一种提高酶促反应过程中脂肪酶使用效率的方法
阅读说明：本技术 一种提高酶促反应过程中脂肪酶使用效率的方法 (Method for improving lipase use efficiency in enzymatic reaction process ) 是由 王小三 黄卓能 陈烨 江聪 黄雅祺 王笑寒 于 2021-08-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高酶促反应过程中脂肪酶使用效率的方法,属于食品加工技术领域。本发明利用蒸馏法或吸附法来降低酶法合成结构脂所需原料的过氧化值后,再和脂肪酶发生催化反应合成结构脂,由此维持脂肪酶活性,增加酶的重复利用率,其中,蒸馏法包括脱臭、分子蒸馏中的一种或两种。本发明提供了一种高效率、低成本酶法合成结构脂方法,避免了传统工业化生产中酶法合成结构脂过程酶消耗大、酶成本昂贵且酶利用效率低等弊端,具有一定发展潜力和实际意义。(The invention discloses a method for improving the use efficiency of lipase in an enzymatic reaction process, and belongs to the technical field of food processing. The invention utilizes a distillation method or an adsorption method to reduce the peroxide value of raw materials required by enzymatic synthesis of structural lipid, and then the raw materials and lipase are subjected to catalytic reaction to synthesize the structural lipid, thereby maintaining the activity of the lipase and increasing the recycling rate of the enzyme, wherein the distillation method comprises one or two of deodorization and molecular distillation. The invention provides a method for synthesizing structural lipid by an enzyme method with high efficiency and low cost, which avoids the defects of large enzyme consumption, high enzyme cost, low enzyme utilization efficiency and the like in the process of synthesizing structural lipid by the enzyme method in the traditional industrial production and has certain development potential and practical significance.)
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种提高酶促反应过程中脂肪酶使用效率的方法。
背景技术
