具体实施方式

定义

如本文所用，“结构域”是用于描述蛋白或核酸的区段。除非另外指明，否则不需要结构域具有任何特定功能特性。

如下进行两个序列之间的同源性或序列一致性(这些术语在本文可互换地使用)的计算。将序列进行比对用于最优比较的目的(例如，用于最优比对，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入空位，并且出于比较的目的，可以不考虑非同源序列)。使用具有Blossum 62打分矩阵(其中空位罚分为12，空位延伸罚分为4，并且移码空位罚分为5)的GCG软件包中的GAP程序，将最优比对确定为最佳评分。然后比较相应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与在第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的百分比一致性是由这些序列共享的相同位置的数量的函数。

如在此使用的，“调节剂”是指可改变受试分子或遗传序列的活性(例如，酶活性、转录活性、或翻译活性)、量、分布、或结构的实体(例如，药物)。在实施例中，调节包括切割，例如，共价或非共价键的断裂、或共价或非共价键的形成，例如，将部分附接至，受试分子。在实施例中，调节剂改变受试分子的三维、二级、三级、或四级结构。调节剂可以增加、降低、引发、或消除受试活性。

如本文所使用的，“多肽”是指具有少于100个氨基酸残基的氨基酸的聚合物。在实施例中，它具有少于50、20、或10个氨基酸残基。

如本文关于分子的修饰所使用的“置换”或“置换的”不需要方法限制，但仅表明置换实体是存在的。

如本文所用的术语“RHO靶位置”是指RHO基因中或附近的靶位置，例如一个或多个核苷酸，使用本文所述的方法靶向改变该靶位置。在某些实施例中，RHO靶位置的改变(例如，通过取代、缺失、或插入)可导致RHO基因的破坏(例如，“敲除”)。在某些实施例中，RHO靶位置可以位于RHO基因的5’区(例如，5’UTR、外显子1、外显子2、内含子1、外显子1/内含子1边界、或外显子2/内含子1边界)、RHO基因的非编码区(例如，增强子区、启动子区、内含子、5’UTR、3’UTR、多聚腺苷酸化信号)、或RHO基因的编码区(例如，RHO基因的早期编码区、外显子(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5)、或外显子/内含子边界(例如，外显子1/内含子1、外显子2/内含子1))。

如本文所用的，“小分子”是指具有小于约2kD(例如，小于约2kD、小于约1.5kD、小于约1kD、或小于约0.75kD)的分子量的化合物。

如本文所用的，“受试者”可以意指人或非人动物。该术语包括但不限于，哺乳动物(例如，人类、其他灵长类动物、猪、啮齿动物(例如，小鼠和大鼠或仓鼠)、兔、豚鼠、奶牛、马、猫、狗、绵羊、以及山羊)。在实施例中，受试者是人。在其他实施例中，受试者是家禽。

如本文所使用的，“治疗(treat、treating和treatment)”意指，治疗哺乳动物(例如，人)的疾病，包括(a)抑制该疾病，即阻止或防止其发展；(b)缓解该疾病，即导致疾病状态的消退；以及(c)治愈该疾病。

如本文所使用的在氨基酸序列的语境下的“X”是指任何氨基酸(例如，二十种天然氨基酸中的任一种)，除非另外说明。

常染色体显性视网膜色素变性(adRP)

在美国，视网膜色素变性(RP)影响了50,000至100,000人。RP是一组遗传性视网膜营养不良症，其影响光受体和视网膜色素上皮细胞。该疾病导致视网膜退化和萎缩，并且其特征是视力逐渐退化，最终导致失明。

典型的疾病发作是在青少年时期，尽管一些受试者可能在成年早期出现。受试者最初表现为夜视力差以及周边视力下降。通常，视力丧失是由周边视野向内进行的。大多数受试者在40岁之前法定盲。中心视野可能会被保留到疾病的晚期，因此一些受试者在小视野内可能具有正常的视力到其70多岁。然而，大多数受试者在50至80岁之间也会失去中心视力(Berson 1990年)。经检查，受试者可能有骨刺色素沉着、视野变窄和视网膜萎缩中的一种或多种。

有超过60个基因和数百个突变导致RP。常染色体显性RP(adRP)占RP的15％-25％。常染色体隐性RP(arRP)占RP的5％-20％。X连锁RP(X-LRP)占RP的5％-15％(Daiger 2007年)。通常，adRP往往有最晚的呈现，arRP有中等的呈现，而X-LRP有最早的呈现。

常染色体显性视网膜色素变性(adRP)是由视紫红质(RHO)基因中的杂合突变引起的。RHO基因中的突变占adRP病例的25％-30％。

RHO基因编码视紫红质蛋白。视紫红质是在视网膜光受体(PR)视杆细胞的外段表达的G蛋白偶联受体，是光转导级联的关键元件。视紫红质吸收的光导致11-顺式视网膜异构化为全反式视网膜。这种构象变化使视紫红质与转导蛋白偶联，这是视觉信号传导级联的第一步。RHO基因中的杂合突变导致野生型视紫红质的产生减少和/或突变型视紫红质的表达。这导致光转导级联的功能低下以及视杆PR细胞的功能下降。随着时间的推移，视杆PR细胞出现萎缩，最终视锥PR细胞也会萎缩。这导致RP受试者经历的累积性视力丧失的典型的表型进展。具有RHO突变的受试者经历进行性周边视野的丧失，然后是中心视野的丧失(后者通过视力的下降来衡量)。

表A中提供了示例性RHO突变。

表A：RHO突变(A组突变)

对RP的治疗是有限的，目前还没有批准的治疗可以大体上逆转或阻止adRP的疾病进展。在实施例中，维生素A的补充可以延迟疾病的发生并减缓疾病的发展。Argus II视网膜植入物于2013年在美国批准使用。Argus II视网膜植入物是电子植入物，对RP患者的视力改善很小。例如，该设备在试验中达到的最佳视力是20/1260。然而，法定盲被定义为20/200的视力。

概述

如本文提供的，本发明人已设计出治疗策略，该治疗策略提供了改变，该改变包含通过如下文所述的RNA指导的核酸酶(例如，Cas9或Cpf1)介导的一个或多个核苷酸的插入或缺失破坏突变型RHO基因以及提供功能性的RHO cDNA。这种类型的改变也被称为“敲除”突变型RHO基因，并且导致该突变型RHO基因的功能丧失。尽管不希望受到理论的束缚，敲除突变型RHO基因并提供功能性外源RHO cDNA可在PR视杆细胞中维持适当水平的视紫红质蛋白。这种治疗策略的好处是可以破坏所有与adRP有关的已知突变型等位基因，例如表A中的RHO突变。

在某些实施例中，靶向突变型RHO基因的5’UTR区(例如，5’UTR、外显子1、外显子2、内含子1、外显子1/内含子1、或外显子2/内含子1边界)以改变(即，敲除)突变型RHO基因(例如，消除其表达)。

在某些实施例中，靶向突变型RHO基因的编码区(例如外显子，例如早期编码区)以改变(即，敲除)突变型RHO基因(例如，消除其表达)。例如，突变型RHO基因的早期编码区包括紧跟着起始密码子、在编码序列的第一外显子之内、或在起始密码子的500bp之内(例如，小于500、450、400、350、300、250、200、150、100或50bp)的序列。

在某些实施例中，靶向突变型RHO基因的非编码区(例如，增强子区、启动子区、内含子、5’UTR、3’UTR、多聚腺苷酸化信号)以改变(即，敲除)突变型RHO基因(例如，消除其表达)。

在某些实施例中，靶向突变型RHO基因的外显子/内含子边界(例如，外显子1/内含子1、外显子2/内含子1)以改变(即，敲除)突变型RHO基因(例如，消除其表达)。在某些实施例中，靶向外显子/内含子边界提供了能够使用没有经密码子修饰为抵抗gRNA剪切的外源RHO cDNA分子的益处。

图1显示了敲除内源RHO基因并提供外源RHO cDNA的治疗策略的一个实施方案的示意图。在一个实施例中，CRISPR/RNA指导的核酸酶基因组编辑系统可用于改变(即，敲除)RHO基因的外显子1或外显子2(例如，消除其表达)。在某些实施例中，RHO基因可以是突变型RHO基因。在某些实施例中，突变型RHO基因可以包含表A中的一种或多种RHO突变。RHO基因的外显子1或外显子2的改变导致内源突变型RHO基因的破坏。

在某些实施例中，治疗策略可以使用双载体系统来完成。在某些方面，本披露集中于编码CRISPR/RNA指导的核酸酶基因组编辑系统和置换型RHO cDNA的AAV载体，以及使用这些载体治疗adRP疾病。图2中示意了示例性载体基因组，其示出了这些载体的某些固定和可变元件：反向末端重复(ITR)、至少一个gRNA序列和用于驱动其表达的启动子序列、RNA指导的核酸酶(例如，Cas9)编码序列和用于驱动其表达的另一个启动子、核定位信号(NLS)序列、以及RHO cDNA序列和用于驱动其表达的另一个启动子。下文详细讨论了这些元件中的每一个。图3中示意了另外的示例性载体基因组，其示出了这些载体的某些固定和可变元件：至少一个gRNA序列和用于驱动其表达的启动子序列(例如，U6启动子)、RNA指导的核酸酶(例如，金黄色葡萄球菌Cas9)编码序列和用于驱动其表达的另一个启动子(例如，最小RHO启动子)、以及RHO cDNA序列和用于驱动其表达的另一个启动子(例如，最小RHO启动子)。图16-18和SEQ ID NO:8-11中列出了用于本文所述的策略的其他示例性载体和序列。

在某些实施例中，本文所用的AAV载体可以是如2018年6月14日公开的WO2018/106693(其标题为用于内源和来源DNA的单发指导RNA(ogRNA)靶向的系统和方法(Systemsand Methods for One-Shot guide RNA(ogRNA)Targeting of Endogenous and SourceDNA)，其全部内容通过引用并入本文)中所述的自限性载体系统。

如图1所示，在某些实施例中，双载体系统可用于敲除突变型RHO基因的表达并递送外源RHO cDNA以恢复野生型视紫红质蛋白的表达。在某些实施例中，一个AAV载体基因组可以包含ITR、和RNA指导的核酸酶编码序列和用于驱动其表达的启动子序列、以及一个或多个NLS序列。在某些实施例中，第二AAV载体基因组可以包含ITR、RHO cDNA序列和用于驱动其表达的启动子、一个gRNA序列和用于驱动其表达的启动子序列。

尽管不希望受到理论的束缚，敲除RHO基因并将其置换为功能性外源RHO cDNA可在PR视杆细胞中维持适当水平的视紫红质蛋白。在视杆PR细胞中恢复适当水平的功能性视紫红质蛋白可维持光转导级联，并且可以延迟或防止adRP患者的PR细胞死亡。

在一些实施例中，本文披露的方法的特征在于敲除有需要的受试者(例如，在患有或易患adRP的受试者中)中的与adRP相关的RHO基因的变体(例如，本文所述的RHO突变型基因或等位基因)，以及恢复野生型RHO蛋白表达。例如，在一些实施例中，本文提供的方法的特征在于敲除具有突变型和野生型RHO等位基因的受试者中的突变型RHO等位基因，以及恢复视杆PR细胞中野生型视紫红质蛋白的表达。在一些实施例中，这种方法的特征是敲除突变型等位基因，同时保持野生型等位基因完整。在其他实施例中，这种方法的特征是同时敲除突变型和野生型等位基因。在一些实施例中，这些方法的特征在于敲除RHO基因的突变型等位基因，以及提供外源野生型蛋白，例如，通过编码野生型RHO蛋白的cDNA的表达。在一些实施例中，敲除有需要的受试者(例如，患有或易患adRP的受试者)中的突变型等位基因(以及任选地，野生型等位基因)的表达，以及恢复野生型RHO蛋白表达(例如，通过外源RHOcDNA的表达)改善与adRP相关的至少一种症状。在一些实施例中，这种改善包括，例如，改善受试者的视力。在一些实施例中，这种改善包括，例如与无临床干预的预期进展相比，延迟adRP疾病进展。在一些实施例中，这种改善包括，例如，阻止adRP疾病进展。在一些实施例中，这种改善包括，例如，防止或延迟受试者的adRP疾病的发作。

在实施例中，本文所述的方法包括离体处理异体或自体视网膜细胞。在实施例中，将离体处理的异体或自体视网膜细胞引入受试者中。

在实施例中，本文所述的方法包括离体处理胚胎干细胞、诱导型多能干细胞或衍生自iPS细胞、造血干细胞、神经元干细胞或间充质干细胞的细胞。在实施例中，将离体处理的胚胎干细胞、诱导型多能干细胞、造血干细胞、神经元干细胞或间充质干细胞引入受试者中。在实施例中，细胞是诱导型多能干细胞(iPS)细胞或衍生自iPS细胞的细胞(例如，从受试者产生的iPS细胞)，被修饰以敲除一种或多种突变型RHO基因并表达功能性外源RHODNA，以及分化为视网膜祖细胞或视网膜细胞(例如，视网膜光受体细胞)，并被注射到受试者的眼睛中，例如通过视网膜下注射，例如在视网膜的黄斑下区。

在实施例中，本文所述的方法包括离体处理自体干细胞。在实施例中，将离体处理的自体干细胞返回给受试者。

在实施例中，受试者在体内治疗，例如，通过病毒(或其他机制)，该病毒靶向来自眼睛的细胞(例如视网膜细胞，例如光受体细胞，例如视锥光受体细胞，例如视杆光受体细胞，例如黄斑视锥光受体细胞)。

在实施例中，受试者在体内治疗，例如，通过病毒(或其他机制)，该病毒靶向干细胞(例如，胚胎干细胞、诱导型多能干细胞或衍生自iPS细胞、造血干细胞、神经元干细胞或间充质干细胞的细胞)。

在实施例中，在疾病发作之前在受试者中开始治疗。在特定的实施例中，在对RHO基因中一个或多个突变检测呈阳性的受试者中开始治疗。

在实施例中，在疾病发作之后在受试者中开始治疗。

在实施例中，在adRP疾病的早期开始治疗。在实施例中，在受试者出现视力逐渐下降后开始治疗。在实施例中，在adRP发作后但在病程早期修复RHO基因将阻止疾病的进展。

在实施例中，在疾病的晚期在受试者中开始治疗。尽管不希望受到理论的束缚，但认为晚期治疗可能会保留受试者的视力(在中心视野)，这对受试者的功能和日常生活活动的进行很重要。

在实施例中，对受试者的治疗阻止疾病进展。尽管不希望受到理论的束缚，但认为在疾病的所有阶段(例如，预防性治疗、早期adRP、和晚期adRP)开始对受试者的治疗将阻止RP疾病进展并对受试者有益。

