一种酶法选择性催化制备结构化脂质的方法
阅读说明：本技术 一种酶法选择性催化制备结构化脂质的方法 (Method for preparing structured lipid by enzymatic method selective catalysis ) 是由 邓利 刘佳豪 刘昌升 陈安南 聂开立 王芳 于 2021-07-08 设计创作，主要内容包括：一种酶法选择性催化制备结构化脂质的方法,属于生物化工和酶催化领域,具体涉及一种以橡胶籽油为基础通过酶法选择性催化制备具有合适n-3PUFA/n-6PUFA比的结构化脂质的方法。该方法包括如下步骤：将橡胶籽油与中链甘油三脂定量混合,加入脂肪酶,在无溶剂体系下,进行酰基交换反应,反应结束后,经过布氏漏斗过滤除去脂肪酶,得到MLCT结构化脂质,该脂质具有MLM、LML、MML、LLM等四种结构,具有合适的n-3PUFA/n-6PUFA比例,能够更好的满足人类营养要求。开发应用于食用油脂,具有平稳供能,减少机体脂肪堆积等优点。反应周期短,反应条件温和,分离工艺简单,绿色经济。(A method for preparing structured lipid by enzyme-method selective catalysis belongs to the fields of biochemical engineering and enzyme catalysis, and particularly relates to a method for preparing structured lipid with proper n-3PUFA/n-6PUFA ratio by enzyme-method selective catalysis based on rubber seed oil. The method comprises the following steps: quantitatively mixing the rubber seed oil and the medium-chain triglyceride, adding lipase, carrying out acyl exchange reaction in a solvent-free system, and filtering and removing the lipase through a Buchner funnel after the reaction is finished to obtain the MLCT structured lipid which has four structures of MLM, LML, MML, LLM and the like, has proper n-3PUFA/n-6PUFA ratio and can better meet the nutritional requirements of human beings. The energy-saving oil-water separator is developed and applied to edible oil and fat, and has the advantages of stable energy supply, reduction of fat accumulation of organisms and the like. Short reaction period, mild reaction conditions, simple separation process, greenness and economy.)
技术领域
本发明属于生物化工和酶催化领域，具体涉及一种酶法选择性催化制备结构化脂质的方法。
技术背景
人类膳食营养中，主要以富含n-6多不饱和脂肪酸(n-6polyunsaturated fattyacid，n-6PUFA)的植物油为主，对于富含n-3多不饱和脂肪酸(n-3polyunsaturated fattyacid，n-3PUFA)的鱼油摄入较少，导致n-3PUFA/n-6PUFA比例严重失调(约为1:20～25)，而该比例的失调容易引起人体炎性反应。
橡胶籽油作为从橡胶籽中提取出的天然优质油料，富含不饱和脂肪酸，n-3PUFA/n-6PUFA比例约为1:2，更加符合中国营养学会对n-3PUFA/n-6PUFA建议摄入比(1:4～6)；同时在精炼加工后可作为食用油，在预防动脉硬化以及心血管疾病等方面具有良好的疗效(何美莹,李国华,李海泉.关于云南橡胶种子油食用开发现状与思考[J].热带农业科技,2010(04):36-43.)与常见食用油相似，橡胶籽油由长链脂肪酸甘油三酯组成，而长链脂肪酸(LCT)在人体内代谢与转运比较复杂，容易以脂肪的形式堆积在体内，若机体摄入过多，容易导致脂肪堆积以及心血管疾病。(Korma S A,Zou X,Ali A H,et al.Preparation ofstructured lipids enriched with medium-and long-chain triacylglycerols byenzymatic interesterification for infant formula[J].Food&BioproductsProcessing,2018,107:121-130.)
