一种3d打印多层微流控芯片及其高通量制备脂质体的方法
阅读说明：本技术 一种3d打印多层微流控芯片及其高通量制备脂质体的方法 (3D printing multilayer microfluidic chip and high-throughput liposome preparation method thereof ) 是由 陈翔 陈泽宇 单晗 林旗波 王丹凤 孙鑫 全彪 肖嘉莹 于 2021-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种3D打印多层微流控芯片及其高通量制备脂质体的方法。采用3D打印制作的多层微流控芯片是多层微通道、入口、出口、接头集成一体化的芯片,多层微通道堆叠分布在芯片内部的不同高度位置,微通道由有机溶液通道、水溶液通道、聚焦区域、混合通道组成。将脂质、胆固醇按照一定的摩尔浓度比溶解在有机溶剂中,然后将脂质的有机溶液注入到芯片的有机通道中,同时也将水溶液注入到水溶液通道中,随着有机溶液与水溶液在聚焦区域交汇,有机溶剂的浓度急剧减小,脂质分子在水中自发形成脂质体。该微流控芯片一方面避免了复杂的微纳加工工艺,具有成本低廉、可批量化制作等优点。另一方面,其集成的多层微通道实现了高通量的脂质体制备。(The invention provides a 3D printing multilayer microfluidic chip and a high-throughput liposome preparation method thereof. The multilayer micro-fluidic chip manufactured by 3D printing is a chip integrating a multilayer micro-channel, an inlet, an outlet and a connector, the multilayer micro-channel is stacked and distributed at different height positions in the chip, and the micro-channel consists of an organic solution channel, an aqueous solution channel, a focusing area and a mixing channel. Dissolving lipid and cholesterol in an organic solvent according to a certain molar concentration ratio, then injecting an organic solution of the lipid into an organic channel of the chip, and simultaneously injecting an aqueous solution into an aqueous solution channel, wherein the concentration of the organic solvent is sharply reduced along with the intersection of the organic solution and the aqueous solution in a focusing region, and lipid molecules spontaneously form liposomes in water. On one hand, the micro-fluidic chip avoids a complex micro-nano processing technology, and has the advantages of low cost, batch manufacturing and the like. On the other hand, the integrated multi-layer micro-channel realizes high-flux liposome preparation.)
技术领域
本发明属于微流控及脂质体制备技术领域，涉及一种基于3D打印技术的多层微流控芯片以及利用微流体聚焦高通量制备脂质体的方法。
背景技术
脂质体是一种由脂质双分子层组成的球形囊泡结构。作为一种优良的药物载体，脂质体具有高度的生物相容性和生物可降解性，能够增加药物在体内的浓度以及保护药物不被降解，在靶向药物递送、分子影像等领域具有广阔的应用前景。目前，制备脂质体常用的方法包括薄膜水化法、逆向蒸发法和乙醇/乙醚注入法等。
