尿液蛋白标志物在诊断颈动脉狭窄和缺血性脑卒中的用途
阅读说明：本技术 尿液蛋白标志物在诊断颈动脉狭窄和缺血性脑卒中的用途 (Application of urine protein marker in diagnosis of carotid stenosis and cerebral arterial thrombosis ) 是由 吴建强 王威 郑月宏 于 2021-08-03 设计创作，主要内容包括：本公开涉及尿液蛋白标志物在诊断颈动脉狭窄和缺血性脑卒中的用途。具体而言,本公开涉及在颈动脉狭窄患者中利用尿液蛋白标志物诊断和早期预测缺血性脑卒中的用途,所述尿蛋白标志物包括溶酶体酸性磷酸酶、磷脂酶D3、N-乙酰氨基半乳糖-6-硫酸酯酶、Culbin、含蛋白3的NHL重复序列、胱抑素-S、溶酶体α-葡萄糖苷酶、甲酰胺酰基转移酶环脱氨酶、α-半乳糖苷酶A等。(The present disclosure relates to the use of urine protein markers for the diagnosis of carotid stenosis and ischemic stroke. In particular, the present disclosure relates to the use of urine protein markers including lysosomal acid phosphatase, phospholipase D3, N-acetylgalactosamine-6-sulfatase, Culbin, NHL repeat containing protein 3, cystatin-S, lysosomal α -glucosidase, formamide acyltransferase cyclic deaminase, α -galactosidase a, and the like, for the diagnosis and early prediction of ischemic stroke in patients with carotid stenosis.)
技术领域
本公开涉及临床医学；具体而言涉及人颈动脉狭窄相关的尿液蛋白标志物。具体而言，本公开涉及利用颈动脉狭窄患者尿液样品和质谱分析蛋白组学技术获得的人颈动脉狭窄诊断和/或早期预测缺血性脑卒中相关的尿液蛋白标志物，及其用途。
背景技术
颈动脉狭窄(carotid artery stenosis，CAS)的特征是颈动脉动脉粥样硬化斑块形成，约占所有脑卒中的20-30％。脑卒中是全球第二大死亡原因和成人残疾的主要原因，因此预防脑卒中社会价值巨大。
CAS的进展是隐匿的，患者可能持续无症状，直到出现脑卒中或短暂性脑缺血发作症状。因此，CAS的早期诊断对于CAS的管理至关重要。CAS在临床上可分为症状性和无症状的CAS。其中症状性CAS患者具有显著增加的脑卒中风险，而且症状性和无症状的CAS患者的临床管理也不同。表征症状性CAS有助于脑卒中的早期预测、风险分层和早期干预。
过去十年中，基于质谱的蛋白质组学分析通过检测来自各种样本来源的数千种蛋白质，彻底改变了疾病生物标志物的发现。由于尿液无创、采集简单、状态稳定、无高丰度蛋白抑制等优点，使其成为临床蛋白质组学研究中极具吸引力的生物标志物来源。
因此，本领域仍需要能够将CAS患者与对照区分开来，并可以将症状性CAS患者与无症状CAS患者区分开来的蛋白标志物，可能为CAS诊断和风险分层提供一种无创且有效的方法。
发明内容
鉴于本领域的上述需求，根据本公开的一些实施方案，提供了选自以下任一蛋白的鉴定试剂在制备用于颈动脉狭窄的诊断装置中的用途：