结构化脂质是一类将天然油脂结构进行修饰而形成的的新型脂类。利用化学催化剂或生物酶对其脂肪酸组成、脂肪酸在甘油三酯分子中的位置、物理化学性质等修饰改造，从而获得具有特定营养价值的脂质。(Lee Y Y,Tang T K,Lai O M.Health Benefits,Enzymatic Production,and Application of Medium-and Long-Chain Triacylglycerol(MLCT)in Food Industries:A Review[J].Journal of Food Science,2012,77(7-8-9):R137-R144)
为了克服LCT的不良副作用，研究人员开发了MLCT结构化脂质，即将长链脂肪酸和中链脂肪酸(MCT)随机结合在同一甘油骨架上，形成具有MLM、LML、MML、LLM等类型的结构脂，结构化的MLCT能够可控的释放MCFA，能够有效减少脂肪堆积，降低疾病的发生。Matsuo等人开发了MLCT结构化脂质将之应用于食用油，如家庭食用油、沙拉酱、植物油酱、膳食补充剂和冷冻晚餐，来降低体内胆固醇。(Matsuo T,Matsuo M,Taguchi N,et al.Thethermic effect is greater for structured medium-and long-chaintriacylglycerols versus long-chain triacylglycerols in healthy young women[J].Metabolism-clinical&Experimental,2001,50(1):125-130.)Matsuo等人对比了摄入以大豆油，菜籽油为基础制备的LCT与MLCT的正常受试者，发现在给予相同能量的前提下，长期服用MLCT可以显著减少体脂。(Matsuo T,Matsuo M,Taguchi N,et al，2002)Korma等人利用单细胞油与MCT合成MLCT用于婴幼儿奶粉配方工艺中，在提高婴儿生长发育的同时，减少婴儿体内脂肪的堆积。(Korma S A,Zou X,Ali A H,et al.2018,107:121-130.与此同时，MLCT结构脂在医疗方面也有很大的应用，在全肠外营养治疗研究中，使用同时含有MCFA和LCFA的MLM结构脂肪乳剂能够向病人提供更好的营养支持，供能更加平稳，促进正氮平衡，有利于术后患者的恢复。(Wu,G.H.,Zaniolo,O.,Schuster,H.,Schlotzer,E.,&Pradelli,L.36:150–161.)
MLCT油脂的合成方法主要包括化学法和酶法。但化学法存在耗能高，产物难以分离等缺点。(寿佳菲.中长链脂肪酸甘油三酯的酶法制备与分离纯化研究[D].合肥工业大学,2012)而酶法是以脂肪酶为催化剂，通过直接酯交换来实现脂肪酸在甘油骨架上位置的重排，与化学法相比，该方法副产物少，工艺简单，生产质量高，更加绿色经济。
综上所述，目前多数研究侧重于以普通食用油，鱼油、藻油等获得单甘脂结构，再通过化学法将该单甘脂结构与中链脂肪酸混合制备MLM结构脂。而通过以橡胶籽油为基础通过酶法合成更加符合人体n-3PUFA/n-6PUFA摄入比例的MLCT结构脂技术尚未开发，该结构脂具有MLM、LML、MML、LLM等四种结构，能够被进一步开发应用于食用油，不仅可以预防机体动脉硬化以及心血管疾病，还可以减少体内炎症反应的发生。
发明内容
本发明提出了一种基于橡胶籽油甘油三酯和中链脂肪酸甘油三酯，采用生物催化工艺制备更加符合人体n-3PUFA/n-6PUFA摄入比MLCT结构化脂质的方法。该结构脂质具有MLM、LML、MML、LLM等四种结构，通过酶催化工艺制备合成，具有反应条件温和，分离纯化简单，反应周期较短等优点，加工后用于食用油，供能平稳，可以有效减少体内炎性发应。
本发明提出一种生物酶法制备结构脂质的方法，包括如下步骤：
将待处理的橡胶籽油和中链甘油三酯充分混合，加入一定质量的脂肪酶，在无溶剂体系下，进行反应，待反应结束后，经过布氏漏斗过滤除酶。
进一步地，所述待处理中链甘油三酯与橡胶籽油的比例为(0.1-1):1。
优选的，所述中链甘油三酯与橡胶籽油的比例为(0.6-1):1.
