgg cgcatgactt 2520

caagactaac tcctctaaat caattaccag tggctgctgc cagtggtgct tttgcatgtc 2580

tttccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg gactgaacgg 2640

ggggttcgtg catacagtcc agcttggagc gaactgccta cccggaactg agtgtcaggc 2700

gtggaatgag acaaacgcgg ccataacagc ggaatgacac cggtaaaccg aaaggcagga 2760

acaggagagc gcacgaggga gccgccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 2820

gggtttcgcc accactgatt tgagcgtcag atttcgtgat gcttgtcagg ggggcggagc 2880

ctatggaaaa acggctttgc cgcggccctc tcacttccct gttaagtatc ttcctggcat 2940

cttccaggaa atctccgccc cgttcgtaag ccatttccgc tcgccgcagt cgaacgaccg 3000

agcgtagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aatatatcct gtatcacata ttctgctgac 3060

gcaccggtgc agcctttttt ctcctgccac atgaagcact tcactgacac cctcatcagt 3120

gccaacatag taagccagta tacactccgc tagcgctgag gtctgcctcg tgaagaaggt 3180

gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca 3240

cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc 3300

acggaacggt ctgcgttgtc gggaagatgc gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt 3360

cgatttattc aacaaagcca cgttgtgtct caaaatctct gatgttacat tgcacaagat 3420

aaaaatatat catcatgaac aataaaactg tctgcttaca taaacagtaa tacaaggggt 3480

gttatgagcc atattcaacg ggaaacgtct tgctcgagta tccgctcatg agattatcaa 3540

aaaggatctt cacctagatc cttttgtaag aggttccaac tttcaccata atgaaataag 3600

atcactaccg ggcgtatttt ttgagttatc gagattttca ggagctaagg aagctaaaat 3660

ggagaaaaaa atcactggat ataccaccgt tgatatatcc caatggcatc gtaaagaaca 3720

ttttgaggca tttcagtcag ttgctcaatg tacctataac cagaccgttc agctggatat 3780

tacggccttt ttaaagaccg taaagaaaaa taagcacaag ttttatccgg cctttattca 3840

cattcttgcc cgcctgatga atgctcatcc ggagtttcgt atggcaatga aagacggtga 3900

gctggtgata tgggatagtg ttcacccttg ttacaccgtt ttccatgagc aaactgaaac 3960

gttttcatcg ctctggagtg aataccacga cgatttccgg cagtttctac acatatattc 4020

gcaagatgtg gcgtgttacg gtgaaaacct ggcctatttc cctaaagggt ttattgagaa 4080

tatgtttttc gtctcagcca atccctgggt gagtttcacc agttttgatt taaacgtggc 4140

caatatggac aacttcttcg cccccgtttt caccatgggc aaatattata cgcaaggcga 4200

caaggtgctg atgccgctgg cgattcaggt tcatcatgcc gtttgtgatg gcttccatgt 4260

cggcagaatg cttaatgaat tacaacagta ctgcgatgag tggcagggcg gggcgtaatt 4320

tttttaaggc gacaccatcg aatggcgcaa aacctttcgc ggtatggcat gatagcgccc 4380

ggaagagagt caattcaggg tggtgaatgt gaaaccagta acgttatacg atgtcgcaga 4440

gtatgccggt gtctcttatc agaccgtttc ccgcgtggtg aaccaggcca gccacgtttc 4500

tgcgaaaacg cgggaaaaag tggaagcggc gatggcggag ctgaattaca ttcccaaccg 4560

cgtggcacaa caactggcgg gcaaacagtc gttgctgatt ggcgttgcca cctccagtct 4620

ggccctgcac gcgccgtcgc aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg atcaactggg 4680

tgccagcgtg gtggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta aagcggcggt 4740

gcacaatctt ctcgcgcaac gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc tggatgacca 4800

ggatgccatt gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc ttgatgtctc 4860

tgaccagaca cccatcaaca gtattatttt ctcccatgaa gacggtacgc gactgggcgt 4920

ggagcatctg gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc cattaagttc 4980

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<220>

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<223> pET-9a

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aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca ggtgcgacaa tctatcgatt gtatgggaag 3660

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tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 1560

