一种针对SARS-CoV-2 RBD结构域的特异性中和抗体竞争法ELISA试剂盒
阅读说明：本技术 一种针对SARS-CoV-2 RBD结构域的特异性中和抗体竞争法ELISA试剂盒 (Specific neutralizing antibody competition method ELISA kit aiming at SARS-CoV-2 RBD structural domain ) 是由 徐建华 张嘉琪 刘万里 石亚玲 王大伟 何金勇 邓敏 于 2020-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种针对SARS-CoV-2 RBD结构域的特异性中和抗体竞争法ELISA试剂盒,该试剂盒含有包被有人ACE2蛋白的固相载体、生物素标记的RBD蛋白。该试剂盒可用于提高新冠检测率,一定程度上弥补核酸检测假阴性带来的漏检问题；可用于检测新冠康复病人体内中和抗体含量,以判断是否可以复工复产及是否存在再次感染风险；还可有效地监测临床研究中的疫苗接种反应及作为后期疫苗效果的评价指标；中和抗体测定可支持强化监测措施,如普遍检测、活动性病例发现、接触者追踪和联系群集。(The invention discloses a specific neutralizing antibody competition ELISA kit aiming at SARS-CoV-2 RBD structure domain, which comprises a solid phase carrier coated with human ACE2 protein and biotin-labeled RBD protein. The kit can be used for improving the detection rate of new coronas and making up the problem of missed detection caused by false negative of nucleic acid detection to a certain extent; can be used for detecting the content of the neutralizing antibody in the body of a patient with new coronary rehabilitation to judge whether the patient can carry out repeated work and production and whether the patient has the risk of secondary infection; the vaccine inoculation reaction in clinical research can be effectively monitored and used as an evaluation index of the later vaccine effect; neutralizing antibody assays may support intensive monitoring measures such as general detection, active case finding, contacter tracking, and contact clustering.)
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，更具体地，涉及一种针对SARS-CoV-2 RBD结构域的特异性中和抗体竞争法ELISA试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种新型β冠状病毒(β-coronavirus)，来自Sarbecovirus亚属，圆形或椭圆形，直径60～140nm，电镜下呈皇冠样形状。与SARS-CoV具有相似的受体结合结构域，依靠人细胞表面ACE2蛋白作为细胞进入受体。包膜刺突蛋白(S)介导受体结合和膜融合，同时也是抗体主要靶点。
新型冠状病毒中和抗体是新型冠状病毒肺炎患者在染病的数天或约一周后血液内产生的一种抗体。中和抗体(NAb)通常是针对S蛋白产生的，病毒表面的S蛋白(spikeprotein)的受体结合域(receptor binding domain，RBD)对病毒进入细胞表现出直接中和活性，是中和抗体(Abs)的主要靶点，阻止了刺突蛋白对表面A CE2受体的有效结合。在使用灭活病毒接种疫苗的方法中证明，SARS-CoV-2的S蛋白通过受体结合结构域(RBD)是一种免疫优势病毒抗原。
中和抗体的检测可提高诊断率，因为实时RT-PCR存在一定比例假阴性问题；抗体测定可支持强化监测措施，如普遍检测、活动性病例发现、接触者追踪和联系群集；还能够有效地监测临床研究中的疫苗接种反应及作为后期疫苗效果的评价指标。
现有的对SARS-CoV-2的检测方法主要有核酸检测和血清学检测，核酸检测主要方法有荧光PCR法；血清学检测主要方法有：酶联免疫吸附法、胶体金层析法、化学发光法。虽然核酸检测灵敏度高，特异性强，准确度高，但是对操作要求相对较高，检测时间长。抗体检测灵敏度较高，特异性较强。
