新型冠状病毒肺炎分期与疗效评估细胞因子标志物及其应用
阅读说明：本技术 新型冠状病毒肺炎分期与疗效评估细胞因子标志物及其应用 (Novel coronavirus pneumonia staging and curative effect evaluation cytokine marker and application thereof ) 是由 徐建华 王大伟 石亚玲 黄若磐 张嘉琪 何金勇 杨雁青 于 2020-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医药技术领域,公开了新型冠状病毒肺炎分期与疗效评估细胞因子标志物及其应用。本发明探索研究得出41种与新型冠状病毒肺炎分期与疗效评估相关度很高的细胞因子(不同来源变异对总变异贡献大小分析：P<0.05),尤其是其中的12种相关度非常高：Eotaxin-2、IP-10、MCP-2、HCC-4、IL-10、ADAM8、G-CSF、Fas、TARC、IL-18、GDF-15、TRAIL R3(进一步用R软件包“LIMMA”,经验贝叶斯方法分析：adj.P.val<0.10),利用这些因子及其组合可用于开发新型冠状病毒肺炎分期与疗效评估产品,在新型冠状病毒肺炎分期与疗效评估方面,以及对于深入探究COVID-19患者细胞因子水平与疾病发生发展之间的关系、建立细胞因子风暴预警体系方面,具有重要的应用价值和应用前景。(The invention belongs to the technical field of biological medicines, and discloses a novel cytokine marker for staging and curative effect evaluation of coronavirus pneumonia and application thereof. The invention explores and researches to obtain 41 cytokines with high correlation with the stage and curative effect evaluation of the novel coronavirus pneumonia (the contribution of variation from different sources to the total variation is analyzed, and the P is less than 0.05), particularly 12 cytokines are very high in correlation: eotaxin-2, IP-10, MCP-2, HCC-4, IL-10, ADAM8, G-CSF, Fas, TARC, IL-18, GDF-15 and TRAIL R3 (further analyzed by an R software package LIMMA, an empirical Bayesian method: adj. P. val is less than 0.10), and the factors and the combination thereof can be used for developing novel products for stage and curative effect evaluation of coronavirus pneumonia, and have important application value and application prospect in the aspects of deeply exploring the relationship between the level of the cell factors of patients with COVID-19 and the occurrence and development of diseases and establishing a cell factor storm early warning system.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及新型冠状病毒肺炎COVID-19 分期与疗效评估细胞因子标志物及其应用。
背景技术
由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的疾病被命名为2019冠状病毒病 (COVID-19)[Coronaviridae Study Group of the International Committee on Taxonomy ofViruses.The species Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus:classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2.Nat Microbiol. 2020；5(4):536-544.doi:10.1038/s41564-020-0695-z]。新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 具有高度传染性。