2004年，Jahn等人提出了利用微流控芯片制备脂质体的微流体聚焦法。由于微流控芯片具有亚毫米尺度的微通道，含有脂质分子的有机溶液和水溶液在微通道内流动时会具有较低的雷诺数，从而在层流状态下实现理想的扩散混合效果。与常规的脂质体合成方法相比，微流体聚焦法能够直接产生较小粒径的脂质体(50-150nm),并且能够精确地控制脂质体的粒径分布，从而保证了脂质体在不同制备批次间的一致性。虽然微流控技术能够方便地合成微米/纳米颗粒，但微流控芯片的制作大多是昂贵且费时的。微流控芯片的主要结构包括微通道层和基底两部分。用于制作微流控芯片的材料主要包括聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、硅和玻璃等。微流控芯片的加工过程往往涉及光刻、反应离子刻蚀、热压、键合等步骤，不仅要求专业的设备，还需要特殊的洁净室环境，而且也是由多个部件键合而成。
3D打印技术因其具有快速原型制作、灵活设计、成本低等优点，在微流控芯片加工领域受到了极大的关注。目前，常见的用于脂质体合成的微流控芯片很难实现高通量的脂质体制备。这是因为，随着体积通量的提高，微通道内会产生较大的注射压力，容易导致微流控芯片发生分离和样品泄露。高分辨率的3D打印技术能够打印出集成一体化的微流控芯片，从而在单个器件上实现更高的体积通量，并且能够承受更高的注射压力。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种3D打印多层微流控芯片及其高通量制备脂质体的方法。该3D打印多层微流控芯片一方面避免了复杂的微纳加工工艺，具有成本低廉、可批量化制作等优点。另一方面，其集成的多层微通道能够在单个器件上承受更高的体积通量和注射压力，实现高通量的脂质体制备。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种3D打印多层微流控芯片，所述多层微流控芯片包括主体、多层微通道、入口、出口、接头；所述入口和出口均与每一层的微通道相通；所述多层微通道堆叠分布在芯片主体内部的不同高度位置；所述微通道由有机溶液通道、水溶液通道、聚焦区域、混合通道组成；所述接头设置在芯片主体上方，为两个高度不同的同心圆管；所述的接头个数为入口与出口个数之和；所述同心圆管包括外部圆管和内部圆管。
优选的，所述的微通道层数为2～10层。
优选的，所述的微通道宽度范围为10～1000μm，深度范围为10～1000μm。
优选的，所述的入口和出口的内径范围为10～1500μm。
优选的，所述内部圆管的内径范围为0.4～2.0mm，高度范围为1～3mm；所述同心圆管的外部圆管的内径范围为1～5mm，高度范围为2～5mm。
优选的，所述的接头通过胶粘密封的方式与外部导管连接。
优选的，所述的微通道聚焦区域为有机溶液通道与水溶液通道交汇区域。
优选的，所述的有机溶液通道与水溶液通道的夹角范围为20～90°。
优选的，所述的混合通道的俯视图形状包括直线形和蛇形。
优选的，所述的微流控芯片由面投影微立体光刻3D打印技术制作，成形精度高。
本发明还公开了一种所述的微流控芯片的高通量制备脂质体的方法，如下：
(1)将脂质、胆固醇按照一定的摩尔浓度比溶解在有机溶剂中，并通过涡旋或超声振荡等方式使其分散均匀；
(2)将脂质的有机溶液注入到微流控芯片的有机通道中，同时也将水溶液注入到水溶液通道中；
(3)随着有机溶液与水溶液在聚焦区域交汇，有机溶剂迅速溶解在水中，使得有机溶剂的浓度急剧减小，由于脂质分子具有亲水性的头部和疏水性的尾部，随着有机溶剂浓度的不断减小，脂质分子会在水中自发形成脂质双分子层结构，最终形成脂质体，即为微流体聚焦法产生脂质体的过程。
(4)微流控芯片总流率的改变可通过调整注射器推进速度以及注入的水溶液和有机溶液的流率比来实现，所述的注射器推进速度的范围为0.05～20mm/s。
(5)脂质体的粒径分布范围可通过改变水溶液与有机溶液的流率比、微流控芯片的通道尺寸以及总流率来调整。
(6)合成脂质体的浓度可通过改变脂质的有机溶液的浓度、注入的水溶液和有机溶液的流率比来实现。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明提供一种基于3D打印技术制作的多层微流控芯片，芯片包括多层微通道，并且所述微通道由有机溶液通道、水溶液通道、聚焦区域、混合通道组成，使得可以利用微流体聚焦法实现脂质体的高通量制备。与其他微流控芯片的加工方法相比，本方案的3D打印的多层微流控芯片避免了复杂的微纳加工工艺，具有成本低廉、可批量化制作等优点。
(2)本发明克服了微流控芯片体积通量小的不足，本发明通过在单个器件上集成多层微通道，使芯片能够承受更高的体积通量和注射压力。
(3)现有的微流控脂质体制备方法，微通道中的液体属于层流状态，且体积通量较低，不适用于脂质体的高通量、大批量生产。随着体积通量的提高，会产生较大的注射压力，本发明通过胶粘密封的方式连接外部导管，保证了溶液在极大的注射压力下也不会发生泄漏，从而实现了脂质体的高通量制备。所公布的高通量脂质体制备方法能够通过调节流率比来控制脂质体的粒径大小，并实现了474mL/min的最高体积通量，这是目前微流控脂质体制备方法中报道的最高体积通量。另外，在高体积通量的条件下，微通道中的液体是湍流状态，脂质体是在湍流条件下合成的。
附图说明
图1是三层微流控芯片整体视图；
图2是微通道不同区域的示意图；
图3是使用微流控芯片进行高通量脂质体合成的系统示意图；
图4是合成脂质体的粒径分布图；
图5是合成脂质体的透射电子显微镜图；
