具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例中所用的原料如无特殊说明，均可从常规商业途径得到。

本发明中涉及到的物质英文简称、英文全称、中文全称对照表如下：

本发明涉及的实验材料说明：

小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)：购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心；

人正常肝细胞(LO₂)：厦门大学陈清西老师实验室惠赠；

斑马鱼卵：厦门大学余娴文老师实验室惠赠。

本发明主要涉及的试剂如下所示：

本发明主要涉及的仪器如下所示：

本发明涉及的相关试剂配制方法如下：

L-tyr溶液：浓度为1mg/mL，称取50mg L-tyr粉末，先加入40μL 1mol/L的HCl，轻微震荡均匀后，用双蒸水(ddH₂O)定容至50mL，使其充分溶解。

L-dopa溶液：浓度为0.5mg/L，称取25mg L-dopa粉末，在避光条件下，溶解于ddH₂O并定容至50mL。

Na₂HPO₄溶液：浓度为0.2mol/L，称取35.61g Na₂HPO₄·2H₂O粉末，溶解于ddH₂O并定容至1L。

NaH₂PO₄溶液：浓度为0.2mol/L，称取27.6g NaH₂PO₄·2H₂O粉末，溶解于ddH₂O并定容至1L

磷酸钠缓冲溶液(pH 6.8)：吸取49mL的0.2mol/L Na₂HPO₄溶液与51mL的0.2mol/LNaH₂PO₄溶液混合均匀即可。

10xPBS(细胞用)：称取4g NaCl、0.1g KCl、0.1g NaH₂PO₄·2H₂O、0.12g无水KH₂PO₄溶解于ddH₂O并定容至500mL。使用前用ddH₂O稀释至1x并高压灭菌后即可使用。

MTT溶液：浓度为5mg/mL。称取50mg MTT粉末，在避光条件下，溶解于ddH₂O并定容至10mL，在无菌环境下用无菌滤头(0.22μm)进行过滤，过滤完毕后用锡箔纸避光并置于-20℃冰箱中保存。

NaOH裂解液：浓度为1mol/L。称取40g NaOH粉末，先加入适量水使其溶解，其后加入4mL DMSO溶液，最后用ddH₂O定容至40mL。

1％TritonX-100裂解液：在10mL的ddH₂O中分别加入100μL的TritonX-100溶液与100μL母液浓度为100mmol/L的蛋白酶抑制剂(PMSF),混合均匀后置于4℃冰箱中保存。

Tris-HCl(pH 8.8):浓度为1.5mol/L。称取90.15g Tris粉末，加入400mL ddH₂O，溶解完全后，将pH调至8.8并用ddH₂O定容至1L。

Tris-HCl(pH6.8)：浓度为1mol/L。称取60.55g Tris粉末，加入400mL ddH₂O，溶解完全后，将pH调至8.8并用ddH₂O定容至1L。

4xSample buffer：将20mL 1mol/L Tris-HCl溶液、8g SDS粉末、40mL甘油、0.04g溴酚蓝粉末混合溶解完全后置于4℃冰箱中备用，使用前加入5％的β-巯基乙醇。

10％SDS：称取10g SDS粉末，溶解于ddH₂O并定容至100mL。

10％APS：称取1g过硫酸铵，溶解于ddH₂O并定容至10mL。

10x浓缩电极液：称取30.3g Tris粉末与144g甘氨酸粉末，加入ddH₂O至总体积为950mL，溶解完全后，调节pH至8.8后定容至1L。

1x电极液：量取100mL 10x浓缩电极液，加入10mL预先配制好的10％SDS溶液后，定容至1L，混合均匀即可。

10x浓缩电极液：称取30.3g Tris粉末与144g甘氨酸粉末，溶解于ddH₂O并定容至1L。

1x电转液：量取100mL 10x浓缩电转液，加入200mL甲醇溶液，最后用ddH₂O定容至1L，混合均匀即可。

10xTBST：称取80g NaCl粉末，30g Tris粉末，溶解于ddH₂O并定容至1L。

1xTBST：量取100ml 10xTBST，加入1.4mL Tween 20，用ddH₂O定容至1L，混合均匀即可。

DPPH工作母液：称取7mg DPPH粉末，溶解于95％甲醇并定容至100mL后置于4℃冰箱中保存。

ABTS+工作母液：称取0.0384g ABTS粉末和0.0134g过硫酸钾粉末分别溶于10mLddH₂O后按1：1体积比混合，将混合液常温避光放置16h后置于4℃冰箱保存。