因此，探求其生理病理机制以指导分期、指导用药及治疗方案的制定、以及预后评价迫在眉睫。
目前，COVID-19分期与疗效评估主要是依靠临床症状、肺部影像等手段，患者临床表现异质性大，影像结果判断局限性等诸多因素，不利于临床快速指导相关治疗。寻求一种快捷稳定的分期与评估体系具有重要的临床应用价值。
发明内容
本发明采用可同时定量检测440种细胞因子的抗体阵列，分析了普通型、重COVID-19患者病程中三个不同临床时期的细胞因子水平，探究了COVID-19患者细胞因子水平与疾病发生发展之间的关系、建立细胞因子风暴预警体系。
本发明的目的是提供新型冠状病毒肺炎分期与疗效评估细胞因子标志物。
本发明另一目的是提供所述细胞因子标志物在新型冠状病毒肺炎分期与疗效评估方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明研究发现，如下41种细胞因子与新型冠状病毒肺炎分期与疗效评估相关度很高：Eotaxin-2、IP-10、MCP-2、HCC-4、IL-10、ADAM8、G-CSF、Fas、 TARC、IL-18、GDF-15、TRAIL R3、I-TAC、ENA-78、GCP-2、MMP-7、Flt-3L、 PARC、CD23、BDNF、MCP-4、P-Cadherin、OSM、Angiostatin、ErbB3、MMP-9、 Pentraxin 3、RAGE、VE-Cadherin、MIP-3a、CEACAM-1、IL-18BPa、IL-6、Galectin-9、 TRAIL R1、MPIF-1、IL-1ra、uPAR、MMP-2、Syndecan-1、TIMP-1。
尤其是其中的12种细胞因子：Eotaxin-2、IP-10、MCP-2、HCC-4、IL-10、 ADAM8、G-CSF、Fas、TARC、IL-18、GDF-15、TRAIL R3，与新型冠状病毒肺炎分期与疗效评估相关度非常高(R软件包“LIMMA”，用经验贝叶斯方法统计分析：adj.P.val<0.10)。
因此，上述这些细胞因子中的一种或几种的组合，及其在新型冠状病毒肺炎分期和/或疗效评估方面的应用，包括作为标志物的应用，以及用于制备新型冠状病毒肺炎分期和/或疗效评估产品方面的应用，均应在本发明的保护范围之内。
基于此，用于检测上述细胞因子标志物含量的试剂，可以开发成相应的新型冠状病毒分期和/或疗效评估试剂盒，也应在本发明的保护范围之内。
本发明具有以下有益效果：
本发明探索研究得出41种与新型冠状病毒肺炎分期与疗效评估相关度非常高的细胞因子，尤其是其中的12种，利用这些因子及其组合可用于开发新型冠状病毒肺炎分期与疗效评估产品，在新型冠状病毒肺炎分期与疗效评估方面具有非常高的应用价值和应用前景。
同时基于此结果，对于深入探究COVID-19患者细胞因子水平与疾病发生发展之间的关系、建立细胞因子风暴预警体系也具有非常好的价值。
附图说明
图1为普通型与重型患者样本早期的细胞因子趋势图；图中，Mo代表普通型，Se代表重型，SYM代表早期。
图2为普通型与重型患者样本好转期的细胞因子趋势图；图中，Mo代表普通型，Se代表重型，REM代表好转期。
图3为普通型与重型患者样本康复期的细胞因子趋势图；图中，Mo代表普通型，Se代表重型，CON代表康复期。
图4为普通型与重型患者样本不同分期(早期、好转期、康复期)的细胞因子趋势图；图中，Mo代表普通型，Se代表重型，SYM代表早期，REM代表好转期，CON代表康复期。
图5为差异因子R软件进行层次聚类分析结果；普通型(Mo)与重型(Se) 患者临床早期(A)、症状缓解期(B)、康复期(C)的热图分析。
图6为差异因子功能富集分析(GO)结果图。
图7为差异因子功能富集分析(GO)结果图。
图8为差异因子功能分析韦恩图。
图9为R软件包“pROC”构建ROC曲线并计算ROC曲线下面积(AUC)(临床早期与康复期)。
图10为R软件包“pROC”构建ROC曲线并计算ROC曲线下面积(AUC) (临床早期与缓解期)。
图11为R软件包“pROC”构建ROC曲线并计算ROC曲线下面积(AUC) (症状缓解期与康复期)。
图12为R软件包“pROC”构建ROC曲线并计算ROC曲线下面积(AUC) (重症和普通型)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
1.资料和实验方法
1.1研究对象
本发明研究分析了14例Sars-cov-2感染患者(来自广州市和佛山市新型冠状病毒定点收治医院的住院治疗患者)，所有患者经核酸检测均为sras-cov-2阳性，并根据国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒辅助诊断与治疗指南》被分类为10例普通型患者及4例重型患者。普通型患者有发热、呼吸道等症状，影像学可见肺炎表现。重症患者定义需符合下列表现之一：呼吸急促(RR≥30 次/分)、静息状态下氧饱和度≤93％、动脉血氧分压(PaO2)/吸氧浓度(FiO2) ≤300mmHg(1mmHg＝0.133kPa)、肺部影像学显示多叶病变或48小时内病灶进展＞50％。
1.2样本收集
为研究covid-19的发生发展，本研究纵向采集了患者三个不同临床时期的血液样本，共42份样本。样本分组如表1：
表1