溶酶体酸性磷酸酶、磷脂酶D3、N-乙酰氨基半乳糖-6-硫酸酯酶、Culbin、含蛋白3的NHL重复序列、胱抑素-S、溶酶体α-葡萄糖苷酶、甲酰胺酰基转移酶环脱氨酶、α-半乳糖苷酶A、芳基磺酸酶F、溶酶体保护蛋白、免疫球蛋白λ变体4-60、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、颗粒蛋白前体、免疫球蛋白λ变体3-19、连接粘附分子A、γ-谷氨酰水解酶、β-葡萄糖醛酸酶、导管素抗菌肽、呆蛋白、过氧化物酶-1、Xaa前氨基肽酶2、溶酶体相关膜糖蛋白2、胞浆丝氨酸羟甲基转移酶，平滑肌肌球蛋白轻链激酶、肿瘤坏死因子受体超家族成员12A、细胞质动力蛋白1重链1、氨基酰化酶-1、半胱氨酸蛋白酶抑制因子-SA、钙结合蛋白39、甜菜碱-同型半胱氨酸S-甲基转移酶1、胞浆10-甲酰四氢叶酸脱氢酶、S-甲基甲硫氨酸-同型半胱氨酸S-甲基转移酶BHMT2、细胞质C-1-四氢叶酸合酶、天冬氨酸蛋白酶A、芳基磺酸酶A、酸性神经酰胺酶、富含半胱氨酸的分泌蛋白3、细胞质甘油-3-磷酸脱氢酶[NAD(+)]、FAM151A蛋白、ADAMTS样蛋白4、低密度脂蛋白受体、过氧化物酶-6、羧肽酶Z、β-己糖胺酶亚单位α、旁血小板溶蛋白、电压依赖性阴离子选择通道蛋白1、三激酶/FMN环化酶、补体成分C9、半乳糖苷酶或其组合；优选地，溶酶体酸性磷酸酶、磷脂酶D3、N-乙酰氨基半乳糖-6-硫酸酯酶、Culbin、含蛋白3的NHL重复序列、胱抑素-S、溶酶体α-葡萄糖苷酶、甲酰胺酰基转移酶环脱氨酶、α-半乳糖苷酶A和芳基磺酸酶F。
在具体的实施方案中，和对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平提高，指示所述受试者患颈动脉狭窄或者患颈动脉狭窄的风险增加：胱抑素-S、免疫球蛋白λ变体4-60、免疫球蛋白λ变体3-19、连接粘附分子A、导管素抗菌肽、平滑肌肌球蛋白轻链激酶、肿瘤坏死因子受体超家族成员12A、细胞质动力蛋白1重链1、半胱氨酸蛋白酶抑制因子-SA、富含半胱氨酸的分泌蛋白3、ADAMTS样蛋白4、羧肽酶Z、旁血小板溶蛋白、补体成分C9或其组合。反之，则风险降低。
在具体的实施方案中，和对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低，指示所述受试者患颈动脉狭窄或患颈动脉狭窄的风险增加：溶酶体酸性磷酸酶、磷脂酶D3、N-乙酰氨基半乳糖-6-硫酸酯酶、Culbin、含蛋白3的NHL重复序列、溶酶体α-葡萄糖苷酶、甲酰胺酰基转移酶环脱氨酶、α-半乳糖苷酶A、芳基磺酸酶F、溶酶体保护蛋白、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、颗粒蛋白前体、γ-谷氨酰水解酶、β-葡萄糖醛酸酶、呆蛋白、过氧化物酶-1、Xaa前氨基肽酶2、溶酶体相关膜糖蛋白2、丝氨酸羟甲基转移酶、氨基酰化酶-1、钙结合蛋白39、甜菜碱-同型半胱氨酸S-甲基转移酶1、胞浆10-甲酰四氢叶酸脱氢酶、S-甲基甲硫氨酸-同型半胱氨酸S-甲基转移酶BHMT2、细胞质C-1-四氢叶酸合酶、天冬氨酸蛋白酶A、芳基磺酸酶A、酸性神经酰胺酶、细胞质甘油-3-磷酸脱氢酶[NAD(+)]、FAM151A蛋白、低密度脂蛋白受体、过氧化物酶-6、β-己糖胺酶亚单位α、电压依赖性阴离子选择通道蛋白1、三激酶/FMN环化酶、半乳糖苷酶或其组合。反之，则风险降低。
在涉及颈动脉狭窄诊断的实施方案中，对照是指未患有颈动脉狭窄(优选也未患有脑卒中)的个体。对照不一定是临床意义上健康的个体，优选是健康的个体。
