一种鼠李糖脂复合表面活性剂的制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种鼠李糖脂复合表面活性剂的制备方法和应用 (Preparation method and application of rhamnolipid composite surfactant ) 是由 李泽勇 李秋如 吴海龙 刘康 于 2021-08-09 设计创作，主要内容包括：本发明属于表面活性剂技术领域,公开了一种鼠李糖脂复合表面活性剂的制备方法和应用。所述制备方法包括：往发酵完成的鼠李糖脂发酵液中加入溶菌酶,在温度为45～50℃,pH为5～7的条件下搅拌反应,所得发酵液冷却至室温,然后加入APG搅拌洗涤,再加入聚合氯化铝进行絮凝沉淀,离心,取上清液浓缩干燥,得到鼠李糖脂-APG复合表面活性剂。本发明的制备方法采用溶菌酶处理发酵液,配合采用APG进行洗涤,可以显著提高鼠李糖脂的得率；并采用聚合氯化铝对溶菌处理后的发酵液进行絮凝沉淀,提高产物纯度。所得产物具有良好的表面活性,应用于日化洗涤用品中具有天然、环保、无刺激、生物可降解的优势。(The invention belongs to the technical field of surfactants, and discloses a preparation method and application of a rhamnolipid composite surfactant. The preparation method comprises the following steps: and adding lysozyme into the rhamnolipid fermentation liquor after fermentation is finished, stirring and reacting under the conditions that the temperature is 45-50 ℃ and the pH value is 5-7, cooling the obtained fermentation liquor to room temperature, adding APG (ammonium polyphosphate G), stirring and washing, adding polyaluminium chloride for flocculation precipitation, centrifuging, taking supernate, concentrating and drying to obtain the rhamnolipid-APG composite surfactant. The preparation method adopts lysozyme to treat fermentation liquor, and is matched with APG for washing, so that the yield of rhamnolipid can be obviously improved; and the polyaluminium chloride is adopted to carry out flocculation precipitation on the fermentation liquor after the bacteriolysis treatment, thereby improving the purity of the product. The obtained product has good surface activity, and has the advantages of naturalness, environmental protection, no irritation and biodegradability when being applied to daily chemical washing products.)
技术领域
本发明属于表面活性剂技术领域，具体涉及一种鼠李糖脂复合表面活性剂的制备方法和应用。
背景技术
