新的小麦cenh3等位基因

文档序号：1821189 发布日期：2021-11-09 浏览：7次 >En<

阅读说明：本技术 新的小麦cenh3等位基因 (Novel wheat CENH3 allele ) 是由吕建于鲲魏娟刘春霞周红菊 K·J·凯利赫于 2019-10-10 设计创作，主要内容包括：提供了具有引起着丝粒组蛋白H3(CENH3)中氨基酸序列改变的突变的小麦植物,其具有单倍体诱导物的生物活性。此外,提供了产生所述小麦植物和通过将所述小麦植物与野生型小麦植物杂交而获得单倍体和双单倍体小麦植物的方法。(Wheat plants having a mutation resulting in an alteration of the amino acid sequence in centromere histone H3(CENH3) are provided which have the biological activity of a haploid inducer. Furthermore, methods of producing said wheat plants and obtaining haploid and doubled haploid wheat plants by crossing said wheat plants with wild type wheat plants are provided.)

新的小麦CENH3等位基因

技术领域

本披露涉及农业领域。特别地，本披露涉及CenH3蛋白和编码它们的多核苷酸、产生单倍体以及后续加倍单倍体植物的方法、以及其衍生的植物和种子，特别是在小麦物种中。

要求优先权

根据巴黎公约，本申请要求于2018年10月12日提交的PCT/CN 2018/110063的优先权，其全文并入本文。

序列表

本申请附有一个序列表，该序列表定名为81696WOPCT_ST25.txt，创建于2019年9月30日，大小为约112千字节。本序列表通过引用以其全文并入本文。本序列表随同此申请经由EFS-Web提交，并且符合37 C.F.R.§1.824(a)(2)-(6)和(b)。

背景技术

育种材料中高度的杂合性会使植物的育种和有益性状的选择非常耗时。即使使用最新的分子育种工具，进行广泛的群体筛查既费力又昂贵。事实证明，创建单倍体植物后进行化学或自发的基因组加倍是解决高杂合性问题并加速育种过程的有效方法。此类技术也被称为双单倍体生产系统。所述双单倍体生产系统的使用使育种者可以通过全基因组复制在单个世代的所有基因座上实现纯合。这有效地消除了对自交或回交的需要，其中通常至少需要7代自交或回交才能将杂合性降低到可接受的水平。

可以根据不同的方法产生单倍体植物。例如，可以通过使用称为小孢子培养的方法在一些作物中产生单倍体植物。但是，该方法昂贵、耗时且不适用于所有作物。在一些作物物种中，可以通过卵细胞的孤雌生殖或通过消除亲本基因组之一来获得(双)单倍体植物。但是，此类方法不是最佳方法，因为它们仅适用于少数几种选定的作物物种，且(双)单倍体植物的产量相当低。

WO 2011/044132披露了一种产生单倍体植物的方法，所述方法由灭活或改变或敲除植物中着丝粒特异性H3(CenH3)蛋白组成。第一步，所述方法包括消除或敲除植物中的内源性CenH3基因。在第二步中，将编码突变或改变的CenH3蛋白的表达盒引入所述植物中。所述突变或改变的CenH3蛋白是通过将任选地带有GFP标签的H3.3 N末端结构域融合到内源性CenH3组蛋白折叠结构域中而产生的。这种方法也被称为“GFP-尾交换(tailswap)”或“尾交换”(也在Britt和Kuppu,Front Plant Sci.[植物科学前沿]2016；7:357中进行了综述)。携带有这种尾交换的植物与野生型植物(即具有功能性内源性CenH3蛋白而没有尾交换)的杂交导致单亲基因组消除，进而导致单倍体植物的产生。通过向内源性CenH3(没有尾交换)的N末端添加GFP，也发现了一些单倍体诱导，尽管频率较低。然而，这种方法不理想，因为它费力、费时并且需要产生转基因植物。

WO 2014/110274描述了一种生产单倍体植物的方法，所述方法包括将表达内源性CenH3基因的第一植物与称为单倍体诱导植物的第二植物杂交，所述第二植物具有来自至少两个物种的基因组，其中大部分基因组来自第一物种，并且所述基因组包含来自第二物种的异源基因组区域，其中所述异源基因组区域编码不同于第一物种的CenH3的CenH3多肽(也描述于Maheshwari等人,PLoS Genet.[PLoS遗传学]2015年1月26日；11(1):e1004970)。但是，这种方法并不是最佳方法，因为它遇到了与上述相同的隐患——费力、费时并且需要产生转基因植物。此外，所述方法关联着单倍体植物的低产量。

其他方法包括在CenH3蛋白或编码所述CenH3蛋白的CenH3基因的C末端组蛋白折叠结构域中引入一个或多个导致单个氨基酸改变的点突变。CenH3蛋白的C末端组蛋白折叠结构域的此类突变的实例报道于Karimi-Ashtiyani等人(2015)Proc Natl Acad Sci[美国科学院院刊]U S A.2015年9月8日；112(36):11211-16；Kuppu,等人(2015)PLoS Genet.[PLoS遗传学]2015年9月9日；11(9):e1005494.。但是，此类方法的成功由于某些原因而减弱，因为发现并非所有这些突变都足以在与野生型植物杂交以产生单倍体植物后诱导单亲基因组消除。

普通小麦(Triticum aestivum)是在对其进行基因编辑或基因突变方面特别复杂的生物，因为它是六倍体生物。经过数千年的进化和与祖先小麦物种的若干杂交育种，普通小麦包含三个基因组：A(可能来自一粒小麦(T.monoccum)或单粒小麦(Einkorn wheat))、B(可能来自斯氏山羊麦(T.searsii))和D(可能来自节节麦(T.tauschii))。每个基因组有7条染色体。普通小麦的每个基因组都有两个拷贝，即AA BB DD；因此，它共有42条染色体(6个完整的基因组，每个具有7条染色体)。通常参见www.cerealsdb.uk.net/cerealgenomics/WheatBP/Documents/DOC_Ev olution.php上的The Evolution of Wheat[小麦的进化]，最后访问于2019年7月10日。此外，一个基因的一个拷贝中的编辑或突变可能不会在普通小麦中表现出可观察到的效果，因为另外的5个拷贝可能会补偿突变型拷贝。为了真正观察敲除突变的效果，必须将所有6个拷贝都进行突变。

因此，仍然难以捉摸的是，CenH3蛋白或编码CenH3蛋白的CenH3基因中的哪些突变或修饰能够或足以诱导单亲基因组消除以产生单倍体植物。因此，在本领域中仍然需要允许有效产生单倍体植物的替代或改良方法(例如，劳动强度低，耗时少，成本低和/或不一定需要制备转基因植物)，其随后可以加倍以产生双单倍体植物。使用双单倍体生产系统，可以在一个世代中实现纯合。

发明内容

为了满足该需求，本发明的一个实施例是一种小麦植物，其至少包含A基因组、B基因组和D基因组，其中所述B基因组在CENH3基因中包含敲除突变，并且任选地，其中所述D基因组在CENH3基因中包含的敲除突变，并且进一步地，其中所述A基因组包含突变的CENH3基因，所述突变的CENH3基因在内含子的5'剪接位点包含至少一个敲低突变。在一方面，所述敲低突变是经修复读框移位突变或大缺失突变。在另一个实施例中，所述小麦植物针对所述B基因组中CENH3基因敲除突变是纯合的。在一个替代实施例中，所述小麦植物针对所述B基因组中CENH3基因敲除突变是双等位基因。在另一个实施例中，所述小麦植物针对所述D基因组中CENH3基因敲除突变是纯合的。在一个替代实施例中，所述小麦植物针对所述D基因组中CENH3基因敲除突变是双等位基因。在又另一个实施例中，所述小麦植物针对所述B基因组和所述D基因组中CENH3基因敲除突变是纯合的、是双等位基因或其组合。在另一个实施例中，所述小麦植物针对所述经修复读框移位CENH3突变是纯合的；或者它针对所述经修复读框移位CENH3突变是杂合的；或者它针对所述经修复读框移位CENH3突变是双等位基因。

本发明的另一方面是产生单倍体诱导小麦植物的方法，所述方法包括：(a)至少获得包含至少三个基因组的小麦植物细胞；(b)使所述三个基因组中的两个突变，以获得CENH3基因纯合敲除突变；(c)使第三个基因组突变，以获得CENH3基因纯合敲低突变；以及(d)从中产生在所述三个基因组中的两个的CENH3基因中包含纯合敲除突变并且进一步在所述第三个基因组的CENH3基因中包含纯合敲低突变的小麦植物；由此在与野生型小麦植物杂交时，由步骤(d)产生的所述小麦植物产生单倍体后代。在一个实施例中，所述三个基因组包含A基因组、B基因组和D基因组。在另一个实施例中，所述CENH3基因敲除突变发生在所述B和D基因组中。在又另一个实施例中，所述CENH3基因敲低突变发生在所述A基因组中。在一方面，所述A基因组中的所述CENH3基因敲低突变是经修复读框移位突变。在另一方面，所述经修复读框移位突变选自由以下组成的组：SEQ ID NO:56、与SEQ ID NO:56具有70％同一性的核酸序列、SEQ ID NO:63、与SEQ ID NO:63具有70％同一性的核酸序列、SEQ IDNO:69以及与SEQ ID NO:69具有70％同一性的核酸序列。

本发明的另一方面是一种小麦植物，其包含突变的CENH3基因，所述突变的CENH3基因在N末端结构域中包含至少一个缺失突变，导致读框移位、经修复读框移位或大缺失。又另一方面是一种小麦植物，其包含突变的CENH3基因，所述突变的CENH3基因在N末端结构域中包含至少一个插入突变，导致读框移位、经修复读框移位或大缺失。

本发明的另一方面是一种在细胞的基因中产生工程化的经修复读框移位的方法，其包括：(a)使所述基因组与定点核酸酶(“SDN”)和至少两个指导核酸接触，其中所述至少两个指导核酸靶向所述基因内的至少两个靶序列；(b)允许所述SDN在所述至少两个靶序列处切割所述基因，从而丢失在所述至少两个靶序列之间的间插序列；并允许发生内源性DNA修复；由此所述内源性DNA修复导致具有工程化的经修复读框移位的基因。在一个实施例中，步骤(b)的所述丢失的间插序列包含(N)个碱基对，其中(N)是3的倍数。