在另一个实施方案中，提供了选自以下的蛋白的鉴定试剂在制备用于早期预测缺血性脑卒中的装置中的用途，所述蛋白标志物选自：免疫球蛋白λ变体3-9、血浆丝氨酸蛋白酶抑制因子、脂蛋白脂肪酶、β-葡萄糖醛酸酶、2'，3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶、免疫球蛋白λ-1轻链、HLA I类组织相容性抗原Cw-7α链、Ras相关蛋白Ral-A、叶酸受体β、白细胞介素-2受体β亚单位、羧肽酶N催化链、黏着斑蛋白、HLA-I类组织相容性抗原B-51α链、肽基脯氨酰顺反异构酶B、钙调素样蛋白3、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PP1γ催化亚单位、T-复合蛋白1亚单位ζ、线粒体苹果酸脱氢酶、斯钙素-1、胆绿素还原酶A、白细胞介素-13受体亚单位α-1、磷脂酰肌醇聚糖特异性磷脂酶D、睾丸蛋白聚糖-1、烟酸磷酸核糖转移酶、肌联蛋白、γ-谷氨酰水解酶、高尔基体蛋白1、磷酸三酯酶相关蛋白、选择连接蛋白18、突触泡膜蛋白VAT-1同源物、含硫氧还蛋白结构域的蛋白质17、内质网氨基肽酶1或其组合；优选，免疫球蛋白λ变体3-9、血浆丝氨酸蛋白酶抑制因子、脂蛋白脂肪酶、β-葡萄糖醛酸酶、2'，3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶、免疫球蛋白λ-1轻链、HLA I类组织相容性抗原Cw-7α链、Ras相关蛋白Ral-A和叶酸受体β。
在具体的实施方案中，所述的缺血性脑卒中的早期预测是在颈动脉狭窄患者(CAS患者)中进行预测。
在具体的实施方案中，在CAS患者中进行取样，症状性CAS患者和无症状CAS患者尿液中的蛋白水平相比较，根据患者尿液中蛋白标志物的变化情况来早期预测缺血性脑卒中。
症状性CAS被定义为，与颈动脉分布相对应的突发性局灶性神经系统症状，包括但不限于：局灶性神经功能障碍、一过性单眼盲、暂性脑缺血发作、小的(非致残性)缺血性脑卒中。该定义根据既往6个月内颈动脉症状的发生而制定。
无症状CAS被定义为，在没有近期同侧颈动脉灌注区域缺血性脑卒中或短暂性脑缺血病史的个体中，存在的颈动脉狭窄。
在具体的实施方案中，和无症状CAS尿液中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者出现缺血性脑卒中风险高：免疫球蛋白λ变体3-9、免疫球蛋白λ-1轻链、HLA I类组织相容性抗原Cw-7α链、叶酸受体β、羧肽酶N催化链、黏着斑蛋白、HLA-I类组织相容性抗原B-51α链、钙调素样蛋白3、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PP1γ催化亚单位、T-复合蛋白1亚单位ζ、线粒体苹果酸脱氢酶、斯钙素-1、胆绿素还原酶A、白细胞介素-13受体亚单位α-1、磷脂酰肌醇聚糖特异性磷脂酶D、烟酸磷酸核糖转移酶、磷酸三酯酶相关蛋白、选择连接蛋白18、突触泡膜蛋白VAT-1同源物、含硫氧还蛋白结构域的蛋白质17、内质网氨基肽酶1、或其组合。反之，则风险降低。
在具体的实施方案中，和无症状CAS尿液中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低，指示所述受试者出现缺血性脑卒中风险高：血浆丝氨酸蛋白酶抑制因子、脂蛋白脂肪酶、β-葡萄糖醛酸酶、2'，3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶、Ras相关蛋白Ral-A、白细胞介素-2受体β亚单位、肽基脯氨酰顺反异构酶B、睾丸蛋白聚糖-1、肌联蛋白、γ-谷氨酰水解酶、高尔基体蛋白1、或其组合。反之，则风险降低。
本申请的鉴定试剂能够识别、或结合、或搜索、或监测、或靶向到这样的标签肽(如表1或表2中所列蛋白包含的肽)。在另一些实施方案中，本申请的鉴定试剂能够识别、或结合、或搜索、或监测、或靶向蛋白的表位(如表1或表2中所列蛋白中表位，线性或非线性表位均适用)。
在一些实施方案中，适用于本公开的鉴定试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。
在具体的实施方案中，抗体是单克隆抗体。本公开对单克隆抗体的物种来源没有限制，任何能够结合上述蛋白的抗体均可以使用。
