发明内容

本发明解决的技术问题是：为了克服现有技术的不足，提出一种基于锰离子诱导的比率型荧光酶联免疫传感平台的构建，用于灵敏和选择性地检测碱性磷酸酶(ALP)和心肌钙蛋白的方法。所述方法可以通过温和的合成条件、简单的合成步骤、便宜的合成原料制备出具有发射强蓝色荧光的纳米颗粒，通过比率型荧光值(F₅₅₀/F₄₆₀)与浓度的线性关系实现对碱性磷酸酶的高灵敏度检测。同时，又利用ALP 在酶联免疫中作为标记酶的特性，构建了ALP引发的比率型荧光免疫传感器并应用于心肌钙蛋白I型的检测。

为了解决本发明的技术问题，提出的技术方案为：一种基于锰离子诱导的比率型荧光传感平台检测锰离子，以左旋多巴和乙二胺为原料，在室温水相中合成了荧光强度高、稳定性好的左多巴纳米颗粒 LFC,Mn²⁺的加入导致LFC的快速聚集，导致468nm处的荧光强度随着Mn²⁺浓度的增加而减弱，而550nm处的荧光强度增强；将不同浓度的Mn²⁺分别加入到左多巴和乙二胺混合溶液中；震荡摇匀，通过荧光光谱仪进行荧光光谱测试，通过F₅₅₀/F₄₆₀荧光强度变化检测锰离子。

优选的，以左旋多巴和乙二胺为原料，在室温水相中合成了荧光强度高、稳定性好的LFC，在Mn²⁺引发聚集后造成了荧光发射波长的改变；将不同浓度的Mn²⁺分别加入400μL混合溶液中，震荡摇匀，反应15mins后，通过荧光光谱仪对其进行荧光强度检测。

为了解决本发明的技术问题，提出的另一技术方案为：所述的基于锰离子诱导的比率型荧光传感平台检测碱性磷酸酶的方法，当 LFC/Mn²⁺与P₃O₁₀ ^5-孵育时，P₃O₁₀ ^5-与Mn²⁺配位，取代了LFC/Mn²⁺中的锰离子，导致LFC荧光比值(F₅₅₀/F₄₆₀)降低，当ALP加入传感体系时，ALP水解P₃O₁₀ ^5-生成磷酸从而释放Mn²⁺，游离的Mn²⁺再次诱导LFC聚集，使得LFC的荧光比值(F₅₅₀/F₄₆₀)增强，故基于荧光左多巴纳米颗粒的发射转变策略可快速、灵敏的检测ALP。

优选的，室温条件下，取40μL Tris-HCl缓冲溶液，pH为9.0,分别加入40μL P₃O₁₀ ^5-(300μM)与0-800mU/mL碱性磷酸酶，震荡摇匀，在37℃条件下孵化反应0.5h后，取孵化液30μL于270μL Tris-HCl 缓冲溶液，再依次加入100μM的左旋多巴，2μM的锰离子，震荡摇匀，反应15mins后，通过荧光光谱仪对其进行比率型荧光值F₅₅₀/F₄₆₀分析。

为了解决本发明的技术问题，提出的另一技术方案为：所述的基于锰离子诱导的比率型荧光传感平台检测碱性磷酸酶的方法，室温条件下，在Tris-HCl缓冲溶液中加入一定量的人体血清，再加入一定量的三聚磷酸钠溶液与不同浓度的碱性磷酸酶孵化反应，再加入左多巴和乙二胺，反应15min后，通过比率型荧光值F₅₅₀/F₄₆₀与碱性磷酸酶浓度的线性关系，计算复杂体系中对碱性磷酸酶浓度检测的恢复效率，为了进一步验证设计的比率型荧光传感器对真实样品进行分析的能力，在人血清中实现了对ALP的定量分析检测，结果表明，该方法的回收率在96％至103％之间，适用于高灵敏测定复杂样品中的碱性磷酸酶。

优选的，首先，单克隆抗体被注入到96孔板中4℃孵化过夜；孵育后，用TBST冲洗数次，加入牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点；孵育清洗后，加入不同浓度的心肌钙蛋白I型，孵育清洗后，取抗山羊/Ab2移入孔板中37℃孵育1h；结束孵化后, TBST清洗数次，取ALP标记的驴羊二抗移入孔板中孵育，然后加入 pH＝9的Tris-HCl缓冲液和三聚磷酸钠盐，从而构成三明治式夹心免疫传感器；接着，加入pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液，加入左多巴和锰离子混合均匀后反应15分钟，进行比率型荧光值分析。

优选的，首先，一系列的单克隆抗体被注入到96孔板中4℃孵化过夜；孵育后，用TBST冲洗4次，每孔加入200μM牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点；随后，37℃孵育1小时，用TBST去除牛血清白蛋白；然后将不同浓度的cTnI溶液100μL， 37℃孵育1h，用TBST去除未结合的cTnI后，取抗山羊抗/Ab2移入孔板中37℃孵育1h；结束孵化后，TBST清洗五次，然后加入 Tris-HCl缓冲液，HRP标记的兔羊二抗和过氧化氢25℃孵化1h，从而构成三明治式夹心免疫；最后，使用TBST冲洗，并在孔板中加入左多巴和乙二胺；在室温下15分钟后进行比率型荧光值分析。