目前，利用不同的病毒抗原和检测不同抗体类别的商业试剂已投入使用。然而，市场上现有的SARS-CoV-2血清学测试并不总是能够以可靠的方式检测，而且目前这些方法只能检测是否处于感染期，并不能针对治愈后患者是否存在再感染风险，以及普通大众是否存在暴露及感染风险等进行确认，这可能会妨碍为临床或流行病学目的进行适当的人群测试。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种针对SARS-CoV-2 RBD结构域的特异性中和抗体竞争法ELISA试剂盒，针对病毒刺突可溶性外膜结构域(Spike)上高免疫原性受体结合结构域(RBD)，采用竞争ELISA法技术对冠病毒感染患者体内中和抗体进行检测，该方法理论可靠，实际可行，在准确性和重复性方面提供了可靠的结果，只需在二级生物安全实验室就可完成。本发明的免疫分析技术灵敏度高、特异性强、操作简单、结果重复性好、干扰因素少。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
采用人ACE2蛋白包被在微孔板上，将生物素标记的RBD加入到待测血清中反应，再将反应物加入到包被好的微孔板中进行竞争性结合，经HRP-链霉亲和素反应后进行显色反应，并在450/630nm处测得吸光度值，以此计算中和抗体的抑制率，判断血清或者血浆中的新冠病毒中和抗体。
因此本发明要求保护一种新型冠状病毒中和抗体的竞争酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，含有包被有人ACE2蛋白的固相载体和生物素标记的RBD蛋白。
生物素标记的RBD蛋白为编码SARS-COV-2spike蛋白(RBD)的DNA序列通过c端多组氨酸标记表达；纯化后的蛋白在体外被生物素化；可特异性结合内源性中和抗体及ACE2蛋白。
包被有人ACE2蛋白的固相载体为均匀包被人ACE2蛋白的96孔板。
中和抗体由纯化的重组SARS-CoV-2(2019nCoV)Spike RBD-MFC蛋白免疫小鼠获得的B细胞与小鼠骨髓瘤融合产生的杂交瘤产生的；可与RBD蛋白特异性结合。
优选地，所述试剂盒还包括显色液、洗涤液、终止液、样品稀释液和酶标二抗，以及SARS-CoV-2中和抗体。
其中SARS-CoV-2中和抗体为阳性对照。SARS-CoV-2中和抗体由纯化的重组SARS-CoV-2(2019nCoV)Spike RBD-MFC蛋白免疫小鼠获得的B细胞与小鼠骨髓瘤融合产生的杂交瘤分泌。
优选地，所述试剂盒的抗体抑制率公式为：抑制率＝(1-待测OD值/阴性对照OD值)×100％。
更优选地，抑制率低于35.93％，则样本不存在中和抗体；抑制率高于35.93％，则样本存在中和抗体。
优选地，检测样本为血清。
优选地，所述酶标二抗为HRP-链霉亲和素。
HRP-链霉亲和素为HRP标记的链霉亲和素。
优选地，所述洗涤液为含0.05％(v/v)吐温和0.5％(w/v)BSA的PBST溶液。
优选地，所述样本稀释液为含0.5％(w/v)BSA的PBS溶液，pH为7.4。
优选地，所述显色液：含2mg/ml TMB、50mmol/L磷酸氢二钠、24.3mmol/L柠檬酸、0.75％(v/v)过氧化氢。
优选地，所述终止液为含2mol/L H2SO4。
最优选地，一种针对SARS-CoV-2 RBD结构域的特异性中和抗体竞争法ELISA试剂盒，
一、组成
包被有人ACE2蛋白的96孔板，0.2ng/孔(制备方法为：可与RBD蛋白结合的人ACE2蛋白包被于微孔板中，配置成2ug/ml，100μl/孔，包被于酶联板上，4℃过夜，并封闭)；
生物素标记的RBD蛋白，每孔用量20ng；
酶标二抗：HRP-链霉亲和素；
显色液：含2mg/ml3,3,5,5'-tetramethylbenzidine(TMB)、50mmol/L磷酸氢二钠、24.3mmol/L柠檬酸、0.75％(v/v)过氧化氢；
终止液：含2mol/L H2SO4；
样本稀释液：含0.5％(w/v)BSA的PBS溶液，pH为7.4；
洗涤液：含0.05％(v/v)吐温和0.5％(w/v)BSA的PBST溶液。
二、使用方法
1、样本处理：将100μl待测血清样本中加入1.0μl(20ng/μl)生物素标记的RBD中进行结合反应，在37℃条件下孵育60min；
2、样本孵育：将步骤1中的样本加入到包被有人ACE2蛋白的96孔板中进行竞争性结合，加样100μl/孔，37℃孵育60min。
3、与酶标二抗反应：洗板后，每孔加入100μl HRP-链霉亲和素进行反应，37℃条件下反应30min。
4、TMB显色：彻底洗板后，每孔加入100μl底物显色液，37℃避光显色15～20min。
5、终止：加入终止液50μl，酶标仪测定450/630nM处吸光值，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈负相关。
6、计算抑制率：抑制率＝(1-待测OD值/阴性对照OD值)×100％。
三、结果判读
抑制率低于35.93％，则样本不存在中和抗体；抑制率高于35.93％，则样本中存在中和抗体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种针对SARS-CoV-2 RBD结构域的特异性中和抗体竞争法ELISA试剂盒，该试剂盒可用于提高新冠检测率，一定程度上弥补核酸检测假阴性带来的漏检问题；可用于检测新冠康复病人体内中和抗体含量，以判断是否可以复工复产及是否存在再次感染风险；还可有效地监测临床研究中的疫苗接种反应及作为后期疫苗效果的评价指标；中和抗体测定可支持强化监测措施，如普遍检测、活动性病例发现、接触者追踪和联系群集。