本发明的又另一方面是一种产生单倍体小麦植物的方法，其包括：(a)获得小麦植物；(b)使所述小麦植物与包含突变的CENH3基因的所述小麦植物杂交；以及(c)选择从所述杂交步骤产生的后代；其中所述后代是单倍体小麦植物。在一个实施例中，步骤(a)的所述小麦植物是父本。在另一个实施例中，步骤(a)的所述小麦植物是母本。在另一个实施例中，所述方法包括将所述后代小麦植物转化为双单倍体小麦植物的进一步步骤。

本发明的另一个方面是提供一种小麦植物，其包含突变的CENH3等位基因，所述突变的CENH3等位基因包含与选自由SEQ ID NO:53-73组成的组的序列具有至少70％同一性的核酸序列，其中所述突变是经修复读框移位突变，并且其中所述小麦植物与野生型二倍体小麦植物杂交时产生单倍体后代。在一个实施例中，所述小麦植物包含所述突变的CENH3等位基因的至少一个拷贝；在另一个实施例中，所述小麦植物包含所述突变的CENH3等位基因的至少两个拷贝；在又另一个实施例中，所述小麦植物包含所述突变的CENH3等位基因的至少三个拷贝。在一个实施例中，所述突变的CENH3等位基因包含与SEQ ID NO:53-73具有80％、90％、95％或100％同一性的核酸序列。

附图说明

图1显示了TaCenH3α基因结构和相对gRNA位置。外显子进行了编号并用粗条表示。内含子用细线表示。两者的长度均用宽度表示。

定义

本发明不限于本文描述的具体方法、方案、细胞系、植物物种或属类、构建体和试剂。本文使用的术语仅出于描述具体实施例的目的，而无意限制本发明的范围，本发明将仅由所附权利要求限制。应当注意的是，如本文和所附权利要求中所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个/种”和“该/所述”包括复数指代。因此，例如，提及“一种植物”是提及一种或多种植物并且包括本领域技术人员已知的其等效物等。如本文所用，词语“或”意指具体清单的任何一个成员并且还包括该清单的成员的任何组合(即，还包括“和”)。

术语“约”在本文用于表示大约、大致、约或在......左右。当术语“约”结合数值范围来使用时，它通过将边界延伸至高于以及低于所阐明的数值来限定这个范围。通常，术语“约”在本文中用于将数值限定至以20％的变化，优选地10％上下(更高或更低)地高于以及低于规定值。关于温度，术语“约”意指±1℃，优选±0.5℃。当术语“约”被用于本发明的上下文中(例如与温度或分子量值组合)时，确切值(即，无“约”)是优选的。

如本文所用，术语“扩增”意指使用至少一种核酸分子作为模板，构建核苷酸分子的多个拷贝或与该核酸分子互补的多个拷贝。扩增系统包括聚合酶链式反应(PCR)系统、连接酶链式反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA，安大略省密西索加的坎基尼公司(Cangene，Mississauga，Ontario))、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)、以及链置换扩增(SDA)。参见，例如，Diagnostic Molecular Microbiology:Principles andApplications[诊断分子微生物学：原理与应用],PERSING等人编,华盛顿美国微生物学会(American Society for Microbiology,Washington,D.C.),(1993)。扩增产物被称为“扩增子”。

术语“双等位基因”是指既不纯合(AA或aa)也不杂合(Aa)的基因对。更确切地说，所述对中的两个基因均已编辑，但不相同。例如，本发明中A染色体上的CenH3基因对可以在一个等位基因中包含一个RFS突变，导致表达时基因的敲除，而另一个等位基因包含基因敲除突变。这可以象征性地表示为“A*a”，并且指示双等位基因突变。

术语“特定DNA序列”表示与另一种指定序列具有大于80％、优选大于85％、更优选大于90％、甚至更优选大于95％、还更优选大于97％、最优选大于99％的核苷酸序列同源性的多核苷酸序列。

“cDNA”是指与mRNA互补并衍生自mRNA的单链或双链DNA。如本文所用，术语“组蛋白H3蛋白的着丝粒特异性变体”(“CenH3蛋白”或简称为“CENH3”)是指作为动粒复合物的成员的蛋白。CenH3蛋白也被称为CENP-A蛋白。动粒复合物位于染色单体上，在细胞分裂过程中纺锤体纤维附着在其中，从而将姊妹染色单体拉开。CenH3蛋白属于一类良好表征的蛋白质，是H3组蛋白的变体。这些蛋白对于适当的动粒的形成和功能是必不可少的，并有助于动粒与DNA缔合。缺乏CenH3的细胞无法将动粒蛋白定位在染色单体上，并且显示出强烈的染色体分离缺陷(即，来自植物的所有表达缺陷CenH3蛋白的染色体都被消除或丢失，导致体细胞的倍性发生变化(例如，减少染色体组的数量(诸如二倍体到单倍体))。因此，CenH3蛋白在双单倍体生产系统中的潜在用途已受到广泛研究。CenH3蛋白的特征在于通过钩部分连接的三个α螺旋区域组成的可变尾结构域(也称为“N末端结构域”或“N末端尾结构域”)和保守的组蛋白折叠结构域(也称为“C末端结构域”)。CenH3组蛋白折叠结构域在不同物种的CenH3蛋白之间相对保守。组蛋白折叠结构域位于内源性CenH3蛋白的羧基末端。与组蛋白折叠结构域相反，即使在密切相关的物种之间，CenH3的N末端尾结构域也是高度可变的。

“具有一个或多个活性突变的编码CenH3的多核苷酸”指编码具有一个或多个活性突变的CenH3蛋白的经非内源或内源性突变的编码CenH3的多核苷酸，当存在于植物中而不存在其编码内源性CenH3的多核苷酸和/或内源性CenH3蛋白时，当植物与野生型植物杂交时，所述多核苷酸使植物具有活力，并允许产生单倍体后代或具有异常倍性的后代。包含具有一个或多个活性突变的编码CenH3的多核苷酸的植物可以称为“修饰植物”。与野生型植物杂交后产生的单倍体后代或具有异常倍性的后代的百分比可以为例如至少0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％或更多。引起从编码CenH3的内源性多核苷酸转变为具有一个或多个活性突变的编码CenH3的多核苷酸的突变在本文中称为活性突变。CenH3蛋白环境中的活性突变除其他因素外，可能导致细胞分裂过程中着丝粒负载减少，CenH3蛋白的功能减弱，和/或染色体分离的功能降低。可以通过本领域技术人员熟知的几种方法中的任何一种，例如通过随机诱变(诸如通过用化学或辐射处理种子或植物细胞所诱导的)、定向诱变、应用核酸内切酶的、通过产生部分或完整的蛋白结构域缺失或通过与异源序列融合，来实现将一个或多个活性突变引入编码CenH3的多核苷酸中。

通过敲除或灭活编码内源性CenH3的多核苷酸可以使植物缺乏编码内源性CenH3的多核苷酸。可替代地，可以修饰编码内源性CenH3的多核苷酸以编码无活性或无功能的CenH3蛋白。

可以将包含具有如本文所教导的一个或多个活性突变的编码CenH3的多核苷酸的修饰植物与作为花粉亲本或胚珠亲本的野生型植物杂交。在一个实施例中，具有一个或多个活性突变的CenH3蛋白可包含相对于内源性CenH3蛋白的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20或更多个氨基酸变化。在一个实施例中，具有一个或多个活性突变的编码CenH3的多核苷酸与编码内源性CenH3的多核苷酸(优选在全长上)具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％的序列同一性。技术人员将能够容易地确定本文所教导的修饰植物是否包含一个或多个活性突变。例如，技术人员可以利用诸如SIFT(Kumar P,Henikoff S,Ng PC.(2009)Predicting the effects of coding non-synonymousvariants on protein function using the SIFT algorithm[使用SIFT算法预测编码非同义变体对蛋白功能的影响].Nat Protoc[自然实验手册]；4(7):1073-81.doi:10.1038/nprot.2009.86)的预测工具提出这样的活性突变。然后可在植物中进行所述一个或多个活性突变，并应敲除植物中内源性CenH3蛋白的表达。当与野生型植物杂交后产生的单倍体后代或具有异常倍性的后代的百分比为至少0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％或更多时，可认为所述植物包含一个或多个活性突变。

将一种缺乏编码内源性CenH3的多核苷酸或缺乏内源性CenH3蛋白表达，并且表达具有一个或多个活性突变的CenH3蛋白的植物作为花粉或作为胚珠亲本与野生型植物(即，表达内源性CenH3蛋白)杂交，导致后代为单倍体或显示异常倍性。这样的植物仅包含表达内源性CenH3蛋白的亲本的染色体，而没有表达具有一个或多个活性突变的CenH3蛋白的植物的染色体。

如本文所用，术语“异常倍性”是指细胞包含异常或反常数目的染色体组的情况。例如，当通常的数目为两个时，每个细胞具有一组或三组染色体的细胞是具有异常倍性的细胞。在本发明中，活性突变型CenH3蛋白及其使用方法可用于产生具有异常倍性的突变的植物，例如，用于产生单倍体植物，而非突变型植物是二倍体。所述单倍体植物可用于加速育种程序，以创建纯合系并消除近交需要。

如本文所用的术语“嵌合构建体”、“嵌合基因”、“嵌合多核苷酸”或“嵌合核酸”(和类似术语)是指如下构建体或分子，该构建体或分子包含被组装进单个核酸分子中的不同来源的两个或更多个多核苷酸。术语“嵌合构建体”、“嵌合基因”、“嵌合多核苷酸”或“嵌合核酸”是指任何构建体或分子，该构建体或分子含有(1)多核苷酸(例如，DNA)，包括在自然界中没有被发现在一起的调节多核苷酸和编码多核苷酸(即，至少一个多核苷酸相对于它的其他多核苷酸中的至少一个是异源的)，或(2)编码不是天然毗邻的蛋白质部分的多核苷酸，或(3)不是天然毗邻的启动子部分。另外，嵌合构建体、嵌合基因、嵌合多核苷酸或嵌合核酸可以包含衍生自不同来源的调节多核苷酸和编码多核苷酸，或包含衍生自相同来源、但以与在自然界中所发现的不同的方式进行布置的调节多核苷酸和编码多核苷酸。在本发明的优选的方面中，嵌合构建体、嵌合基因、嵌合多核苷酸或嵌合核酸包含表达盒，该表达盒包含在调节多核苷酸的控制下的、特别地在植物中具有功能性的调节多核苷酸的控制下的本发明的多核苷酸。