进一步地，所述脂肪酶来源于动物、植物或微生物中的一种；
优选的，脂肪酶包括诺维信435脂肪酶，诺维信TL IM脂肪酶，诺维信40086脂肪酶；
更优选的，所述脂肪酶为诺维信40086脂肪酶。
进一步地，所述脂肪酶的质量为橡胶籽油和中链甘油三酯总质量的1％-10％；
优选的，脂肪酶的质量为橡胶籽油和中链甘油三酯总质量的1％-5％；
更优选的，脂肪酶的质量为橡胶籽油和中链甘油三酯总质量的3％。
进一步地，反应温度为10-80℃，反应的时间为2-80小时；
优选的，反应温度为10-60℃，反应时间为4-48小时；
更优选的，反应温度为30-50℃，反应时间为4-24h小时。
进一步地，所述反应在常压条件下进行；反应在金属浴、搅拌、填充床、摇床条件下进行，转速为100rpm-2000rpm。
优选的，反应时采用恒温金属浴，转速为1000rpm。
本发明还提出上述任一结构化脂质在食品、保健品、药品领域的应用。
本发明具有以下优势：
本发明提出的生物酶法制备结构脂质的方法，使用橡胶籽油和中链甘油三脂发生酯交换反应，优化反应中原料配比以及反应条件，制备结构脂质。同时，经过酯交换，橡胶籽油上的部分长链脂肪酸与中链脂肪酸交换，形成的结构脂更容易被机体吸收与代谢，更加符合人体n-3PUFA/n-6PUFA(本发明为2.3-2.4)摄入比例，开发制得的食用油更加符合人类营养需求。反应周期短，条件温和，分离纯化简单，绿色经济。
附图说明
：如图1所示，是橡胶籽油和中链甘油三酯的反应式。
如图2所示，为反应物与产物对比气相峰图。
具体实施方式
：
本发明一实施例提出一种生物酶法制备结构脂质的方法，包括如下步骤：
将待处理橡胶籽油与中链甘油三脂充分混合，加入脂肪酶，进行酯交换反应，制备结构脂质。所述中链甘油三酯与橡胶籽油质量比为(0.1-1)：1；待酯化反应结束后，经过布氏漏斗过滤除酶，得到结构脂质。
所述酯化反应在10℃-80℃条件下，反应时间为2-80小时。
本发明一实施例中，待处理中链甘油三酯与橡胶籽油的质量比为(0.1-1)：1。具体地，所述待处理中链甘油三酯与橡胶籽油的质量比可以为0.1:1、0.2：1、0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1等。优选条件下所述中链甘油三酯与橡胶籽油的比例为(0.6-1):1。
为本发明的一个实施例，反应温度为5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃，反应时间可以为2h、4h、10h、20h、30h、40h、50h、60h、70h、80h。优选条件下，反应条件为10-60℃下，反应时间4-48小时，更优选条件下，反应条件为30-50℃下，反应时间4-24小时。
在20-80℃条件下，脂肪酶可以表现出更高的酶活力，随着反应时间的增长，未反应的橡胶籽油，中链甘油三脂以及副产物脂肪酸均会减少。
所述脂肪酶来源于动物、植物或微生物中的一种。
优选条件下，所述脂肪酶包括但不限于为诺维信435(Novozym 435)，诺维信脂肪酶40086(Novozym 40086)，诺维信脂肪酶TL IM(Lipozyme TL IM)。
上述四种脂肪酶为商业化脂肪酶，其中Novozym 435来源于黑曲霉菌Aspergillusniger，固定化载体为疏水性大孔树脂，采购自诺维信公司；Novozym40086来源于米赫根毛霉，固定化载体为树脂，采购自诺维信公司；Lipozyme TL IM来源于绵毛嗜热丝Thermomyceslanuginosa，固定化载体为二氧化硅，采购自诺维信公司。
更优选条件下，所述脂肪酶为诺维信40086酶，在最优选条件下，底物转化率最大达到70％(气相表征)。
作为本发明的一个实施例，所述脂肪酶的用量为橡胶籽油和中链甘油三脂总质量的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％，16％、17％、18％、19％、50％，较高的脂肪酶用量会缩短反应时间，但会增加成本；过低脂肪酶用量不能达到较好的结构脂质转化率。