附图说明
图1为试剂盒实验原理及操作示意图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1生物素标记的RBD中和效果的检测
一、实验方法
为评判生物素标记的RBD蛋白的中和效果，现检测不同浓度生物素化RBD及不同浓度中和抗体间的中和效果。具体操作如下：
1、制备包被人ACE2的ELISA板：将可与RBD蛋白结合的人ACE2蛋白包被于微孔板中，配置成2μg/ml，100μl/孔，包被于酶联板上，4℃过夜，并封闭；
2、样本处理：采用健康人血清样本，加入不同量的生物素标记的RBD及中和抗体进行结合反应(具体每孔的用量见表1)，在37℃条件下孵育60min；
3、样本孵育：将步骤2中的反应物加入到步骤1制备的包被人ACE2的ELISA板中进行竞争性结合，100μl/孔加样，37℃孵育60min；
4、与二抗反应：洗板后，每孔加入100μl HRP-链霉亲和素进行反应，37℃条件下反应30min；
5、TMB显色：彻底洗板后，每孔加入100μl显色液(含2mg/ml TMB、50mmol/L磷酸氢二钠、24.3mmol/L柠檬酸、0.75％过氧化氢)，37℃避光显色15～20min；
6、终止：加入终止液(含2mol/L H2SO4)50μl，酶标仪测定450/630nm处吸光值，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈负相关；
7、计算抑制率：抑制率＝(1—样本OD值/阴性对照OD值)×100％。
二、实验方法
检测结果见表1。
表1：
检测结果显示，与未加中和抗体的测试相比，生物素标记的RBD对于中和抗体有较高的抑制率，即本竞争法ElISA试剂盒选用的生物素标记的RBD具有较好的中和效果。
并且发现，当每孔包被0.2ng人ACE2蛋白时，生物素标记的RBD蛋白和SARS-CoV-2中和抗体的用量分别为10～40ng和73.75～1180ng，生物素标记的RBD对于SARS-CoV-2中和抗体有较高的抑制率。
实施例2针对新冠病毒RBD结构域的特异性中和抗体竞争法ELISA试剂盒
一、针对新冠病毒RBD结构域的特异性中和抗体竞争法ELISA试剂盒的成分如下：
A.包被有人ACE2蛋白的96孔板，0.2ng/孔(制备方法为：可与RBD蛋白结合的人ACE2蛋白包被于微孔板中，配置成2ug/ml，100μl/孔，包被于酶联板上，4℃过夜，并封闭)；
B.生物素标记的RBD蛋白，每孔用量20ng；
C.酶标二抗：HRP-链霉亲和素；
D.显色液：含2mg/ml3,3,5,5'-tetramethylbenzidine(TMB)、50mmol/L磷酸氢二钠、24.3mmol/L柠檬酸、0.75％(v/v)；
E.终止液：含2mol/L H2SO4；
F.样本稀释液：含0.5％(w/v)BSA的PBS溶液，pH为7.4；
G.洗涤液：含0.05％(v/v)吐温和0.5％(w/v)BSA的PBST溶液。
二、本针对新冠病毒RBD结构域的特异性中和抗体竞争法ELISA试剂盒的使用方法，即针对新冠病毒RBD结构域的特异性中和抗体竞争法ELISA检测方法(试剂盒实验操作示意图如图1)，步骤如下：
1、样本处理：将100μl待测血清样本中加入1.0μl(20ng/μl)生物素标记的RBD中进行结合反应，在37℃条件下孵育60min；
2、样本孵育：将步骤1中的样本加入到包被有人ACE2蛋白的96孔板中进行竞争性结合，加样100μl/孔，37℃孵育60min。
3、与酶标二抗反应：洗板后，每孔加入100μl HRP-链霉亲和素进行反应，37℃条件下反应30min。
4、TMB显色：彻底洗板后，每孔加入100μl底物显色液，37℃避光显色15～20min。
5、终止：加入终止液50μl，酶标仪测定450/630nM处吸光值，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈负相关。
6、计算抑制率：抑制率＝(1-待测OD值/阴性对照OD值)×100％。
实施例3临床样本的检测
一、实验方法
1、为检验本试剂盒在新冠患者中的检测效果，使用实施例2的试剂盒检测临床样本。本实施例依据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》纳入了14位经一段时间住院治疗的新冠感染者，与此同时还纳入了7例健康者作为对照。
2、检测结果
检测结果见表1，新冠感染者抑制率与健康者抑制率比较，p值小于0.05，本发明提供的试剂盒可依据抑制率明显区分新冠感染患者及健康者。根据CUT OFF＝NC+2SD计算(NC为健康对照者，[19.7±7.98])，计算得到Cut off＝19.97+2×7.98＝35.93，即抑制率低于35.93％可认为该患者体内不存在中和抗体，抑制率高于35.93％可认为该患者体内存在中和抗体。
表2：
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。