斑马鱼胚胎培养水：称取3.5g NaCl粉末，0.05g KCl粉末，0.05g NaHCO₃粉末，0.05g无水CaCl₂粉末，溶解于ddH₂O并定容至1L。

DMEM高糖培养基：首先将一袋1L规格的DMEM高糖培养基粉末溶解于950mL无菌水中，加入3.7g NaHCO₃粉末溶解完全后,调节pH至7.0-7.2之间，用已灭菌的滤器(滤膜孔径为0.22μm)在生物安全柜内过滤培养基，分装于蓝盖瓶后用封口膜封口置于4℃冰箱备用。使用前按培养基：胎牛血清：双抗＝100：10：1的体积比加入胎牛血清与双抗混匀即可。

本发明中结果呈现方式为平均值，通过SPSS16.0软件采用LSD检验法(p<0.05)对样本数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，将实验组与对照组进行两两比较，并用prism5软件作图。

本发明中乙基麦芽酚是一种市售的食品添加剂，可作为一种已知的酪氨酸酶抑制剂对照。

实施例一：目标产物KAD4的合成

KAD4的合成方法如图1所示，第一步：合成席夫碱：将0.73g(约5mmol)AHMT粉末与700μL(约5mmol)α-甲基肉桂醛液体放入反应瓶中并往反应瓶中加入30mL无水乙醇，在搅拌条件下80℃油浴反应2h后，用无水乙醇抽滤洗涤反应液可得到淡黄色粉末即席夫碱。第二步：合成曲酸氯化物：称取0.7g(约5mmol)曲酸粉末放入干燥的反应瓶中，并往反应瓶中加入30mL左右的氯化亚砜溶液，在搅拌条件下冰浴反应12h后，用二氯甲烷溶液抽滤洗涤反应液可得到白色粉末状固体即曲酸氯化物。第三步，合成目标产物KAD4：各称取5mmol第一步与第二步的反应产物分别溶于10mL DMF后，将两者置于反应瓶中混合并加入1mL三乙胺保持碱性环境。在搅拌条件下80℃油浴反应12h后在反应体系中加入ddH₂O终止反应并使产物析出，后续用ddH₂O和无水乙醇依次抽滤洗涤，得到棕色粉末即为

2-{4-Amino-5-[N'-(2-methyl-3-phenyl-allylidene)-hydrazino]-4H-[1,2,4]triazol-3-ylsulfanylmethyl}-5-hydroxy-pyran-4-one(全文简称为KAD4)粗产物。粗产物经LC-MS提纯，然后旋蒸、干燥可得到提纯后的KAD4棕色粉末，KAD4的化学式为C₁₈H₁₈N₆O₃S。

KAD4的合成是通过脱水反应等改变曲酸吡喃酮环C₅的取代基，既保留了曲酸原有的化学结构优势又丰富了侧链基团的功能。

实施例二：KAD4化学结构式鉴定质谱鉴定：取10mg KAD4粉末置于离心管内，并加入500μL DMSO溶液进行溶解，溶解完全后，用滤头(0.22μm)过滤溶液后吸取至质谱管中，用分析型液相色谱-质谱仪检测化合物的分子量，水相为ddH₂O，有机相为甲醇，检测结果为[M+H]⁺，主产物的分子量为399.43[M+H]⁺，质谱图如图2所示。