在本文所用的术语“染色体”是如本领域公认的，意指细胞核中含有细胞DNA并具有线性基因阵列的自我复制的基因结构。

“编码多核苷酸”是转录成RNA(诸如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、正义RNA或反义RNA)的多核苷酸。优选地，RNA进而在生物中被翻译以产生蛋白质。它可由如在cDNA中的“不间断的编码多核苷酸”构成，即缺乏内含子，或它可包括以适合的剪接点为界的一个或多个内含子。“内含子”是聚(核糖)核苷酸，其包含在原转录本中但通过该细胞内的RNA的裂解和再连接去除以建立可被翻译为蛋白质的成熟mRNA。

如本文所用，术语“双单倍体植物”是指当单倍体细胞经历染色体加倍时形成的基因型。双单倍体的人工生产在植物育种中很重要。双单倍体可以在体内或体外产生。单倍体胚是通过孤雌生殖、假配偶或染色体消除在体内产生的。从单倍体生物产生双单倍体生物的各种各样的体外方法是已知的。体外产生双单倍体的方法的非限制性实例包括用染色体倍增剂诸如秋水仙碱处理体细胞单倍体细胞、单倍体胚、单倍体种子或由单倍体种子产生的单倍体植物。在本发明中，可以通过使单倍体细胞与染色体倍增剂(诸如秋水仙碱)、抗微管除草剂或一氧化二氮接触，从单倍体细胞再生纯合双单倍体植物，以产生纯合双单倍体细胞。染色体加倍的方法披露在，例如，美国专利号5,770,788；7,135,615以及美国专利公开号2004/0210959和2005/0289673；Antoine-Michard,S.等人,Plant Cell,Tissue OrganCult.[植物细胞，组织器官培养],Cordrecht,荷兰,克卢沃学术出版社(Kluwer AcademicPublishers)48(3):203-207(1997)；Kato,A.,Maize Genetics Cooperation Newsletter[玉米遗传合作简讯]1997,36-37；和Wan,Y.等人,Trends Genetics[遗传学趋势]77:889-892(1989)。Wan,Y.等人,Trends Genetics[遗传学趋势]81:205-21 1(1991)，其披露内容通过引用并入本文。双单倍体植物可以进一步与其他植物杂交以产生具有所需性状的植物的Fl、F2或后代。常规近交过程需要七代才能达到大约完全的纯合性，而单倍体倍增则需要一代。

术语“E0”首先是指编辑的植物。即，由例如CRISPR编辑并然后使其成熟成植物的植物细胞已成为E0植物。E1植物是E0的包含编辑后代(通常但不一定是自体受精的)。同样，E2植物是E1植物的包含编辑后代(通常但不一定是自体受精的)。E3、E4、E5等植物同样地与E0植物一代一代远离。

术语“基因编辑”、“编辑”、“基因组编辑”、“GE”等是指在靶序列处进行的位点特异性突变。这也可以称为“定向诱变”。如本文所使用的，术语“定向诱变”或“诱变策略”是指导致所选择的基因的有意诱变的任何诱变方法。定向诱变包括方法CRISPR、TILLING、TALEN和其他尚未发现但可以用于实现相同结果的其他方法。可以根据本领域已知的任何技术进行诱变，例如但不限于合成在特定调节序列的序列内具有一个或多个突变的寡核苷酸。具体地，位点特异性诱变是通过对基础DNA的特异性诱变可用于制备启动子突变体的技术。也可以使用RNA指导的内切核酸酶(“RGEN”，例如CRISPR/Cas9)。例如，结合一个或多个前述考虑，通过将一个或多个核苷酸序列改变引入DNA中，所述技术进一步提供制备和测试序列变体的现成能力。位点特异性诱变允许通过使用编码所希望的突变的DNA序列的特定寡核苷酸序列以及足够数量的相邻核苷酸来提供足够大小和序列复杂性的引物序列以在正在详细研究的缺失连接片段的两侧形成稳定的双链体而产生突变体。典型地，长度为约17个至约75个核苷酸或更多个核苷酸的引物是优选的，其中序列连接片段的两侧上约10个至约25个或更多个残基被改变。通常参见美国专利号10,285,348，其全文通过引用并入本文。

术语“编辑的N末端尾”或“编辑的N末端结构域”在本文全文可互换使用。

在本发明的上下文中与蛋白或基因组合使用的术语“内源性”是指所述蛋白或基因源自仍包含它的植物。通常，内源性基因会以其正常的遗传背景存在于植物中。在另一上下文中，术语“内源性”可以指细胞的正常功能。例如但不限于，“内源性DNA修复”是指细胞的正常DNA修复机制、酶和过程。

当参考多核苷酸(如植物的基因、ORF或其部分、或转基因)使用时，术语“表达”是指通过基因的“转录”(即经由RNA聚合酶的酶促作用)将基因中编码的遗传信息转化为RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)，并在适用的情况下(例如，如果基因编码蛋白)通过mRNA的“翻译”转化为蛋白质的过程。基因表达可以在该过程的许多阶段进行调节。例如，在反义构建体或dsRNA构建体的情况下，各自地表达可仅指该反义RNA或仅指dsRNA的转录。在实施例中，“表达”是指正义(mRNA)或功能性RNA的转录和稳定累积。“表达”还可指蛋白质的产生。

术语核苷酸或氨基酸序列的“同源性”“序列相似性”或“序列同一性”意指两个或更多个序列的同一性或相似性程度，并且可以常规地通过使用已知软件或计算机程序(如Best-Fit或Gap成对比较程序(GCG威斯康星软件包(Wisconsin Package)，威斯康星州麦迪逊科学先驱路575号遗传学计算机集团公司(Genetics Computer Group,575ScienceDrive,Madison,Wis.)，53711)确定。BestFit使用Smith和Waterman，Advances in AppliedMathematics[应用数学进展]2:482-489(1981)的局部同源性算法以找到两个序列之间最佳的同一性或相似性区段。通常通过在比较窗口上比较这两个序列的部分来进行两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列比较，以鉴定并比较序列相似性的局部区域。比较窗口通常是从约20至200个连续核苷酸。Gap使用Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453(1970)的方法执行所有一个序列与所有另一个相似的序列的全局比对。当使用序列比对程序(如BestFit)来确定DNA序列同源性、相似性或同一性的程度时，可以使用默认设置，或者可以选择适当的评分矩阵以优化同一性、相似性或同源性评分。类似地，当使用程序(如BestFit)来确定两个不同氨基酸序列之间的序列同一性、相似性或同源性时，可以使用默认设置，或者可以选择适当的评分矩阵(如blosum45或blosum80)以优化同一性、相似性或同源性评分。

术语“基因座”是指在给定的物种中在染色体上的位置(例如，基因、基因标记物等的位置)。

如本文所用，术语“引物”是指当置于诱导引物延伸产物的合成的条件下(例如在核苷酸和用于聚合的试剂如DNA聚合酶的存在下并且在合适的温度和pH下)时能够退火至扩增靶标的寡核苷酸，该扩增靶标允许DNA聚合酶附接，从而用作DNA合成的起始点。(扩增)引物优选地是单链的，以获得最大的扩增效率。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物通常足够长以在用于聚合的试剂存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括引物的温度和组成(A/T和G/C含量)。一对双向引物由DNA扩增领域中(诸如在PCR扩增中)常用的一个正向引物和一个反向引物组成。应当理解的是，如本文所用，“引物”可以指超过一种引物，特别是在关于待扩增的靶区域的一个或多个末端序列的信息中存在一些模糊性的情况下。因此，“引物”包括含有代表该序列中的可能变异的序列的引物寡核苷酸的集合，或包括允许典型的碱基配对的核苷酸。寡核苷酸引物可以通过任何合适的方法制备。用于制备特异性序列的寡核苷酸的方法是本领域已知的，并且包括例如适当序列的克隆和限制以及直接化学合成。化学合成方法可以包括例如在例如美国4,458,066中披露的磷酸二酯或三酯法、二乙基氨基磷酸酯法和固相载体法。如果需要，可以通过并入可通过例如光谱方法、荧光方法、光化学方法、生物化学方法、免疫化学方法或化学方法检测的手段来对引物进行标记。一种或多种寡聚核苷酸引物的模板依赖性延伸由聚合试剂在适量的四种脱氧核糖核苷酸三磷酸(dATP、dGTP、dCTP和dTTP；即dNTP)或类似物的存在下、在反应介质(包含适当的盐、金属阳离子和pH缓冲体系)中催化。合适的聚合剂是已知催化引物和模板依赖性DNA合成的酶。已知的DNA聚合酶包括例如大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶或其Klenow片段、T4 DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶。用这些DNA聚合酶催化DNA合成的反应条件是本领域已知的。合成的产物是由模板链和引物延伸链组成的双链分子，其包括靶序列。这些产物反过来作为另一轮复制的模板。在第二轮复制中，第一轮循环的引物延伸链用其互补引物退火；合成产生“短”产物，该产物通过引物序列或其互补物在5'-末端和3'-末端两者上结合。变性、引物退火和延伸的重复循环导致由引物限定的靶区域的指数累积。进行足够的循环以实现所需量的含有核酸靶区域的多核苷酸。所需的量可以变化，并且由产物多核苷酸起到的功能决定。PCR方法在手册中已经很好地描述，并且是本领域技术人员已知的。通过PCR进行扩增后，可以通过与探针多核苷酸杂交来检测靶多核苷酸，该探针多核苷酸在低、中度或甚至高度严格的杂交和洗涤条件下与靶序列的多核苷酸形成稳定的杂交体。如果预期探针将与靶序列基本上完全互补(即，约99％或更多)，则可以使用高度严格条件。如果预期有一些错配，例如如果预期变体品种会导致探针不完全互补，则可以降低杂交的严格性。然而，典型地选择排除非特异性/偶然结合的条件。影响杂交并针对非特异性结合而选择的条件是本领域已知的，并且描述于例如Sambrook和Russell,2001中。通常，较低的盐浓度和较高温度增加了杂交条件的严格性。“PCR引物”在本发明的范围内优选地被理解为是指DNA的特定区域的PCR扩增中所用的单链DNA的相对短的片段。

术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文可以互换地使用。

术语“启动子”是指多核苷酸，通常在它的编码多核苷酸的上游(5')，它通过提供对正确转录所需的RNA聚合酶以及其他因子的识别来控制该编码多核苷酸的表达。

术语“定点核酸酶”是指由核苷酸序列指导至DNA链内的靶序列的任何酶。定点核酸酶优选地是基于CRISPR的，但是还可是大范围核酸酶、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、或锌指核酸酶。定点核酸酶可以简称为“SDN”。SDN包括但不限于大范围核酸酶(MN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、Cas9核酸酶、Cpf1(Cas12a)核酸酶、dCas9-FokI、dCpf1-FokI、嵌合Cas9-胞嘧啶脱氨酶、嵌合Cas9-腺嘌呤脱氨酶、嵌合FEN1-FokI、和Mega-TAL、切口酶Cas9(nCas9)、嵌合dCas9非FokI核酸酶和dCpf1非FokI核酸酶；并且进一步地所述指导核酸是指导RNA。