优选的，首先，1μg/mL的单克隆抗体100μL被注入到96孔板中4℃孵化过夜；孵育后，用TBST冲洗数次，每孔加入200μL牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点；随后，37℃孵育 1小时，用TBST去除牛血清白蛋白；然后往各孔中分别加入200ng/mL 的心肌钙蛋白I型，甲胎蛋白，溶酶体酵解素，胃蛋白酶，胰蛋白酶 100μL，37℃孵育1h，用TBST去除未结合的上述物质后，取抗山羊/Ab2移入孔板中37℃孵育1h；结束孵化后,TBST清洗数次，取 ALP标记的驴羊二抗移入孔板中37℃孵育1h，然后加入pH＝9的 Tris-HCl缓冲液50μL，加入三聚磷酸钠盐200μM于37℃孵化0.5h，从而构成三明治式夹心免疫传感器；接着，加入pH＝7.4的Tris-HCl 缓冲液250μL，加入左多巴和锰离子混合均匀后反应15min，进行比率型荧光值分析。

为了解决本发明的技术问题，提出的另一技术方案为：所述的基于比率型荧光酶联免疫传感平台的应用，在真实水样中进行锰离子含量检测。

为了解决本发明的技术问题，提出的另一技术方案为：根据所述的方法制备检测碱性磷酸酶、心肌钙蛋白的试剂盒。

一种基于锰离子诱导的比率型荧光传感平台检测锰离子，以左旋多巴和乙二胺为原料，在室温水相中合成了荧光强度高、稳定性好的 LFC，在Mn²⁺引发聚集后实现了蓝色荧光向黄色荧光的转换。将不同浓度的Mn²⁺水溶液分别加入400μL混合溶液中。震荡摇匀，反应15 mins后，通过荧光光谱仪对其进行比率型荧光检测。

以下对本发明做出进一步说明。

将16μL左旋多巴(10mM)和40μL乙二胺(10g/mL)加入8000μL Tris-HCl缓冲液(10mM，pH＝7.4)中，得到LFC。混合均匀后，将不同浓度的Mn²⁺水溶液分别加入400μL混合溶液中。震荡摇匀，反应 15mins后，通过荧光光谱仪对其进行比率型荧光检测，激发波长为385nm。绘制荧光扫描图、荧光强度散点图和标准曲线图。在相同条件下，考察了几种常见金属离子(如Ag⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、 Co²⁺、Al³⁺、Ni²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、K⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Pd²⁺、Hg²⁺、Cu²⁺)对Mn²⁺的选择性。结果表明该方法对Mn²⁺的具有很好的特异性。所有离子的浓度均为2μM。

一种基于锰离子诱导的比率型荧光反应检测碱性磷酸酶的方法，室温条件下，在Tris-HCl缓冲溶液中，加入一定量的三聚磷酸钠溶液与不同浓度的碱性磷酸酶孵化反应，再加入左多巴和乙二胺，15分钟反应后，通过比率型荧光值(F₅₅₀/F₄₆₀)与碱性磷酸酶浓度的线性关系，获得在复杂体系中对碱性磷酸酶浓度检测的恢复效率。

室温下，取40μL Tris-HCl缓冲溶液，pH为9.0,分别加入40μL P₃O₁₀ ^5-(300 μM)与0-800mU/mL碱性磷酸酶，震荡摇匀，在37℃条件下孵化反应0.5h后，取孵化液30μL于270μLTris-HCl缓冲溶液，再依次加入100μM的左多巴，2μM的锰离子，震荡摇匀，反应15mins 后，通过荧光光谱仪对其进行荧光比率型检测，激发波长为385nm。

一种基于锰离子诱导的比率型荧光传感器在复杂环境体系中检测碱性磷酸酶的方法，室温条件下，在Tris-HCl缓冲溶液中加入一定量的人体血清，再加入一定量的三聚磷酸钠溶液与不同浓度的碱性磷酸酶孵化反应，再加入左多巴和乙二胺，反应15分钟后，通过比率型荧光值与碱性磷酸酶浓度的线性关系，获得在复杂体系中对碱性磷酸酶浓度检测的恢复效率。为了进一步验证设计的传感器对真实样品进行分析的能力，在人血清中实现了对ALP的检测。与标准加入方法比较，所发展的方法对ALP检测的回收率在96％至103％之间。以下对本发明做出进一步说明。

在构建一种锰离子诱导的比率型荧光传感器在复杂环境体系中实时检测碱性磷酸酶的荧光传感时，所述缓冲溶液的pH为7.4， Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10mM，三聚磷酸钠盐的浓度为160μM，左多巴的浓度为100μM，锰离子的浓度为2μM；取40μL Tris-HCl 缓冲溶液，pH为9.0,分别加入1.6mM三聚磷酸钠盐的与0-200 mU/mL碱性磷酸酶，在37℃条件下孵化反应0.5h后，取孵化液30 μL于270μL Tris-Hcl缓冲溶液中，加入1％的人体血清，再依次加入 100μM的左多巴，2μM的锰离子，震荡摇匀，反应15分钟后，通过荧光光谱仪测量绘制荧光强度图，记录加碱性磷酸酶前后比率型荧光值的变化情况。