脂肪是人体所必需的营养素，并且广泛存在于众多食品中。脂肪中含量最高的成分为甘油三酯(Triacylglycerols)，由甘油和不同的脂肪酸酯化而成。近年来，研究者对中碳链脂肪酸甘油三酯和长碳链脂肪酸甘油三酯做了许多研究，为综合各自的优点，结构脂随即出现。当前研究较为火热的结构脂包括人乳替代脂、代可可脂、中长碳链脂肪酸结构脂和含多不饱和脂肪酸的甘油三酯等。人乳替代脂如OPO、OPL等加入到婴幼儿配方奶粉中能有效模拟人乳脂的组成，有利于婴幼儿对脂质的吸收，更好的维持婴幼儿体内矿物质含量的平衡，减少便秘。代可可脂同样是一类需求量较大的结构脂质，能缓解可可脂原料的资源紧张。而中长碳链脂肪酸结构脂同时综合了中碳链脂肪酸甘油三酯代谢较快、供能快和长碳链脂肪酸甘油三酯的营养高的优点，对人体益处极大。含多不饱和脂肪酸的甘油三酯则能有效提供人体必需脂肪酸，具有降血脂的作用。
目前在工业化生产中合成结构脂使用最为广泛的方法是酶法合成法，与传统的无机或有机催化合成方法相比，脂肪酶催化结构脂合成具有条件温和、催化效率高、副产物少和选择性高的优点，但脂肪酶也一直存在着价格高昂的问题，一些固定化脂肪酶如Novozym435、Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM在人乳脂替代品的加工生产中应用较为频率，但这些酶价格普遍都很昂贵，人们一直在寻找重复利用脂肪酶的方法，来提高酶的利用率，降低成本，如采用电场法、有机溶剂和混合油脂浸泡法来处理，但是这些方法不利于连续化生产，每使用一次酶就要进行一次处理，操作繁琐、不环保且效率低。
发明内容
【技术问题】
现有合成结构脂时所用到的脂肪酶成本高、重复利用率低。
【技术方案】
为了解决上述问题，本发明利用降低合成结构脂所需原料的过氧化值更好的保留了脂肪酶的活性，增加酶的重复利用次数，为工业化生产提供了高效、低成本的结构脂酶法合成方法，具有一定现实意义。
具体的，本发明提供了如下技术方案：一种提高酶促反应过程中脂肪酶使用效率的方法，合成结构脂所用底物经过降过氧化值处理后，再和脂肪酶发生催化反应合成结构脂，其中，所述降过氧化值的方法包括蒸馏法和吸附法中的一种或两种。
优选的，所述蒸馏法包括脱臭、分子蒸馏中的一种或两种。
优选的，所述脱臭温度为220℃～270℃，优选240℃～270℃。
优选的，所述脱臭时间为30min～150min，操作压力小于8mbar。
优选的，所述分子蒸馏的蒸发面温度为200～290℃，优选为220～250℃，操作压力小于10mbar。
优选的，所述吸附法使用的吸附剂包括硅胶、活性白土、活性炭、二氧化硅、沸石、硅藻土和凹凸棒土中的一种或几种，更优选硅胶、活性炭、二氧化硅。
优选的，所述吸附剂的添加量为底物质量的0.5％～6％，优选为1％～3％。
优选的，所述吸附法的吸附时间为60min以下，优选为30min以下。
优选的，所述脂肪酶包括用于催化水解反应、催化酯交换反应或催化酯化反应的脂肪酶的任一种。
优选的，所述用于催化水解反应的脂肪酶包括但不限于来源于柱状假丝酵母(Candida cylindracea)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、米根霉(Rhizopusoryzea)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)的脂肪酶中的任一种或几种。
优选的，所述用于催化酯交换反应的脂肪酶包括但不限于以南极假丝酵母(Candida antarctica)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米根霉(Rhizopus oryzea)、米黑根毛霉菌(Rhizomucor miehei)为来源的脂肪酶中的任一种或几种。
优选的，所述用于催化酯化反应脂肪酶包括但不限于以米黑根毛霉菌(Rhizomucor miehei)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、洋葱伯克霍尔德菌(Burholderia cepacia)、南极假丝酵母(Candida antarctica)、米根霉(Rhizopusoryzea)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、黑曲霉(Asperigillus niger)为来源的脂肪酶中的任一种或几种。
优选的，所述催化反应的条件可根据现有技术公开的催化反应条件一致。