术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指多核苷酸与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)的条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同的情形下将会不同。通过控制该杂交和/或洗涤条件的严格度，能够鉴定与该探针(同源探测)100％互补的靶多核苷酸。可替代地，可调整严格条件以允许序列中的一些错配，使得检测到更低程度的相似性(异源探测)。典型地，严格条件将是以下这些：其中盐浓度小于大约1.5M Na离子、典型地为约0.01至1.0M Na离子(或其他盐)，pH为7.0至8.3，并且对于短探针(例如，10至50个核苷酸)温度为至少30℃而对于长探针(例如，大于50个核苷酸)至少约60℃。还可以通过添加去稳定剂(如甲酰胺)来达到严格条件。示例性低严格条件包括在37℃下使用30％至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(w/v；十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液进行杂交，并且在50℃至55℃下在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性中等严格条件包括在37℃下在40％至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并且在55℃至60℃下在0.5×至1×SSC中洗涤。示例性高严格条件包括在37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并且在60℃至65℃下在0.1×SSC中洗涤。特异性典型地取决于杂交后的洗涤，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度以及温度。对于DNA-DNA杂交物，Tm可以从Meinkoth和Wahl(Anal.Biochem.[分析生物化学],138:267-284,(1984))的等式中进行估计：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺是杂交溶液中甲酰胺的百分比，L是杂交体的碱基对长度。Tm是50％的互补靶序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度及pH下)。每失配1％，Tm降低约1℃；因此，可以调节Tm、杂交和/或洗涤条件以与所需同一性的序列杂交。例如，如果寻找具有大约90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。一般来说，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在限定的离子强度以及pH下的热熔点(Tm)低约5℃。但是，极度严格条件可以在比热熔点(Tm)低1℃、2℃、3℃或4℃下利用杂交和/或洗涤；中度严格条件可以在比热熔点(Tm)低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下利用杂交和/或洗涤；低严格条件可以在比热熔点(Tm)低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃下利用杂交和/或洗涤。使用该方程、杂交和洗涤组成以及所需的Tm，本领域普通技术人员应了解，杂交和/或洗涤溶液严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度以使得可使用较高温度。对核酸杂交的广泛指导见于以下文献中：Tijssen,Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes[生物化学和分子生物学实验室技术-使用核酸探针的杂交]第2章第I部分“Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays[杂交原理和核酸探针测定策略综述]”,纽约爱思唯尔集团(Elsevier,N.Y.)(1993)；以及Current Protocols in Molecular Biology[现代分子生物学实验技术],第2章,Ausubel等人编，纽约格林出版和威利交叉科学公司(Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York)(1995)。严格杂交的方法是本领域已知的，这些条件可以通过本领域已知的方法计算。这披露于Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress),1989,纽约冷泉港(Cold Spring Harbor,N.Y.)以及Current Protocols inMolecular Biology[现代分子生物学实验技术],Ausebel等人编,约翰·威利父子公司(John Wiley and Sons,Inc.),2000中。确定序列同一性百分比的方法是本领域已知的，其实例是GCG计算机序列分析软件(威斯康星州麦迪逊的GCG公司(GCG,Inc,Madison Wis.))。

如本文所用，术语“经修复读框移位”(“RFS”)是指基因中的突变或一系列突变，其单独或组合地中断基因的编码序列，但不改变编码序列的读框。这也可以称为“修复读框同步”。例如，DNA编码序列包含一系列密码子。每个密码子包含三个核苷酸，且每个密码子(转录成RNA时)会在翻译时编码一个氨基酸。所述编码序列中的一个或两个核苷酸的插入/缺失突变(“插缺”)将导致编码框的偏移(“读框移位”)。但是，插入或缺失，无论是单独还是组合，以三个的倍数累积发生，即使编码序列本身发生了变化，也将密码子修复到其原始读框。参见，例如，B.N.Ames和H.J.Whitfield,Jr.,Frameshift Mutagenesis in Salmonella[沙门氏菌读框移位突变],Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.[冷泉港座谈会定量生物学]31:221-225(1966)。例如，并且在该定义的范围内，包含至少两个插缺突变缺失的序列(无论是否连续，并且插缺突变导致阅读框修复至其原始读框)是包含经修复读框移位突变的序列。术语“工程化的经修复读框移位”也可以用来描述已经通过基因组编辑或基因组修饰产生的RFS突变。

如本文所用，术语“大缺失”(“LD”)是指引起几个连续核苷酸丢失的突变。特别地，大缺失是指丢失5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90或100个或更多个核苷酸。在一些实施例中，LD中丢失的序列将是3的倍数(即3、6、9、12、15、18、21、24、27、30等)。在其他实施例中，LD突变也可与同一序列中其他地方的插缺突变一起发生，从而引起经修复读框移位突变。

在本发明的上下文中，术语“野生型”或“野生型植物”的使用是指不携带突变型CenH3蛋白或基因(即，不包含本文所教导的一个或多个活性突变)并且内源性表达或产生功能性CenH3基因和蛋白的植物。

具体实施方式

在这里，我们通过应用CRISPR-Cas9编辑包含5'和3'剪接位点的顺式剪接序列，在小麦(普通小麦)中诱导了可变剪接。我们选择小麦作为靶标模型生物，因为小麦是六倍体，从而赋予了小麦功能基因组冗余性。作为靶基因，我们选择了着丝粒蛋白编码基因CENTROMERIC HISTONE 3(“CenH3”)，因为对该基因的修饰应产生具有作物育种价值的植物。CenH3负责细胞分裂过程中染色体的忠实分离。与H3和其他常规组蛋白不同，CENH3具有长的高变N末端尾。参见J.Monen等人Separase Cleaves the N-Tail of the CENP-ARelated Protein CPAR-1at the Meiosis I Metaphase-Anaphase Transition inC.elegans[分离酶在秀丽线虫减数分裂I中期-后期转变中切割CENP-A相关蛋白CPAR-1的N-尾],PLoS One[公共科学图书馆·综合]10:e0125382(2015)。尾的直接或自然修饰会触发动粒的代偿性变化，这可能使CENH3通过减数分裂或抑制合子染色体分离来驱动物种形成。参见I.Lermontova等人,Knockdown of CENH3 in Arabidopsis reduces mitoticdivisions and causes sterility by disturbed meiotic chromosome segregation[在拟南芥中敲除CENH3减少有丝分裂并通过干扰减数分裂染色体分离导致不育],Plant J[植物杂志]68:40-50(2011)和M.Ravi和R.Bondada,Genome Elimination by TailswapCenH3:In Vivo Haploid Production in Arabidopsis thaliana[通过尾交换CenH3消除基因组：拟南芥体内单倍体的产生],Methods Mol Biol[分子生物学方法]1469:77-99(2016)。用H3尾交换N末端尾导致拟南芥(Arabidopsis)(M.Ravi和S.Chan,Haploid plantsproduced by centromere-mediated genome elimination[着丝粒介导的基因组消除产生的单倍体植物],Nature[自然]464:615-618(2010))和玉米中(T.Kelliher等人,MaternalHaploids are Preferentially Induced by CENH3-tailswap TransgenicComplementation in Maize[玉米中母本单倍体优先由CENH3-尾交换转基因互补诱导],Front.Plant Sci.[植物科学前沿],doi.org/10.3389/fpls.2016.00414 31(7):414(2016)的单倍体诱导。单倍体诱导是异常的繁殖过程，导致一代到下一代的倍性减少。单倍体可以加倍以产生近交系，从而节省了产生新的纯种种群通常需要的六代自花授粉。向作物提供尾交换方法需要多代来组装天然等位基因敲除和稳定插入转基因。我们能够通过直接编辑小麦CenH3的N末端序列来诱导AS。研究了这些新的CenH3序列，以确定突变型CENH3蛋白是否以及以何种组合可能引起小麦的单倍体诱导。在我们描述的情况下，它确实可以。

因此，本发明的一个实施例是一种小麦植物，其至少包含A基因组、B基因组和D基因组，其中所述B基因组在CENH3基因中包含敲除突变，并且任选地，其中所述D基因组在CENH3基因中包含的敲除突变，并且进一步地，其中所述A基因组包含突变的CENH3基因，所述突变的CENH3基因在内含子的5'剪接位点包含至少一个敲低突变。在一方面，所述敲低突变是经修复读框移位突变或大缺失突变。在另一个实施例中，所述小麦植物针对所述B基因组中CENH3基因敲除突变是纯合的。在一个替代实施例中，所述小麦植物针对所述B基因组中CENH3基因敲除突变是双等位基因。在另一个实施例中，所述小麦植物针对所述D基因组中CENH3基因敲除突变是纯合的。在一个替代实施例中，所述小麦植物针对所述D基因组中CENH3基因敲除突变是双等位基因。在又另一个实施例中，所述小麦植物针对所述B基因组和所述D基因组中CENH3基因敲除突变是纯合的、是双等位基因或其组合。在另一个实施例中，所述小麦植物针对所述经修复读框移位CENH3突变是纯合的；或者它针对所述经修复读框移位CENH3突变是杂合的；或者它针对所述经修复读框移位CENH3突变是双等位基因。

本发明的另一方面是产生单倍体诱导小麦植物的方法，所述方法包括：(a)至少获得包含至少三个基因组的小麦植物细胞；(b)使所述三个基因组中的两个突变，以获得CENH3基因纯合敲除突变；(c)使第三个基因组突变，以获得CENH3基因纯合敲低突变；以及(d)从中产生在所述三个基因组中的两个的CENH3基因中包含纯合敲除突变并且进一步在所述第三个基因组的CENH3基因中包含纯合敲低突变的小麦植物；由此在与野生型小麦植物杂交时，由步骤(d)产生的所述小麦植物产生单倍体后代。在一个实施例中，所述三个基因组包含A基因组、B基因组和D基因组。在另一个实施例中，所述CENH3基因敲除突变发生在所述B和D基因组中。在又另一个实施例中，所述CENH3基因敲低突变发生在所述A基因组中。在一方面，所述A基因组中的所述CENH3基因敲低突变是经修复读框移位突变。在另一方面，所述经修复读框移位突变选自由以下组成的组：SEQ ID NO:56，、与SEQ ID NO:56具有70％同一性的核酸序列、SEQ ID NO:63、与SEQ ID NO:63具有70％同一性的核酸序列、SEQ IDNO:69以及与SEQ ID NO:69具有70％同一性的核酸序列。