在具体的实施方案中，抗原结合片段包括但不限于：Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、ScFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、双-scFv、mimi抗体。任何保留了抗原结合活性的抗体片段均适用于本公开。
在一个实施方案中，当采用质谱鉴定试剂时，鉴定试剂作广泛理解，不能仅解释为实体存在的化学、生物试剂。该术语也包含质谱鉴定参数。作为一个示例，将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息。这种采集方法像地毯式轰炸，无遗漏地打击全部靶标；将碎片的质荷比信息在数据库中进行比对，以鉴定蛋白身份和定量。应当理解，尽管具体示例中采用了特定的鉴定方式，但是本申请技术效果的实现并不依赖于特定的鉴定方式(例如质谱操作步骤、质谱仪型号、质谱方法中设定的参数、质谱鉴定中所识别的特定肽段序列、色谱柱型号；抗体供应商、抗体所靶向的特定表位、抗体分型、免疫学操作步骤和参数)，这是因为本申请技术方案的核心在于发现了前述蛋白在尿液中的存在量与疾病之间的关系，因此任何能够确定蛋白含量的手段都是可用的。
标签肽(文中也称特异性肽)是指能够代表某一个蛋白的肽段，其特征在于存在且特异性仅存在于某蛋白质氨基酸序列中。
应当理解，尽管具体示例中基于特定的某段序列对蛋白进行了鉴定和定量，但是这不意味着表1或表2中所列蛋白中其它位置的肽片段不能使用，只要这样的片段能将不同的蛋白彼此区分开，就适用于本申请。在本申请的教导下，技术人员根据常规技术结合所用鉴定方法的操作要求，便可确定片段的位置或长度。
在具体的实施方案中，表达水平是蛋白质水平。
在具体的实施方案中，表达水平是蛋白在受试者的尿液样本中表达水平。
在具体的实施方案中，所述受试者是人。
在本公开的技术方案中，所述颈动脉狭窄患者是颅外颈动脉狭窄患者。
在具体的实施方案中，根据本公开的蛋白标志物能够用于诊断和/或分层颈动脉狭窄。
根据另一些实施方案，还提供了一种用于诊断颈动脉狭窄的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂、或者由选自以下的蛋白的鉴定试剂组成：溶酶体酸性磷酸酶、磷脂酶D3、N-乙酰氨基半乳糖-6-硫酸酯酶、Culbin、含蛋白3的NHL重复序列、胱抑素-S、溶酶体α-葡萄糖苷酶、甲酰胺酰基转移酶环脱氨酶、α-半乳糖苷酶A、芳基磺酸酶F、溶酶体保护蛋白、免疫球蛋白λ变体4-60、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、颗粒蛋白前体、免疫球蛋白λ变体3-19、连接粘附分子A、γ-谷氨酰水解酶、β-葡萄糖醛酸酶、导管素抗菌肽、呆蛋白、过氧化物酶-1、Xaa前氨基肽酶2、溶酶体相关膜糖蛋白2、胞浆丝氨酸羟甲基转移酶，平滑肌肌球蛋白轻链激酶、肿瘤坏死因子受体超家族成员12A、细胞质动力蛋白1重链1、氨基酰化酶-1、半胱氨酸蛋白酶抑制因子-SA、钙结合蛋白39、甜菜碱-同型半胱氨酸S-甲基转移酶1、胞浆10-甲酰四氢叶酸脱氢酶、S-甲基甲硫氨酸-同型半胱氨酸S-甲基转移酶BHMT2、细胞质C-1-四氢叶酸合酶、天冬氨酸蛋白酶A、芳基磺酸酶A、酸性神经酰胺酶、富含半胱氨酸的分泌蛋白3、细胞质甘油-3-磷酸脱氢酶[NAD(+)]、FAM151A蛋白、ADAMTS样蛋白4、低密度脂蛋白受体、过氧化物酶-6、羧肽酶Z、β-己糖胺酶亚单位α、旁血小板溶蛋白、电压依赖性阴离子选择通道蛋白1、三激酶/FMN环化酶、补体成分C9、半乳糖苷酶、或其组合。