鼠李糖脂是一种研究时间最长、应用技术最为成熟的一种生物表面活性剂。其主要由假单胞菌或伯克氏菌类或其他合适的微生物通过发酵而生产。然而，必须进一步处理所得发酵混合物或“发酵液”以分离/纯化鼠李糖脂。鼠李糖脂产生菌的发酵液成分复杂，其他发酵液成分包括不完全反应的进料底物，例如甘油三酯、甘油二酯和甘油单酯，还有脂肪酸，以及细胞成分和糖等。从发酵液中提取鼠李糖脂的成本高、难度较大。高回收和纯化成本是鼠李糖脂的大规模商业化所要克服的主要障碍。目前，从发酵液中提取鼠李糖脂的方法主要为氯仿-甲醇萃取法、硅胶柱层析法等。然而上述方法存在使用有毒溶剂和成本高的问题。
专利CN 107405537 A公开了一种从发酵液分离鼠李糖脂的方法，包括：(a)将惰性吸附载体与鼠李糖脂混合物混合；(b)在高于31℃的温度和高于73巴的压力下将混合物溶解在有机溶剂中；(c)分离至少一种脂肪化合物；(d)向所述有机溶剂中加入共溶剂；(e)改变温度和/或压力；(f)分离第一鼠李糖脂化合物；和(g)分离第二鼠李糖脂化合物。该专利主要采用吸附载体进行吸附，并使用超临界CO2的脱水/脱脂以及用超临界CO2和渐增比例的助溶剂除去单和二鼠李糖脂化合物的分级步骤。工艺控制难度较大，成本较高。
专利CN 108191930 A公开了一种提取发酵液中鼠李糖脂产物的方法，包括：1)预处理：加热发酵液、冷却后离心除去菌体、变性蛋白等不溶物；2)絮凝与浓缩：上清液中加入适量壳聚糖，搅拌混匀，在适宜温度下自然沉降，弃掉上层液相；3)洗脱：蒸馏水清洗去除沉淀物中残余发酵液后，加入适宜浓度的NaHCO3溶液，洗脱沉淀物中的鼠李糖脂，收集洗脱液；4)获取：调节洗脱液pH、静置沉淀、离心，获得鼠李糖脂产物。该专利技术采用壳聚糖絮凝沉降鼠李糖脂产物，然后采用NaHCO3水溶液洗脱，酸溶液沉淀，得到鼠李糖脂产物。然而在实际操作中，采用壳聚糖絮凝沉降鼠李糖脂产物存在产物纯度和得率较低的问题。
专利CN 112225763 A公开了一种鼠李糖脂的分离纯化方法，包括：制备氧化石墨烯；对所述氧化石墨烯进行阳离子修饰，得到阳离子修饰氧化石墨烯；将所述阳离子修饰氧化石墨烯加入发酵液中进行吸附，得到鼠李糖脂吸附量。该专利技术采用阳离子修饰氧化石墨烯吸附鼠李糖脂，存在制备成本高，得率低的问题。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种鼠李糖脂复合表面活性剂的制备方法。本发明的制备方法采用溶菌酶处理发酵液，配合采用烷基糖苷(APG)进行洗涤，可以显著提高鼠李糖脂的得率；并采用聚合氯化铝对溶菌处理后的发酵液进行絮凝沉淀，去除固体份及溶菌处理后的细胞及蛋白，降低不利杂质成分。所得鼠李糖脂和APG的复合表面活性剂具有良好的表面活性和生物可降解性。
本发明的另一目的在于提供上述方法制备得到的复合表面活性剂在日化洗涤用品中的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种鼠李糖脂复合表面活性剂的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)往发酵完成的鼠李糖脂发酵液中加入溶菌酶，在温度为45～50℃，pH为5～7的条件下搅拌反应；
(2)将步骤(1)溶菌处理后的发酵液冷却至室温，然后加入APG搅拌洗涤；
(3)往步骤(2)洗涤后的发酵液中加入聚合氯化铝进行絮凝沉淀，离心，取上清液浓缩干燥，得到鼠李糖脂-APG复合表面活性剂。
进一步地，步骤(1)中所述鼠李糖脂发酵液是指以铜绿假单胞菌(Aeruginosa)为生产菌株经发酵培养基培养所得发酵液；发酵液(离心去除菌体后的发酵液)中鼠李糖脂含量为5～70g/L。
进一步优选地，所述发酵培养基包括碳源、氮源和无机盐；所述碳源包括大豆油、棕榈油、花生油、甘油、葡萄糖、糖蜜中的至少一种，所述氮源包括酵母粉、蛋白胨、硝酸盐、铵盐中的至少一种，所述无机盐包括钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的至少一种。
进一步地，步骤(1)中所述溶菌酶的加入量为鼠李糖脂发酵液质量的0.02％～0.08％。
进一步地，步骤(1)中所述搅拌反应的时间为1～4h。
进一步地，步骤(2)中所述APG的加入量为溶菌处理后的发酵液质量的0.5％～5％。