本发明的另一个方面是提供一种小麦植物，其包含突变的CENH3等位基因，所述突变的CENH3等位基因包含与选自由SEQ ID NO:56-73组成的组的序列具有至少70％同一性的核酸序列，其中所述突变是经修复读框移位突变，并且其中所述小麦植物与野生型二倍体小麦植物杂交时产生单倍体后代。在一个实施例中，所述小麦植物包含所述突变的CENH3等位基因的至少一个拷贝；在另一个实施例中，所述小麦植物包含所述突变的CENH3等位基因的至少两个拷贝；在又另一个实施例中，所述小麦植物包含所述突变的CENH3等位基因的至少三个拷贝。在一个实施例中，所述突变的CENH3等位基因包含与SEQ ID NO:56-73具有80％、90％、95％或100％同一性的核酸序列。

实例

实例1：使用两个N末端指导RNA的理论

CENH3-尾交换转基因在敲除天然CENH3基因的系中异源表达时，会导致单倍体诱导。参见，例如，美国专利申请公开号2019/0136250，其通过引用并入本文。这被称为尾交换法。重要的是，在尾交换单倍体诱导系中没有野生型等位基因。据推测，转基因具有部分功能，并能够产生足够稳定的着丝粒，当纯合时，所述着丝粒足以获得正常发育的植物。但是，当细胞中的尾交换转基因与野生型CENH3异源时，尾交换转基因是不稳定的，并在异交期间导致成功的单倍体诱导。在这些尾交换植物的设计中，至关重要的是敲除天然的CENH3基因，并且尾交换转基因的N末端结构域发生显著变化，而C末端结构域仅发生较小的变化，或优选为零。即使突变型CENH3基因编码保留正常或接近正常功能的CENH3蛋白，也不会发生单倍体诱导。

为了在小麦中实现单倍体诱导，我们直接编辑了六个CENH3α基因以敲除多个拷贝，并在其他拷贝中对N末端结构域(保留C末端结构域完整)进行修饰。根据我们测量所述A、B和D基因组的CENH3α基因表达的实验，我们特别关注在所述A基因组中产生N末端修饰，并在所述B和D基因组中进行敲除。如果我们的编辑成功，我们将保留零拷贝CENH3α正常(完整)：所有基因都将被编辑，但是编辑的结果将有所不同。重要的是，我们的编辑设计不包括任何CENH3转基因——我们只是想通过直接编辑来创建所述A基因组CENH3α的部分功能，N末端修饰版本。

典型地，可以通过CRISPR SDN II基因组编辑(也称为等位基因替换(“AR”)或同源重组(“HR”))对编码蛋白的区域进行较大的改变，但是该技术的效率在植物中非常低，并且仅很少在小麦中实现。因此，我们设计了一种使用两种指导RNA(“gRNA”)进行编辑的策略，这些RNA可能会修饰CENH3α，从而产生部分丧失功能等位基因，所述等位基因的N末端结构域和C末端结构域的天然(未改变)序列有很大的改变(超过5个氨基酸的改变)。这将需要在两个指导RNA位点进行特异性切割。我们知道所选的指导RNA也会编辑CENH3α的B和D基因组的拷贝，这是有意的。实际上，由于两个指导RNA的每个特定编辑结果的不可预测性，我们预期由于编码序列的读框移位导致截短了CENH3α蛋白产物并因此完全敲除了天然基因的过早终止密码子，大多数编辑的等位基因将为完全丧失功能等位基因(在A、B和D基因组拷贝中)。但是，我们也知道，如果敲除CENH3α基因的所有拷贝，由于植物发育需要CENH3α的部分功能，因此这些植物将死亡。如果在A基因组中创建修饰的单倍体诱导等位基因的相同指导物可以同时(在同一植物中)敲除B和D基因组的等位基因，那么它将帮助我们：结果将是构思完美的单倍体诱导系。因此，我们的目的是通过直接编辑使用两个gRNA来模拟尾交换转基因系统，但我们的关键创造性步骤不是进行任何等位基因替代或CENH3α转基因，而是通过在N末端结构域中的两个指导RNA处核酸酶切后通过小的插缺产生了新的修饰变体。

但是，并非每对指导物都有可能组合起来以产生与功能性C末端结构域配对的改变的N末端结构域：并非每对指导物都能产生具有部分功能和单倍体诱导潜能的那些“编辑的N末端尾”改变的拷贝。在检查了编辑会导致氨基酸序列方面的修饰后，许多指导物会导致过早终止密码子。换句话说，我们意识到我们必须专门选择我们预测可以在靶位点产生组合编辑的指导RNA，其将在成熟CENH3α蛋白产物中产生包含N末端结构域显著改变的氨基酸序列，但C末端结构域不受影响。特别地，我们计划筛选植物，并鉴定出那些包含CENH3α的A基因组拷贝的此类高产、N末端修饰的等位基因，以及具有CENH3α的B和D基因组拷贝的敲除等位基因的植物。知道定点核酸酶介导的编辑并非总是在转化过程中立即发生的，因此我们认为在E0代中，我们可能会产生CENH3α基因的一些拷贝的敲除(完全丧失功能)等位基因，以及其他拷贝的部分功能丧失(单倍体诱导)等位基因，并且这些材料可能能够通过自花授粉产生单倍体——假设雄和雌配子(精子和卵细胞)具有不同的编辑方式或等位基因的不同组合，因此潜在的着丝粒不同。换句话说，我们认为我们可能在E1代植物中发现了一些单倍体。我们希望让这些观察结果指导我们选择某些E1植物进行基因分型(即，在自花授粉时会产生一些单倍体的种群中的基因型二倍体同胞)，并鉴定处于纯合状态的部分丧失功能等位基因的E1植物。如果我们能够做到这一点，那么我们将使用那些特定的植物通过异交来测试单倍体诱导率。总而言之，我们认为一旦产生了稳定突变的系，我们就能够测试它们是否真的是单倍体诱导物，但是我们知道我们在第一代就不能这样做，因为编辑可能到了那个时间点还不‘完全’——并且我们需要在E1和E2代的不同基因型中测试和重新测试单倍体诱导。

我们可以从具有适当PAM位点的许多指导RNA中进行选择，但是只有几个选择对可以产生我们所需的单倍体诱导等位基因。关于所需的等位基因，一对指导RNA可以产生此类等位基因的一种方式是编辑第一gRNA靶位点以产生读框移位，然后通过第二靶位点的补偿突变修复读框移位，所述补偿突变将转录物重新回到正确(天然)读框中。这将导致两个指导RNA靶位点之间的间插氨基酸串的N末端结构域氨基酸序列改变，并且将修复C末端结构域的“天然”序列。我们决定将此类等位基因称为经修复读框移位(“RFS”)等位基因。可替代地，在两个指导RNA靶位点同时切割或接近同时切割可能导致间插核酸序列的缺失。在许多情况下，缺失会在下游序列中产生读框移位，但在一些情况下，这种缺失可能恰好将转录物的3'序列留在正常读框中，从而使很大一部分的N末端结构域氨基酸序列在所得的蛋白质产物中不存在，但C末端结构域仍保持完整。我们决定将这些称为大缺失(“LD”)等位基因。最后，在一些情况下，我们将gRNA设计为靶向剪接位点连接，并且在这些靶位点进行编辑可能会生成其他剪接模式(例如，可能导致内含子保留或外显子跳跃)。这些可变剪接(“AS”)等位基因在大多数情况下会导致过早终止密码子和基因敲除，但我们还发现了一种指导RNA，如果进行正确的编辑和正确的剪接，它将不会在读框中导致任何过早终止密码子。取而代之的是，它可能导致成熟转录物中的大量插入，通过插入一段较长的氨基酸而导致N末端结构域的显著改变，但然后在第二靶位点进行的特异性编辑可能会使所述序列回到C末端结构域的读框中。换句话说，利用gRNA的智能设计，可以预测剪接位点突变产生成熟的mRNA转录物变体，这些变体会改变N末端结构域的氨基酸代码，但修复C末端结构域的正常读框和序列。

在以下实例中，我们详细描述了我们回收的特定指导RNA和编辑，以及特定植物中的编辑组合。我们将详细展示如何通过使用两个针对高变N末端结构域的指导RNA直接编辑天然CENH3基因，在小麦中产生单倍体诱导系。按照设计，在某些情况下在两个靶位点均具有突变的植物产生含有对N末端结构域氨基酸序列的显著改变而不会影响C末端结构域氨基酸序列的蛋白产物。我们选择并维护了具有这些类型的编辑的N末端尾改变的等位基因CENH3等位基因的编辑系，并确保CenH3基因的其他拷贝(来自A、B和D基因组)被那些相同的指导RNA产生的突变敲除。我们在具有所需突变的系中回收并测试了单倍体诱导，这些突变包括A基因组RFS等位基因与B和D基因组敲除的组合。这些相同的系，加上我们预料产生单倍体的编辑的正确组合，确实导致了单倍体诱导。

实例2：确定gRNA序列以编辑Fielder基因组的CENH3α基因。

六倍体小麦中有两个CenH3基因，TaCen3α和TaCenH3β。利用针对“中国春_v2”品种基因组序列设计的引物，将两个基因的A、B和D基因组克隆到“Fielder”小麦品种中。给出了序列(SEQ ID NO:1-12)。先前的研究表明，TaCenH3α的病毒诱导基因沉默(“VIGS”)导致矮化和根系繁殖力降低，而TaCenH3β沉默则减少种子结实(Yuan等人,New Phytol.[新植物学家]206(2):839-51.2015)。像大多数小麦基因一样，对A、B和D基因组每个同源物的特定表达模式和功能也没有很好的研究。为了进行基因组编辑，我们选择了对Fielder春小麦品种的TaCenH3α进行修饰，理由是该基因的突变对种子结实的影响不应像TaCenH3β的突变那样多。使用同源物特异性Taqman qPCR测定查询生殖组织(花粉、子房和花药)以及幼叶组织中TaCENH3α-A、TaCENH3α-B和TaCENH3α-D(SEQ ID NO:13-21)的表达水平。TaCenH3α-A和TaCenH3α-B在花药、花粉和卵巢中高水平表达，而TaCenH3α-D表达转录物几乎不存在(表2)。在叶中，TaCenH3α-A是主要的转录物，这可能表明该基因的功能丧失导致TaCenH3α沉默后的矮表型。