在另一些具体的实施方案中，提供了一种用于早期预测缺血性脑卒中的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂、或者由选自以下的蛋白的鉴定试剂组成：免疫球蛋白λ变体3-9、血浆丝氨酸蛋白酶抑制因子、脂蛋白脂肪酶、β-葡萄糖醛酸酶、2'，3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶、免疫球蛋白λ-1轻链、HLA I类组织相容性抗原Cw-7α链、Ras相关蛋白Ral-A、叶酸受体β、白细胞介素-2受体β亚单位、羧肽酶N催化链、黏着斑蛋白、HLA-I类组织相容性抗原B-51α链、肽基脯氨酰顺反异构酶B、钙调素样蛋白3、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PP1γ催化亚单位、T-复合蛋白1亚单位ζ、线粒体苹果酸脱氢酶、斯钙素-1、胆绿素还原酶A、白细胞介素-13受体亚单位α-1、磷脂酰肌醇聚糖特异性磷脂酶D、睾丸蛋白聚糖-1、烟酸磷酸核糖转移酶、肌联蛋白、γ-谷氨酰水解酶、高尔基体蛋白1、磷酸三酯酶相关蛋白、选择连接蛋白18、突触泡膜蛋白VAT-1同源物、含硫氧还蛋白结构域的蛋白质17、内质网氨基肽酶1、或其组合。
在一些实施方案中，试剂盒中包含上述蛋白的鉴定试剂。
在另一些实施方案中，芯片上固定有上述蛋白的鉴定试剂。
在一些实施方案中，所述鉴定试剂是抗体或其抗原结合片段。
根据一些实施方案，提供了一种用于诊断受试者是否患有颈动脉狭窄的方法，包括步骤：
1)获得受试者或对照的尿液样本，
2)任选地，从尿液样本中分离蛋白，
3)确定所述受试者的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：
溶酶体酸性磷酸酶、磷脂酶D3、N-乙酰氨基半乳糖-6-硫酸酯酶、Culbin、含蛋白3的NHL重复序列、胱抑素-S、溶酶体α-葡萄糖苷酶、甲酰胺酰基转移酶环脱氨酶、α-半乳糖苷酶A、芳基磺酸酶F、溶酶体保护蛋白、免疫球蛋白λ变体4-60、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、颗粒蛋白前体、免疫球蛋白λ变体3-19、连接粘附分子A、γ-谷氨酰水解酶、β-葡萄糖醛酸酶、导管素抗菌肽、呆蛋白、过氧化物酶-1、Xaa前氨基肽酶2、溶酶体相关膜糖蛋白2、胞浆丝氨酸羟甲基转移酶，平滑肌肌球蛋白轻链激酶、肿瘤坏死因子受体超家族成员12A、细胞质动力蛋白1重链1、氨基酰化酶-1、半胱氨酸蛋白酶抑制因子-SA、钙结合蛋白39、甜菜碱-同型半胱氨酸S-甲基转移酶1、胞浆10-甲酰四氢叶酸脱氢酶、S-甲基甲硫氨酸-同型半胱氨酸S-甲基转移酶BHMT2、细胞质C-1-四氢叶酸合酶、天冬氨酸蛋白酶A、芳基磺酸酶A、酸性神经酰胺酶、富含半胱氨酸的分泌蛋白3、细胞质甘油-3-磷酸脱氢酶[NAD(+)]、FAM151A蛋白、ADAMTS样蛋白4、低密度脂蛋白受体、过氧化物酶-6、羧肽酶Z、β-己糖胺酶亚单位α、旁血小板溶蛋白、电压依赖性阴离子选择通道蛋白1、三激酶/FMN环化酶、补体成分C9、半乳糖苷酶或其组合；
4)和获自对照的样本中蛋白表达水平进行比较。
在具体的实施方案中，使用质谱方法、ELISA方法、或Western方法确定表达水平。
当采用质谱方法确定蛋白及其表达水平时，在获得尿液样本的步骤之后，还可以包括蛋白酶的消化步骤。在具体的实施方案中，用蛋白酶使尿液样本中的蛋白片段化。
根据一些实施方案，提供了一种用于诊断受试者患有颈动脉狭窄的方法，包括步骤：
1)获得受试者和对照的尿液样本，