在实施例中，在确定受试者(例如，婴儿或新生儿、青少年、或成人)对RHO基因中的突变(例如，本文所述的突变)呈阳性后开始治疗。

在实施例中，在确定受试者对RHO基因中的突变(例如，本文所述的突变)呈阳性后但在疾病症状表现之前开始治疗。

在实施例中，在确定受试者对RHO基因中的突变(例如，本文所述的突变)呈阳性后并且在疾病症状表现之后开始治疗。

在实施例中，在视野出现下降时在受试者中开始治疗。

在实施例中，在周边视力出现下降时在受试者中开始治疗。

在实施例中，在出现夜视力差和/或夜盲时在受试者中开始治疗。

在实施例中，在出现进行性视力丧失时在受试者中开始治疗。

在实施例中，在出现视野进行性收缩时在受试者中开始治疗。

在实施例中，在检查受试者后，在出现一种或多种与adRP一致的适应症时，在受试者中开始治疗。示例性适应证包括但不限于骨刺色素沉着、视野变窄、视网膜萎缩、视网膜血管衰减、视网膜色素上皮的丧失、视神经苍白、和/或其组合。

在实施例中，本文所述的方法包括视网膜下注射、黄斑下注射、脉络膜上注射、或玻璃体内注射本文所述的gRNA或其他组分，例如，RNA指导的核酸酶(例如，Cas9或Cpf1分子)和RHO cDNA分子。

在实施例中，通过AAV、慢病毒、纳米颗粒、或细小病毒(例如，设计用于靶向来自眼睛的细胞(例如视网膜细胞，例如光受体细胞，例如视锥光受体细胞，例如视杆光受体细胞，例如黄斑视锥光受体细胞)的经修饰的细小病毒)将本文所述的gRNA或其他组分(例如，RNA指导的核酸酶(例如，Cas9或Cpf1分子)和RHO cDNA分子)，例如递送给受试者。

在实施例中，通过AAV、慢病毒、纳米颗粒、或细小病毒(例如，设计用于靶向干细胞(例如，胚胎干细胞、诱导型多能干细胞或衍生自iPS细胞、造血干细胞、神经元干细胞或间充质干细胞的细胞)的经修饰的细小病毒)将本文所述的gRNA或其他组分(例如，RNA指导的核酸酶(例如，Cas9或Cpf1分子)和RHO cDNA分子)，例如递送给受试者。

在实施例中，通过电穿孔，离体递送本文所述的gRNA或其他组分，例如，RNA指导的核酸酶(例如，Cas9或Cpf1分子)和RHO cDNA分子。

在实施例中，CRISPR/RNA指导的核酸酶组分用于敲除引起疾病的突变型RHO基因。

I.gRNA分子

术语指导RNA和gRNA是指促进RNA指导的核酸酶(例如Cas9或Cpf1)与细胞中的靶序列(例如基因组或附加体序列)的特异性缔合(或“靶向”)的任何核酸。gRNA可以是单分子(包含单一RNA分子，并且可替代地称为嵌合)或模块(包含多于一个、并且典型地两个单独的RNA分子，例如crRNA和tracrRNA，其通常例如通过双链化彼此缔合)。在整个文献中描述了gRNA及其组分(例如，参见Briner 2014，将其通过引用并入；也参见Cotta-Ramusino)。

在细菌和古细菌中，II型CRISPR系统通常包含RNA指导的核酸酶蛋白(例如Cas9)、包括与外来序列互补的5’区的CRISPR RNA(crRNA)和包括与crRNA的3’区互补并形成双链体的5’区的反式激活crRNA(tracrRNA)。虽然并非旨在受限于任何理论，但认为此双链体有助于形成RNA指导的核酸酶/gRNA复合物，并且是该复合物的活性所需的。在II型CRISPR系统经改适用于基因编辑中时，发现crRNA和tracrRNA可以接合成单一单分子或嵌合gRNA，例如通过借助桥接crRNA(在其3’末端)和tracrRNA(在其5’末端)的互补区的四核苷酸(例如GAAA)“四环(tetraloop)”或“接头”序列来接合(Mali 2013；Jiang 2013；Jinek 2012；全部通过引用并入本文)。

指导RNA不论是单分子的或模块化的都包括靶向结构域，该靶向结构域与靶序列(例如，期望编辑的细胞基因组中的双链DNA序列)内的靶结构域完全或部分互补。在某些实施例中RHO靶序列涵盖、包含或接近RHO靶位置。靶向结构域在文献中通过多种名称来提及，包括但不限于“指导序列”(Hsu 2013，通过引用并入本文)、“互补性区”(Cotta-Ramusino)、“间隔子”(Briner 2014)和一般性地称为“crRNA”(Jiang 2013)。不论给予其何种名称，靶向结构域典型地长度为10-30个核苷酸，优选地长度为16-24个核苷酸(例如，长度为16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸)，并且在Cas9 gRNA情形中位于5’末端处或5’末端附近，并且在Cpf1 gRNA情形中位于3’末端处或3’末端附近。与靶结构域互补的核酸序列(即包含该靶结构域的双链DNA的互补DNA链上的核酸序列)，在本文中称为“原型间隔子”。

“原型间隔子邻近基序”(PAM)序列的名称来源于其于“原型间隔子”序列的顺序关系。与原型间隔子序列一起，PAM序列定义特定RNA指导的核酸酶/gRNA组合的靶序列和/或靶位置。多种RNA指导的核酸酶可能需要PAM与原型间隔子之间的不同顺序关系。

例如，通常，Cas9核酸酶识别原型间隔子3’的PAM序列：

5′----[原型间隔子][PAM]--------3′

3′----[靶结构域]-------------5′

再如，通常，Cpf1识别原型间隔子5’的PAM序列：

5′----[PAM][原型间隔子]--------3′

3′---------[靶结构域]--------5′

在本文所述的一些实施例中，描述了RHO原型间隔子和示例性合适的靶向结构域。本领域的普通技术人员应当知道可用于将RNA指导的核酸酶靶向给定的原型间隔子的其他合适的指导RNA靶向结构域，例如，包括另外或较少核苷酸的靶向结构域，或者在与靶结构域杂交时包含一个或多个核苷酸错配的靶向结构域。

除了靶向结构域以外，gRNA典型地(但不一定，如下文所讨论)包括多个影响gRNA/Cas9复合物的形成或活性的域。例如，如上文所提及，通过gRNA的第一和第二互补性结构域形成的双链化结构(也称为重复：抗重复双链体)与Cas9的识别(REC)叶相互作用，并且可以介导Cas9/gRNA复合物的形成(Nishimasu 2014；Nishimasu 2015；两者均通过引用并入本文)。应注意，第一和/或第二互补性结构域可含有一个或多个聚A段，其可以由RNA聚合酶识别为终止信号。因此，第一和第二互补性结构域的序列任选地经修饰以消除这些段，并促进gRNA的体外转录的完成，例如通过使用如Briner 2014中所述的A-G交换或A-U交换来修饰。对第一和第二互补性结构域的这些和其他类似修饰在本公开的范围内。

与第一和第二互补性结构域一起，Cas9 gRNA典型地包括两个或更多个另外的双链化区，该两个或更多个另外的双链化区对体内核酸酶活性是必需的，但在体外不一定是必需的(Nishimasu 2015)。在第二互补性结构域的3’部分附近的第一茎环被不同地称为“近端结构域”(Cotta-Ramusino)、“茎环1”(Nishimasu 2014：Nishimasu 2015)以及“连结(nexus)”(Briner 2014)。一个或多个其他茎环结构通常存在于gRNA的3’末端附近，其数目依物种而变：化脓链球菌gRNA典型地包括两个3’茎环(总计四个茎环结构，包括重复:抗重复双链体)，而金黄色葡萄球菌和其他物种仅具有一个(总计三个)。对根据物种组织化的保守茎环结构(更通常地，和gRNA结构)的描述于Briner 2014中提供。

本领域技术人员将理解，可以通过多种方式修饰gRNA，其中一些方式在下文中描述，并且这些修饰在本发明的范围内。为了便于呈现本披露，可以仅通过参考它们的靶向结构域序列来呈现gRNA。

gRNA修饰

gRNA的活性、稳定性或其他特征可以通过并入化学和/或序列修饰来改变。作为一个实例，瞬时表达或递送的核酸可能易于被例如细胞核酸酶降解。因此，本文所述的gRNA可以含有引入针对核酸酶的稳定性的一个或多个经修饰核苷或核苷酸。虽然不希望受理论束缚，但还据信当引入细胞群，特别是本发明的细胞时，本文所述的某些修饰的gRNA可展现出减少的先天性免疫应答。如上所述的，术语“先天性免疫应答”包括对外源核酸的细胞应答，外源核酸包括通常是病毒或细菌来源的单链核酸，所述细胞应答涉及细胞因子(特别是干扰素)表达与释放以及细胞死亡的诱导。

一种常见的3’末端修饰是添加包含一个或多个(典型地5-200个)腺嘌呤(A)残基的聚A段。聚A段可以被包含在编码gRNA的核酸序列中，或者可以在化学合成期间，或者在使用聚腺苷聚合酶(例如，大肠杆菌聚(A)聚合酶)体外转录后被添加到gRNA上。在体内，通过使用多聚腺苷酸化信号，可以将聚A段添加到从DNA载体转录的序列中。Maeder中提供了此类信号的实例。

本文提供了在本RNA指导的核酸酶技术的上下文中有用的一些示例性gRNA修饰，并且本领域技术人员将能够基于本披露确定可与本文披露的gRNA和治疗方式结合使用的其他合适修饰。合适的gRNA修饰包括但不限于美国专利申请号US2017/0073674A1和国际公开号WO 2017/165862 A1中描述的那些，将它们各自的全部内容通过引用并入本文。

II.用于设计gRNA的方法

本文描述了用于设计gRNA的方法，包括用于选择、设计和验证靶结构域的方法。本文还提供了示例性靶向结构域。可以将在此所论述的靶向结构域掺入在此所描述的gRNA中。

用于选择和验证靶位点连同脱靶分析的方法描述于例如，Mali 2013；Hsu 2013；Fu 2014；Heigwer 2014；Bae 2014；Xiao 2014中。

例如，软件工具可以用来优化在使用者的靶位点之内的gRNA的选择，例如，以跨基因组最小化总脱靶活性。脱靶活性可以不同于切割。对于使用化脓链球菌Cas9的每个可能的gRNA选择，工具可以识别跨基因组所有脱靶位点(以上的NAG或NGG PAM)，这些脱靶位点含有高达一定数量(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)的错配碱基对。在每个脱靶位点处的切割效率是可以预测的，例如使用实验衍生的加权方案。进而根据每个可能的gRNA的总的预测的脱靶切割进行排序；最高排名的gRNA表示可能具有最大中靶和最少脱靶切割的那些。其他功能(例如，用于CRISPR构建的自动化试剂设计、用于中靶Surveyor测定的引物设计、和用于高通量检测以及经由下一代测序对脱靶切割进行定量的引物设计)也可以被包括在该工具中。

可以将本文论述的靶向结构域掺入本文所述的gRNA中。

示例性原型间隔子和靶向结构域

鉴定出了靶向RHO基因内的不同位置用于与金黄色葡萄球菌Cas9一起使用的指导RNA。鉴定后，将gRNA排序成三个等级。基于RHO基因的外显子1和外显子2中的剪切选择等级1中的gRNA。等级1指导物在T细胞中表现出>9％的编辑。对于等级2gRNA的选择，选择基于在RHO基因的5’UTR中的剪切。等级2gRNA在T细胞中表现出>10％的编辑。基于RHO基因的内含子1中的剪切选择等级3gRNA。等级3gRNA在T细胞中表现出>10％的编辑。

表1提供了根据第一等级参数选择的RHO基因中外显子1或外显子2RHO靶位置的靶向结构域。基于RHO基因的外显子1或外显子2中的剪切选择靶向结构域，并且这些靶向结构域在T细胞中表现出>9％的编辑。本文考虑了，靶向结构域与通过互补碱基配对跟提供靶结构域序列互补的链杂交。表中的靶向结构域中的任一个都可以与提供双链切割的金黄色葡萄球菌Cas9分子一起使用。表中的靶向结构域中的任一个都可以与金黄色葡萄球菌Cas9单链断裂核酸酶(切口酶)一起使用。

表1

表2提供了根据第二等级参数选择的RHO基因中5’UTR RHO靶位置的靶向结构域。基于RHO基因的5’UTR区中的剪切选择靶向结构域，并且这些靶向结构域在T细胞中表现出>10％的编辑。在此考虑了，靶向结构域通过互补碱基配对与靶结构域杂交。表中的靶向结构域中的任一个都可以与提供双链切割的金黄色葡萄球菌Cas9分子一起使用。表中的靶向结构域中的任一个都可以与金黄色葡萄球菌Cas9单链断裂核酸酶(切口酶)一起使用。

表2

表3提供了根据第三等级参数选择的RHO基因中内含子1RHO靶位置的靶向结构域。基于RHO基因的内含子1中的剪切选择靶向结构域，并且这些靶向结构域在T细胞中表现出>10％的编辑。在此考虑了，靶向结构域通过互补碱基配对与靶结构域杂交。表中的靶向结构域中的任一个都可以与提供双链切割的金黄色葡萄球菌Cas9分子一起使用。表中的靶向结构域中的任一个都可以与金黄色葡萄球菌Cas9单链断裂核酸酶(切口酶)一起使用。

表3

III.RNA指导的核酸酶

根据本披露的RNA指导的核酸酶包括但不限于天然存在的2类的CRISPR核酸酶，例如Cas9和Cpf1，以及由其衍生或获得的其他核酸酶。在功能方面，RNA指导的核酸酶被定义为如下的那些核酸酶：(a)与gRNA相互作用(例如复合)；和(b)与gRNA一起缔合或任选地切割或修饰DNA的靶区域，该靶区域包括(i)与gRNA的靶向结构域互补的序列，以及任选地，(ii)称为“原型间隔子邻近基序”或“PAM”的另一序列，其更详细地描述于下文中。在说明以下实例时，RNA指导的核酸酶可以在广义上依据其PAM特异性和切割活性来定义，即使在共享相同PAM特异性或切割活性的个别RNA指导的核酸酶之间可能存在变异。本领域技术人员将理解，本披露的一些方面涉及可以使用具有某种PAM特异性和/或切割活性的任何适宜RNA指导的核酸酶实施的系统、方法和组合物。为此，除非另外指定，否则术语RNA指导的核酸酶应理解为通用术语，并不限于任何特定类型(例如，Cas9与Cpf1)、物种(例如，化脓链球菌与金黄色葡萄球菌)或变异(例如，全长与截短或分裂；天然存在的PAM特异性与工程化的PAM特异性)。