优选的，所述酯交换反应和水解反应的底物包括油脂或其分提物。
优选的，所述底物包括植物油脂、动物油脂、微生物油脂的任一种或几种。
优选的，所述植物油脂包括但不限于大豆油、花生油、蓖麻油、葵花籽油、橄榄油、椰子油、亚麻籽油、棕榈油或其分提物、棕榈仁油和菜籽油等的一种或几种。
优选的，所述动物油脂包括但不限于猪油、鱼油、鸡油、牛油、鸭油等的一种或几种。
优选的，所述微生物油脂包括但不限于富含ARA的油脂、富含DHA的油脂的任一种或几种。
优选的，所述酯化反应的底物为酰基供体，包括但不限于油酸、亚油酸、中链脂肪酸等游离脂肪酸。
优选的，所述催化酯交换反应包括酸解反应、醇解反应及酯酯交换反应。
优选的，所述结构脂包括但不限于人乳替代脂、甘油二酯、代可可脂、中长碳链脂肪酸结构脂和含多不饱和脂肪酸的甘油三酯等。
本发明还提供了上述方法在结构脂制备领域、食品领域中的应用。
本发明的有益效果：
本发明对酶法合成结构脂所需的原料进行降过氧化值处理，进而能更好的保留酶法合成结构脂过程中脂肪酶的活性，可有效增加酶的重复利用次数，提高脂肪酶的利用率，能够有效解决工业化生产过程中脂肪酶成本高、利用率低的问题，具有重大的意义。
附图说明
图1为本发明原料降过氧化值处理前后的脂肪酶的重复利用次数，其中，a为对比例1的条件下酶的重复利用次数，b为实施例1的条件下酶的重复利用次数。
图2为本发明原料降过氧化值处理前后的脂肪酶在醇解反应中使用10次后得到的2-甘油一酯的液相色谱图(示差检测器)，其中，a为对比例2条件下醇解粗产物的液相色谱图，b为实施例2中脱臭条件下醇解粗产物的液相色谱图。
图3为本发明原料降过氧化值处理前后所用的脂肪酶在水解反应中使用10次后得到的甘油二酯的液相色谱图(示差检测器)，其中，a为对比例3条件下水解粗产物的液相色谱图，b为实施例4中吸附条件下水解粗产物的液相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
1.结构脂分析方法：
①HPLC-ELSD检测的操作方法和参数：参考高亮等(高亮,余旭伟,邹凤,等.酶法合成1-油酸-2-棕榈酸-3-亚油酸甘油三酯结构脂的研究[J].中国油脂,2020,45(08):66-70.)的方法，采用反相高效液相色谱仪(RP-HPLC)配备蒸发光检测器来检测分析样品油中TAG组成。取样品20mg，溶于1.0mL色谱级正己烷中，经膜过滤后置于高效液相色谱仪中进行分析。高效液相色谱条件：Lichrospher C18色谱柱(250mm×4.6mm×5μm)；蒸发光检测器温度55℃；空气流速设定为1.8mL/min，增益值为1；洗脱流速为0.8mL/min；进样浓度20mg/mL，进样量20μL。
高效液相色谱程序：流动相洗脱程序如表1所示，结合峰面积归一化法进行定量分析。
表1高效液相色谱流动相洗脱程序
②HPLC-RID分析的操作方法和参数：参考Wang等(Wang W F,Li,T,Qin,X L,etal.Production of lipase SMG1 and its application in synthesizingdiacylglyecrol[J].Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic,2012,77(6):87-91.)的方法，利用HPLC-RID对反应后体系中的脂质成分进行定量分析。色谱条件为：色谱柱Sepax HP-Silica(4.6mm×250mm×5μm)，柱温30℃；样品浓度为10mg/mL，进样量为15μL；流动相正己烷：异丙醇：甲酸之比为15:1:0.03(v/v/v)，流速为1mL/min。各脂质组分通过标准品定性，样品浓度与峰面积呈线性关系，各物质的相对组成通过面积归一法表示(％)
2.过氧化值分析方法：参照《GB 5009.227-2016食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》的方法测定过氧化值。