普通型(Mo)
重型(Se)
A：早期SYM
10
4
B：好转期REM
10
4
C：康复期CON
10
4
其中A采样点采集于临床早期，即患者入院后24h内；B采样点采集于症状缓解期，患者经一段时间有效治疗后，病情有所缓解，体现于肺部影像学、症状等有所好转；C采样点采集于康复期，患者均体温恢复正常、呼吸道症状明显好转，肺部影像学显示炎症明显吸收、连续两次呼吸道病原核酸检测阴性，即满足《新型冠状病毒辅助诊断与治疗指南》规定的出院标准。
1.3抗体阵列Q440
COVID19 Cytokines采用瑞博奥QAH-CAA-440蛋白芯片(QAH-CAA-440,RayBiotech,Inc.,Peachtree Corners,GA,USA)，测量了42份来自COVID19患者的血清标本中生物标志物的水平，包括分析观察样本中不同COVID19分型(包括普通型和重型)、分期(包括早期、好转期、康复期)患者血清Cytokine水平。
具体地，使用可定量检测440种的人类血清蛋白的细胞因子阵列Q440(QAH-CAA-440，RayBiotech，Inc，Peachtree Corners，GA，USA)进行蛋白质筛选。抗体阵列操作严格按照厂家说明书进行。简而言之，将阵列在室温下干燥2小时，然后在每孔中加入100μl的2倍稀释的样品稀释剂进行封堵，30分钟后吸出样品稀释剂。每孔中加入100μl 2倍稀释血清样品，4℃孵育过夜。用洗涤缓冲液I洗涤玻片5次，每次5min，然后用洗涤缓冲液II洗涤3次，每次5min。吸干洗涤缓冲液，每孔加入80μl生物素偶联抗体混合物，室温孵育2小时。清洗阵列后，每孔加入80μl AlexaFluor 555-偶联链霉亲和素，室温避光孵育1小时。最后，使用InnoScan310扫描仪(Innopsys，Carbonne，法国)扫描并提取信号。
1.4统计分析
通过分析研究中不同来源的变异对总变异的贡献大小，从而确定可控因素对研究结果影响力的大小。当P<0.05时，表示差异具有统计学意义。
使用R软件包“LIMMA”，用经验贝叶斯方法建立线性模型，分析COVID19 对不同时期、不同症状患者血清细胞因子水平的影响，包括对个体内部的相关性分析。当adj.P.val<0.10时，表示差异具有显著统计学意义。使用R软件(版本 3.6.3)分析所有统计数据。
GO分析和KEGG富集分析确定了蛋白功能和信号通路的显著富集，P值 <0.05。使用R软件(版本3.6.3)分析PCA(R包“ggbilot”)、分级聚类分析(R包“gplots”)、KEGG富集分析(R包“clusterProfiler”)和GO富集分析(R包“org.hs.e.db”和“clusterProfiler”)。
2.实验结果
2.1应用经验贝叶斯方法的线性模型分析
多种因素下统计差异蛋白，筛选条件P.Value＜0.5，差异蛋白41个，如表2。筛选条件adj.P.val＜0.1，差异蛋白12个(表2中前12个：Eotaxin-2、IP-10、 MCP-2、HCC-4、IL-10、ADAM8、G-CSF、Fas、TARC、IL-18、GDF-15、TRAIL R3)。
表2
2.2将筛选条件进一步严格，即adj.P.val＜0.1，筛选出12个差异细胞因子在普通型与重型患者三个不同临床时期的表达水平，如图1-4所示。
2.3根据蛋白质表达模式的差异，用R软件进行层次聚类分析，以分析不同组样本和蛋白质之间的差异，见图5，普通型(Mo)与重型(Se)患者临床早期(A)、症状缓解期(B)、康复期(C)的热图分析。
2.4通过对差异因子进行通路富集分析(KEGG)可知，差异因子主要富集于“病毒蛋白与细胞因子及其受体的相互作用”、“趋化因子信号通路”等通路。通过功能富集分析(GO)可知差异因子主要富集于“淋巴细胞迁移及趋化”功能。如图 6-7所示。
2.5通过数据库查询并将12个细胞因子分类对应到相应功能和通路中，制作韦恩图，得到5个具有淋巴细胞迁移于趋化功能，并参与病毒蛋白与细胞因子及其受体受体相互作用通路的细胞因子，包括HCC-4、IP-10、MCP-2、TARC、 Eotaxin-2，见图8、表3。
表3
2.6使用R软件包“pROC”构建ROC曲线并计算ROC曲线下面积(AUC)。对于临床早期与缓解期，Eotaxin-2(AUC＝0.872)、MCP-2(AUC＝0.883)、HCC-4 (AUC＝0.878)、IP-10(AUC＝0.867)、G-CSF(AUC＝0814)具有较好的分期诊断效能，见图9。
对于临床早期与康复期，IP-10(AUC＝0.918)、TARC(AUC＝0.913)、HCC-4 (AUC＝0.913)、IL-10(AUC＝0.923)、Eotaxin-2(AUC＝0.898)、MCP-2 (AUC＝0.888)、Fas(AUC＝0.832)、TRAIL R3(AUC＝0.817)具有较好的分期诊断效能，见图10。
对于症状缓解期与康复期，TARC(AUC＝0.806)具有较好的分期诊断效能，见图11。
同时，我们探究了作为新冠肺炎患者危重病例识别因素的可能性，GDF-15 (AUC＝0.856)、IL-18(AUC＝0.883)在识别重症和普通型中具有较好的分期诊断效能，见图12。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。