图6是流率比与脂质体平均粒径关系的拟合曲线图；其中：1入口，2微通道，3出口，4主体，5接头，6导管，7水溶液注射器，8有机溶液注射器，9支架，10线性位移平台，201水溶液通道、202有机溶液通道，203聚焦区域，204混合通道。
具体实施方式
以下结合技术方案和附图详细说明本发明的实施方式。
该实施例提供的一种3D打印多层微流控芯片及其高通量制备脂质体的方法如下：
一种3D打印多层微流控芯片，所述多层微流控芯片是主体4、多层微通道2、入口1、出口3、接头5集成一体化的芯片；所述的多层微通道堆叠分布在芯片内部的不同高度位置；所述的微通道层数为2～10；所述的微通道2由有机溶液通道201、有机水溶液通道202、聚焦区域203、混合通道204组成；所述的微通道宽度范围为10～1000μm，深度范围为10～1000μm；所述的入口和出口的内径范围为10～1500μm；所述的接头5为两个高度不同的同心圆管；所述的接头5个数为入口1与出口3个数之和；所述的同心圆管的内部圆管的内径范围为0.4～2.0mm,高度范围为1～3mm；所述的同心圆管的外部圆管的内径范围为1～5mm，高度范围为2～5mm。
优选的，所述的入口和出口均与每一层的微通道相通。
优选的，所述的接头通过胶粘密封的方式与外部导管连接。
优选的，所述的微通道聚焦区域为有机溶液通道与水溶液通道交汇区域。
优选的，所述的有机溶液通道与水溶液通道的夹角范围为20～90°。
优选的，所述的混合通道的俯视图形状包括直线形和蛇形。
优选的，所述的微流控芯片由面投影微立体光刻3D打印技术制作，成形精度高。
一种所述的微流控芯片的高通量制备脂质体的方法，包括以下步骤：
步骤(1)将脂质、胆固醇按照一定的摩尔浓度比溶解在有机溶剂中，并通过涡旋或超声振荡等方式使其分散均匀；
步骤(2)将脂质的有机溶液注入到微流控芯片的有机通道中，同时也将水溶液注入到水溶液通道中；
步骤(3)随着有机溶液与水溶液在聚焦区域交汇，有机溶剂迅速溶解在水中，使得有机溶剂的浓度急剧减小，由于脂质分子具有亲水性的头部和疏水性的尾部，随着有机溶剂浓度的不断减小，脂质分子会在水中自发形成脂质双分子层结构，最终形成脂质体。
进一步地，步骤(2)中微流控芯片总流率的改变可通过调整注射器推进速度以及注入的水溶液和有机溶液的流率比来实现，所述的注射器推进速度的范围为0.05～20mm/s。
进一步地，脂质体的粒径分布范围可通过改变水溶液与有机溶液的流率比、微流控芯片的通道尺寸以及总流率来调整。
进一步地，合成脂质体的浓度可通过改变脂质的有机溶液的浓度、注入的水溶液和有机溶液的流率比来实现。
具体操作过程如下：使用重庆摩方精密科技有限公司生产的microArchTMS140 3D打印机制作微流控芯片，打印所使用的树脂是重庆摩方精密科技有限公司生产的GR型号树脂。微流控芯片整体视图如图1所示，微流控芯片的主体4的长×宽×高为18×15×5mm。微流控芯片内部集成了三层微通道2，微通道2的深度和宽度均为400μm。如图2所示，每层微通道2均由两条水溶液通道201、一条有机溶液通道202、一个聚焦区域203和一条混合通道204组成。微流控芯片包含三个入口1和一个出口3，入口1和出口3的内径均为1mm，深度为3.5mm。微流控芯片集成四个接头5，接头5内部圆管的内径、外径和高度分别为1.8mm、2.8mm和3mm，外部圆管的内径、外径和高度分别为4mm、5mm和5mm。使用微流控芯片进行高通量脂质体合成的系统示意图如图3所示，接头5和导管6之间通过AB胶密封连接，导管6采用内径为1.2mm、外径为1.6mm的PEEK毛细管。将三个入口3分别使用三根导管6连接到两支水溶液注射器7和一支有机溶液注射器8上。注射器7的规格是30mL，注射器8的规格是1mL。其中，使用注射器7抽取浓度为0.1M、pH为7.4的PBS缓冲液，使用注射器8抽取二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)与胆固醇的摩尔比为7：3的异丙醇溶液，DPPC在异丙醇中的浓度为10mM。注射器7和注射器8使用支架9进行固定，支架9通过3D打印制作，材质为ABS树脂材料。使用北京卓立汉光仪器有限公司生产的高精度线性位移平台10推动注射器。高精度线性位移平台10的推进速度为10mm/s，得到的微流控芯片的总流率为474mL/min。对合成的脂质体利用动态光散射技术(DLS)测试粒径分布，得到的脂质体的粒径分布如图4所示。然后，使用透射电子显微镜(TEM)观察脂质体的形貌，得到的脂质体的TEM照片如图5所示。通过调整注射器7和注射器8的规格，能够得到不同的流率比，并进一步得到不同粒径大小的脂质体，如图6所示，该微流控芯片实现了脂质体的粒径可控的高通量合成。
以上所述实施例仅表达本发明的实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利的范围的限制，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。
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