进一步地，步骤(3)中所述聚合氯化铝的加入量为洗涤后的发酵液质量的0.1～0.5％。经验证本发明聚合氯化铝的加入量对所得产物的得率及纯度影响显著。在低于0.1％的加入量条件下，絮凝沉淀效果不佳，产物纯度降低；在高于0.5％的加入量条件下，部分鼠李糖脂及APG也会被絮凝沉淀，产物得率降低。
进一步地，步骤(3)中所述絮凝沉淀在pH为5～7的条件下进行。经验证本发明絮凝沉淀的pH条件对所得产物的得率及纯度影响显著。在pH低于5的酸性条件下，絮凝沉淀效果不佳，产物纯度降低；在pH高于7的碱性条件下，部分鼠李糖脂及APG也会被絮凝沉淀，产物得率降低。
进一步地，步骤(3)中所述上清液在浓缩干燥前先经有机溶剂洗涤除杂。优选地，所述有机溶剂为环己烷和乙酸乙酯的混合。通过有机溶剂洗涤可进一步萃取除去未絮凝沉淀的甘油酯及脂肪酸等亲油性成分，降低对所得复合表面活性剂起泡性能的不利影响。
上述方法制备得到的复合表面活性剂在日化洗涤用品中的应用。
进一步地，所述日化洗涤用品包括洗发香波、沐浴露、洗面奶、洗衣液、洗衣粉、洗手液、洗洁精、皂粉或香皂。
本发明原理为：首先通过溶菌酶处理鼠李糖脂发酵液，使菌体内的鼠李糖脂进一步溶出，然后加入APG搅拌洗涤，APG具有与鼠李糖脂类似的分子结构，且在水中溶解度大，可进一步促进鼠李糖脂的脱附并进入水相溶解，上述两方面可显著提高鼠李糖脂的得率。由于溶菌酶的处理会造成菌体分解为小颗粒悬浮物、蛋白胶体成分以及少量溶解性物质(包括无机盐)，上述物质通过简单离心处理难以分离去除，本发明则通过加入聚合氯化铝进行絮凝沉淀，通过调节聚合氯化铝的加入量及絮凝沉淀的pH条件，可以实现对悬浮物、蛋白胶体及无机盐成分的优先选择性吸附，而对高水溶性的鼠李糖脂和APG成分影响较小，再通过离心分离，即可实现鼠李糖脂和APG复合成分的分离纯化。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明的制备方法在不使用或减少有机溶剂使用的情况下，可以达到相当甚至更高的鼠李糖脂的得率及纯度。
(2)本发明所得产物为鼠李糖脂与APG的复合物泡沫丰富细腻、配伍性强、无毒、无害、对皮肤无刺激，生物降解迅速彻底，可以直接应用于日化洗涤用品中，且相比单纯的鼠李糖脂成分具有更好的起泡性能(起泡力、起泡稳定性和泡沫细腻度)。
(3)本发明采用溶菌酶处理发酵液，配合采用烷基糖苷(APG)进行洗涤，可以显著提高鼠李糖脂的得率；在后续采用聚合氯化铝对溶菌处理后的发酵液进行絮凝沉淀的过程中，虽然会吸附少量鼠李糖脂造成得率降低，但整体得率与现有技术中采用的离心分离菌体后有机溶剂萃取得率相当或更优。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例中所用鼠李糖脂发酵液是指以铜绿假单胞菌(Aeruginosa)为生产菌株经发酵培养基(大豆油6％，酵母粉0.5％，磷酸二氢钠0.4％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸镁0.03％，氯化钙0.003％，余量为水，pH＝7)连续加料培养所得发酵液；发酵液(离心去除菌体后的发酵液)中鼠李糖脂含量为35.3g/L。
以下实施例中所用APG为市场上商业购买的低聚合度淡黄色油状产品(纯度检测为96.7％)。
实施例1
本实施例的一种鼠李糖脂复合表面活性剂的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)往鼠李糖脂发酵液中加入溶菌酶，调节溶菌酶的加入量分别为鼠李糖脂发酵液质量的0.01％、0.02％、0.04％、0.08％和0.10％，在温度为45～50℃，磷酸调节pH为5.5～6.5的条件下搅拌反应2h。并以未加入溶菌酶的发酵液作为空白对照。
(2)将步骤(1)溶菌处理后的发酵液冷却至室温，然后加入APG搅拌洗涤，APG的加入量为溶菌处理后的发酵液质量的3.5％。
(3)往步骤(2)洗涤后的发酵液中加入聚合氯化铝进行絮凝沉淀，絮凝沉淀维持体系pH为6左右，聚合氯化铝的加入量为洗涤后的发酵液质量的0.35％，离心，取上清液浓缩干燥至水分含量低于1％，得到棕色粘稠状鼠李糖脂-APG复合表面活性剂。
对本实施例不同溶菌酶加入量条件下所得鼠李糖脂-APG复合表面活性剂的鼠李糖脂得率(最终复合表面活性剂中鼠李糖脂含量与初始发酵液中鼠李糖脂含量的百分比)及所得复合表面活性剂纯度(鼠李糖脂和APG总百分含量)进行检测，结果如下表1所示。
表1
溶菌酶加入量