优选条件下，所述脂肪酶用量为3％-10％，用量太少会导致转化率降低，酶量的增加只会提高反应速率，没有明显增加产率，反而会导致浪费。
实施例1:在常压条件下，一种生物酶法制备结构脂质的方法
步骤一：在常压条件下(1.013×105pa)，取5ml棕色小瓶以1g橡胶籽油和0.7g中链甘油三脂油为原料，加入0.051g Novozym40086脂肪酶，在无溶剂体系下，于40℃，800rpm恒温金属浴反应器中进行酯化反应24h，定时取样，利用气相测得MLCT最高产率为70％，其中MLM类占比最高，约为67％，MML、LLM、LML总占比为33％。通过皂化和甲酯化反应，经气相测得其n-3PUFA/n-6PUFA比为2.3，
步骤二：每次反应结束后，将剩余反应液倒出，加入相同底物，重复步骤一和步骤二，共重复六个批次后，酶活保持在初始酶活的80％以上。
实施例2:在减压条件下，一种生物酶法制备结构脂质的方法
步骤一：在减压条件下(1000pa)，在50ml圆底烧瓶中，加入10g橡胶籽油和7g中链甘油三脂(用量关系与发明内容相反)，加入0.51g Novozym40086脂肪酶，控制水浴锅温度为40℃，加入磁子，控制转速为800rpm,反应24h。
步骤二；酯交换反应过程中，定时取样0.32ml反应液与2ml离心管中，加入1.6ml正己烷，以5000rpm离心三分钟，取1.5ml上清液至2ml进样瓶中。使用气相分析测得MLCT最高产率为67％。待反应结束，利用布氏漏斗过滤除去反应酶，获得最终产物，其中MLM类占比最高，约为70％，MML、LLM、LML总占比为30％，经气相测得其n-3PUFA/n-6PUFA比为2.4.
减压条件下有利于酯化产生的水分蒸发，有利于反应向酯化方向进行,水分的减少会导致酶活力下降，进而导致产物产率降低。
实施例3:填充床反应器体系下，一种生物酶法制备结构脂质的方法
步骤一：在常压条件下(1.013×105pa)，取10g橡胶籽油和7g中链甘油三酯油为原料，充分混合，作为反应底物。
步骤二；在长20cm，内径1cm，外径2cm的钢制夹套填充床反应器中，填入0.051gNovozym40086脂肪酶，两端填入玻璃珠，通过柱塞泵将反应底物由下至上泵入填充床反应器中，流速0.4mL/min，夹套温度由循环水浴控制40℃。停留时间10min时；气象色谱测得物质产率为10％，循环进料4次时，MLCT的产率为68％。所有反应液，四次循环通过填充床反应器的总反应时间为19.17h，反应结束后，利用布氏漏斗过滤除酶，获得最终产物。其中MLM类占比最高，约为65％，MML、LLM、LML总占比为25％，经气相测得其n-3PUFA/n-6PUFA比为2.3.
实验例1：无溶剂体系下，常压条件下，不同脂肪酶对MLCT结构脂产量的影响。
为了说明不同脂肪酶对MLCT生成率的影响，因此将实验分为5组，其中：
实验组1：0.051g诺维信435脂肪酶(采购自诺维信公司)；
实验组2：0.051g诺维信40086脂肪酶(采购自诺维信公司)；
实验组3：0.051g诺维信TL IM脂肪酶(采购自诺维信公司)；
对比组：不加入任何反应酶。
实验方法：
步骤一.将实验分为五组，在常压条件下(1.013×105pa)，取5ml棕色小瓶，分别制备1g橡胶籽油和0.7g中链甘油三酯油，分别加入0.051g诺维信435脂肪酶，诺维信40086脂肪酶，诺维信TL IM脂肪酶，在无溶剂体系下，在恒温金属浴体系下，控制反应温度40℃，转速800rpm，进行酯化反应24h。
步骤二：酯交换反应过程中，定时取样0.32ml反应液与2ml离心管中，加入1.6ml正己烷，以5000rpm离心三分钟，取1.5ml上清液至2ml进样瓶中，进行气相分析。
步骤三：实验结果发现，在脂肪酶催化下，大部分底物均发生转化，且产生的水解脂肪酸含量较少。产物具有易分离，纯化简单，条件温和等优点。诺维信435脂肪酶，诺维信40086脂肪酶，诺维信TL IM脂肪酶，对比组分别为63％，70％，59％，0％，可以看出，利用本发明中的诺维信40086脂肪酶产物的转化率最高。