关于PAM序列，该结构的名称来源于其与“原型间隔子”序列的顺序关系，该原型间隔子与gRNA靶向结构域(或“间隔序列”)互补。与原型间隔子一起，PAM序列定义特定RNA指导的核酸酶/gRNA组合的靶区域或序列。

多种RNA指导的核酸酶可能需要PAM与原型间隔子之间的不同顺序关系。通常，Cas9s识别相对于顶部或互补链可视化的原型间隔子5’的PAM序列。

除了识别PAM和原型间隔子的特定顺序定向以外，RNA指导的核酸酶通常识别特定PAM序列。例如，金黄色葡萄球菌Cas9识别NNGRRT的PAM序列，其中N个序列紧靠由gRNA靶向域所识别区的3’。化脓链球菌Cas9识别NGG PAM序列。还应注意，工程化的RNA指导的核酸酶可具有与相似核酸酶的PAM特异性不同的PAM特异性(例如，衍生出RNA指导的核酸酶的天然存在的变体，或与工程化的RNA指导的核酸酶具有最大氨基酸序列同源的天然存在的变体)。识别替代PAM序列的经修饰的Cas9如下所述。

RNA指导的核酸酶的特征还在于它们的DNA切割活性：天然存在的RNA指导的核酸酶典型地在靶核酸中形成DSB，但是已产生仅生成SSB的工程化的变体(如以上讨论；还参见Ran 2013，通过引用并入本文)，或完全不剪切的工程化的变体。

术语“RNA指导的核酸酶”和“RNA指导的核酸酶分子”在本文可互换使用。在一些实施例中，RNA指导的核酸酶是RNA指导的DNA内切核酸酶。在一些实施例中，RNA指导的核酸酶是CRISPR核酸酶。下表4中列出了适合在本文提供的方法、策略和治疗方式的上下文中使用的RNA指导的核酸酶的实例，并且在一些实施例中，本文披露的方法、组合物和治疗方式可以使用本文披露或为本领域普通技术人员所知的RNA指导的核酸酶的任何组合。

表4.RNA指导的核酸酶

在一个实施例中，RNA指导的核酸酶是氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp.)Cpf1RR变体(AsCpf1-RR)。在另一个实施例中，RNA指导的核酸酶是Cpf1 RVR变体。

用于设计靶向结构域和指导RNA以及用于在基因组编辑方法的上下文中使用各种Cas核酸酶的示例性合适方法是本领域技术人员已知的。本文披露了一些示例性方法，并且基于本披露，其他合适方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。本披露在这方面不受限制。

IV.RHO基因组序列和互补DNA序列

RHO基因组序列为本领域普通技术人员所知。为了易于引用，提供了如下示例性RHO基因组序列：

RHO基因组序列可注释如下：

mRNA 1..456,2238..2406,3613..3778,3895..4134,4970..6706

CDS 96..456,2238..2406,3613..3778,3895..4134,4970..5080

为了说明的目的，下表5中提供了在本文其他地方更详细描述的示例性靶结构域：

表5

本文可使用多种RHO cDNA序列。在某些实施例中，可以递送RHO cDNA以提供外源功能性RHO cDNA。

下面提供了野生型RHO cDNA的示例性核酸序列：

在某些实施例中，RHO cDNA可经密码子优化以增加表达。在某些实施例中，RHOcDNA可经密码子修饰为抵抗与gRNA靶向结构域的杂交。在某些实施例中，RHO cDNA没有经密码子修饰为抵抗与gRNA靶向结构域的杂交。

下面提供了密码子优化的RHO cDNA的示例性核酸序列：

密码子优化的RHO-编码序列1(密码子1)：

密码子优化的RHO-编码序列2(密码子2)：

密码子优化的RHO-编码序列3(密码子3)：

密码子优化的RHO-编码序列4(密码子4)：

密码子优化的RHO-编码序列5(密码子5)：

密码子优化的RHO-编码序列6(密码子6)：

在某些实施例中，RHO cDNA可以包括经修饰的5’UTR、经修饰的3’UTR、或其组合。例如，在某些实施例中，RHO cDNA可以包括截短的5’UTR、截短的3’UTR、或其组合。在某些实施例中，RHO cDNA可以包括来自已知稳定的信使RNA(mRNA)的3’UTR。例如，在某些实施例中，RHO cDNA可以包括RHO编码序列下游的异源3’-UTR。例如，在一些实施例中，RHO cDNA可以包括α-珠蛋白3’UTR。在某些实施例中，RHO cDNA可以包括β-珠蛋白3’UTR。在某些实施例中，RHO cDNA可以包括一个或多个内含子。在某些实施例中，RHO cDNA可以包括截短的一个或多个内含子。

可用于稳定RHO cDNA的转录物的示例性合适的异源3’-UTR包括但不限于以下：

HBA1 3’UTR：

short HBA1 3’UTR：

TH 3’UTR：

COL1A1 3’UTR：

ALOX15 3′UTR：

在某些实施例中，RHO cDNA可以包括一个或多个内含子。在某些实施例中，RHOcDNA可以包括截短的一个或多个内含子。

下表6提供了含有内含子的RHO cDNA的示例性序列。

表6

V.基因组编辑途径

在一些实施例中，使用本文讨论的方法中的一种改变RHO基因。

NHEJ介导的RHO的敲除

本披露的一些方面提供了策略、方法、组合物和治疗方式，其特征在于将RNA指导的核酸酶(例如，Cas9或Cpf1核酸酶)靶向RHO靶序列(例如，本文所述的靶序列)和/或使用本文所述的指导RNA，其中该RNA指导的核酸酶在RHO靶序列处或附近剪切RHO基因组DNA，导致NHEJ介导的剪切基因组DNA的修复。这种NHEJ介导的修复的结果通常是在剪切位点产生indel，进而导致剪切RHO基因的功能丧失。功能丧失的特征在于基因产物的表达减少或完全消除(例如在RHO基因的情况下：RHO基因产物，例如RHO转录物或RHO蛋白)，或表达不表现出野生型基因产物的功能的基因产物。在一些实施例中，RHO基因的功能丧失的特征在于功能性RHO蛋白的较低水平的表达。在一些实施例中，RHO基因的功能丧失的特征在于来自RHO基因的RHO蛋白的表达的消除。在一些实施例中，突变型RHO基因或等位基因的功能丧失的特征在于编码的突变型RHO蛋白的表达降低或表达消除。

如本文所述的，核酸酶诱导的非同源末端连接(NHEJ)可以用于在靶位置处引入indel。核酸酶诱导的NHEJ还可以用于去除(例如，缺失)包括目的基因中靶位置处的突变的基因组序列。

虽然不希望受理论束缚，认为在实施例中，与本文所描述的方法相关的基因组改变依赖于核酸酶诱导的NHEJ以及NHEJ修复通路的易错性质。NHEJ通过将两端连接在一起修复DNA中的双链断裂；然而，通常，只有两个相容端(完全如它们通过双链断裂所形成的)是完全连接的，原始序列才被恢复。在末端重新连接之前，双链断裂的DNA端常常是酶加工的受试者，在一条或两条链处产生核苷酸的添加或去除。这使得NHEJ修复位点处的DNA序列中存在插入和/或缺失(indel)突变。

由NHEJ产生的indel突变在性质上是不可预测的；然而，在给定的断裂位点处，某些indel序列是有利的并且在群体中过度表达，这可能归因于微同源性的小区域。缺失的长度可以广泛变化；最常见地在1-50bp范围内，但是它们可以容易地达到大于100-200bp。插入倾向于较短并且通常包括直接围绕断裂位点的序列的短复制。然而，有可能获得大的插入，并且在这些情形中，插入的序列通常已经被追溯至基因组的其他区域或追溯至存在于细胞中的质粒DNA。

因为NHEJ是诱变的过程，它还可以用于缺失小序列基序，只要不需要产生特异性最终序列。如果双链断裂被靶向特异性序列基序附近，则由NHEJ修复导致的缺失突变常常跨越并且因此去除不想要的核苷酸。对于较大的DNA区段的缺失，引入两个双链断裂(序列的每侧上一个双链断裂)可以在末端之间产生NHEJ，其中去除了整个间插序列。这两种途径都可以用于缺失特异性DNA序列；然而，NHEJ的易出错性质仍可能在缺失位点处产生indel突变。

双链切割性RNA指导的核酸酶和单链(或切口酶)RNA指导的核酸酶均可以用于本文所述的方法和组合物以产生断裂诱导的indel。

本文提供了一些以NHEJ介导的RHO基因的敲除为特征的示例性方法，以及一些示例性合适的指导RNA、RNA指导的核酸酶、递送方法和与这些方法相关的其他方面。基于本披露，另外的合适的方法、指导RNA、RNA指导的核酸酶、递送方法等对于本领域普通技术人员将是显而易见的。

HDR修复和模板核酸

如本文所述，在某些实施例中，核酸酶诱导的同源定向修复(HDR)可用于改变突变型RHO基因的靶位置(例如，敲除)，并用野生型RHO序列置换突变型RHO基因。尽管不希望受到理论的束缚，但认为靶位置的改变通过用供体模板或模板核酸进行同源定向修复(HDR)而发生。例如，供体模板或模板核酸提供了靶位置的改变。考虑了可以将质粒供体用作用于同源重组的模版。进一步考虑了可以将单链供体模板用作通过在剪切序列和供体模板之间同源定向修复(例如，单链退火)的替代方法用于改变靶位置的模板。通过供体模板实现的靶序列改变取决于RNA指导的核酸酶分子的切割。通过RNA指导的核酸酶分子切割可以包括双链断裂或两个单链断裂。

可以使用模板核酸通过HDR用野生型RHO置换的突变型RHO基因包括包含点突变、突变热点或序列插入的突变型RHO基因。在实施例中，具有点突变或突变热点(例如，小于约30bp，例如小于25、20、15、10或5bp的突变热点)的突变型RHO基因可以通过单个双链断裂或两个单链断裂来改变(例如，敲除)。在实施例中，具有点突变或突变热点(例如，突变热点大于约30bp，例如，大于35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、400或500bp)或插入的突变型RHO基因可以通过以下改变(例如，敲除)：(1)单个双链断裂，(2)两个单链断裂，(3)两个双链断裂，其中断裂发生在靶位置的每一侧，或(4)四个单链断裂，其中在靶位置的每一侧发生一对单链断裂。

可以通过HDR改变(例如，敲除)并被模板核酸置换的突变型RHO基因包括但不限于表A中的那些，如P23(例如P23H或P23L)、T58(例如T58R)和P347(例如P347T、P347A、P347S、P347G、P347L或P347R)。

双链断裂介导的改变

在实施例中，双链切割受到RNA指导的核酸酶的影响。在某些实施例中，RNA指导的核酸酶可以是具有与HNH样结构域相关的切割活性以及与RuvC样结构域相关的切割活性(例如，N-末端RuvC样结构域)的Cas9分子(例如，野生型Cas9)。这样的实施例仅需要单一的gRNA。

单链断裂介导的改变

在其他实施例中，两个单链断裂或切口受到具有切口酶活性(例如，与HNH样结构域相关的切割活性或与N-末端RuvC样结构域相关的切割活性)的Cas9分子的影响。这样的实施例需要两个gRNA，各用于布置每个单链断裂。在实施例中，具有切口酶活性的Cas9分子切割gRNA所杂交的链，但不是互补于与gRNA杂交的链的链。在实施例中，具有切口酶活性的Cas9分子不切割gRNA所杂交的链，而是切割互补于与gRNA杂交的链的链。

在实施例中，该切口酶具有HNH活性，例如，具有RuvC活性失活的Cas9分子(例如，在D10处具有突变(例如，D10A突变)的Cas9分子)。D10A使RuvC失活；因此，Cas9切口酶(仅)具有HNH活性并且将剪切gRNA所杂交的链(互补链，其上并不具有NGG PAM)。在其他的实施例中，具有H840(例如，H840A)突变的Cas9分子可以用作切口酶。H840A使HNH失活；因此，Cas9切口酶(仅)具有RuvC活性并且剪切非互补链(具有NGG PAM并且其序列与gRNA相同的链)。

在实施例中，其中将一种切口酶和两种gRNA用于定位两个单链切口，一个切口在靶核酸的+链上而一个切口在-链上。这些PAM面向外部。可以选择gRNA，这样使得通过从约0-50、0-100、或0-200个核苷酸中分离gRNA。在实施例中，互补于两个gRNA的靶向结构域的靶结构域之间没有重叠。在实施例中，这些gRNA不重叠并且是通过多至50、100、或200个核苷酸分离的。在实施例中，使用两个gRNA可以增加特异性，例如，通过降低脱靶结合(Ran2013)。

在实施例中，单一切口可以用于诱导HDR。在此考虑了可以将单一切口用于增加HR与NHEJ在给定切割位点的比率。

双链断裂或单链断裂相对于靶位置的布置

在这些链中一条中的双链断裂或单链断裂应当足够接近于靶位置，以使得改变发生。在实施例中，距离不多于50、100、200、300、350或400个核苷酸。尽管不希望受到理论的束缚，但认为断裂应当足够接近于靶位置，以使得断裂在末端切除过程中在经受外切核酸酶介导的去除的区域内。

在实施例中，为了诱导HDR介导的置换的目的，其中gRNA(单分子(或嵌合)或模块化gRNA)和RNA指导的核酸酶诱导双链断裂，切割位点在远离靶位置0-200bp(例如，0-175、0至150、0至125、0至100、0至75、0至50、0至25、25至200、25至175、25至150、25至125、25至100、25至75、25至50、50至200、50至175、50至150、50至125、50至100、50至75、75至200、75至175、75至150、75至125、75至100bp)之间处。在实施例中，切割位点在远离靶位置0-100bp(例如，0至75、0至50、0至25、25至100、25至75、25至50、50至100、50至75或75至100bp)之间处。

在实施例中，为了诱导HDR介导的置换的目的，其中与Cas9切口酶复合的两个gRNA(独立地为单分子(或嵌合)或模块化gRNA)诱导两个单链断裂，较近的切口在远离靶位置0-200bp(例如，0-175、0至150、0至125、0至100、0至75、0至50、0至25、25至200、25至175、25至150、25至125、25至100、25至75、25至50、50至200、50至175、50至150、50至125、50至100、50至75、75至200、75至175、75至150、75至125、75至100bp)之间处，并且理想地这两个切口彼此将在25-55bp之内(例如，25至50、25至45、25至40、25至35、25至30、30至55、30至50、30至45、30至40、30至35、35至55、35至50、35至45、35至40、40至55、40至50、40至45bp)并且彼此远离不超过100bp(例如，彼此远离不超过90、80、70、60、50、40、30、20、10或5bp)。在实施例中，切割位点在远离靶位置0-100bp(例如，0至75、0至50、0至25、25至100、25至75、25至50、50至100、50至75或75至100bp)之间处。