核磁鉴定：取20mg左右干燥的KAD4粉末充分溶解于700μL的氘代试剂DMSO-D6中，用滤头(0.22μm)对化合物溶液进行过滤后置于核磁管中，并用Varian Mercury-600spectronmeter测定KAD4的¹H NMR、¹³C NMR和DEPT-135图谱并用MestReNova软件进行分析。图3为提纯后产物的氢谱结果：¹H NMR(600MHz,DMSO)δ9.22(s,1H),8.13(s,1H),8.10–8.04(m,1H),7.49(d,J＝7.6Hz,2H),7.42(dd,J＝15.9,7.9Hz,2H),7.36–7.28(m,1H),6.86(s,1H),6.44–6.37(m,1H),6.00(d,J＝34.0Hz,2H),4.28(d,J＝11.9Hz,2H),2.14(s,3H)。图4为提纯后产物的碳谱结果：¹³C NMR(151MHz,DMSO)δ174.09,162.79,154.08,151.29,149.38,146.35,140.42,138.30,136.54,129.92,129.80,129.72,128.98,128.45,128.13,113.78,32.82,19.19,13.07。而后根据DEPT-135图谱判断产物的碳原子类型，DEPT-135图谱中甲基碳和次甲基碳向上出峰，亚甲基碳为倒峰。如图5所示，产物的DEPT-135图谱中仅有一个倒峰。这与KAD4仅一个亚甲基碳的结构特征是相符的。

实施例三：吡喃酮类化合物对mTYR单酚酶活性的抑制效果

以L-tyr为酶催化底物分别测定乙基麦芽酚与KAD4对mTYR单酚酶活性的抑制效果。将乙基麦芽酚用ddH₂O配制成100mmol/L的母液，KAD4用DMSO溶液配制成20mmol/L的母液，再根据实验设计稀释成相应的浓度。在实验开始前，将实验中需用到的溶液预先置于37℃水浴锅中加热保温以保证反应体系适宜的温度。往比色皿中加入以下溶液：1.55mLddH₂O、750μL PBS(pH 6.8)、500μL L-tyr、100μL化合物，最后加入100μL mTYR溶液，加液完毕后，迅速混匀并将比色皿放置于酶标仪内测定单酚酶活性曲线，用GRAPHWIN软件对所得数据作图并分析，曲线切线的斜率即为单酚酶活力，横轴截距为反应的迟滞时间。通过SPSS软件进行分析可求出化合物对单酚酶活性抑制效果的IC₅₀。

如图6所示，I-A、II-A为分别加入两种化合物后，单酚酶催化底物反应的动力学循环曲线图。在反应刚开始期间，反应产物积累速率比较缓慢，随着时间的推移，产物积累速率越来越快，当呈现直线式增长即斜率维持不变时，说明体系中的反应已达到稳定态。I-B、II-B为催化反应达到稳定态后的酶活力即稳态酶活力，随着反应体系内两种化合物浓度的增加，稳态酶活力均逐渐下降。当乙基麦芽酚浓度为3.3mmol/L，稳态酶活力降到57.79％，当KAD4浓度为20μmol/L，稳态酶活力降到41.83％，乙基麦芽酚与KAD4对单酚酶抑制效应的IC₅₀分别为4.294mmol/L和11.819μmol/L，结果汇总于下表。I-C、II-C为随着化合物浓度增加，单酚酶催化反应达到稳定态的迟滞时间的变化，由图可知，乙基麦芽酚对于迟滞时间基本没有造成影响，KAD4对mTYR单酚酶催化反应具有延缓作用。当KAD4浓度为20μmol/L时，迟滞时间长达7.6min。综上，KAD4对单酚酶活力的抑制效应优于乙基麦芽酚。图6中，I-A中0-4分别为乙基麦芽酚的终浓度为0、0.8、1.6、2.4、3.3mmol/L。Ⅱ-A中0-4分别为KAD4的终浓度为0、5、10、15、20μmol/L。(A):动力学循环图；(B)稳态酶活力。稳态酶活力随着化合物浓度的升高而降低；(C)迟滞时间。乙基麦芽酚对于迟滞时间基本没有造成影响，KAD4对mTYR单酚酶催化反应具有延缓作用。

上表中，曲酸的数据来自于Chen Y M,Li C,Zhang W J,et al.Kinetic andcomputational molecular docking simulation study of novel kojic acidderivatives as anti-tyrosinase and antioxidant agents[J].Journal Of EnzymeInhibition And Medicinal Chemistry,2019,34(1):990-998。

