阅读说明：本技术 链霉亲和素标记微球的生物素化抗体结合量的测定方法 (Method for measuring binding capacity of biotinylated antibody of streptavidin marked microsphere ) 是由 张尧锋 李因来 于 2021-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种链霉亲和素标记微球的生物素化抗体结合量的测定方法,包括以下步骤：1)生物素化抗体的制备：2mg的抗体用PBS缓冲液稀释至5mg/ml,加入一定量的sulfo-NHS-LC-Biotin,摇匀后室温反应1小时,透析纯化；2)吖啶酯-生物素化抗体的制备：步骤1)中的生物素化抗体稀释至2mg/ml,加入一定量的吖啶酯的DMSO溶液,摇匀后室温避光反应2小时,避光透析纯化并用BCA法进行定量；3)绘制标准曲线,读取发光值RLU；绘制吖啶酯-生物素化抗体加入质量-RLU关系曲线。本发明的优点为：采用化学发光法,较荧光法灵敏度更高,抗干扰能力更强,比测试微球复合物操作更简单,结果更准确。(The invention provides a method for measuring the binding capacity of a biotinylated antibody of streptavidin marked microspheres, which comprises the following steps: 1) preparation of biotinylated antibody: diluting 2mg of antibody to 5mg/ml by using PBS buffer solution, adding a certain amount of sulfo-NHS-LC-Biotin, shaking uniformly, reacting at room temperature for 1 hour, and dialyzing and purifying; 2) preparation of acridinium ester-biotinylated antibody: diluting the biotinylated antibody in the step 1) to 2mg/ml, adding a certain amount of DMSO solution of acridinium ester, shaking up, reacting at room temperature in a dark place for 2 hours, dialyzing in the dark place, purifying and quantifying by using a BCA method; 3) drawing a standard curve, and reading a luminescence value RLU; acridinium ester-biotinylated antibody addition mass-RLU relationship curves are plotted. The invention has the advantages that: compared with a fluorescence method, the chemiluminescence method has the advantages of higher sensitivity, stronger anti-interference capability, simpler operation and more accurate result compared with the method for testing the microsphere compound.)

链霉亲和素标记微球的生物素化抗体结合量的测定方法

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体是指链霉亲和素标记微球的生物素化抗体结合量的测定方法。

背景技术

链霉亲和素-生物素(SA-Biotin)系统具有极高的结合亲和力，在生物领域有广泛应用。近些年来，链霉亲和素标记微球，包括链霉亲和素标记的乳胶微球、荧光微球、量子点微球、二氧化硅磁性微球、聚合物磁性微球等，在生物医药、体外诊断等领域的应用也越来越广。链霉亲和素标记微球能够非常方便快速地与生物素化抗体结合，从而得到表面标记了特定抗体的微球，可用于后续免疫反应。

现有技术方案：目前能查阅到的测定生物素化抗体结合量的资料很少，没有公开资料提到具体测定方法。一些公司提到了可以用荧光染料来标记生物素化抗体，与链霉亲和素标记微球结合后，通过测定荧光物质的发射光谱强度来对结合的生物素化抗体进行定量。

常规的有机小分子荧光染料(如FITC等)stokes位移小，激发波与发射波有一定程度的重叠，很容易发生干扰，影响测定结果的准确性。另外，一般认为，荧光定量的灵敏度高于紫外-可见光，但低于化学发光，限制了其在微量蛋白定量方向的应用。

另一方面，通过我们的实验发现，微球与水体系为两相体系，与溶液相的测试存在较大区别，通过简单地测定微球-抗体复合物的荧光值并不能准确地反映生物素化抗体的结合量，一般较实际结合量低很多，可能是荧光在两相间传递时发生了淬灭。

发明内容

以解决上述背景技术中提出的问题，本发明的目的在于提供一种链霉亲和素标记微球的生物素化抗体结合量的测定方法，化学发光法较荧光法灵敏度更高，抗干扰能力更强。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：

链霉亲和素标记微球的生物素化抗体结合量的测定方法，包括以下步骤：

1)生物素化抗体的制备：2mg的抗体用PBS缓冲液稀释至5mg/ml，加入一定量的sulfo-NHS-LC-Biotin，摇匀后室温反应1小时，透析纯化；

2)吖啶酯-生物素化抗体的制备：步骤1)中的生物素化抗体稀释至2mg/ml,加入一定量的吖啶酯的DMSO溶液，摇匀后室温避光反应2小时，避光透析纯化并用BCA法进行定量；

3)标准曲线的绘制：取吖啶酯-生物素化抗体，配制成不同浓度的溶液，分别为0ug/ml、2ug/ml、4ug/ml、6ug/ml、8ug/ml、10ug/ml、12ug/ml，各取10ul到化学发光专用的96孔板，然后各加100ul的激发液，振荡摇匀后放到Thermo Luminoskan化学发光仪中，通过仪器注射泵加入激发液后，读取发光值RLU；绘制吖啶酯-生物素化抗体加入质量-RLU关系曲线。

作为改进，所述步骤1)和步骤2)的室温保持在20-30℃。

本发明的有益效果是：

本发明采用化学发光法，较荧光法灵敏度更高，抗干扰能力更强，通过测定上清液中未结合的吖啶酯-生物素化抗体的量，进而计算得到霉亲和素标记微球的生物素化抗体结合量，比测试微球复合物操作更简单，结果更准确。

具体实施方式

下面用具体实施例说明本发明，并不是对本发明的限制。

实施例

一种链霉亲和素标记微球的生物素化抗体结合量的测定方法，包括以下步骤：

生物素化抗体的制备：2mg的抗体(以鼠IgG为例)用PBS缓冲液稀释至5mg/ml，加入一定量的sulfo-NHS-LC-Biotin，摇匀后室温反应1小时，透析纯化。

吖啶酯-生物素化抗体的制备：上述生物素化抗体稀释至2mg/ml,加入一定量的吖啶酯的DMSO溶液，摇匀后室温避光反应2小时，避光透析纯化，用BCA法进行定量。

标准曲线的绘制：取吖啶酯-生物素化抗体，配制成不同浓度的溶液，分别为0ug/ml、2ug/ml、4ug/ml、6ug/ml、8ug/ml、10ug/ml、12ug/ml，各取10ul到化学发光专用的96孔板，然后各加100ul的激发液，振荡摇匀后放到Thermo Luminoskan化学发光仪中，通过仪器注射泵加入激发液后，读取发光值RLU。绘制吖啶酯-生物素化抗体加入质量-RLU关系曲线。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。