在一个实施例中，两个gRNA(例如，独立地为单分子(或嵌合)或模块化gRNA)被配置成将双链断裂定位在靶位置的两侧。在替代性实施例中，三个gRNA(例如，独立地为单分子的(或嵌合的)或模块化的gRNA)被配置成将双链断裂(即，一个gRNA与cas9核酸酶复合)和两个单链断裂或成对单链断裂(即，两个gRNA与Cas9切口酶复合)定位在靶位置的任一侧。在另一个实施例中，四个gRNA(例如，独立地为单分子的(或嵌合的)或模块化的gRNA)被配置成在靶位置的任一侧产生两对单链断裂(即，两对的两个gRNA与Cas9切口酶复合物)。理想地，一个或多个双链断裂或成对的两个单链切口中更近者将在靶位置的0-500bp之内(例如，离靶位置不超过450、400、350、300、250、200、150、100、50或25bp)。当使用切口酶时，成对的两个切口彼此在25-55bp(例如，在25至50、25至45、25至40、25至35、25至30、50至55、45至55、40至55、35至55、30至55、30至50、35至50、40至50、45至50、35至45、或40至45bp之间)之内并且彼此远离不超过100bp(例如、不超过90、80、70、60、50、40、30、20或10bp)。

同源臂的长度

同源臂应该至少延伸远至可发生末端切除的区域，例如，以便允许所切除的单链突出端在供体模板内找到互补区域。总长度可由如质粒大小或病毒包装限制之类的参数进行限制。在实施例中，同源臂不延伸到重复元件(例如，ALU重复、LINE重复)中。

示例性同源臂长度包括至少50、100、250、500、750或1000个核苷酸。

如本文所使用的，靶位置是指由Cas9分子依赖性方法修饰的靶核酸(例如，RHO基因)上的位点。例如，靶位置可以是进行靶核酸的修饰Cas9分子切割和模板核酸定向修饰(例如，改变)的靶位置。在实施例中，靶位置可以是在其中添加进一个或多个核苷酸的靶核酸上两个核苷酸(例如，相邻的核苷酸)之间的位点。靶位置可以包括一个或多个通过模板核酸改变的(例如，敲除的)核苷酸。在实施例中，靶位置在靶结构域(例如，gRNA结合至的序列)之内。在实施例中，靶位置是靶结构域(例如，gRNA结合至的序列)的上游或下游。

如本文所用的术语模板核酸，是指可以与RNA指导的核酸酶分子和gRNA分子结合用于改变靶位置的结构的核酸序列。在实施例中，对靶核酸进行修饰以具有模板核酸的一些或全部序列，典型地在一个或多个切割位点处或附近。在实施例中，模板核酸是单链的。在替代实施例中，模板核酸是双链的。在实施例中，模板核酸是DNA(例如，双链DNA)。在替代实施例中，模板核酸是单链DNA。在实施例中，模板核酸如Cas9和gRNA在相同的载体骨架例如AAV基因组，质粒DNA上编码。在实施例中，模板核酸在体内从载体骨架上切除，例如其侧翼为gRNA识别序列。

在实施例中，模板核酸通过参与同源定向修复事件来改变靶位置的结构。在实施例中，模板核酸改变靶位置的序列。在实施例中，模板核酸导致修饰的或非天然发生的碱基掺入靶核酸中。

典型地，模板序列经历断裂介导或催化的与靶序列的重组。在实施例中，模板核酸包括与通过eaCas9介导的切割事件切割的靶序列上的位点相对应的序列。在实施例中，模板核酸包括与在第一Cas9介导的事件中被切割的靶序列上的第一位点、以及在第二Cas9介导的事件中被切割的靶序列上的第二位点二者相对应的序列。

在实施例中，模板核酸可以包括导致所翻译序列的编码序列改变的序列(例如，导致蛋白产物中一种氨基酸取代另一种的序列(例如，将突变型等位基因转化成野生型等位基因、将野生型等位基因转化成突变型等位基因、和/或引入终止密码子、氨基酸残基的插入、氨基酸残基的缺失、或无意义突变))。

在其他实施例中，模板核酸可以包括导致非编码序列改变的序列(例如，外显子或5’或3’非翻译区或非转录区中的改变)。此类改变包括控制元件(例如，启动子、增强子)中的改变、以及顺式作用或反式作用控制元件中的改变。

可以使用与RHO基因中靶位置具有同源性的模板核酸来改变靶序列的结构。可以将模板序列用于改变不想要的结构(例如，不想要的或突变型核苷酸)。

模板核酸包括以下组分：

[5’同源臂]-[置换序列]-[3’同源臂]。

同源臂提供用于重组到染色体中，因此用置换序列置换了不希望的元件(例如，突变或标签)。在实施例中，同源臂侧翼于最远端切割位点。

在实施例中，5’同源臂的3’端是紧邻置换序列的5’端的位置。在实施例中，5’同源臂可以从置换序列的5’端延伸至少10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、或2000个核苷酸5’。

在实施例中，3’同源臂的5’端是紧邻置换序列的3’端的位置。在实施例中，3’同源臂可以从置换序列的3’端延伸至少10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、或2000个核苷酸3’。

示例性模板核酸

示例性模板核酸(在本文中也被称为供体构建体)包含RHO基因的一个或多个核苷酸。在某些实施例中，模板核酸包含RHO cDNA分子。在某些实施例中，模板核酸序列可经密码子修饰为抵抗与gRNA分子的杂交。

下表7提供了示例性模板核酸。在实施例中，模板核酸包括来自表7的一行的5’同源臂和3’同源臂。在其他实施例中，来自第一列的5’同源臂可以与来自表7的3’同源臂组合。在每个实施例中，5’和3’同源臂的组合包括置换序列，例如胞嘧啶(C)残基。

表7

基因组编辑方法中gRNA的实例

如本文所述的gRNA分子可以与产生双链断裂或单链断裂的RNA指导的核酸酶分子(例如，Cas9或Cpf1分子)一起使用，以改变靶核酸的序列，例如靶位置或靶基因标签。本领域技术人员将能够基于本披露确定可与本文披露的方法和治疗方式结合使用的其他合适gRNA分子。合适的gRNA分子包括但不限于美国专利申请号US2017/0073674A1和国际公开号WO 2017/165862 A1中描述的那些，将它们各自的全部内容通过引用并入本文。

VI.靶细胞

在多种细胞中，可以将RNA指导的核酸酶分子(例如，Cas9或Cpf1分子)和gRNA分子(例如，Cas9或Cpf1分子/gRNA分子复合物)用于操纵细胞，例如以编辑靶核酸。

在一些实施例中，通过编辑(例如，改变)一个或多个靶基因(例如，如本文所述的)来操纵细胞。在一些实施例中，例如，在体内调节一个或多个靶基因(例如，本文所述的一个或多个靶基因)的表达。在其他实施例中，例如，离体调节一个或多个靶基因(例如，本文所述的一个或多个靶基因)的表达。

可以将本文所述的RNA指导的核酸酶分子(例如，Cas9或Cpf1分子)、gRNA分子、和RHO cDNA分子递送至靶细胞。在实施例中，靶细胞是来自眼睛的细胞，例如视网膜细胞，例如光受体细胞。在实施例中，靶细胞是视锥光受体细胞或视锥细胞。在实施例中，靶细胞是视杆光受体细胞或视杆细胞。在实施例中，靶细胞是黄斑视锥光受体细胞。在示例性实施例中，黄斑中的视锥光受体细胞被靶向，即，黄斑中的视锥光受体细胞是靶细胞。

合适的细胞还可以包括干细胞，通过举例，如胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、造血干细胞、神经元干细胞和间充质干细胞。在实施例中，细胞是诱导型多能干细胞(iPS)细胞或衍生自iPS细胞(例如，从受试者产生的iPS细胞)的细胞，被修饰以改变(例如，敲除)突变型RHO基因并将外源RHO cDNA递送至细胞，以及分化为视网膜祖细胞或视网膜细胞(例如，视网膜光受体细胞)，并将该细胞注射到受试者的眼睛中，例如通过视网膜下注射，例如在视网膜的黄斑下区。

VII.递送、配制品和施用途径

组分(例如，RNA指导的核酸酶分子(例如，Cas9或Cpf1分子)、gRNA分子、和RHOcDNA分子)可以多种形式递送或配制，参见例如表8-9。在实施例中，例如，通过AAV载体递送一个RNA指导的核酸酶分子(例如，Cas9或Cpf1分子)、一个或多个(例如，1、2、3、4、或更多个)gRNA分子、和RHO cDNA分子的序列。在实施例中，编码RNA指导的核酸酶分子(例如，Cas9或Cpf1分子)的序列、编码一个或多个(例如，1、2、3、4、或更多个)gRNA分子的一个或多个序列、以及RHO cDNA分子的序列存在于相同的核酸分子(例如，AAV载体)上。在实施例中，编码RNA指导的核酸酶分子(例如，Cas9或Cpf1分子)的序列存在于第一核酸分子(例如，AAV载体)上，并且编码一个或多个(例如，1、2、3、4、或更多个)gRNA分子的一个或多个序列、以及RHO cDNA分子的序列存在于第二核酸分子(例如，AAV载体)上。在实施例中，编码RNA指导的核酸酶分子(例如，Cas9或Cpf1分子)的序列存在于第一核酸分子(例如，AAV载体)上，并且编码一个或多个(例如，1、2、3、4、或更多个)gRNA分子的一个或多个序列存在于第二核酸分子(例如，AAV载体)上，并且RHO cDNA分子的序列存在于第三核酸分子(例如，AAV载体)上。

当RNA指导的核酸酶分子(例如，Cas9或Cpf1分子)、gRNA、或RHO cDNA组分被编码在DNA中递送时，该DNA将典型地包括控制区(例如，包含启动子)以实现表达。用于RNA指导的核酸酶分子(例如，Cas9或Cpf1分子)序列的有用的启动子包括CMV、EFS、EF-1a、MSCV、PGK、CAG、hGRK1、hCRX、hNRL、和hRCVRN控制启动子。对于gRNA有用的启动子包括H1、EF-1a和U6启动子。用于RHO cDNA序列的有用的启动子包括CMV、EFS、EF-1a、MSCV、PGK、CAG、hGRK1、hCRX、hNRL，和hRCVRN控制启动子。在某些实施例中，用于RHO cDNA和RNA指导的核酸酶分子序列的有用的启动子包括RHO启动子序列。在某些实施例中，RHO启动子序列可以是最小RHO启动子序列。在某些实施例中，最小RHO启动子序列可包含SEQ ID NO:44中所示的序列。在一些实施例中，最小RHO启动子包含不超过100bp、不超过200bp、不超过250bp、不超过300bp、不超过400bp、不超过500bp、不超过600bp、不超过700bp、不超过800bp、不超过900bp、或不超过1000bp的内源RHO启动子区(例如，自RHO转录起始位点上游高达3000bp的区)。在一些实施例中，最小RHO启动子包含不超过100bp、不超过200bp、不超过250bp、不超过300bp、不超过400bp、不超过500bp、或不超过600bp的在内源RHO基因的转录起始位点近端的序列，以及RHO启动子的远端增强子区或其片段。在某些实施例中，最小RHO cDNA启动子可以是视杆特异性启动子。在某些实施例中，RHO cDNA启动子可以是人视蛋白启动子。适合用于本文提供的方法、组合物和治疗方式的RHO启动子和工程化启动子变体包括，例如，Pellissier 2014中描述的那些；以及国际专利申请PCT/NL 2014/050549、PCT/US 2016/050809、和PCT/US2016/019725中描述的那些，将它们各自的全部内容通过引用并入本文。

在实施例中，启动子是组成型启动子。在另一个实施例中，启动子是组织特异性启动子。可以选择具有类似或不同强度的启动子来调谐组分的表达。编码RNA指导的核酸酶分子的序列可以包括核定位信号(NLS)，例如，SV40 NLS。在实施例中，编码RNA指导的核酸酶分子的序列包含至少两个核定位信号。在实施例中，用于RNA指导的核酸酶分子、gRNA分子、或RHO cDNA分子的启动子可以独立地是诱导型、组织特异性、或细胞特异性的。为了检测RNA指导的核酸酶的表达，可以使用亲和标签。有用的亲和标签序列包括但不限于3xFlag标签、单一Flag标签、HA标签、Myc标签或HIS标签。表12中披露了示例性亲和标签序列。为了调节RNA指导的核酸酶表达(例如，在哺乳动物细胞中)，可以使用多聚腺苷酸化信号(聚(A)信号)。表13中披露了示例性多聚腺苷酸化信号。

表8提供了其中可以将组分递送至靶细胞的形式的实例。

表8

表9概括了RNA指导的核酸酶系统的组分(例如，如本文所述的Cas9或Cpf1分子组分、gRNA分子组分、和RHO cDNA分子组分)的各种递送方法。

表9

表10描述了可在AAV载体中用于RNA指导的核酸酶(例如，Cas9或Cpf1)表达的示例性启动子序列。

表10.RNA指导的核酸酶启动子序列

表11描述了可在AAV载体中用于RHO cDNA的示例性启动子序列。

表11.RHO cDNA启动子序列

表12描述了可在AAV载体中例如用于RNA指导的核酸酶(例如，Cas9或Cpf1)表达的示例性亲和标签序列。

表12.示例性亲和标签序列

表13描述了可在AAV载体中例如用于RNA指导的核酸酶(例如，Cas9或Cpf1)表达的示例性多聚腺苷酸化(聚A)序列。

表13.示例性聚A序列

表14描述了可在AAV载体中使用的示例性反向末端重复(ITR)序列。

表14.来自示例性AAV血清型的ITR的序列

以下提供了本文所述的重组AAV基因组组分的另外的示例性序列。

示例性U6启动子序列：

本文描述了示例性gRNA靶向结构域序列(例如，在表1-3和18中)。

本领域技术人员将理解，在一些实施例中，例如当gRNA由U6启动子驱动时，向gRNA靶向结构域序列添加5’G可能是有利的。

示例性gRNA支架结构域序列：

示例性N-ter NLS核苷酸序列：

示例性N-ter NLS氨基酸序列：PKKKRKV(SEQ ID NO:82)。

如本文所述的示例性Cas9核苷酸序列。

如本文所述的示例性Cas9氨基酸序列。

如本文所述的示例性Cpf1核苷酸序列。

如本文所述的示例性Cpf1氨基酸序列。

示例性C-ter NLS序列：CCCAAGAAGAAGAGGAAAGTC(SEQ ID NO:83)。

示例性C-ter NLS氨基酸序列：PKKKRKV(SEQ ID NO:84)。

示例性聚(A)信号序列：

示例性3xFLAG核苷酸序列：

示例性3xFLAG氨基酸序列：

DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK(SEQ ID NO:51)。

示例性间隔子序列：

示例性SV40内含子序列：

在某些方面，本披露集中于编码CRISPR/RNA指导的核酸酶基因组编辑系统和RHOcDNA分子的AAV载体，以及使用这些载体治疗adRP。图2中示意了示例性AAV载体基因组，其示出了这些载体的某些固定和可变元件：第一AAV载体，其包含ITR、RNA指导的核酸酶(例如，Cas9)编码序列和用于驱动其表达的启动子，其中该RNA指导的核酸酶编码序列侧翼为NLS序列；以及第二AAV载体，其包含ITR、一个RHO cDNA序列和用于驱动其表达的最小RHO启动子、以及一个gRNA序列和用于驱动其表达的启动子序列。图3和16-18中还列出了另外的示例性AAV载体基因组。SEQ ID NO:8-11中列出了示例性AAV载体基因组序列。