实施例四：吡喃酮类化合物对mTYR二酚酶活性的抑制效果

以L-dopa为酶催化底物测定两种化合物对mTYR二酚酶活性的抑制效果。实验开始前，将实验需用到的溶液预先置于37℃水浴锅中加热保温以保证反应体系适宜的温度。往比色皿中加入以下溶液：1.8mL ddH₂O、750μL PBS(pH 6.8)、300μL L-dopa、100μL化合物，最后加入50μL mTYR溶液，加液完毕后，迅速混匀并将比色皿放置于酶标仪内进行二酚酶活性的测定，用prism软件对所得数据进行作图并分析,直线斜率为二酚酶活力。通过SPSS软件进行分析可求出化合物对二酚酶活性抑制效果的IC₅₀。

如图7所示，在不同浓度化合物作用下，两种化合物均得到一组通过原点但斜率不同的直线，随着化合物浓度的增加，直线斜率减小，说明乙基麦芽酚与KAD4对mTYR二酚酶的抑制机理均为可逆性抑制，两种化合物均以非共价键的形式与mTYR相互作用导致酶活力降低。结果汇总于实施例三中的表格。图7中，Ⅰ中0-4代表乙基麦芽酚的终浓度为0、0.4、0.8、1.2和1.6mmol/L，Ⅱ中0-4代表KAD4的终浓度为0、4、8、12和16μmol/L。两种化合物均得到一组通过原点但斜率不同的直线，随着化合物浓度的增加，直线斜率减小，说明两者的抑制机理均为可逆性抑制。

实施例五至实施例六涉及的细胞培养：设置细胞培养箱温度为37℃，二氧化碳浓度为5％，使用DMEM高糖培养基分别在直径为10cm的培养皿内培养LO₂和B16F10两种细胞。每隔24h观察一次细胞状态并将培养皿内培养基替换成新鲜培养基，当细胞的生长密度为90％左右且细胞状态良好，可将细胞传代或冻存，细胞传代步骤如下：弃去旧培养基后沿培养皿内侧壁缓慢加入5mL PBS，轻轻左右摇晃后弃去PBS，然后加入1mL胰酶并将细胞放入培养箱中消化1-2min，消化完毕后，弃去胰酶并加入2mL DMEM高糖培养基终止消化，然后用移液枪轻轻吹打培养皿底部，使细胞脱落得到细胞悬液并平均分装于两个离心管内，将其1500r/min离心3min，离心完毕弃去上清各加入1mL新鲜培养基重悬细胞后，分别吸取细胞悬液于两个直径10cm的新培养皿中，各加入10mL培养基，左右摇晃均匀后于培养箱中继续培养。细胞冻存步骤如下：同细胞传代步骤至1500r/min离心3min后，弃去上清各加入1mL细胞冻存液(胎牛血清：DMSO＝9:1)重悬细胞，转移细胞悬液至已灭菌的冻存管内并用封口膜封口，将其放入预先装满异丙醇的程序降温冻存盒内于-80℃冰箱中12h后转移至液氮罐中即可。

实施例五：吡喃酮类化合物对B16F10细胞黑色素含量的影响

分别设置以下化合物浓度作用于细胞60h(乙基麦芽酚：0、100、150、200μmol/L；KAD4：0、10、20、40、80、100μmol/L)。细胞培养方法参照上述，待细胞完全贴壁生长、状态良好并且密度为90％左右，按照细胞传代的方法得到细胞悬液，将其稀释100倍后转移至6cm培养皿中，每孔3mL，继续培养12h，当细胞贴壁并且状态良好后，弃去旧培养基，重新加入3mL预先配制好的含有特定浓度化合物的新鲜培养基，在培养箱中继续培养60h后对细胞进行处理，弃去旧培养基，分别加入1mL PBS后用细胞刮使细胞脱落并收集细胞悬液于离心管中，将其8000r/min离心5min后弃去上清，往离心管中重新加入1mL PBS重悬清洗细胞，8000r/min离心5min后弃去上清，拍照记录细胞沉淀颜色后往其中加入150μL1mol/L NaOH裂解(含10％DMSO)，重悬细胞沉淀后置于金属浴中95℃高温加热30min，每隔10min重悬细胞沉淀一次，以保证细胞充分裂解，待细胞裂解液冷却至室温，首先用Bradford试剂盒测定蛋白浓度的大小并用NaOH裂解液将对照组与处理组的蛋白浓度调至一样，而后转移等量的细胞裂解液至96孔板内，在酶标仪内测定405nm处的吸光值，值的大小与黑色素含量成正比。