2)确定受试者和对照的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：溶酶体酸性磷酸酶、磷脂酶D3、N-乙酰氨基半乳糖-6-硫酸酯酶、Culbin、含蛋白3的NHL重复序列、胱抑素-S、溶酶体α-葡萄糖苷酶、甲酰胺酰基转移酶环脱氨酶、α-半乳糖苷酶A、芳基磺酸酶F、溶酶体保护蛋白、免疫球蛋白λ变体4-60、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、颗粒蛋白前体、免疫球蛋白λ变体3-19、连接粘附分子A、γ-谷氨酰水解酶、β-葡萄糖醛酸酶、导管素抗菌肽、呆蛋白、过氧化物酶-1、Xaa前氨基肽酶2、溶酶体相关膜糖蛋白2、胞浆丝氨酸羟甲基转移酶，平滑肌肌球蛋白轻链激酶、肿瘤坏死因子受体超家族成员12A、细胞质动力蛋白1重链1、氨基酰化酶-1、半胱氨酸蛋白酶抑制因子-SA、钙结合蛋白39、甜菜碱-同型半胱氨酸S-甲基转移酶1、胞浆10-甲酰四氢叶酸脱氢酶、S-甲基甲硫氨酸-同型半胱氨酸S-甲基转移酶BHMT2、细胞质C-1-四氢叶酸合酶、天冬氨酸蛋白酶A、芳基磺酸酶A、酸性神经酰胺酶、富含半胱氨酸的分泌蛋白3、细胞质甘油-3-磷酸脱氢酶[NAD(+)]、FAM151A蛋白、ADAMTS样蛋白4、低密度脂蛋白受体、过氧化物酶-6、羧肽酶Z、β-己糖胺酶亚单位α、旁血小板溶蛋白、电压依赖性阴离子选择通道蛋白1、三激酶/FMN环化酶、补体成分C9、半乳糖苷酶或其组合；
3)将受试者中所述蛋白的表达水平和对照中所述蛋白的表达水平进行比较；
4)确定所述受试者是否患有颈动脉狭窄、或评价患有颈动脉狭窄的风险。
在具体的实施方案中，和对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平升高，指示所述受试者存在颈动脉狭窄患病风险增加：胱抑素-S、免疫球蛋白λ变体4-60、免疫球蛋白λ变体3-19、连接粘附分子A、导管素抗菌肽、平滑肌肌球蛋白轻链激酶、肿瘤坏死因子受体超家族成员12A、细胞质动力蛋白1重链1、半胱氨酸蛋白酶抑制因子-SA、富含半胱氨酸的分泌蛋白3、ADAMTS样蛋白4、羧肽酶Z、旁血小板溶蛋白、补体成分C9或其组合。
在具体的实施方案中，和对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低，指示所述受试者存在颈动脉狭窄的患病风险增加：溶酶体酸性磷酸酶、磷脂酶D3、N-乙酰氨基半乳糖-6-硫酸酯酶、Culbin、含蛋白3的NHL重复序列、溶酶体α-葡萄糖苷酶、甲酰胺酰基转移酶环脱氨酶、α-半乳糖苷酶A、芳基磺酸酶F、溶酶体保护蛋白、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、颗粒蛋白前体、γ-谷氨酰水解酶、β-葡萄糖醛酸酶、呆蛋白、过氧化物酶-1、Xaa前氨基肽酶2、溶酶体相关膜糖蛋白2、丝氨酸羟甲基转移酶、氨基酰化酶-1、钙结合蛋白39、甜菜碱-同型半胱氨酸S-甲基转移酶1、胞浆10-甲酰四氢叶酸脱氢酶、S-甲基甲硫氨酸-同型半胱氨酸S-甲基转移酶BHMT2、细胞质C-1-四氢叶酸合酶、天冬氨酸蛋白酶A、芳基磺酸酶A、酸性神经酰胺酶、细胞质甘油-3-磷酸脱氢酶[NAD(+)]、FAM151A蛋白、低密度脂蛋白受体、过氧化物酶-6、β-己糖胺酶亚单位α、电压依赖性阴离子选择通道蛋白1、三激酶/FMN环化酶、半乳糖苷酶或其组合。
根据一些实施方案，提供了一种用于早期预测缺血性脑卒中的方法，包括步骤：
1)获得受试者或对照(优选无症状性颈动脉狭窄患者)的尿液样本；
2)确定受试者或对照的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：免疫球蛋白λ变体3-9、血浆丝氨酸蛋白酶抑制因子、脂蛋白脂肪酶、β-葡萄糖醛酸酶、2'，3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶、免疫球蛋白λ-1轻链、HLA I类组织相容性抗原Cw-7α链、Ras相关蛋白Ral-A、叶酸受体β、白细胞介素-2受体β亚单位、羧肽酶N催化链、黏着斑蛋白、HLA-I类组织相容性抗原B-51α链、肽基脯氨酰顺反异构酶B、钙调素样蛋白3、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PP1γ催化亚单位、T-复合蛋白1亚单位ζ、线粒体苹果酸脱氢酶、斯钙素-1、胆绿素还原酶A、白细胞介素-13受体亚单位α-1、磷脂酰肌醇聚糖特异性磷脂酶D、睾丸蛋白聚糖-1、烟酸磷酸核糖转移酶、肌联蛋白、γ-谷氨酰水解酶、高尔基体蛋白1、磷酸三酯酶相关蛋白、选择连接蛋白18、突触泡膜蛋白VAT-1同源物、含硫氧还蛋白结构域的蛋白质17、内质网氨基肽酶1或其组合；