首先参看本披露的核酸或AAV载体中利用的gRNA，一个或多个gRNA可用于剪切突变型RHO基因的5’区(例如，5’UTR、外显子1、外显子2、内含子1、外显子1/内含子边界)。在某些实施例中，突变型RHO基因的5’区中的剪切导致突变型RHO基因的敲除或功能丧失。在某些实施例中，一个或多个gRNA可用于剪切突变型RHO基因的编码区(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5)或突变型RHO基因的非编码区(例如，5’UTR、内含子、3’UTR)。在某些实施例中，突变型RHO基因的编码区或非编码区中的剪切会导致突变型RHO基因的敲除或功能丧失。

表1-3和18中列出了示例性指导物(DNA和RNA序列两者)的靶向结构域序列。

在一些实施例中，本披露中使用的gRNA可以衍生自金黄色葡萄球菌gRNA，并且可以是单分子或模块化的，如下所述。与单分子金黄色葡萄球菌gRNA对应的示例性DNA和RNA序列显示如下：

DNA：[N]_16-

以及

RNA：[N]_16-

DNA：[N]_16-

以及

RNA：[N]_16-

应注意靶向结构域可具有任何适宜长度。在本披露的各种实施例中使用的gRNA优选地在其5’末端包括长度为16至24个(包括)碱基的靶向结构域，并且任选地包括如图所示的3’U6终止序列。

在一些情况下，可以使用模块化指导物。在上述示例性单分子gRNA序列中，对应于crRNA(下划线)的5’部分通过GAAA接头连接到对应于tracrRNA(双下划线)的3’部分。本领域技术人员将理解，可以使用与下划线和双下划线部分对应的两部分模块化gRNA。

本领域技术人员将理解，本文所述的示例性gRNA设计可通过以下所述或本领域已知的多种方式进行修饰；此类修饰的引入在本披露的范围内。

AAV载体中一个或多个gRNA的表达可由一对U6启动子(如人U6启动子)驱动。如Maeder中所述的示例性U6启动子序列为SEQ ID NO：78。

接着参看RNA指导的核酸酶，在一些实施例中，该RNA指导的核酸酶可以是Cas9或Cpf1蛋白。在某些实施例中，Cas9蛋白是化脓链球菌Cas9。在某些实施例中，Cas9蛋白是金黄色葡萄球菌Cas9。在本披露的另外的实施例中，Cas9序列经修饰以包括Cas9蛋白的C-末端和N-末端的两个核定位序列(NLS)以及微-多聚腺苷酸化信号(或聚-A序列)。本文提供了示例性Cas9序列和Cpf1序列。这些序列本质上是示例性的而不是限制性的。本领域技术人员将理解，在某些应用中，这些序列的修饰可以是可能的或期望的；此类修饰在下文中描述，或为本领域已知的，且在本披露的范围内。

本领域技术人员还将理解，多聚腺苷酸化信号在本领域中被广泛使用并已知，并且在本披露的实施例中可以使用任何合适的多聚腺苷酸化信号。SEQ ID NO:56-58中列出了示例性多聚腺苷酸化信号。

在本披露的某些载体中，Cas9表达可由以下三种启动子之一驱动：巨细胞病毒(CMV)(即，SEQ ID NO:45)、延伸因子-1(EFS)(即，SEQ ID NO:46)、或人g蛋白受体偶联的激酶-1(hGRK1)(即，SEQ ID NO:47)，其在视网膜光受体细胞中特异性表达。启动子序列的修饰在某些应用中是可能的或期望的，并且此类修饰在本披露的范围内。在某些实施例中，Cas9表达可由本文所述的RHO启动子(例如，最小RHO启动子(250bp)SEQ ID NO:44)驱动。

接着参看RHO cDNA，在一些实施例中，RHO cDNA分子可以是野生型RHO cDNA(例如，SEQ ID NO:2)。在某些实施例中，RHO cDNA可以是密码子修饰的cDNA，以抵抗与gRNA的杂交。在某些实施例中，RHO cDNA分子没有经密码子修饰为抵抗与gRNA的杂交。在某些实施例中，RHO cDNA分子可以是密码子优化的cDNA，以提供视紫红质蛋白(例如，SEQ ID NO:13-18)的增加的表达。在某些实施例中，RHO cDNA可以包含经修饰的3’UTR，例如来自高表达的稳定的转录物(α或β珠蛋白)的3’UTR。SEQ ID NO:38-42中列出了示例性3’UTR。在某些实施例中，RHO cDNA可以包括一个或多个内含子(例如，SEQ ID NO:4-7)。在某些实施例中，RHOcDNA可以包括截短的一个或多个内含子。

在某些实施例中，RHO cDNA表达可由视杆特异性启动子驱动。在某些实施例中，RHO cDNA表达可由本文所述的RHO启动子(例如，最小RHO启动子(250bp)SEQ ID NO:44)驱动。

根据本披露的AAV基因组通常并入衍生自AAV5血清型的反向末端重复(ITR)。示例性左侧和右侧ITR分别是SEQ ID NO:63(AAV5左侧ITR)和SEQ ID NO:72(AAV5右侧ITR)。在某些实施例中，示例性左侧和右侧ITR分别是SEQ ID NO:92(AAV左侧ITR)和SEQ ID NO:93(AAV右侧ITR)。然而，应注意，本领域使用了AAV5 ITR的许多修改版本，并且本文所示的ITR序列是示例性的，并非旨在进行限制。这些序列的修饰是本领域已知的，或者对技术人员来说是显而易见的，因此包括在本披露的范围内。

gRNA、RNA指导的核酸酶、RHO cDNA启动子是可变的，并且可以从本文提供的列表中选择。为了清楚起见，本披露涵盖包含这些元件的任何组合的核酸和/或AAV载体，但某些组合可优选用于某些应用。

在各种实施例中，第一核酸或AAV载体可以编码以下：左侧和右侧AAV ITR序列(例如，AAV5 ITR)、用于驱动RNA指导的核酸酶(例如，由Cas9核酸分子编码的Cas9或由Cpf1核酸编码的Cpf1)的表达的启动子(例如，CMV、hGRK1、EFS、RHO启动子)、RNA指导的核酸酶核酸分子侧翼的NLS序列，并且第二核酸或AAV载体可以编码以下：左侧和右侧AAV ITR序列(例如，AAV5 ITR)、用于驱动包含靶向结构域序列(例如，根据表1-3或18中的序列的序列)的指导RNA的表达的U6启动子、以及用于驱动RHO cDNA分子的表达的RHO启动子(例如，最小RHO启动子)。

核酸或AAV载体还可以包含猿猴病毒40(SV40)剪接供体/剪接受体(SD/SA)序列元件。在某些实施例中，SV40 SD/SA元件可以位于启动子和RNA指导的核酸酶基因(例如，Cas9或Cpf1基因)之间。在某些实施例中，科扎克(Kozak)共有序列可位于RNA指导的核酸酶(例如，Cas9或Cpf1)的起始密码子之前，以确保RNA指导的核酸酶(例如，Cas9或Cpf1)稳健表达。

在一些实施例中，核酸或AAV载体与上述核酸或AAV载体中的一种共享至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。

应注意，上述这些序列是示例性的，并且可以不破坏其编码的元件的工作原理的方式进行修饰。此类修饰(其中一些在下面讨论)在本披露的范围内。不限制前文，本领域技术人员将理解本披露的元件的DNA、RNA或蛋白质序列可以不中断其功能的方式变化，而且基本上相似(例如，大于90％、95％、96％、97％、98％或99％序列相似性，或者在短序列如gRNA靶向结构域的情况下，序列的差异不超过1、2或3个核苷酸)的各种相似序列可用于本文所述的各种系统、方法和AAV载体。此类修饰的序列在本披露的范围内。

可以将上述AAV基因组包装到AAV衣壳(例如，AAV5衣壳)中，这些衣壳可以包含在组合物(如药物组合物)中和/或施用于受试者。根据本披露的包含AAV衣壳的示例性药物组合物可包括药学上可接受的载剂，例如平衡盐溶液(BSS)和一种或多种表面活性剂(例如Tween20)和/或热敏或反向热敏聚合物(例如普朗尼克(pluronic))。本领域已知的其他药物配制品元件也可适用于在本文所述组合物中使用。

根据本披露的包含AAV载体的组合物可以通过任何合适的方式施用于受试者，包括但不限于注射，例如视网膜下注射。选择组合物中AAV载体的浓度，以确保除其他外，向受试者的视网膜施用足够的AAV剂量，同时考虑到注射装置内的死体积和可安全施用于视网膜的相对有限的体积。合适的剂量可以包括，例如，1x10¹¹个病毒基因组(vg)/mL、2x10¹¹个病毒基因组(vg)/mL、3x10¹¹个病毒基因组(vg)/mL、4x10¹¹个病毒基因组(vg)/mL、5x10¹¹个病毒基因组(vg)/mL、6x10¹¹个病毒基因组(vg)/mL、7x10¹¹个病毒基因组(vg)/mL、8x10¹¹个病毒基因组(vg)/mL、9x10¹¹个病毒基因组(vg)/mL、1x10¹²vg/mL、2x10¹²个病毒基因组(vg)/mL、3x10¹²个病毒基因组(vg)/mL、4x10¹²个病毒基因组(vg)/mL、5x10¹²个病毒基因组(vg)/mL、6x10¹²个病毒基因组(vg)/mL、7x10¹²个病毒基因组(vg)/mL、8x10¹²个病毒基因组(vg)/mL、9x10¹²个病毒基因组(vg)/mL、1x10¹³vg/mL、2x10¹³个病毒基因组(vg)/mL、3x10¹³个病毒基因组(vg)/mL、4x10¹³个病毒基因组(vg)/mL、5x10¹³个病毒基因组(vg)/mL、6x10¹³个病毒基因组(vg)/mL、7x10¹³个病毒基因组(vg)/mL、8x10¹³个病毒基因组(vg)/mL、或9x10¹³个病毒基因组(vg)/mL。可以将任何合适体积的组合物递送至视网膜下空间。在一些情况下，选择体积以在视网膜下空间形成泡，例如1微升、10微升、50微升、100微升、150微升、200微升、250微升、300微升等。

可以靶向视网膜的任何区，尽管中央凹(从眼睛中心向外延伸大约1度)在某些情况下可能是优选的，这是由于中央凹在中央视力中的作用以及在那里的相对于视网膜的外围区的相对高浓度的视锥光受体细胞。可替代地或另外地，注射可以靶向中央凹周围区(在偏离中心向外延伸大约2到10度之间)，其特征在于存在视杆和视锥光受体细胞。此外，可以使用穿过视网膜中线的针路径以相对锐角向中央凹周围凹区进行注射。例如，注射路径可从巩膜靠近角膜缘的鼻侧延伸，穿过玻璃体腔，进入颞侧的中央凹周围视网膜，从巩膜的颞侧延伸至鼻侧的中央凹周围视网膜，从位于角膜上方的巩膜部分到下方中央凹周围位置，和/或从巩膜下部到上方中央凹周围位置。使用相对于视网膜表面的较小的注射角度可以有利地减少或限制载体从泡溢出到玻璃体的可能性，从而减少载体在递送过程中的损失。在其他情形中，可以靶向黄斑(包括中央凹)，并且在其他情形中，可以靶向另外的视网膜区，或者可以接收溢出剂量。

为了减轻眼部炎症和相关的不适感，可以在施用包含AAV载体的组合物之前、期间和/或之后，施用一种或多种皮质类固醇。在某些实施例中，皮质类固醇可以是口服皮质类固醇。在某些实施例中，口服皮质类固醇可以是强的松(prednisone)。在某些实施例中，在施用包含AAV载体的组合物之前，可施用皮质类固醇作为预防剂。例如，皮质类固醇可在施用包含AAV载体的组合物前一天，或在施用包含AAV载体的组合物前2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天施用。在某些实施例中，皮质类固醇可以在施用包含AAV载体的组合物之后1周至10周(例如，施用包含AAV载体的组合物之后1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、或10周)施用。在某些实施方案中，皮质类固醇治疗可在施用包含AAV载体的组合物之前(例如，施用前一天，或施用前2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天)和之后(例如，施用后1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、或10周)施用。例如，皮质类固醇治疗可以在AAV载体施用前3天开始，直到施用后6周。

皮质类固醇的合适的剂量可以包括，例如，0.1mg/kg/天至10mg/kd/天(例如，0.1mg/kg/天、0.2mg/kg/天、0.3mg/kg/天、0.4mg/kg/天、0.5mg/kg/天、0.6mg/kg/天、0.7mg/kg/天、0.8mg/kg/天、0.9mg/kg/天、或1.0mg/kg/天)。在某些实施例中，在皮质类固醇治疗期间，可以较高的剂量施用皮质类固醇，然后再逐渐减少皮质类固醇的剂量。例如，0.5mg/kg/天的皮质类固醇可以施用4周，然后逐渐减量15天(0.4mg/kg/天施用5天，然后0.2mg/kg/天施用5天，然后0.1mg/kg/天施用5天)。如果手术后(例如，手术后4周内)分级量表上的玻璃体炎症增加了1+，则可以增加皮质类固醇的剂量。例如，当患者接受0.5mg/kg/天的剂量时，如果分级量表上的玻璃体炎症增加1+(例如，手术后4周内)，则皮质类固醇剂量可增加至1mg/kg/天。如果术后4周内出现任何炎症，则可以延迟减量。