由图8Ⅰ-A、Ⅱ-A可知，实验组细胞黑色素积累少于对照组。测定各浓度化合物作用后的细胞黑色素含量，如图8Ⅰ-B、Ⅱ-B所示，化合物处理后黑色素含量均有所下降，当乙基麦芽酚浓度为200μmol/L时，黑色素含量为对照组的61.19％，当KAD4浓度为100μmol/L，黑色素含量为对照组的58.76％。图8中，Ⅰ、Ⅱ分别代表乙基麦芽酚、KAD4。A为细胞沉淀表观图；B为不同浓度化合物作用下黑色素含量变化。化合物处理后细胞内黑色素含量均有所下降。*P<0.05，与对照组相比。

实施例六：吡喃酮类化合物对B16F10细胞内TYR活力的影响

分别设置以下化合物浓度作用于细胞60h(乙基麦芽酚：0、100、150、200μmol/L；KAD4：0、10、20、40、80、100μmol/L)。细胞培养、加药和收集方式如上述，往细胞沉淀中各加入200μL 1％Triton裂解液(含1mmol/LPMSF)重悬细胞，放置于-80℃冰箱内反复冻融3次后，8000r/min、4℃离心15min，取上清用于测定TYR活性，测定活性前，首先测定蛋白浓度的大小并用1％Triton裂解液将对照组与处理组的蛋白浓度调至一样。而后将细胞裂解液与1mg/mL L-dopa溶液以1：1的比例加入到96孔板中，震荡均匀后避光孵育30min，然后在酶标仪内测定475nm处的吸光值，值的大小与酶催化活力成正比。

如图9所示，随着化合物浓度升高，细胞内TYR活性均逐渐下降，当乙基麦芽酚浓度为200μmol/L时，酶活力为对照组的77.64％，当KAD4浓度为100μmol/L时，酶活力为对照组的49.37％。两种化合物均能抑制细胞内TYR活力，KAD4的抑制效果优于乙基麦芽酚。图9中，Ⅰ、Ⅱ分别代表乙基麦芽酚、KAD4。化合物处理后细胞内TYR活性均逐渐下降。*P<0.05，与对照组相比。

实施例七：化合物对斑马鱼胚胎黑色素合成的影响

斑马鱼的配鱼与收卵：

斑马鱼是一种需要光周期调控并且在早晨产卵的鱼类，营养充足时，成熟雌鱼可以每周产卵一次，每次平均产卵200枚。配鱼时间最好在喂完晚餐30min后，配鱼专用缸分为外缸和内胆两个部分，内胆底部有很多小孔方便卵漏下避免斑马鱼误食，每缸按照雌：雄为1：1或2：1放置总数不超过8条的成鱼，然后用隔板将雌雄鱼隔开，放入约三分之二缸的养鱼水^[85]。第二天早晨抽去隔板，会发现雄鱼追逐雌鱼的尾部，大约20min后即可收集鱼卵置于培养皿中，挑取透明的鱼卵分装于六孔板内，每个孔内放置40个斑马鱼卵，每个孔内加入3mL胚胎培养液并转移至28.5℃培养箱中进行培养，维持培养箱内一定的湿度并且昼夜节律为12h/12h。

斑马鱼黑色素含量的测定：

按照上述方法将鱼卵分装于6孔板培养24h后，检查六孔板内是否有未受精或者死亡的斑马鱼卵，如有发现及时清除并补充。然后弃去旧胚胎培养液，各加入3mL预先配制好的含有特定药物浓度的胚胎培养液进行培养，作用于斑马鱼胚胎的化合物浓度如下：乙基麦芽酚：0、500、1000、1500、2000μmol/L；KAD4：0、100、200、300、400μmol/L。每12h更换一次含药物的培养液，持续培养60h后，用体式镜对斑马鱼的形态颜色进行拍照记录，然后用培养液清洗斑马鱼并将斑马鱼收集至离心管中，收集完毕后放置于-80℃冰箱内使其失去活动能力，室温解冻后，5000r/min离心5min沉淀鱼体，弃去上清，留下鱼体，往管内各加入150μL NaOH裂解液(含10％DMSO)，在超声仪内超声破碎1min辅助鱼体裂解后金属浴95℃高温裂解30min，裂解期间每10min震荡重悬一次，以保证充分裂解，裂解完毕并冷却至室温后，首先用Bradford试剂盒测定蛋白浓度的大小并用NaOH裂解液将对照组与实验组的蛋白浓度调至一样，而后转移等量的鱼体裂解液至96孔板内，在酶标仪内测定405nm处的吸光值，值的大小与黑色素含量成正比。