表2.TaCenH3α-A、TaCenH3α-B和TaCenH3α-D的相对表达。

相对表达(平均值±SD)

使用NGG PAM位点并根据我们对如果在那些靶位点进行某些编辑会导致CENH3蛋白产物的氨基酸序列类型的预测来选择指导RNA。重要的是，我们考虑的大多数指导RNA都无法生成产生RFS或AS等位基因的编辑组合。我们专注于选择可以想到的几对gRNA。指导RNA1(ACGTCGGCGACACCGGTGCG；SEQ ID NO:25)(下划线是由CRISPR-Cas9复合物诱导的双链断裂切割的大概位点)位于外显子2-内含子2连接区。该gRNA1由TaU6启动子驱动。指导RNA2(CTTGTGGGAGCAGGGGCAAC；SEQ ID NO:26)恰好在TaU6驱动的内含子3-外显子4连接之后靶向。在大多数情况下，指导RNA2不会编辑内含子3的3'剪接受体位点。选择使用两个指导RNA是为了使我们可以在N末端结构域中产生显著改变，例如RFS、LD或AS等位基因，同时仍在读框内保留C末端结构域。例如，在一些植物和编辑的等位基因中，两个gRNA都会同时切割，从而导致间插序列的缺失。在一些情况下，所产生的修复作用将产生读框移位，从而将蛋白敲除。在其他情况下，它将产生缺少内含子2、所有外显子3和部分外显子4的缩短的LD转录物，其从蛋白产物中大约去除了氨基酸序列RAGRAAAPGGAQGA(SEQ ID NO:76)，构成了N末端结构域的显著改变。

可替代地，两个位点的非同时切割可能会在gRNA1处产生读框移位(例如，命中编码序列且不是3的倍数的任何插缺)，所述读框移位在gRNA2位点由互补插缺修复，从而将编码序列放回其正常读框中。例如，在gRNA1处1个核苷酸(“nt”)的缺失和在gRNA2处1个核苷酸的插入将修复编码框，从而导致RFS等位基因。假设在间插读框移位的序列中没有终止密码子，则该等位基因可能不是丧失功能等位基因。从我们对潜在变化的评估中，我们可以看到，至少有一种编辑组合会在gRNA1和gRNA2之间产生一个RFS，在间插序列中没有任何终止密码子。因此，我们可以预测gRNA1和gRNA2上的哪对小插缺会组合在一起，从而为我们提供功能性RFS等位基因。

这两个指导RNA可以产生可变剪接(“AS”)等位基因，其也具有充当RFS或大插入等位基因的能力。指导RNA1将在GT(SEQ ID NO:25；上面加下划线)之间切割。那是外显子2末端的5'剪接供体。如果对GT进行了修饰，使得内含子2没有正确剪接，则可能会生成AS等位基因，从而导致内含子2保留在编码序列中。翻译后，核糖体将阅读此内含子，并产生新的44-47个氨基酸的插入，具体取决于gRNA1和gRNA2上的插缺的性质。在考虑插缺和新的成熟mRNA的翻译后，可以通过阅读新的编码框来预测这种新的插入。例如，如果gRNA1和gRNA2在TaCENH3α-A的两个位点均产生单个A核苷酸的插入，则可以可变剪接转录物，从而在通过gRNA突变修复正常序列之前插入氨基酸序列“VARDLPGSLPFRFVLFSVFWSDLLVTCSTECRGEPGGRRPQGGLKGQ”(SEQ ID NO:77)，去除外显子3的WT序列“RRAGRAAAPGGAQGA”(SEQ ID NO:76)。同样，可以类似地预测与gRNA2(C的缺失)组合的gRNA1(例如，GTG的缺失)的不同突变导致可变剪接，从而产生新的“GTFPGRFLFVSSCFLFFGLTCSSPVRRNAEASRAGGGPRGGSRG”(SEQ IDNO:78)插入，去除天然序列“RAGRAAAPGGAQGA”(SEQ ID NO:76)。我们还可以预测，在gRNA1和gRNA2处的其他突变组合会产生读框移位，而这些读框移位不会重新放入读框中，从而导致丧失功能等位基因。类似地，在CenH3的N末端区域其他位点诱导的可变剪接等位基因将无法生成修饰的mRNA序列，其C末端结构域修复为正常氨基酸序列，因为在保留的内含子中或在跳过一个或多个外显子后会产生终止密码子。因此，可以根据gRNA在N末端结构域中产生较大变化的能力来选择gRNA，同时保留C末端结构域完整并正常翻译。

实例3：构建体设计和植物转化。

用针对中国春基因组序列设计的引物克隆了Fielder品种的TaCENH3α-A、TaCENH3α-B和TaCENH3α-D的特定序列，然后根据PAM位点选择了gRNA。gRNA1(ACGTCGGCGACACCGGTGCG；SEQ ID NO:25)位于外显子2-内含子2连接区(图1)。gRNA2(CTTGTGGGAGCAGGGGCAAC；SEQ ID NO:26)靶向内含子3-外显子4连接之后。SpCas9基因在两端进行了两个NLS的小麦密码子优化，并由带有两个增强子的甘蔗Ubi启动子驱动。通过GenScript(www.genscript.com)合成了包含小麦U6启动子和gRNA支架的gRNA盒，并将其克隆到二元载体，构建体24194(SEQ ID NO:74)中。

使用Fielder进行转化，这是一种春小麦近交系。收获直径约2.0-2.5mm的未成熟胚，用70％乙醇灭菌1min，并用1％次氯酸钠灭菌10min。灭菌后，用手术刀和刮刀将未成熟胚分离到一个小试管中，并在20,000×g，4℃下于接种培养基中离心10min。用农杆菌(Agrobacterium)将分离的胚感染5min，然后在黑暗中于23℃转移到共培养培养基中2天。从未成熟胚中切下胚轴，之后转移到休眠培养基中，在25℃下在黑暗中培养5天，然后转移到含有15g/L甘露糖的选择培养基中。参见Y.Ishida等人,Wheat(Triticum aestivum L.)Transformation Using Immature Embryos[利用幼胚转化普通小麦],Methods inMolecular Biology[分子生物学方法]1223:189-198(2015)。4周后，将旺盛生长的愈伤组织转移至再生培养基中以产生绿色植物。使存活的植物经过Taqman检查，所述检查分析了转基因DNA插入中DNA片段的存在与否；其中，只有对35S和PMI Taqman测定呈阳性的植物才被送入温室。

实例4：对E0编辑的植物进行测序。

从Taqman阳性E0植物的幼叶中分离基因组DNA。用高保真DNA聚合酶，即KOD-Plus-Neo(来源：东洋纺生命科学(TOYOBO Life Science))进行测序。使用TaCenH3α-A等位基因特异性引物(FA，SEQ ID NO:50；R3，SEQ ID NO:51)。如下进行PCR：95℃5min；35个循环，分别为95℃30秒，65℃30秒，68℃1min；68℃10min。PCR反应混合物包含11.5μl蒸馏水，2.5μl用于KOD-Plus-Neo的10X PCR缓冲液，1μl 2mM dNTPs，1μl 25mM MgSO₄，1μlKOD-Plus-NeoDNA聚合酶，1μl正向引物FA(10μM)，1μl反向引物R3(10μM)和1μl基因组DNA。通过SQ-1引物(SEQ ID NO:79)直接对PCR产物进行测序，或将其克隆到pEASY-Blunt Zero克隆载体(北京全式金生物(Transgen Biotech))中。将M13R(SEQ ID NO:52)和M13F(SEQ ID NO:53)用于菌落测序。

实例5：小麦事件A004A

所述小麦事件A004A表现出单倍体诱导。所述事件编号A004A是通过转化构建体24194而产生的数百株转基因植物之一。Taqman测定后进行直接测序表明，TaCENH3α基因的基因型在E0苗期为AA*BBdd。此处，大写字母表明未编辑的野生型TaCENH3α等位基因，小写字母表明等位基因功能丧失，而带星号(*)的大写字母表示经修复读框移位(RFS)、大缺失(LD)或可变剪接(AS)等位基因，这表示推定的单倍体诱导等位基因。所述A004A植物A*等位基因在gRNA 1的靶位点处包含腺嘌呤插入，并且在gRNA2的靶位点处包含另一腺嘌呤插入(SEQ ID NO:56)。gRNA1处的腺嘌呤插入实际上位于内含子中，位于外显子2末端下游3bp，紧接5'剪接点之后。它本身不会破坏编码序列，但在一些情况下可能会改变剪接模式。gRNA2上的腺嘌呤插入在外显子3中，并移动了编码序列的读框。对在gRNA1靶位点插入腺嘌呤诱导的剪接模式的预测表明，这可能是AS等位基因，其显示2号内含子的内含子保留(IR)，因为在5'剪接供体位点后有额外的腺嘌呤可以改变内含子去除的启动，触发可变剪接。在这种情况下，可变剪接将为导入外显子3中的许多个氨基酸的插入。如果存在可变剪接，则对结果的分析表明，外显子3中的序列将不符合读框，直到gRNA2编辑(腺嘌呤的另一次插入)修复C末端结构域的正常读框和氨基酸代码。