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cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 3840

tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 3900

tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 3960

ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 4020

aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 4080

cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 4140

ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 4200

agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 4260

ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 4320

acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg 4380

cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc 4440

gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcctga 4500

tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcataaat tccgacacca 4560

tcgaatggtg caaaaccttt cgcggtatgg catgatagcg cccggaagag agtcaattca 4620

gggtggtgaa tgtgaaacca gtaacgttat acgatgtcgc agagtatgcc ggtgtctctt 4680

atcagaccgt ttcccgcgtg gtgaaccagg ccagccacgt ttctgcgaaa acgcgggaaa 4740

aagtggaagc ggcgatggcg gagctgaatt acattcccaa ccgcgtggca caacaactgg 4800

cgggcaaaca gtcgttgctg attggcgttg ccacctccag tctggccctg cacgcgccgt 4860

cgcaaattgt cgcggcgatt aaatctcgcg ccgatcaact gggtgccagc gtggtggtgt 4920

cgatggtaga acgaagcggc gtcgaagcct gtaaagcggc ggtgcacaat cttctcgcgc 4980

aacgcgtcag tgggctgatc attaactatc cgctggatga ccaggatgcc attgctgtgg 5040

aagctgcctg cactaatgtt ccggcgttat ttcttgatgt ctctgaccag acacccatca 5100

acagtattat tttctcccat gaagacggta cgcgactggg cgtggagcat ctggtcgcat 5160

tgggtcacca gcaaatcgcg ctgttagcgg gcccattaag ttctgtctcg gcgcgtctgc 5220

gtctggctgg ctggcataaa tatctcactc gcaatcaaat tcagccgata gcggaacggg 5280

aaggcgactg gagtgccatg tccggttttc aacaaaccat gcaaatgctg aatgagggca 5340

tcgttcccac tgcgatgctg gttgccaacg atcagatggc gctgggcgca atgcgcgcca 5400

ttaccgagtc cgggctgcgc gttggtgcgg atatctcggt agtgggatac gacgataccg 5460

aagacagctc atgttatatc ccgccgtcaa ccaccatcaa acaggatttt cgcctgctgg 5520

ggcaaaccag cgtggaccgc ttgctgcaac tctctcaggg ccaggcggtg aagggcaatc 5580

agctgttgcc cgtctcactg gtgaaaagaa aaaccaccct ggcgcccaat acgcaaaccg 5640

cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg 5700

aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag 5760

gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 5820

cacacaggaa acagctatga ccatgattac ggattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg 5880

tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc 5940

cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct 6000

gaatggcgaa tggcgctttg cctggtttcc ggcaccagaa gcggtgccgg aaagctggct 6060

ggagtgcgat cttcctgagg ccgatactgt cgtcgtcccc tcaaactggc agatgcacgg 6120

ttacgatgcg cccatctaca ccaacgtaac ctatcccatt acggtcaatc cgccgtttgt 6180

tcccacggag aatccgacgg gttgttactc gctcacattt aatgttgatg aaagctggct 6240

acaggaaggc cagacgcgaa ttatttttga tggcgttgga att 6283

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物F2 minCKO

<400> 18

aacaacaata atgcgtgcca t 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物R2 minCKO

<400> 19

gcgctggcga tgattaatag 20

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物F9 minCKO

<400> 20

agtaacaaca ataatgcgtg cc 22

<210> 21

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物R9 minCKO

<400> 21

cgcgctggcg atgatt 16

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物F7 minDKO

<400> 22

ttccgcgaga gaaagaaatc g 21

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物R7 minDKO

<400> 23

gaccgttcaa ccgttaaatt gat 23

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物F10 minDKO

<400> 24

ctgtgttttt cttccgcgag 20

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物R10 minDKO

<400> 25

tcaaccgtta aattgatccc ttttt 25

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物F6 minCDKO

<400> 26

tccgcgagag aaagaaatcg 20

<210> 27

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物R6 minCDKO

<400> 27

cgcgctggcg atgatta 17

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物F9 minCDKO

<400> 28

ctgtgttttt cttccgcgag 20

<210> 29

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物R9 minCDKO

<400> 29

cgcgctggcg atgatt 16

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物3'minCKO_1

<400> 30

ggccggataa aacttgtgct 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物3'minCKO_2

<400> 31

agtcttcgga acatcatcgc 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 32

ccctttgccc gaagtaacaa 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物5'minCKO_2

<400> 33

acggtgaaaa cctggcctat 20

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物minC_check_4_1

<400> 34

tcaatttaac ggttgaacgg tca 23

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物minC_检查_4_2

<400> 35

atgtcaaaca cgccaatcga 20

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物minD_检查_2_1

<400> 36

ttatcctccg aacaagcgtt tga 23

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物minD_检查_2_2

<400> 37

atggcacgca ttattgttgt tac 23