3)将受试者与对照所述蛋白的表达水平进行比较；
4)确定所述受试者发生缺血性脑卒中的风险。
在具体的实施方案中，相较于无症状CAS患者样品，受试者中选自以下的蛋白的表达水平提高，指示缺血性脑卒中高风险：免疫球蛋白λ变体3-9、免疫球蛋白λ-1轻链、HLA I类组织相容性抗原Cw-7α链、叶酸受体β、羧肽酶N催化链、黏着斑蛋白、HLA-I类组织相容性抗原B-51α链、钙调素样蛋白3、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PP1γ催化亚单位、T-复合蛋白1亚单位ζ、线粒体苹果酸脱氢酶、斯钙素-1、胆绿素还原酶A、白细胞介素-13受体亚单位α-1、磷脂酰肌醇聚糖特异性磷脂酶D、烟酸磷酸核糖转移酶、磷酸三酯酶相关蛋白、选择连接蛋白18、突触泡膜蛋白VAT-1同源物、含硫氧还蛋白结构域的蛋白质17、内质网氨基肽酶1或其组合。
在具体的实施方案中，相较于无症状CAS样品，选自以下的蛋白的表达水平降低，指示缺血性脑卒中高风险：血浆丝氨酸蛋白酶抑制因子、脂蛋白脂肪酶、β-葡萄糖醛酸酶、2'，3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶、Ras相关蛋白Ral-A、白细胞介素-2受体β亚单位、肽基脯氨酰顺反异构酶B、睾丸蛋白聚糖-1、肌联蛋白、γ-谷氨酰水解酶、高尔基体蛋白1或其组合。
附图说明
图1A和图1B：CAS患者和对照的颈部进行CT检查。
具体实施方式
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本公开。本领域技术人员公知，在不悖离本公开精神的情况下，可以对本公开做出许多修改，这样的修改也落入本公开的范围。如无特别说明，所使用的实验材料均可从商业公司获取。
实施例.颈动脉狭窄患者的尿液收集及分析
1.获取颈动脉狭窄患者的晨尿样品；与对照，以及无症状颈动脉狭窄患者的尿液蛋白表达进行比较。
对照为无颈动脉狭窄的受试者。
无症状颈动脉狭窄的判定标准：参见Moresoli P等人Carotid Stenting VersusEndarterectomy for Asymptomatic Carotid Artery Stenosis:A Systematic Reviewand Meta-Analysis.Stroke 2017；48:2150-2157。
症状性颈动脉狭窄的判定标准：参见Brott,T.G.等人Long-Term Results ofStenting versus Endarterectomy for Carotid-Artery Stenosis.New EnglandJournal of Medicine 2016；374(11),1021-1031。
2.材料与试剂
1)仪器：
Orbitrap Q Exactive HF高分辨质谱仪购自Thermo Fisher公司；高效液相色谱仪EASY-nLC 1200购自Thermo Fisher公司。
2)试剂：
色谱级乙腈、甲酸和甲醇为Waters公司生产；碘乙酰铵(IAA)、碳酸氢铵、二硫苏糖醇(DTT)从Sigma公司购买；质谱级胰酶从Promega公司购买。
3.实验方法
1)样本收集流程：收集颈动脉狭窄患者和对照的尿液。
2)提取患者尿液蛋白：患者尿液5000g离心30min取上清，将尿液与丙酮按体积比1:4进行混合，-20℃过夜沉淀尿液蛋白。4℃以12000g离心30min，弃上清，沉淀自然风干后加裂解液复溶。