为了临床前开发的目的，根据本披露的系统、组合物、核苷酸和载体可以使用视网膜外植体系统进行离体评估，或使用动物模型，如小鼠、兔、猪、非人灵长类动物等进行体内评估。视网膜外植体任选地保持在支持基质上，并且AAV载体可以通过注射到光受体层和支持基质之间的空间中来递送，以模拟视网膜下注射。用于视网膜移植的组织可以从人或动物受试者(例如小鼠)上获得。

外植体对于研究gRNA、RNA指导的核酸酶、和病毒转导后的视紫红质蛋白的表达，以及研究相对较短的间隔内的基因组编辑特别有用。这些模型还允许比动物模型中可能有的更高的通量，并且可以预测动物模型和受试者中的表达和基因组编辑。小型(小鼠、大鼠)和大型动物模型(如兔、猪、非人灵长类动物)可用于药理学和/或毒理学研究，以及在接近临床使用的条件和体积下测试本披露的系统、核苷酸、载体和组合物。因为选择模型系统是为了再现人类解剖学和/或生理学的相关方面，在这些系统中获得的数据通常(尽管不一定)可以预测根据本披露的AAV载体和组合物在人和动物受试者中的行为。

RNA指导的核酸酶分子、gRNA分子、和/或RHO表达盒的基于DNA的递送

可以通过本领域已知或如本文所述的方法将编码RNA指导的核酸酶分子(例如，Cas9或Cpf1分子)、gRNA分子、和/或RHO cDNA分子的DNA施用于受试者或递送到细胞中。例如，编码RNA指导的核酸酶(例如，Cas9或Cpf1)的DNA、编码gRNA的DNA、和/或RHO cDNA可以通过例如通过载体(例如，病毒或非病毒载体)、非基于载体的方法(例如，使用裸DNA或DNA复合物)或其组合进行递送。

在一些实施例中，通过载体(例如，病毒载体/病毒或质粒)递送编码RNA指导的核酸酶(例如，Cas9或Cpf1)的DNA、编码gRNA的DNA、和/或RHO cDNA。

载体可以包含编码编码RNA指导的核酸酶的DNA、编码gRNA的DNA、和/或RHO cDNA分子的序列。载体还可以包含编码融合到例如RNA指导的核酸酶序列上的信号肽(例如，用于核定位、核仁定位、线粒体定位)的序列。例如，载体可以包含融合到编码RNA指导的核酸酶(例如，Cas9或Cpf1)分子的序列上的核定位序列(例如，来自SV40)。

一个或多个调节/控制元件(例如，启动子、增强子、内含子、多腺苷酸化信号、科扎克共有序列、内部核糖体进入位点(IRES)、2A序列和剪接受体或供体)可以被包括在载体中。在一些实施例中，启动子由RNA聚合酶II识别(例如，CMV启动子)。在其他实施例中，启动子被RNA聚合酶III识别(例如，U6启动子)。在一些实施例中，启动子是受调控的启动子(例如，诱导型启动子)。在其他实施例中，启动子是组成型启动子。在一些实施例中，启动子是组织特异性启动子。在一些实施例中，启动子是病毒启动子。在其他实施例中，启动子是非病毒启动子。

在一些实施例中，载体或递送媒介物是病毒载体(例如，用于产生重组病毒)。在一些实施例中，病毒是DNA病毒(例如，dsDNA或ssDNA病毒)。在其他实施例中，病毒是RNA病毒(例如，ssRNA病毒)。示例性病毒载体/病毒包括例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、痘苗病毒、痘病毒以及单纯疱疹病毒。

在一些实施例中，病毒感染分裂细胞。在其他实施例中，病毒感染非分裂细胞。在一些实施例中，病毒感染分裂和非分裂细胞两者。在一些实施例中，病毒可以整合到宿主基因组中。在一些实施例中，病毒被工程化以具有降低的免疫性(例如，在人类中)。在一些实施例中，病毒是有复制能力的。在其他实施例中，病毒是复制缺陷型的(例如，另外多轮的病毒粒子复制和/或包装所需的基因的一个或多个编码区域被其他基因置换或缺失)。在一些实施例中，病毒引起RNA指导的核酸酶分子、gRNA分子、和/或RHO cDNA分子的瞬时表达。在其他实施例中，病毒引起RNA指导的核酸酶分子、gRNA分子、和/或RHO cDNA分子的持久(例如，至少1周、2周、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、1年、2年、或永久)表达。病毒的包装能力可以在，例如，至少约4kb到至少约30kb(例如，至少约5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb、或50kb)之间变化。

在一些实施例中，通过重组逆转录病毒递送编码RNA指导的核酸酶的DNA、编码gRNA的DNA、和/或RHO cDNA。在一些实施例中，逆转录病毒(例如，莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒)包含(例如，允许整合进宿主基因组中的)逆转录酶。在一些实施例中，逆转录病毒是有复制能力的。在其他实施例中，逆转录病毒是复制缺陷型的(例如，另外多轮的病毒粒子复制和包装所需的基因的一个或多个编码区域被其他基因置换或缺失)。

在一些实施例中，通过重组慢病毒递送编码RNA指导的核酸酶的DNA、编码gRNA的DNA、和/或RHO cDNA。例如，慢病毒是复制缺陷型的(例如，不包含病毒复制所需的一个或多个基因)。

在一些实施例中，通过重组腺病毒递送编码RNA指导的核酸酶的DNA、编码gRNA的DNA、和/或RHO cDNA。在一些实施例中，腺病毒被工程化以在人类中具有减少的免疫性。

在一些实施例中，通过重组AAV递送编码RNA指导的核酸酶的DNA、编码gRNA的DNA、和/或RHO cDNA。在一些实施例中，AAV可以将其基因组合整合到宿主细胞(例如，如本文所述的靶细胞)的基因组中。在一些实施例中，AAV是自我互补腺有关病毒(scAAV)(例如，对一起退火以形成双链DNA的两条链进行包装的scAAV)。可以在所披露的方法中使用的AAV血清型包括AAV1、AAV2、经修饰的AAV2(例如，在Y444F、Y500F、Y730F和/或S662V处的修饰)、AAV3、经修饰的AAV3(例如，在Y705F、Y731F和/或T492V处的修饰)、AAV4、AAV5、AAV6、经修饰的AAV6(例如，在S663V和/或T492V处的修饰)、AAV8、AAV 8.2、AAV9、AAV rh 10，并且假型AAV(如AAV2/8、AAV2/5和AAV2/6)也可以在所披露的方法中使用。

在一些实施例中，通过杂合病毒(例如，本文所述的一种或多种病毒的杂合体)递送编码RNA指导的核酸酶的DNA、编码gRNA的DNA、和/或RHO cDNA。

使用包装细胞形成能够感染宿主或靶细胞的病毒粒子。这样的细胞包括可以包装腺病毒的293细胞和可以包装逆转录病毒的ψ2细胞或PA317细胞。在基因治疗中使用的病毒载体通常由将核酸载体包装进病毒粒子的生产者细胞系产生。载体典型地包含包装以及随后整合进宿主或靶细胞(如果适用的话)所需的最低量序列，而其他病毒序列由编码有待表达的蛋白的表达盒置换。例如，在基因疗法中使用的AAV载体典型地仅具有来自AAV基因组的反向末端重复(ITR)序列，这些序列为包装并在宿主或靶细胞中基因表达所需。失去的病毒功能由包装细胞系反式地提供。此后，将病毒DNA包装进如下细胞系中，所述细胞系含有编码辅助质粒的其他AAV基因，即rep和cap，但缺少ITR序列。所述细胞系还被作为辅助者的腺病毒感染。所述辅助病毒促进AAV载体的复制和从辅助质粒表达AAV基因。由于缺少ITR序列，未以显著的量包装所述辅助质粒。可以通过例如与AAV相比腺病毒更加敏感的热处理减少腺病毒的污染。

在实施例中，病毒载体具有识别细胞类型和/或组织类型的能力。例如，病毒载体可以用不同/替代的病毒包膜糖蛋白进行假型包装；用细胞类型特异性受体进行工程化(例如，对病毒包膜糖蛋白进行基因修饰以结合靶向配体(如肽配体、单链抗体、生长因子))；和/或被工程化为具有双重特异性的分子桥，其中一端识别病毒糖蛋白而另一端识别靶细胞表面的部分(例如，配体-受体、单克隆抗体、亲和素-生物素和化学缀合)。

在实施例中，病毒载体实现细胞类型特异性表达。例如，可以构建组织特异性启动子以仅在靶细胞中限制转基因(Cas9和gRNA)的表达。载体的特异性也可以由转基因表达的微小RNA依赖性控制所介导。在实施例中，病毒载体具有增加的病毒载体和靶细胞膜的融合效率。例如，可以结合融合蛋白(例如，融合感受态血球凝集素(HA))以增加病毒摄取进入细胞中。在实施例中，病毒载体具有核定位的能力。例如，可以将需要分解细胞壁(在细胞分裂期间)并且因此将不感染非分裂细胞的病毒改变成结合病毒的基质蛋白中的核定位肽，由此能够实现非增殖细胞的转导。

在一些实施例中，通过非基于载体的方法(例如，使用裸DNA或DNA复合物)递送编码RNA指导的核酸酶的DNA、编码gRNA的DNA、和/或RHO cDNA。例如，可以通过例如有机改性二氧化硅或硅酸盐(Ormosil)、电穿孔、基因枪、声致穿孔、磁转染、脂质介导的转染、树状聚合物、无机纳米颗粒、磷酸钙、或其组合递送DNA。

在一些实施例中，通过载体和非基于载体的方法的组合递送编码RNA指导的核酸酶的DNA、编码gRNA的DNA、和/或RHO cDNA。例如，病毒体包括与灭活病毒(例如，HIV或流感病毒)组合的脂质体，这可以导致比单独的病毒或脂质体方法更有效的基因转移(例如，在呼吸道上皮细胞中)。

在实施例中，递送媒介物是非病毒载体。在实施例中，非病毒载体是无机纳米颗粒(例如，附接至有效载荷至纳米颗粒的表面)。示例性无机纳米颗粒包括，例如，磁性纳米颗粒(例如，Fe₃MnO₂)、或二氧化硅。可以将纳米颗粒的外表面与带正电荷的聚合物(例如，聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚丝氨酸)缀合，这允许有效载荷的附接(例如，缀合或截留)。在实施例中，非病毒载体是有机纳米颗粒(例如，截留纳米颗粒内的有效载荷)。示例性有机纳米颗粒包括，例如，包含阳离子脂质连同中性辅助脂质的SNALP脂质体，其涂覆有聚乙二醇(PEG)和鱼精蛋白以及涂覆有脂质包衣的核酸复合物。

用于基因转移的示例性脂质示于下表15中。

表15：用于基因转移的脂质

用于基因转移的示例性聚合物示于下表16。

表16：用于基因转移的聚合物

在实施例中，媒介物具有靶向修饰以增加靶细胞摄入纳米颗粒和脂质体(例如，细胞特异性抗原、单克隆抗体、单链抗体、适配体、聚合物、糖、和细胞穿透肽)。在实施例中，媒介物使用融合肽和内体去稳定肽/聚合物。在实施例中，媒介物经历酸触发的构象变化(例如，以加速负荷物的内体逃逸)。在实施例中，使用刺激可切割的聚合物，例如，用于在细胞区室中释放。例如，可以使用在还原性细胞环境中裂解的基于二硫化物的阳离子型聚合物。

在实施例中，递送媒介物是生物非病毒递送媒介物。在实施例中，媒介物是减毒细菌(例如，天然或人工工程化成待侵入性的，但减毒以防止发病原和表达转基因(例如，单核细胞增生李斯特菌、某些沙门氏菌菌株、长双歧杆菌、和修饰的大肠杆菌)、具有营养和组织特异性向性以靶向特定组织的细菌、具有修饰的表面蛋白以改变靶组织特异性的细菌)。在实施例中，媒介物是转基因噬菌体(例如，具有大包装能力、较少免疫原性、含有哺乳动物质粒维持序列并且具有结合的靶向配体的工程化噬菌体)。在实施例中，媒介物是哺乳动物病毒样颗粒。例如，可以产生修饰的病毒颗粒(例如，通过纯化“空心”颗粒，随后用希望的负荷物离体组装病毒)。媒介物也可以被工程化以结合靶向配体从而改变靶组织特异性。在实施例中，媒介物是生物脂质体。例如，生物脂质体是衍生自人类细胞的基于磷脂的颗粒(例如，红细胞血影，其是这些红血细胞分解成衍生自受试者的球状结构(例如，可以通过附接不同组织或细胞特异性配体来实现组织靶向)、或分泌外泌体-受试者(即，患者)衍生的内吞起源的膜结合纳米运载体(30-100nm)(例如，可以产生自不同细胞类型并且因此可以被细胞吸收，而不需要靶向配体)。

在实施例中，递送除了本文所述的RNA指导的核酸酶系统的组分(例如，Cas9或Cpf1分子组分)、gRNA分子组分、和/或RHO cDNA分子组分外的一种或多种核酸分子(例如，DNA分子)。在实施例中，核酸分子在递送RNA指导的核酸酶系统的组分中的一个或多个的同时递送。在实施例中，核酸分子在递送RNA指导的核酸酶系统的组分中的一个或多个之前或之后(例如，小于约30分钟、1小时、2小时、3小时、6小时、9小时、12小时、1天、2天、3天、1周、2周或4周)递送。在实施例中，核酸分子通过与RNA指导的核酸酶系统的组分(例如，Cas9或Cpf1分子组分)、gRNA分子组分、和/或RHO cDNA分子组分中的一个或多个不同的方式递送。核酸分子可以通过本文所述的任何递送方法来递送。例如，核酸分子可以通过病毒载体(例如，整合缺陷型慢病毒)递送，并且RNA指导的核酸酶分子组分、gRNA分子组分、和/或RHOcDNA分子组分可以通过电穿孔递送，例如，使得可以降低由核酸(例如，DNA)引起的毒性。在实施例中，核酸分子编码治疗性蛋白质(例如，本文所述的蛋白质)。在实施例中，核酸分子编码RNA分子(例如，本文所述的RNA分子)。

编码RNA指导的核酸酶分子的RNA的递送

可以通过本领域已知或如本文所述的方法将编码RNA指导的核酸酶分子(例如，本文所述的Cas9或Cpf1分子)的RNA、gRNA分子、和/或RHO cDNA分子递送到细胞(例如，本文所述的靶细胞)中。例如，可以通过例如显微注射、电穿孔、脂质介导的转染、肽介导的递送、或其组合递送RNA指导的核酸酶分子(例如，本文所述的Cas9或Cpf1分子)、gRNA分子、和/或RHO cDNA分子。