一种基于碱性磷酸酶构建的比率型荧光免疫传感器检测心肌肌钙蛋白I型的方法，在96孔板中，捕获抗体与抗原相结合，随后抗原与一抗相连接，一抗又与ALP标记的驴羊二抗相连构建一个三明治式夹心免疫传感器，最后加上荧光底物，通过形成荧光有机物的比率型荧光值的变化来实现对心肌钙蛋白I型的定量检测。

以下对本发明做出进一步说明。

首先，1μg/mL的单克隆抗体100μL被注入到96孔板中4℃孵化过夜。孵育后，用TBST冲洗4次，每孔加入200μL牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点。随后，37℃孵育1小时，用TBST去除牛血清白蛋白。然后往各孔中分别加入200ng/mL的心肌钙蛋白I型，甲胎蛋白，溶酶体酵解素，胃蛋白酶，胰蛋白酶100 μL，37℃孵育1h，用TBST去除未结合的上述物质后，取抗山羊/Ab2 移入孔板中37℃孵育1h。结束孵化后,TBST清洗五次，取ALP标记的驴羊二抗移入孔板中37℃孵育1h，，然后加入pH＝9的Tris-HCl 缓冲液50μL，加入三聚磷酸钠盐200μM于37℃孵化0.5h，从而构成三明治式夹心免疫。接着，加入pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液250μL，加入左多巴和锰离子混合均匀后反应15分钟，进行比率型荧光值分析。

本发明的有益效果：

本发明的方法以左旋多巴和乙二胺为原料，在室温水相中通过缩合反应生成具有强蓝色荧光的左多巴纳米颗粒(LFC)。基于制备的 LFC设计了一种检测ALP活性的比率型荧光传感器，实现了对ALP 的高选择性、高灵敏度的检测，其检测限为0.1mU/mL。在碱性磷酸酶(ALP)的催化水解下，P₃O₁₀ ^5-能迅速转化为磷酸根离子，从而使得黄色荧光增强。我们以心肌钙蛋白I型为靶向抗原，以碱性磷酸酶作为标记酶构建了一个ALP引发的比率型荧光酶联免疫试剂盒，实现对心肌钙蛋白I型的定量检测。该传感器还成功应用于人体血清中 ALP活性的检测，这些研究有助于糖尿病、乳腺癌等疾病的研究与治疗。

(1)一种基于锰离子诱导的比率型荧光酶联免疫传感平台的构建，用于灵敏和选择性地检测碱性磷酸酶(ALP)活性和心肌钙蛋白，属于纳米生物传感技术领域。该方法以左旋多巴和乙二胺为原料，在室温水相中合成了发射强蓝色荧光、稳定性好的左多巴纳米颗粒 (LFC)，在Mn²⁺引发聚集后蓝色波长荧光降低，黄色波长荧光增强。利用Mn²⁺对P₃O₁₀ ^5-的亲和力强于LFC表面的羟基，实现了比率型荧光降低(F₅₅₀/F₄₆₀)。ALP的催化水解下，P₃O₁₀ ^5-能迅速转化为磷酸根离子，从而实现比率型荧光增强检测ALP。我们以心肌钙蛋白I型为靶向抗原，ALP作为标记酶构建了一个免疫荧光传感平台。该比率型传感平台在人血清中对ALP活性和心肌钙蛋白检测仍表现出良好的回收率。

(2)以左多巴和乙二胺为原料，在室温水相中通过缩合反应生成具有强蓝色荧光的左多巴纳米颗粒。该纳米颗粒的制备过程简单、快速且无需加热及复杂的后处理步骤。

(3)室温水相合成的左多巴纳米颗粒荧光强度稳定且分散性良好。纳米颗粒在Mn²⁺的诱导下易聚集从而导致其荧光颜色的转变。这种荧光比率型传感器降低了背景荧光的干扰，并且实现了对Mn²⁺的高选择性、高灵敏度的检测，其检测限为10nM。

(4)基于荧光左多巴纳米颗粒设计了一种高选择性、高灵敏度检测ALP的比率型荧光传感器，其检测限为0.1mU/mL。该传感器依赖于Mn²⁺对荧光左多巴纳米颗粒的诱导作用、三聚磷酸钠对锰离子的螯合作用以及ALP对三聚磷酸钠的水解作用，从而实现对ALP 的定量检测。此外，我们将该传感器成功应用于真实水样中锰离子的检测及人体血清中ALP的活性检测。

(5)在相同条件下，考察了几种常见金属离子(如Ag⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、 Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Al³⁺、Ni²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、K⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Pd²⁺、 Hg²⁺、Cu²⁺)对Mn²⁺的选择性。所有离子的浓度均为2μM。如图8、图9。表明该方法对Mn²⁺的检测具有特异性。

(6)左旋多巴和乙二胺为原料，在室温水相中合成了荧光强度高、稳定性好的LFC。