为了验证A004A A*等位基因是可变剪接并产生推定的单倍体诱导等位基因，我们检查了A004A幼年期E0叶中CENH3α-A基因的成熟mRNA序列。按照制造商的说明，使用INVITROGEN TRIzol提取幼叶的总RNA。通过Superscript III第一链合成系统(英杰公司(Invitrogen))使用oligo-dT引物从1mg总RNA合成cDNA。使用KOD-Plus-Neo(TOYOBO)用引物F1(SEQ ID NO:54)和R1(SEQ ID NO:55)扩增TaCenH3α-A转录物。按照制造商的说明进行PCR，如下所示：95℃5min；35个循环，分别为95℃30秒，62℃20秒，68℃20秒，35个循环；68℃10min。PCR反应混合物包含11.5μl蒸馏水，2.5μl用于KOD-Plus-Neo的10X PCR缓冲液，1μl2mM dNTP，1μl 25mM MgSO₄，1μl KOD-Plus-Neo，1μl F1引物(10μM)，1μl R1引物(10μM)和1μl cDNA。通过GeneJET PCR纯化试剂盒(赛默飞科技(Thermo Scientific))纯化PCR产物，并将其克隆到pEASY-Blunt Zero克隆载体(北京全式金生物)中。引物M13R和M13F用于菌落测序。将每个PCR产物的几个克隆都进行了测序，并通过Vector NTI软件(英杰公司)进行了分析。通过克隆数计算剪接变体的相对表达。对菌落的PCR测序分析表明，A004A中的TaCENH3α-A mRNA具有两个转录物，表明了可变剪接。使用规范的5'剪接位点剪接18个克隆中的8个(44％)中发现的转录物之一(SEQ ID NO:58)。对于这些转录物，内含子2的正常剪接意味着gRNA1编辑不会影响成熟mRNA的氨基酸翻译；但是，gRNA2编辑引起了读框移位。因此，在这种情况下，组成型剪接成熟mRNA实际上是敲除转录物。另一方面，18个菌落中有10个(56％)具有保留内含子2的成熟mRNA转录物(SEQ ID NO:57)，导致N末端RFS等位基因包含47个新氨基酸，因此32个氨基酸由内含子2插入，连同通过外显子3中的读框移位改变的15个氨基酸。这种32aa插入和47aa总体变化严重改变了RFS mRNA翻译产生的蛋白的N末端结构域。重要的是，我们在AS等位基因A004A-TaCENH3α-A*中获得的成熟mRNA序列是我们预测会发生的确切成熟mRNA序列结果。A004A E0植物通过开花得以维持。我们没有观察到任何反常表型，并且从该植物产生的穗中收获了E1种子(自花授粉后)。

检查了由A004A植物的自花授粉产生的E1后代种子的倍性水平。种植种子，对发芽的幼苗进行采样，并通过流式细胞术分析其DNA含量。在播种的第一批后代植物中获得了单倍体：单倍体诱导率(“HIR”)为3.8％。在第二批幼苗中，再次观察到单倍体，且HIR为4.2％。小麦单倍体比其二倍体小，类似于水稻和玉米中的单倍体。重要的是，这些植物要么没有敲除“B”等位基因的两个拷贝，要么没有由gRNA2靶位点处的突变引起的经修复读框移位。这表明，只有将CENH3α-A基因中gRNA1和gRNA2的两个靶位点的正确编辑组合与敲除“B”等位基因的两个拷贝配对时，才足以触发单倍体诱导。

在第一批中，我们观察到了两株双生苗植物；根据流式细胞术检查，两株幼苗均为单倍体。这表明一个种子中有两个单倍体胚。双生胚可能是由胚珠发育的破坏引起的，这可能部分由CENH3α的编辑触发，尽管需要更多的实验工作来证实这一点。

虽然我们对自花授粉后观察到的单倍体感到有些惊讶(因为通常在异交过程中单倍体仅在CENH3修饰中诱导)，但编辑E0植物的连续能力意味着雄性和雌性性细胞可能继承不同的序列(编辑)，因此，彼此的着丝粒结合和动粒构建互不相同，导致自交后的单倍体。

实例6：小麦事件C003A。

编辑植物C003A，使得TaCenH3α基因型在E0植物阶段为A*abbdd。通过在gRNA1中缺失鸟嘌呤并在gRNA2中插入腺嘌呤来引入A*。在蛋白水平上，与野生型序列相比，N末端结构域有11个氨基酸差异。SEQ ID NO:63-65分别显示了C003A的A*基因组CenH3序列、A*CDS序列和A*蛋白序列。

E1种子是通过对C003A E0植物进行自交产生的。在温室中使具有A*A*bbdd基因型的E1植物生长，以确定其在异交后诱导单倍体的能力。选择野生型植物(测试物03S0352-22)作为花粉供体。手动去掉E1 C003A，并用野生型花粉授粉。通过SNP标记物(SEQ ID#29-43)检测单倍体，可以区分Fielder和03S0352-22之间的差异，然后通过流式细胞术检查确认。在208株F1植物中，我们获得了一个单倍体。这显示了针对四个标记物的仅父本基因型，但显示了针对一个标记物的母本基因型(KW11091)。

实例7：小麦事件A073A。

在E0苗期，植物A073A具有TaCENH3α的基因型AA*B*bdd。A073A A*等位基因在基因组DNA中具有由gRNA 3引起的腺嘌呤插入和由gRNA4引起的鸟嘌呤缺失。这会触发蛋白水平的经修复读框移位，野生型和编辑型之间在N末端结构域有31个氨基酸的差异。该植物因其产生后代A*A*bbdd(触发单倍体诱导的理想遗传组合)的能力而被突出显示为单倍体诱导系的潜在祖先。SEQ ID NO:69-71分别显示了A073A的A*基因组CenH3序列、A*CDS序列和A*蛋白序列。

通过允许A073A E0植物自花授粉来生产E1种子。对E1植物进行测序，并选择具有基因型组合AA*bbdd的植物，使其在温室中进一步生长，以测定异交后的单倍体诱导潜力。使用选择为花粉供体的测试物系03S0352-22，手动去掉E1编辑的植物，并手工授粉。通过SNP标记物检测单倍体，这些标记物可以在基因型上区分Fielder和03S0352-22。然后通过流式细胞术检查总DNA含量，证实如通过针对这些标记物的纯合性确定的推定的单倍体。在57株F1植物中，有53株主要针对SNP标记是杂合的，通过倍性检查是二倍体，表明它们是杂种。相比之下，只有四株具有父本基因组SNP标记物，并且通过流式细胞术检测为单倍体，异交单倍体诱导率达到7％。

带有AA*bbdd的E1植物在成苗过程中也产生了E2单倍体(表3)。我们从13株E2植物观察到一个单倍体(7.7％单倍体诱导率)。同时，我们观察到几株具有部分染色体消除的植物。

表3：源自A073A的自交E2植物的倍性水平。

序列表

<110> Syngenta Participations AG

Syngenta Biotechnology China Co., Ltd.

Lv, Jian

Yu, Kun

Wei, Juan

Liu, Chunxia

Zhou, Hongju

Kelliher, Timothy

<120> 新的小麦CENH3等位基因

<130> 81696-WO-REG-ORG-P-1

<150> PCT/CN2018/110063

<151> 2018-10-12

<160> 79

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 普通小麦

<400> 1

agcgaatgaa acaacacacg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 普通小麦

<400> 2

gaagtcggtg acctccttga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 普通小麦

<400> 3

caaggaggtc accgacttct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 普通小麦

<400> 4

gccttgcaag ctgtatgtcc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 普通小麦

<400> 5

actagacgag tcgggacgaa 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 普通小麦

<400> 6

gaagtcggtg acctccttga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 普通小麦

<400> 7

caaggaggtc accgacttct 20

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 普通小麦

<400> 8

acgcctcgcg agctgtat 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 普通小麦

<400> 9

gggtccaaga aagacacacg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 普通小麦

<400> 10

gaagtcggtg acctccttga 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 普通小麦

<400> 11

caaggaggtc accgacttct 20

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 普通小麦

<400> 12

acgcctcgcg agctgtat 18

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针

<400> 13

ggttcaggcc aggcacg 17

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针

<400> 14

caaatggtgc aaacgggat 19

<210> 15

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针

<400> 15

aggtatcaga agtcg 15

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针

<400> 16

gtcgttagaa agtattgtag gtgtatcatt 30

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针

<400> 17

ctgaatgcaa aagtcgaatg atc 23

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针

<400> 18

tagatgtgtc ttcaaagtt 19

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针

<400> 19

cgttcgactc gctggagtag t 21

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针

<400> 20

cctgccgatt gtttgtttta ctg 23

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针

<400> 21

tagtagtaac cgcgcctccc gcac 24

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针

<400> 22

tcgatgccgc tggtaagac 19

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针

<400> 23

tccgatggtt gggatggt 18

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针

<400> 24

ctacaagctc aagctcggag agatcgtca 29

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向外显子2-内含子2连接的sgRNA

<400> 25

acgtcggcga caccggtgcg 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向内含子3-外显子4连接的sgRNA

<400> 26

cttgtgggag caggggcaac 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向外显子1的sgRNA

<400> 27

gccttggtct tcctgacggc 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向内含子2-外显子3连接的sgRNA