空白对照
0.01％
0.02％
0.04％
0.08％
0.10％
得率
69.3％
80.6％
85.7％
88.6％
90.8％
91.2％
纯度
90.6％
90.2％
89.7％
88.5％
86.2％
84.3％
通过表1结果可以看出，随着溶菌酶加入量的增加，所得鼠李糖脂得率具有提高趋势，但纯度具有降低趋势。相比不加入溶菌酶的空白对照组，本发明可显著提高鼠李糖脂得率，且纯度较高。在溶菌酶加入量为0.02％～0.08％范围内，鼠李糖脂得率能达到85％以上，所得复合表面活性剂纯度能达到86％以上。
实施例2
本实施例的一种鼠李糖脂复合表面活性剂的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)往鼠李糖脂发酵液中加入溶菌酶，溶菌酶的加入量为鼠李糖脂发酵液质量的0.04％，在温度为45～50℃，磷酸调节pH为5.5～6.5的条件下搅拌反应2h。
(2)将步骤(1)溶菌处理后的发酵液冷却至室温，然后加入APG搅拌洗涤，调节APG的加入量分别为溶菌处理后的发酵液质量的0.5％、1％、2％、3.5％、5％和7.5％。并以未加入APG洗涤的发酵液作为空白对照。
(3)往步骤(2)洗涤后的发酵液中加入聚合氯化铝进行絮凝沉淀，絮凝沉淀维持体系pH为6左右，聚合氯化铝的加入量为洗涤后的发酵液质量的0.35％，离心，取上清液浓缩干燥至水分含量低于1％，得到棕色粘稠状鼠李糖脂-APG复合表面活性剂。
对本实施例不同APG加入量条件下所得鼠李糖脂-APG复合表面活性剂的鼠李糖脂得率(最终复合表面活性剂中鼠李糖脂含量与初始发酵液中鼠李糖脂含量的百分比)及所得复合表面活性剂纯度(鼠李糖脂和APG总百分含量)进行检测，结果如下表2所示。
表2
APG加入量
空白对照
0.5％
1％
2％
3.5％
5％
7.5％
得率
56.6％
81.8％
84.0％
86.9％
89.4％
91.7％
91.2％
纯度
87.3％
87.7％
88.4％
88.0％
87.6％
86.2％
81.4％
由表2结果可见，APG的加入对鼠李糖脂得率影响显著，说明APG的加入可促进鼠李糖脂与菌体或溶菌后蛋白胶体的脱附，且能减少后续絮凝沉淀对鼠李糖脂的吸附，从而提高得率。在一定范围内APG的加入对纯度影响不大，但APG的加入量超过5％后，产物纯度出现明显降低的情况，这有可能是过量的APG会降低絮凝沉淀过程对杂质的吸附，导致产物纯度降低。
实施例3
本实施例的一种鼠李糖脂复合表面活性剂的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)往鼠李糖脂发酵液中加入溶菌酶，溶菌酶的加入量为鼠李糖脂发酵液质量的0.04％，在温度为45～50℃，磷酸调节pH为5.5～6.5的条件下搅拌反应2h。
(2)将步骤(1)溶菌处理后的发酵液冷却至室温，然后加入APG搅拌洗涤，APG的加入量为溶菌处理后的发酵液质量的3.5％。
(3)往步骤(2)洗涤后的发酵液中加入聚合氯化铝进行絮凝沉淀，絮凝沉淀维持体系pH为6左右，分别调节聚合氯化铝的加入量为洗涤后的发酵液质量的0.05％、0.1％、0.2％、0.35％、0.5％和0.75％，并以未加入聚合氯化铝的条件作为空白对照，离心，取上清液浓缩干燥至水分含量低于1％，得到棕色粘稠状鼠李糖脂-APG复合表面活性剂。
对本实施例不同聚合氯化铝加入量条件下所得鼠李糖脂-APG复合表面活性剂的鼠李糖脂得率(最终复合表面活性剂中鼠李糖脂含量与初始发酵液中鼠李糖脂含量的百分比)及所得复合表面活性剂纯度(鼠李糖脂和APG总百分含量)进行检测，结果如下表3所示。
表3
聚合氯化铝加入量
空白对照
0.05％
0.1％
0.2％
0.35％
0.5％
0.75％
得率
103.7％
96.2％
94.8％
91.2％
89.0％
81.9％
72.5％
纯度
49.8％
80.5％
85.9％
87.7％
88.2％
89.8％
92.2％
由表3结果可见，在不加入聚合氯化铝进行絮凝沉淀的情况下，经过单纯的离心难以除去溶菌后的杂质成分。本发明通过加入聚合氯化铝进行絮凝沉淀，可以显著提高产物纯度。另外随着聚合氯化铝加入量的提高，鼠李糖脂得率呈现降低的趋势，说明聚合氯化铝对鼠李糖脂产生了一定的吸附作用。但可以看到的是未加入聚合氯化铝的情况下鼠李糖脂得率超过了100％，说明本发明前期溶菌酶处理及APG洗涤的过程使得处理后的发酵液中鼠李糖脂含量相比未处理的初始发酵液(离心去除菌体后的发酵液)中测定值有明显提高，而这种提高可以弥补聚合氯化铝对鼠李糖脂得率的降低作用，使得在一定聚合氯化铝添加量(0.1％～0.5％)情况下，鼠李糖脂得率保持在80％以上，产物纯度保持在85％以上。