递送RNA指导的核酸酶分子蛋白

可以通过本领域已知的方法或如本文所述的方法将RNA指导的核酸酶分子(例如，本文所述的Cas9或Cpf1分子)递送到细胞中。例如，可以通过例如显微注射、电穿孔、脂质介导的转染、肽介导的递送、或其组合递送RNA指导的核酸酶蛋白分子。递送可以伴随编码gRNA的DNA和/或RHO cDNA、或gRNA和/或RHO cDNA。

施用途径

全身施用模式包括口服和肠胃外途径。肠胃外途径包括，通过举例，静脉内、动脉内、骨内、肌内、皮内、皮下、鼻内以及腹膜内途径。全身施用的组分可以被修饰或配制以将这些组分靶向眼睛。

局部施用模式包括，通过举例，眼内、眼眶内、结膜下、玻璃体内、视网膜下或经巩膜途径。在实施例中，与当全身施用(例如，静脉内)相比时，显著较少量的组分(与全身途径相比)可以在局部施用(例如，玻璃体内)时发挥作用。局部施用模式可以降低或消除在全身性施用治疗有效量的组分时可能发生的潜在毒副作用的发生率。

在实施例中，本文描述的组分是通过视网膜下进行递送的(例如，通过视网膜下注射)。视网膜下注射可以直接进入黄斑(例如，黄斑下注射)。

在实施例中，本文描述的组分是通过玻璃体内注射进行递送的。玻璃体内注射具有相对较低的视网膜脱离风险。在实施例中，经玻璃体内递送纳米颗粒或病毒(例如，AAV载体(例如，AAV5载体(例如，经修饰的AAV5载体)、AAV2载体(例如，经修饰的AAV2载体)))。

用于将药剂施用至眼的方法是医学领域中已知的并且可以用于施用本文描述的组分。示例性的方法包括眼内注射(例如，眼球后、视网膜下、黄斑下、玻璃体内和脉络膜内)、离子电渗、滴眼剂、以及眼内植入(例如，玻璃体内、榫体下(sub-Tenons)和结膜下)。

施用可以被提供为周期性推注(例如，视网膜下、静脉内或玻璃体内)或提供为从内部储存器(例如，来自布置在眼内或眼外位置处的植入物(参见，美国专利号5,443,505和5,766,242))或从外部储存器(例如，来自静脉内注射袋)连续输注。可以局部施用组分，例如，通过从固定至眼的内壁的缓释药物递送装置中持续释放或经由定向经巩膜控制释放进入脉络膜中(参见，例如，PCT/US 00/00207、PCT/US02/14279、Ambati 2000a和Ambati2000b)。多种适合用于将组分局部施用至眼睛内部的装置在本领域中是已知的。参见，例如，美国专利号6,251,090、6,299,895、6,416,777、6,413,540、和PCT/US 00/28187。

此外，可以将组分配制成允许经延长的时段释放。释放系统可以包括生物可降解材料或通过扩散释放所并入组分的材料的基质。组分可以在释放系统中均匀或者非均匀分配。多种释放系统可以是有用的，然而，选择适当的系统将取决于具体应用所需要的释放速率。不可降解和可降解的释放系统均可以被使用。适宜释放系统包括聚合物和聚合基质、非聚合基质或无机和有机赋形剂和稀释剂，例如但不限于碳酸钙和糖(例如，海藻糖)。释放系统可以是天然的或合成的。然而，合成释放系统是优选的，因为其通常更可靠、更具可重现性并且产生更明确的释放曲线。可以选择释放系统材料，使得具有不同分子量的组分是通过穿过材料扩散或通过材料降解而释放。

代表性的合成生物可降解聚合物包括例如：聚酰胺，例如聚(氨基酸)和聚(肽)；聚酯，例如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(己内酯)；聚(酸酐)；聚原酸酯；聚碳酸酯；和其化学衍生物(取代、添加化学基团，例如，烷基、亚烷基、羟化、氧化和本领域技术人员常规进行的其他修饰)、共聚物和其混合物。代表性的合成非生物可降解聚合物包括例如：聚醚，例如聚(氧化乙烯)、聚(乙二醇)和聚(环氧丁烷)；乙烯基聚合物-聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯，例如甲基、乙基、其他烷基、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸和甲基丙烯酸和其他，例如聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)和聚(乙酸乙烯酯)；聚(氨酯)；纤维素和其衍生物，例如烷基、羟烷基、醚、酯、硝化纤维素和各种醋酸纤维素；聚硅氧烷；和其任何化学衍生物(取代、添加化学基团，例如，烷基、亚烷基、羟化、氧化和本领域技术人员常规进行的其他修饰)、共聚物和其混合物。

聚丙交酯乙交酯共聚物微球也可以用于眼内注射。典型地，微球是由乳酸和乙醇酸的聚合物构成，其经结构化以形成空心球体。球体的直径可以是约15-30微米，并且可以加载本文所述的组分。

组分的双模或差别递送

RNA指导的核酸酶系统的组分(例如，RNA指导的核酸酶分子组分(例如，Cas9或Cpf1分子组分))、gRNA分子组分、和RHO cDNA分子组分的分别递送，并且更具体地，通过不同模式对这些组分的递送，可以通过例如改善组织特异性和安全性来增强性能。

在实施例中，通过不同模式(或有时在本文中称为差别模式)递送RNA指导的核酸酶分子组分、gRNA分子组分、和RHO cDNA分子组分。本文所使用的，不同或差别模式是指递送模式，这些递送模式赋予受试组分分子(例如，RNA指导的核酸酶分子、gRNA分子、或RHOcDNA分子)不同的药效学或药物代谢动力学特性。例如，递送模式可以导致不同的组织分布，不同的半衰期或不同的时间分布，例如，在所选区室、组织或器官中。

一些递送的模式(例如，通过例如通过自主复制或插入细胞核酸中而在细胞或细胞后代中持续存在的核酸载体来递送)导致组分更持久的表达和存在。实例包括病毒(例如，腺相关病毒或慢病毒)递送。

通过举例，组分(例如，RNA指导的核酸酶分子、gRNA分子、和RHO cDNA分子)可以通过在所递送组分在体内或在特定区室、组织或器官中的所得半衰期或持久性方面不同的模式进行递送。在实施例中，gRNA分子可以通过此类模式进行递送。RNA指导的核酸酶分子组分可以通过导致在体内或特定区室或组织或器官中更低持久性或更少暴露的模式进行递送。RHO cDNA分子组分可以通过与gRNA分子组分和RNA指导的核酸酶分子组分的模式不同的模式递送。

更一般地说，在实施例中，第一递送模式被用于递送第一组分并且第二递送模式被用于递送第二组分。第一递送模式赋予第一药效学或药物代谢动力学特性。第一药效学特性可以是例如组分或编码该组分的核酸在体内、区室、组织或器官中的分布、持久性或暴露。第二递送模式赋予第二药效学或药物代谢动力学特性。第二药效学特性可以是例如组分或编码该组分的核酸在体内、区室、组织或器官中的分布、持久性或暴露。

在实施例中，第一药效动力学或药物代谢动力学特性(例如，分布、持久性或暴露)比第二药效动力学或药物代谢动力学特性更为有限。

在实施例中，选择第一递送模式以优化(例如，最小化)药效动力学或药物代谢动力学特性(例如，分布、持久性或暴露)。

在实施例中，选择第二递送模式以优化(例如，最大化)药效动力学或药物代谢动力学特性(例如，分布、持久性或暴露)。

在实施例中，第一递送模式包括使用较为持久的元件(例如，核酸(例如，质粒或病毒载体(例如，AAV或慢病毒)))。由于此类载体相对持久，从其转录的产物将相对持久。

在实施例中，第二递送模式包括较为短暂的元件(例如，RNA或蛋白)。

在实施例中，第一组分包含gRNA，并且该递送模式是较为持久的(例如，gRNA转录自质粒或病毒载体(例如，AAV或慢病毒))。这些基因的转录将具有极小生理学意义，因为这些基因不编码蛋白质产物，并且这些gRNA不能够单独起作用。第二组分(RNA指导的核酸酶分子)是以瞬时方式递送，例如，作为mRNA或作为蛋白质递送，从而确保完整的RNA指导的核酸酶分子/gRNA分子复合物仅在短时段内存在并有活性。

此外，这些组分可以不同的分子形式或用不同的互为补充以增强安全性和组织特异性的递送载体进行递送。

使用差别递送模式可以增强性能、安全性和功效。例如，可以降低最终脱靶修饰的可能性。通过较不持久的模式递送免疫原性组分(例如，RNA指导的核酸酶分子)可以降低免疫原性，因为来自细菌源Cas酶的肽通过MHC分子展示于细胞表面上。两部分式递送系统可以改善这些缺点。

差别递送模式可以用于将组分递送至不同但重叠的靶区域。在靶区域的重叠以外，活性复合物的形成被最小化。因此，在实施例中，第一组分(例如，gRNA分子)通过第一递送模式进行递送，其导致第一空间(例如，组织)分布。第二组分(例如，RNA指导的核酸酶分子)是通过第二递送模式进行递送，其导致第二空间(例如，组织)分布。在实施例中，第一模式包括选自脂质体、纳米颗粒(例如，聚合物纳米颗粒)、以及核酸(例如，病毒载体)的第一元件。第二模式包含选自该组的第二元件。在实施例中，第一递送模式包括第一靶向元件(例如，细胞特异性受体或抗体)，并且第二递送模式不包括该元件。在实施例中，第二递送模式包括第二靶向元件(例如，第二细胞特异性受体或第二抗体)。

当在病毒递送载体、脂质体或聚合纳米颗粒中递送RNA指导的核酸酶分子时，存在递送至多个组织并且在多个组织中具有治疗活性的可能性，但此时可能希望仅靶向单一组织。两部分式递送系统可以解决这一挑战并且增强组织特异性。如果将gRNA分子和RNA指导的核酸酶分子包装于具有不同但重叠的组织向性的分开的递送媒介物中，那么完全功能复合物仅在两种载体所靶向的组织中形成。

离体递送

在一些实施例中，将表8中描述的组分引入细胞中，然后将其引入受试者中。引入组分的方法可以包括例如表9中所述的任何递送方法。

VIII.经修饰的核苷、核苷酸和核酸

在本披露的一些实施例中，经修饰的核苷和/或经修饰的核苷酸可以存在于核酸(例如，本文提供的gRNA分子)中。本文提供了在本RNA指导的核酸酶技术的上下文中有用的一些示例性核苷、核苷酸、和核酸修饰，并且本领域技术人员将能够基于本披露确定可与本文披露的核苷、核苷酸、和核酸和治疗方式结合使用的其他合适修饰。合适的核苷、核苷酸、和核酸修饰包括但不限于美国专利申请号US2017/0073674A1和国际公开号WO 2017/165862 A1中描述的那些，将它们各自的全部内容通过引用并入本文。

实例

以下实例仅仅是说明性的，并不旨在以任何方式限制本披露的范围或内容。

实例1：筛选用于编辑T细胞中RHO等位基因的gRNA

设计了约430个靶向RHO基因内不同位置的用于与Cas9一起使用的gRNA，并并筛选用于编辑T细胞中的活动。简单地说，SA Cas9和指导RNA以1:2的比率复合(RNP复合)，并通过电穿孔递送给T细胞。RNP电穿孔后三天，从T细胞中提取gDNA，并且从gDNA中PCR扩增靶位点。通过下一代测序(NGS)评估RHO PCR基因产物的测序分析。下表18提供了在T细胞中表现出>0.1％编辑的gRNA的靶向结构域的RNA和DNA序列。这些数据表明，包含表18中列出的靶向结构域gRNA和Cas9支持对RHO基因的编辑。

实例2：HEK293细胞中RHO等位基因的剂量依赖性编辑

选择三个gRNA(这些gRNA的靶位点被预测为在RHO基因的外显子1或外显子2中)RHO-3、RHO-7、和RHO-10(表17)用于进一步优化并测试Cas9的剂量依赖性编辑。简单地说，通过电穿孔将浓度增加的对照质粒(在不靶向人基因组内序列的乱序gRNA情况下表达Cas9)或表达Cas9和gRNA的质粒递送至HEK293细胞。RNP电穿孔后三天，从HEK293细胞中提取gDNA，并且从gDNA中PCR扩增gRNA靶位点。通过NGS评估RHO PCR基因产物的测序分析。Cas9/gRNA质粒浓度的增加支持RHO基因的indel增加到80％(图4)。测序分析表明，增加质粒的浓度导致indel的增加。

表17：靶向RHO基因的gRNA

使用技术人员熟知的用于分析CRISPR-Cas9特异性的两种不同的测定方法(Digenome-seq(消化的基因组测序)和GUIDE-seq测定)评估gRNA(即，RHO-3、RHO-7、RHO-10)和Cas9核糖核蛋白复合物的特异性。在生理条件下，没有检测到RHO-3、RHO-7或RHO-10gRNA与Cas9复合的RNP的明显的脱靶编辑(数据未显示)。

实例3：通过模拟RHO-3、RHO-7和RHO-10gRNA的中靶编辑产生的新RHO等位基因的 特征

预测了RHO等位基因的RHO-3、RHO-7或RHO-10gRNA(参见表17中的靶向结构域)的中靶编辑产生的剪切位点。图5示出了RHO-3、RHO-7、或RHO-10gRNA在RHO人cDNA上的预测的剪切位置以及由此产生的RHO蛋白的长度。预测RHO-3靶向外显子1，预测RHO-10靶向外显子2和内含子2的边界，预测RHO-7靶向RHO cDNA的外显子1和内含子1的边界。预测RHO-3、RHO-10、或RHO-7靶位点上的1个或2个碱基对的缺失会引起RHO cDNA的移码，从而导致RHO蛋白的异常。图6显示了由RHO-3、RHO-10、或RHO-7gRNA编辑产生的预测的RHO等位基因的示意图。

对由RHO-3、RHO-7、或RHO-10gRNA的中靶编辑产生的等位基因的影响进行了表征，以确定使用这些gRNA编辑是否会导致潜在有害的RHO等位基因。简单地说，在CMV启动子的控制下，将野生型(WT)或模拟编辑的RHO等位基因克隆到哺乳动物表达质粒中，并将其进行脂质体转染到HEK293细胞中。模拟编辑的RHO等位基因包括图6中所示的突变型等位基因中的每一种(即，RHO-3(-1、-2、或-3bp)、RHO-10(-1、-2、或-3bp)、或RHO-7(-1bp、-2bp、-3bp))。克隆并测试导致视网膜色素变性的主要形式的众所周知的P23H RHO变体。过表达48小时后，使用ATPLite发光测定(珀金埃尔默公司)评估WT和每个模拟编辑的等位基因的细胞生存力。