3.酶活性的判定：以产物中C52甘油三酯含量(或甘油二酯结构脂含量、甘油一酯结构脂含量)为纵坐标，酶剩余80％活性即为80％×第一次酶法反应得到的C52甘油三酯含量(或甘油二酯结构脂含量、甘油一酯结构脂含量)。
实施例1：(酯交换——酸解反应制备OPO)
降过氧化值处理：将过氧化值为7.4mmol/kg的棕榈硬脂(即棕榈油分提物)原料进行降过氧化值处理，处理方法见表2。
酯交换合成结构脂：取经降过氧化值处理后的棕榈硬脂与油酸(摩尔比1:10)混合于25mL反应釜中，当反应底物溶解并稳定时，加入原料体系总质量10％的Lipozyme RM(以米黑根毛霉菌Rhizomucor miehei为来源)，在60℃下反应6h。反应结束后，在4000r/min的转速下离心3min，回收该脂肪酶，并去除游离脂肪酸，得到含量丰富的C52结构脂，使用HPLC-ELSD检测C52甘油三酯含量，即第一次酶法反应得到的C52甘油三酯含量。将回收后的脂肪酶加入下一次结构脂酶法合成反应中，条件与第一次反应一致，经过一定次数的重复使用后，酶剩余80％活性，停止使用，并计算酶的重复使用次数。
探究不同的降过氧化值处理方法及各方法下不同的条件对酶重复利用次数的影响：分别使用分子蒸馏、脱臭和吸附的方法对原料进行处理，采用控制变量法，分别测得各方法条件下酶的重复利用次数，见表2。其对照组使用的是初始过氧化值相同的原料，不进行任何降过氧化值处理。
表2实施例1中的酶在酸解反应中的重复利用次数(反应底物经或不经降过氧化值处理)
从表2中可知，使用蒸馏和吸附方法均能有效提高酶重复利用次数，增加酶的利用率，并且吸附方法带来的效果最为显著，尤其是使用硅胶和活性炭吸附。
实施例2：(酯交换——醇解反应制备2-甘油一酯)
降过氧化值处理：将过氧化值为8.2mmol/kg的高油酸葵花籽油原料进行降过氧化值处理(见表3)。
酯交换合成结构脂：取处理后的高油酸葵花籽油与乙醇(摩尔比1:60)混合于25mL反应釜中，当反应底物溶解并稳定时，加入原料体系总质量10％的Lipozyme TL IM(以疏棉状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus为来源)，在30℃下反应5h。反应结束后，在4000r/min的转速下离心3min，回收该脂肪酶，并去除游离脂肪酸，得到一定量的2-甘油一酯(2-MAG)，使用HPLC-RID检测2-MAG含量，即第一次酶法反应得到的2-MAG含量。将回收后的脂肪酶加入下一次结构脂酶法合成反应中，条件与第一次反应一致，经过一定次数的重复使用后，酶剩余80％活性，停止使用，并计算酶的重复使用次数。各个条件下酶重复利用次数见表3。
表3实施例2中的酶在醇解反应中的重复利用次数(反应底物经或不经降过氧化值处理)
实施例3：(酯化反应——制备甘油三酯)
降过氧化值处理：将过氧化值为7.8mmol/kg的油酸进行降过氧化值处理(见表4)。
酯化合成结构脂：取处理后的油酸和甘油(摩尔比3:1)，加入体系质量10％的Lipozyme435脂肪酶(以南极假丝酵母Candida antarctica为来源)合成结构脂，体系反应温度55℃，反应时间为6h。反应结束后回收本步骤使用的脂肪酶，得到含量丰富的三油酸甘油三酯(OOO)结构脂，使用HPLC-ELSD检测OOO含量，即第一次酶法反应得到的OOO含量。将回收后的脂肪酶加入下一次结构脂酶法合成反应中，条件与第一次反应一致，经过一定次数的重复使用后，酶剩余80％活性，停止使用，并计算酶的重复使用次数。各个条件下酶重复利用次数见表4。
表4实施例3中的酶在酯化反应中的重复利用次数(反应底物经或不经降过氧化值处理)
实施例4：(水解反应——制备甘油二酯)
降过氧化值处理：将过氧化值为9.3mmol/kg的大豆油原料进行降过氧化值处理(见表5)。
水解生成结构脂：取处理后的大豆油原料和水(油水质量比1:1)反应，加入10％的Lipase DF IM脂肪酶(以米根霉Rhizopus oryzae为来源)，反应在搅拌的条件下进行，反应温度控制为35℃，水解时间1h。反应结束后8000r/min离心15min，取上清液得到甘油二酯(DAG)，并回收所用脂肪酶，使用HPLC-RID检测DAG含量，即第一次酶法反应得到的DAG含量。将回收后的脂肪酶加入下一次结构脂酶法合成反应中，条件与第一次反应一致，经过一定次数的重复使用后，酶剩余80％活性，停止使用，并计算酶的重复使用次数。各个条件下酶重复利用次数见表5。