实施例4
本实施例的一种鼠李糖脂复合表面活性剂的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)往鼠李糖脂发酵液中加入溶菌酶，溶菌酶的加入量为鼠李糖脂发酵液质量的0.04％，在温度为45～50℃，磷酸调节pH为5.5～6.5的条件下搅拌反应2h。
(2)将步骤(1)溶菌处理后的发酵液冷却至室温，然后加入APG搅拌洗涤，APG的加入量为溶菌处理后的发酵液质量的3.5％。
(3)往步骤(2)洗涤后的发酵液中加入聚合氯化铝进行絮凝沉淀，絮凝沉淀过程分别调节体系pH为4、5、6、7、8、9，聚合氯化铝的加入量为洗涤后的发酵液质量的0.35％，离心，取上清液浓缩干燥至水分含量低于1％，得到棕色粘稠状鼠李糖脂-APG复合表面活性剂。
对本实施例不同絮凝沉淀pH值条件下所得鼠李糖脂-APG复合表面活性剂的鼠李糖脂得率(最终复合表面活性剂中鼠李糖脂含量与初始发酵液中鼠李糖脂含量的百分比)及所得复合表面活性剂纯度(鼠李糖脂和APG总百分含量)进行检测，结果如下表4所示。
表4
絮凝沉淀pH
4
5
6
7
8
9
得率
92.8％
90.7％
88.6％
84.5％
71.5％
23.8％
纯度
62.9％
85.7％
87.8％
89.3％
92.3％
93.8％
通过表4结果可以看出，絮凝沉淀pH值条件对鼠李糖脂得率及产物纯度影响显著，pH值低于5的酸性条件下，絮凝效果不佳，部分杂质无法有效去除，产物纯度低；而pH值高于7的碱性条件下，鼠李糖脂得率显著降低，说明碱性条件会造成鼠李糖脂的吸附絮凝损失，得率降低。
实施例5
本实施例的一种鼠李糖脂复合表面活性剂的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)往鼠李糖脂发酵液中加入溶菌酶，溶菌酶的加入量为鼠李糖脂发酵液质量的0.04％，在温度为45～50℃，磷酸调节pH为5.5～6.5的条件下搅拌反应2h。
(2)将步骤(1)溶菌处理后的发酵液冷却至室温，然后加入APG搅拌洗涤，APG的加入量为溶菌处理后的发酵液质量的3.5％。
(3)往步骤(2)洗涤后的发酵液中加入聚合氯化铝进行絮凝沉淀，絮凝沉淀维持体系pH为6左右，聚合氯化铝的加入量为洗涤后的发酵液质量的0.35％，离心，取上清液加入1倍体积的环己烷和乙酸乙酯混合溶剂(环己烷:乙酸乙酯体积比为7:3)搅拌洗涤。静置分层后取水相浓缩干燥至水分含量低于1％，得到棕色粘稠状鼠李糖脂-APG复合表面活性剂。
本实施例所得鼠李糖脂-APG复合表面活性剂的鼠李糖脂得率为88.2％，复合表面活性剂纯度为94.2％，相比实施例1中同等条件下的鼠李糖脂得率影响不大，纯度有一定程度提高。对所得复合表面活性剂进行起泡性能(起泡力、起泡稳定性和泡沫细腻度)测试。测试方法为配置质量浓度为1％的水溶液，移取50mL试液于透明玻璃长管中，盖好塞子，用力上下摇动玻璃管10次，产生泡沫后用尺子测量泡沫高度并记录结果，观察泡沫大小，然后静置记录泡沫至完全消失的时间，平行测定3组取平均值，并以纯鼠李糖脂作为对比，测试结果如下表5所示。
表5
起泡性能
泡沫高度
泡沫消失时间
泡沫大小
实施例5
26cm
43min
细小泡沫
实施例1
21cm
35min
细小泡沫
纯鼠李糖脂
16cm
26min
较粗泡沫
由表5结果可见，本发明通过进一步采用环己烷和乙酸乙酯混合溶剂洗涤絮凝沉淀后的清液，可以进一步降低影响起泡性能的杂质含量，起泡力和起泡稳定性得到一定程度的提升。且本发明所得鼠李糖脂-APG复合表面活性剂相比单纯的鼠李糖脂，具有更好的起泡性能。同时APG也属于绿色环保可降解的表面活性剂，应用于日化洗涤用品中仍具有天然、环保、无刺激、生物可降解的优势。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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