3)蛋白组样品制备：尿液蛋白使用FAST法进行膜上酶切，参见Wisniewski JR等人Universal sample preparation method for proteome analysis.Nature methods2009；6:359-62。
4)质谱鉴定：对酶切的肽段用Orbitrap Q Exactive HF高分辨质谱仪进行串联质谱分析。参数设置：修改质谱可变窗口，扫描时间为60min，碰撞能量：28％；一级扫描分辨率设置为60000，二级分辨率为30000；母离子最大注入时间80ms；母离子扫描范围：300-1300m/z；子离子扫描范围：从200m/z开始；设置40个扫描窗口；窗口大小根据一级母离子数目确定，平均分布。
5)蛋白组定量分析：所得质谱数据经过Proteome Discoverer软件(版本2.1)检索，结果文件后导入Spectronaut软件，建立谱图库。正式样品质谱原始数据导入Spectronaut软件，与谱图库中数据进行匹配，q值<1.0％，通过iRT试剂校正保留时间。筛选鉴定到2个以上特异性多肽的蛋白用于后续蛋白组定量。筛选出蛋白表达量变化倍数在1.5倍以上，p值小于0.05的蛋白作为差异蛋白。
测试例
测试例1.颈动脉CT(电子计算机断层扫描)检查
受试者通过颈部CT检查，确定是否发生颈动脉狭窄。检查结果如下：
1.CT影像学改变：
对CAS患者(图1A)和对照(图1B)的颈部进行CT检查，发现CAS患者颈动脉发生明显狭窄。
2.蛋白鉴定结果：
收集35例确诊的颈动脉狭窄患者尿液样品，其中症状性颈动脉狭窄患者12例，无症状性颈动脉狭窄患者23例，在至少鉴定到2个特异性多肽及蛋白鉴定FDR<1％的水平，共鉴定到蛋白数1394个。
1)与对照的样品比对，筛选出变化倍数在1.5倍以上且独立样本t检验p<0.05的差异蛋白，选出p值较小的前50个差异蛋白作为诊断标志物。
表1显示，颈动脉狭窄共筛选出差异蛋白50个，14个蛋白升高，36个蛋白降低。
表1.颈动脉狭窄患者和对照差异尿液蛋白标志物
2)与无症状颈动脉狭窄的样品相比，症状性颈动脉狭窄筛选出变化倍数在1.5倍以上且独立样本t检验p<0.05的差异蛋白。表2显示，共筛选出差异蛋白33个，21个蛋白升高，11个蛋白降低。
表2.症状性和无症状颈动脉狭窄患者差异尿液蛋白标志物
针对表1中的蛋白，购买市售抗体(或实验室自行制备特异性抗体)。收集CAS患者和受试者尿液样本，采用盲法，用所得抗体测试样本中的蛋白表达水平。经统计学分析(p＝0.05)，表1蛋白(单独或者组合使用)的表达水平，能够区分CAS患者和受试者(数据未显示)。具体而言，表1中溶酶体酸性磷酸酶、磷脂酶D3、N-乙酰氨基半乳糖-6-硫酸酯酶、Culbin、含蛋白3的NHL重复序列、胱抑素-S、溶酶体α-葡萄糖苷酶、甲酰胺酰基转移酶环脱氨酶、α-半乳糖苷酶A和芳基磺酸酶F组合使用时(其他标记物可任选，增加标记物，则会增加灵敏度和特异性)，检测方法的灵敏度和特异性均满足临床要求。
针对表2中的蛋白，购买市售抗体(或实验室自行制备特异性抗体)。收集症状性和无症状颈动脉狭窄患者尿液样本，采用盲法，用所得抗体测试样本中的蛋白表达水平。经统计学分析(p＝0.05)，表2蛋白(单独或者组合使用)的表达水平，能够区分症状性和无症状颈动脉狭窄患者，并预测脑卒中风险(数据未显示)。具体而言，表2中免疫球蛋白λ变体3-9、血浆丝氨酸蛋白酶抑制因子、脂蛋白脂肪酶、β-葡萄糖醛酸酶、2'，3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶、免疫球蛋白λ-1轻链、HLA I类组织相容性抗原Cw-7α链、Ras相关蛋白Ral-A和叶酸受体β组合使用时(其他标记物可任选，增加标记物，则会增加灵敏度和特异性)，检测方法的灵敏度和特异性均满足临床要求。
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