表5实施例4中的酶在水解反应中的重复利用次数(反应底物经或不经降过氧化值处理)
实施例5：(酶的优化)
降过氧化值处理：将过氧化值为7.4mmol/kg的棕榈硬脂原料在4mbar，90min，250℃条件下进行脱臭处理(见表6)。
结构脂合成：取处理后的棕榈硬脂原料与油酸(摩尔比1:10)混合于25mL反应釜中，当反应底物溶解并稳定时，加入原料体系总质量10％的催化酯交换反应的脂肪酶，在60℃下反应6h。反应结束后，在4000r/min的转速下离心3min，回收该脂肪酶，并去除游离脂肪酸，得到含量丰富的C52结构脂，使用HPLC-ELSD检测C52甘油三酯含量，即第一次酶法反应得到的C52甘油三酯含量。将回收后的脂肪酶加入下一次结构脂酶法合成反应中，条件与第一次反应一致，经过一定次数的重复使用后，酶剩余80％活性，停止使用，并计算酶的重复使用次数。
探究不同的脂肪酶对重复利用次数的影响：分别使用不同脂肪酶进行反应，其余条件保持不变，分别测得不同脂肪酶的重复利用次数，对照组为原料未经处理的各种脂肪酶，见表6。
表6实施例5所得参与反应的不同脂肪酶的重复利用次数
对比例1：(与实施例1对比)
与实施例1的不同在于，对比例1使用的是未经降过氧化值处理的原料。酯交换酸解合成结构脂的实验条件与实验步骤同实施例1。
取实施例1中原料在分子蒸馏最佳条件(6mbar，230℃)下处理后所用的酶作对比，如图1所示，图1a为原料未经处理的脂肪酶在酯交换酸解反应中的重复利用次数以及产物的含量，图1b为原料经分子蒸馏处理后的脂肪酶在酯交换酸解反应中的重复利用次数以及产物含量。说明原料的过氧化值降低对酶活性的维持非常有利，一定程度上能增加酶的重复利用次数。
对比例2：(与实施例2对比)
与实施例2的不同在于，对比例2使用的是未经降过氧化值处理的原料。酯交换醇解合成结构脂的实验条件与实验步骤同实施例2。
取实施例2中原料在脱臭最佳条件(4mbar，90min，250℃)下处理后进行醇解反应所回收的酶，将该酶使用10次后得到的2-MAG含量与对比例2的酶使用10次后得到的2-MAG含量作对比，见图2。其中，图2a为原料不经降过氧化值处理反应得到的液相色谱图，图2b为原料经过脱臭处理反应得到的液相色谱图。图2a的2-MAG含量较低为15.27％；图2b的2-MAG含量有21.87％，汇总见表7。说明在酯交换醇解反应中，同一种原料经过降过氧化值处理后，酶活的持续性有显著提升，具体体现在脂肪酶使用10次之后，生成的2-MAG含量比原料不经脱臭处理所用脂肪酶生成的高。
表7原料经脱臭和未经脱臭处理对酯交换粗产物中2-甘油一酯含量的影响
注：酶均已使用10次
对比例3：(与实施例4对比)
与实施例4的不同在于，对比例3使用的是未经降过氧化值处理的原料。水解合成结构脂的实验条件与实验步骤同实施例4。
取实施例4中原料在吸附最佳条件(2％硅胶，室温，20min)下处理后进行水解反应所回收的酶，将该酶使用10次后得到的2-MAG含量与对比例3的酶使用10次后得到的2-MAG含量作对比，见图3。其中，图3a为原料不经降过氧化值处理反应得到的液相色谱图，图3b为原料经过吸附处理反应得到的液相色谱图。图3a的DAG含量为27.74％；图3b的DAG含量有33.78％，汇总见表8。说明在水解反应中，原料经过降过氧化值处理后，能有效保留酶的活性，具体体现在该脂肪酶使用10次之后，生成的DAG含量比原料不经吸附处理所用脂肪酶生成的更高。
表8原料经吸附处理和未经吸附处理对水解粗产物中甘油二酯含量的影响
注：酶均已使用10次
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
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