如图10所示，加药组与对照组相比，乙基麦芽酚与KAD4处理组斑马鱼的背部和卵黄囊处的黑色素沉积都有一定程度的减少，曲酸处理组没有明显变化。将各浓度组斑马鱼卵黄囊区段部分的颜色深度用Image J软件进行定量分析，如图11所示，乙基麦芽酚与KAD4处理组斑马鱼卵黄囊区段部分黑色素含量均低于对照组，阳性对照组400μmol/L曲酸基本上没有抑制作用，当三种化合物作用浓度均为400μmol/L时，KAD4对斑马鱼黑色素沉积的抑制效果最好。图10中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别代表乙基麦芽酚、KAD4、曲酸。加药组与对照组相比，乙基麦芽酚与KAD4处理组斑马鱼的背部和卵黄囊处的黑色素沉积都有一定程度的减少，曲酸处理组没有明显变化。图11中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别代表乙基麦芽酚、KAD4、曲酸。乙基麦芽酚与KAD4处理组斑马鱼卵黄囊区段部分黑色素含量均低于对照组，阳性对照组400μmol/L曲酸基本上没有抑制作用。

实施例八：抗氧化实验

本实施例测试两种吡喃酮类化合物的抗氧化能力。本发明采用DPPH法和ABTS+法两种方法来探究两种化合物的体外抗氧化能力，DPPH是一种稳定自由基，在517nm处有强吸收峰。ABTS+在735nm处有强吸收峰，以上两者与化合物反应时吸光值下降的速率可以有效反应化合物抗氧化能力的强弱。分别用DMSO和水配制KAD4与乙基麦芽酚母液。具体实验操作如下，DPPH法:首先用95％的甲醇调节DPPH工作母液的浓度，使其在517nm处的吸光值在0.7-0.8之间，调节完毕后，往96孔板内各加入10μL不同浓度的化合物，然后各加入190μL调节好浓度的DPPH溶液，加液完毕后，将96孔板放入酶标仪内震荡均匀后避光反应6min，最后测定各孔在517nm处的吸光值。ABTS+法：首先用80％的乙醇调节DPPH工作母液的浓度，使其在734nm处的吸光值在0.7-0.8之间，往96孔板内各加入10μL不同浓度的化合物，然后各加入190μL调节好浓度的DPPH溶液，加液完毕后，将96孔板放入酶标仪内震荡均匀后避光反应30min，最后测定各孔在734nm处的吸光值。依据吸光值即可计算出化合物的抗氧化能力，计算公式如下：

抗氧化能力(％)＝(1-A₁/A₀)×100

式中，A₀：对照组的吸光值，A₁：实验组的吸光度。每组设计三个平行。

如12所示，两种方法均证明两种化合物具有抗氧化能力，并且KAD4的抗氧化能力优于乙基麦芽酚，图12Ⅰ-A、Ⅱ-A分别为乙基麦芽酚与KAD4用ABTS+法测定的结果，抗氧化效应的IC₅₀分别为3.4mmol/L、146.7μmol/L，图12Ⅰ-B、Ⅱ-B分别为乙基麦芽酚与KAD4用DPPH法测定的结果，抗氧化效应的IC₅₀分别为3.7mmol/L、50.5μmol/L。此结果汇总于下表。图12中，Ⅰ、Ⅱ分别代表乙基麦芽酚、KAD4。A、B分别代表ABTS+、DPPH检测的结果。两种方法均证明两种化合物具有抗氧化能力。*P<0.05，与对照组相比。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。