虽然WT RHO过表达相比于载体对照(pUC19质粒，上虚线)相对没有诱发细胞毒性，但正如预期P23H RHO导致50％的细胞死亡(下虚线)(图7A)。此外，在RHO-3、RHO-7、或RHO-10gRNA靶位点处表达一或两个碱基对缺失的移码，并没有诱导与WT RHO相比的细胞生存力的明显损失(图7A，参见RHO-3 1和2bp del；RHO-10 1和2bp del；以及RHO-7 1和2bp del)。然而，对于RHO-3和RHO-10靶位点处的框内三个碱基对缺失，细胞生存力有明显损失，这导致细胞死亡水平与P23H RHO相当(图7A，参见RHO-3 3bp del和RHO-10 3bp del)。并非所有gRNA都是如此，因为RHO-7序列处的三个碱基对缺失导致非细胞毒性RHO等位基因(图7A，参见RHO-7 3bp del)。

接下来，为了确定RHO-3、RHO-7、和RHO-10模拟编辑的RHO等位基因是否能够降低RHO的P23H变体的毒性，在CMV启动子的控制下，将图6所示并含有P23H突变的模拟编辑的RHO-3、RHO-7、和RHO-10RHO等位基因克隆到哺乳动物表达质粒中，并将其进行脂质体转染到HEK293细胞中。过表达48小时后，使用ATPLite发光测定(珀金埃尔默公司)评估WT和每个模拟编辑的等位基因的细胞生存力。

在RHO-3、RHO-7、或RHO-10gRNA靶位点处一或两个碱基对缺失的移码的表达降低RHO的P23H变体的毒性，并没有诱导与WT RHO相比的细胞生存力的明显损失(图7B，参见RHO-3 1和2bp del；RHO-10 1和2bp del；以及RHO-7 1和2bp del)。RHO-3和RHO-10靶位点的框内三个碱基对缺失没有降低RHO的P23H变体的毒性，因为细胞生存力有明显损失，这导致细胞死亡水平与P23H RHO相当(图7B，参见RHO-3 3bp del和RHO-10 3bp del)。然而，RHO-7靶序列的三个碱基对缺失降低了RHO的P23H变体的毒性，并产生了非细胞毒性RHO等位基因(图7B，参见RHO-7 3bp del)。

这些数据表明，由RHO-3、RHO-7、或RHO-10gRNA产生的框外RHO编辑是多产且无毒的，而框内编辑的效果取决于gRNA/基因座。

实例4：通过包含Cas9和靶向RHO基因的gRNA的核糖核蛋白编辑非人灵长类动物外 植体

评估了包含靶向RHO基因的RHO-9gRNA和Cas9的核糖核蛋白编辑来自非人灵长类动物(NHP)的外植体的能力。RHO-9gRNA(包含SEQ ID NO:108(RNA)(SEQ ID NO:608(DNA)，表1)中列出的靶向结构域序列)具有交叉反应性，并且可编辑人和NHP RHO序列。

简单地说，从NHP供体收获视网膜外植体并将其转移到24孔板中转孔(trans-well)室的膜上。将300μl的视网膜培养基添加到24孔板(即含有B27(含VitA)50X(20mL)、抗生素-抗真菌剂(5mL)和GlutaMAX 1％(5mL)的Neurobastal-A培养基(无酚红)(470mL))中。在24-48小时后发生了包含RHO-9gRNA、SA Cas9和置换RHO的双AAV的转导。将AAV用视网膜培养基稀释至所需的滴度(10¹²vg/ml)，以获得总浓度为100μl的最终浓度。将稀释/滴定的AAV逐滴添加到24孔板中的外植体顶部。每72小时补充300μl的视网膜培养基。2-4周后，外植体裂解以获得DNA、RNA和蛋白质，用于分子生物学分析。从外植体中提取视杆特异性mRNA(神经视网膜亮氨酸拉链(NRL))并进行测量，以测量外植体中视杆细胞的百分比。还测量了持家RNA(β肌动蛋白(ACTB))，以确定细胞的总数。

如图8所示，每个数据点代表单一的外植体，该外植体可以含有不同数量的视杆光受体细胞。x轴显示通过RT-qPCR测量的ACTB和NRL RNA水平之间的Δ，这是裂解外植体时外植体中视杆细胞的百分比的量度。显示了显著编辑和高比例视杆细胞之间的相关性，表明在具有大量视杆细胞的外植体中可以实现稳健的编辑水平(图8)。这些数据表明，靶向RHO的gRNA可以有效地编辑非人灵长类动物外植体。

实例5：RHO置换型载体的优化

优化RHO置换型载体的各种组分(例如，启动子、UTR、RHO序列)以鉴定用于RHOmRNA和RHO蛋白的最大表达的最佳RHO置换型载体。首先，设计双荧光素酶系统来测试不同长度的RHO启动子对RHO表达的影响。荧光素酶系统的组分包括由骨架中的CMV驱动的海肾荧光素酶，用于归一化质粒浓度和转染效率(图9)。

简单地说，将含有不同长度的RHO启动子和标记有萤火虫荧光素酶的RHO基因(通过自切割T2A肽(100ng/10,000个细胞)分开)的质粒与表达NRL、CRX、和NONo(100ng/10,000)的质粒一起转染到HEK293细胞中，以开启从RHO启动子的表达(参见Yadav 2014，其全部内容通过引用并入本文)。72小时后裂解细胞，并且分析转染效率(萤火虫荧光素酶)和实验变量(NanoLuc)。使用 报告测定系统(普洛麦格公司(Promega Corporation)，目录号N1521)测量发光。测量了来自萤火虫荧光素酶和NanoLuc两者的发光。如图10所示，不同长度的启动子显示具有功能性，包括最小的250bp RHO启动子(SEQ ID NO:44)。

接下来，测试不同的3’UTR，以确定3’UTR是否能够改善RHO mRNA和RHO蛋白的表达。简单地说，来自高度稳定的转录物和基因的3’UTR被克隆到CMV RHO的下游(即，HBA1 3’UTR(SEQ ID NO:38)、短HBA1 3’UTR(SEQ ID NO:39)、TH 3’UTR(SEQ ID NO:40)、COL1A1 3’UTR(SEQ ID NO:41)、ALOX15 3’UTR(SEQ ID NO:42)、和minUTR(SEQ ID NO:56))。将载体(500ng)转染到HEK293细胞(80,000个细胞/孔)中。72小时后裂解细胞，并且分别使用RHO-RT-qPCR和RHO-ELISA测定来确定RHO mRNA和蛋白质表达水平。图11A显示将来自稳定的转录物的3’UTR掺入RHO置换型载体提高了RHO mRNA表达水平。图11B显示将来自稳定的转录物的3’UTR掺入RHO置换型载体也提高了RHO蛋白表达水平。

接下来，将RHO内含子1、2、3、或4的序列的掺入添加到RHO置换型载体中的RHOcDNA(即，分别为SEQ ID NOs:4-7)中，以确定对RHO蛋白表达的影响。将载体(500与250ng)转染到HEK293细胞(80,000个/孔)中。72小时后裂解细胞，并且使用RHO ELISA确定RHO蛋白表达。图12显示内含子的添加影响RHO蛋白表达。

最后，测试不同密码子优化的RHO cDNA构建体(即，SEQ ID NO:13-18)，以确定密码子优化对RHO表达的影响。将载体(500与250ng)转染到HEK293细胞(80,000个/孔)中。72小时后裂解细胞并且使用RHO ELISA确定RHO蛋白表达。图13显示RHO cDNA的密码子优化影响RHO蛋白表达。

实例6：使用自限性Cas9载体系统进行体内编辑，以在成功编辑后降低Cas9水平

在体内测试了表达Cas9和gRNA的双载体系统编辑RHO基因组并使Cas9载体表达无功能的能力。自限性载体系统先前已经公布(参见2018年6月14日公开的WO 2018/106693，其标题为用于内源和来源DNA的单发指导RNA(ogRNA)靶向的系统和方法(Systems andMethods for One-Shot guide RNA(ogRNA)Targeting of Endogenous and Source DNA)，其全部内容通过引用并入本文)。简单地说，产生了Cas9载体系统，其中该Cas9载体包含Cas9 cDNA(SD Cas9)中RHO gRNA的靶位点。施用SD Cas9和RHO载体六周后，评估Cas9蛋白水平、Cas9 AAV和RHO的编辑。

图14A表明SD Cas9载体系统展示出对Cas9水平的成功沉默。图14B表明携带SDCas9系统的载体系统在RHO基因座上产生了稳健的编辑，尽管与编码野生型Cas9序列的载体系统相比，水平略低。

实例7：通过包含靶向RHO基因的gRNA和Cas9的核糖核蛋白编辑人外植体

评估了包含靶向RHO基因的RHO-9gRNA(表1)和Cas9的核糖核蛋白编辑人外植体的能力。简单地说，从一个人供体收获视网膜外植体并将其转移到24孔板中转孔室的膜上。将300μl的视网膜培养基添加到24孔板(即含有B27(含VitA)50X(20mL)、抗生素-抗真菌剂(5mL)和GlutaMAX 1％(5mL)的Neurobastal-A培养基(无酚红)(470mL))中。比较了不同的“敲低和置换”策略：“shRNA”：用靶向RHO基因的shRNA和提供RHO cDNA的置换型载体转导视网膜外植体(如Cideciyan 2018年发表)；“载体A”：双载体系统(载体1，其包含由最小RHO启动子(250bp)驱动的saCas9；以及载体2，其包含密码子优化的RHO cDNA(密码子6(SEQ IDNO:18))且包含由最小250bp RHO启动子控制的HBA1 3’UTR，以及由U6启动子控制的RHO-9gRNA)；“载体B”：除包含wt RHO cDNA的载体2之外，与“载体A”相同的双载体系统；以及“UTC”：未转导的对照。将各自的AAV用视网膜培养基稀释至所需的滴度(1x10¹²vg/ml)，以获得总浓度为100μl的最终浓度。将稀释/滴定的AAV逐滴添加到24孔板中的外植体顶部。每72小时补充300μl的视网膜培养基。4周后，外植体裂解以获得蛋白质，用于分子生物学分析。测量RHO蛋白:总蛋白的比率。数据表明载体A(包含最小250bp启动子、RHO cDNA、HBA1 3’UTR、和RHO-9gRNA)导致RHO蛋白的稳健表达(图15)。

实例8：向有需要的患者施用基因编辑系统

向患有adRP的人类患者施用包含两个基于AAV5的表达载体的基因编辑系统。

载体1包含编码金黄色葡萄球菌Cas9蛋白的核酸序列(在GRK1启动子的控制下或在RHO最小启动子(例如，250bp RHO启动子)的控制下)，每个位点侧翼上都有核定位序列。

载体2包含编码一个或多个指导RNA的核酸序列，每个都在U6启动子的控制下。一个或多指导RNA的靶向结构域独立地选自以下序列：

RHO-1：GUCAGCCACAAGGGCCACAGCC(SEQ ID NO:100)

RHO-2：CCGAAGACGAAGUAUCCAUGCA(SEQ ID NO:101)

RHO-3：AGUAUCCAUGCAGAGAGGUGUA(SEQ ID NO:102)

RHO-4：CUAGGUUGAGCAGGAUGUAGUU(SEQ ID NO:103)

RHO-5：CAUGGCUCAGCCAGGUAGUACU(SEQ ID NO:104)

RHO-6：ACGGGUGUGGUACGCAGCCCCU(SEQ ID NO:105)

RHO-7：CCCACACCCGGCUCAUACCGCC(SEQ ID NO:106)

RHO-8：CCCUGGGCGGUAUGAGCCGGGU(SEQ ID NO:107)

RHO-9：CCAUCAUGGGCGUUGCCUUCAC(SEQ ID NO:108)

RHO-10：GUGCCAUUACCUGGACCAGCCG(SEQ ID NO:109)

RHO-11：UUACCUGGACCAGCCGGCGAGU(SEQ ID NO:110)

编码指导RNA的核酸序列在U6启动子的控制下。载体2进一步包含在最小RHO启动子序列(其包含RHO远端增强子的一部分和RHO近端启动子区的一部分)控制下的核酸，该核酸包含编码RHO 5’-UTR的上游序列、RHO cDNA和编码HBA13’-UTR的下游序列。载体2的[启动子]-[5’UTR]-[cDNA]-[3’UTR]序列如下：

当使用包含与RHO cDNA中存在的野生型RHO序列结合的靶向结构域的指导RNA时，RHO cDNA的密码子修饰版本可替代包含在上述核酸构建体中的RHO cDNA。

根据本领域已知的方法，将载体1和载体2包装成病毒颗粒，并以约300微升的1x10¹¹-3x10¹¹个病毒基因组(vg)/mL的剂量通过视网膜下注射递送给患者。施用后对患者进行监测，并定期评估与adRP相关的一种或多种症状。例如，患者定期接受视杆光受体细胞功能评估，例如，通过暗视微视野检查。在施用载体1和载体2约一年后，患者显示出至少一种adRP相关症状的改善，例如，视杆功能的稳定，其特征在于与患者或适当的对照组在没有临床干预的情况下预期的视杆功能水平相比，视杆功能得到改善。

表18：在HEK293T细胞中提供>0.1％的RHO等位基因编辑的gRNA

通过引用并入

本文提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用以其整体而特此并入，如同每一单独的出版物、专利或专利申请具体且单独地指明通过引用而并入一样。在有冲突的情况下，以本申请(包括本文的任何定义)为准。

等效物

本领域的普通技术人员仅使用常规实验就应认识到或能够确定本文所述的本披露的具体实施例的许多等效物。此类等效物旨在由以下权利要求涵盖。

另外的序列

可以在某些实施例中使用的示例性序列在下面列出：

AAV ITR：

U6启动子：

示例性saCas9 gRNA原型间隔子：

指导RNA支架序列：

最小RHO启动子(250bp)：

SV40内含子：

密码子优化的RHO-编码序列1(密码子1)：

密码子优化的RHO-编码序列2(密码子2)：

密码子优化的RHO-编码序列3(密码子3)：

密码子优化的RHO-编码序列4(密码子4)：

密码子优化的RHO-编码序列5(密码子5)：

密码子优化的RHO-编码序列6(密码子6)：

血红蛋白A1(HBA1)3’UTR：

最小UTR(最小聚A)：

反向ITR序列：

示例性置换型载体(250bp最小RHO启动子驱动密码子优化的RHO cDNA；U6启动子驱动靶向RHO的gRNA)(参见图16对特征的注释)：

Cas9载体2(250bp最小RHO启动子驱动Cas9 w/α珠蛋白UTR)(参见图17对于特征的注释)：

Cas9载体1(550bp最小RHO启动子驱动具有SV40聚A信号的wt Cas9)(参见图18对于特征的注释)：

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其他实施例在权利要求书中。