<400> 28

gacggaatgc agaggcgagc 20

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

ggatcttgct ctgcctgcct gtt 23

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

gcagctcatt tcagttacaa acttag 26

<210> 31

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

gcagctcatt tcagttacaa acttac 26

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

tcggagttca ctattgcctc aggaa 25

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

gcccatcact tggctgatct ctt 23

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

cccatcactt ggctgatctc tc 22

<210> 35

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

cggaccagtt aatgtgattc gacagat 27

<210> 36

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

aaatcagcaa acccaaaatg gcatgat 27

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

atcagcaaac ccaaaatggc atgac 25

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

gtggttgttc tgctcggcca ct 22

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

cagactgaat caagtgcatc cct 23

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

cagactgaat caagtgcatc ccc 23

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

tgttttcctt ggcgctggcg atttt 25

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

cagagacaag aatcaggagc a 21

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 43

ctcagagaca agaatcagga gcg 23

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 44

gacagtggtc ccaaagatgg a 21

<210> 45

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

cgtggttgga acgtcttctt tt 22

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 46

ccccacccac gaggagcatc g 21

<210> 47

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

ccctatcccc gttgacgac 19

<210> 48

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 48

ctgatagtgg tctccttgtc gct 23

<210> 49

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 49

ttcgccttca gcctgcacga cct 23

<210> 50

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 50

caaaacagat aaaacaaaat gtagggaatg t 31

<210> 51

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 51

ggtgcaaacg ggatgagaaa gtc 23

<210> 52

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 52

gtaaaacgac ggccagt 17

<210> 53

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 53

caggaaacag ctatgac 17

<210> 54

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 54

tggcccgcac caagc 15

<210> 55

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 55

gctgtatgtc cttttgcatg acg 23

<210> 56

<211> 4401

<212> DNA

<213> 普通小麦

<400> 56

atggcccgca ccaagcaccc ggccgtcagg aagaccaagg cgccgcccaa gaagcagctc 60

gggccccgcc ccgcgcagcg gcggcaggag acaggtcagc ccttccctcc ttcctccccc 120

cgtctcccgc ctctcgagcg aacgccgtcg ccatttcgtc gcgagagatg gacggacgga 180

cgccccacgc atgacgctaa tgtgctcttc ctctcccttt gcagatggcg cgggcacgtc 240

ggcgacaccg gtagcgcggg accttcccgg gtcgcttcct tttcgtttcg tcttgttttc 300

tgttttttgg tctgacttgc tcgtcacctg ttcgacggaa tgcagaggcg agccgggcgg 360

gcggcggccc cagggggggc tcaaggtgcg gccttctttg cgcttttcgg ttttccgccg 420

cgtgtttagg gccatttccg tcttgtttgg gggtgcgcgg ggcgggggct tgtttttttt 480

cctcccccct tcgttgttgc gcacattgct cgggaatgct gccaggagcg gttgcggttc 540

ttctttgacc cttcgggagg gctggatcgg cagtttcttc gcttccttgc tccagatttt 600

agttcatctt gtaccagtac agtagcaaga tgatggatgg gggcttgttt tttctttctc 660

cttccttgtt ccggacattt ctctggagcg acttttatgc atttcccagt attgtccttt 720

gtccttagag ggtagtggat cggcagtttt cttcgcctca ttggtccaga ttttagttta 780

tcttgtacgg taccaagatg atggatgtgg cacaaagttc tcagtttggg ggttgcgctc 840

ttccgggcag ttgttatttt ggtctgtgat gactaactcg tatctattct tgtgggagca 900

ggggcaaact gggcaaccca agcagaggaa accacaccgg ttcaggccag gcacggtggc 960

actgcgggag atcaggaggt atcagaagtc ggtcgacttt ctcatcccgt ttgcaccatt 1020

tgtccgtctg gtgggtacct ctgtctgtca tatcctctcg ctctctctac aaacgatctg 1080

cagtgcagag tgtaattgga atattttgtt cctgacaaat ttgcagatca aggaggtcac 1140

cgacttcttc tgtcctgaaa tcagccgctg gactccccaa gcgctcgtcg cgattcaaga 1200

ggtcagtgct aaaacctggc atgtactatt agatctgatg gtttgattag agtactacaa 1260

tgcagatgaa ttcaatatcc gaaaaccatg aactgtgggg tagatacatg tatcgcctta 1320

attcatggtt tctgaatgct ctgctattaa ttcagtttga tatatttatt tagcagcatg 1380

gtattgtttt ggtggctggt aaatcaaaac tgaaatgtga ttacgagcaa aacggtatcg 1440

attgtcgatc ctgtgtgttt ttgtgcacat ctggttgttt ggtcaagatg tgtttgtgca 1500

catcttgcaa catgatcctg cccacacact caaaactgac tattggttag gttccatttg 1560

tcttatggaa tttagggtgt aactgagagg tgagcaagtg gtagtaacgt tcaattttga 1620

ttcaggatga ggatattgtg atccagaaaa ttgcatgtta tggttatgtg tccaaacgcc 1680

aaatgattat gtctatatcc agtactttag aaccagtaca acaacaaaaa gtactttaga 1740

accagtcaag tttattgtgc atttatacaa gagtgttgtt tgcacaatag acttgcttta 1800

gtcgtctctt gccagaaatg ccttcttctg cacaacgagc aaaaataaca taaagttgac 1860

tatactcagt gtggcctaag aaatgagttg tactttttag tcactggcct gtgtatttgc 1920

tttgaattga cacataattc ccttttcctt tccctctgca ggctgcagag tatcacctcg 1980

tcgacgtatt tgaaagggca aatcactgtg ccatccatgc aaagcgtgtt accgtcagta 2040

agttctcact gaatgaaaac tccctttctt ttacaatatt gcgcagaagg aaacatgcca 2100

gttatgaaag agtttcaatt acaggatcac ctttgctttc atttgatgtg atatctagtt 2160

ttgatgttgt ttcaaggttc aagaattcta atgataaatg ataggatcca caattgttat 2220

atctctgcag ctcctcgtat ctgttgtcca cgaacaaaca tatcaaacaa ttcattaaaa 2280

agatgaagaa gtcaaacaaa cagtatatgt gcactgcata ttagatatca aacctggtta 2340

ctatacgact gatctggcct gacccccgcg tcgcctctcc ctggcggcac ggggggaacc 2400

actccggcgc cgccaccttc cctcctccct ccacccccca cctcgccgcc gcctgaggag 2460

ttcgccggcg aagcccggtc tggctccagg gagggtggcg gcggggcatc tctctgcgag 2520

gcgtgagggc gcatctcgtg cgcgggcgcg gcgagcttgg gcgggatcgc gggcgcggct 2580

ctggctcggg ctggtgaggc tccggcggtc cgaggggtgt cgcggcgcgg cgggggtctc 2640

gctccggcgc gggcggtccg agggcgcgcg ggatctggcg ctccagcagg ggcgccgtca 2700

aggggagccg ggcagggaag ctcgtcaggc gggctcgtca ggcaggcgtg acgcggggcg 2760

gcggccgcgg gctggaagcc atggcgtttt ggccatggtg tcgtgtgcgc tcgcttctca 2820

ttcgcagctt gaggtgctgc tgctgagggt ggtgcgcggt gaagcttggt ggtcggcgtt 2880

ggagagtgca aggcgcaaca ggaatggctc caatgatctc cacgcttctg ggtggatcag 2940

atctgcggcc ctccataggg gtgtgttccg ggcgaaagcc ttgacccgac tttgtcggtg 3000

ccgtcgacgg cggcgctttc gggcgtcgtt tccctccttg gaggcgtcgt tgtggaactc 3060

atcttcttct atgtggggct cgggctctcc gggtgaaaac ctaagctcca gattttccgg 3120

agcgggcgat ggcggcgtct tcgtcgtttc cctcttgggg gcgttgcttg ggagagttag 3180

cttgtgcttg gtgcgtttgg ttttctccta cgtcgggttt ggtggatgcc ggggcagcgg 3240

ccccggacgg ctgatgaacg ccgaggcggc ggcctcggaa agtgatgcgc ggtgcggctc 3300

catggggcgg ggcggtggct cggccttcac ttgggtggca atcttgggcc acttgggtgg 3360

caggcttgtc ggtccggtcg acgcgttcca gagggggcgg tctgactttg cgtcggggcg 3420

gcggccccgg atgtggtgcg acgttcgtgg tctgcgagcg gttgccttga gcagcgtggg 3480

ctgcgggcag ctgggtcgcg cggcgttgct gctcgagcgg agcggtggta cgtcggggcg 3540

gcggccccgg aaggtgatgc cggttgattg cgctgggcgt gacggagcgg tggatgtcgg 3600

ggcggcggcc ccgagaaaat cactgtggcg tccagatttc tgtggcaacg atgatggtgg 3660

gagcgatgtc ggcgacgcgg caatggttgc gatagtcggc tcttctccgg cgtgtccacg 3720

atattgcctc ggtttgtttg ttgctgtgga gtcgaagctg cggcggcgag gccctgtggt 3780

atacgatgac tggttccagg tgtcctttcg tcgatcttcc gtggcgccag ccgtgcctgg 3840

tttcgttctt ccgagttctc cgtcagaatc ggagctgcgt tgtctgtccg caggtcgaca 3900

tgttgtcgag aagggtgggc tttgccctgt gtgtttcagt ctatgcgagt gggctcggcc 3960

cttgttgttc tggtttttgc ccggttttcc gtaattaact gggcaattct cttctgctta 4020

attaatagat gaggcaatct ttgcctccct ttcaaaaaaa aacctggtta ctatagcagg 4080

aaattcaggg ttgattactt tatttcttat ctgaaggata aacattgtat caaatcagaa 4140

ttttatttgt aagttacatt tttttttact tataaaactt ggaaactgtt ttactgtgac 4200

aaatagatgc cactagaatc atgatcacat cgtggctgtt gctattctaa caaataaatg 4260

ctcctgaaca aatgggaact atatatgaag atgtatggac cagcatgttc ctgttaacct 4320

gacctttttc ctttttttgc tgctgcagtg caaaaggaca tacagcttgc aaggcgtatc 4380

ggcgggagga ggctttggtg a 4401

<210> 57

<211> 588

<212> DNA

<213> 普通小麦

<400> 57

atggcccgca ccaagcaccc ggccgtcagg aagaccaagg cgccgcccaa gaagcagctc 60

gggccccgcc ccgcgcagcg gcggcaggag acagatggcg cgggcacgtc ggcgacaccg 120

gtagcgcggg accttcccgg gtcgcttcct tttcgtttcg tcttgttttc tgttttttgg 180

tctgacttgc tcgtcacctg ttcgacggaa tgcagaggcg agccgggcgg gcggcggccc 240

cagggggggc tcaaggggca aactgggcaa cccaagcaga ggaaaccaca ccggttcagg 300

ccaggcacgg tggcactgcg ggagatcagg aggtatcaga agtcggtcga ctttctcatc 360

ccgtttgcac catttgtccg tctgatcaag gaggtcaccg acttcttctg tcctgaaatc 420

agccgctgga ctccccaagc gctcgtcgcg attcaagagg ctgcagagta tcacctcgtc 480

gacgtatttg aaagggcaaa tcactgtgcc atccatgcaa agcgtgttac cgtcatgcaa 540

aaggacatac agcttgcaag gcgtatcggc gggaggaggc tttggtga 588

<210> 58

<211> 493

<212> DNA

<213> 普通小麦

<400> 58

atggcccgca ccaagcaccc ggccgtcagg aagaccaagg cgccgcccaa gaagcagctc 60

gggccccgcc ccgcgcagcg gcggcaggag acagatggcg cgggcacgtc ggcgacaccg 120

aggcgagccg ggcgggcggc ggccccaggg ggggctcaag gggcaaactg ggcaacccaa 180

gcagaggaaa ccacaccggt tcaggccagg cacggtggca ctgcgggaga tcaggaggta 240

tcagaagtcg gtcgactttc tcatcccgtt tgcaccattt gtccgtctga tcaaggaggt 300

caccgacttc ttctgtcctg aaatcagccg ctggactccc caagcgctcg tcgcgattca 360

agaggctgca gagtatcacc tcgtcgacgt atttgaaagg gcaaatcact gtgccatcca 420

tgcaaagcgt gttaccgtca tgcaaaagga catacagctt gcaaggcgta tcggcgggag 480

gaggctttgg tga 493

<210> 59

<211> 195

<212> PRT

<213> 普通小麦

<400> 59

Met Ala Arg Thr Lys His Pro Ala Val Arg Lys Thr Lys Ala Pro Pro

1 5 10 15

Lys Lys Gln Leu Gly Pro Arg Pro Ala Gln Arg Arg Gln Glu Thr Asp

20 25 30

Gly Ala Gly Thr Ser Ala Thr Pro Val Ala Arg Asp Leu Pro Gly Ser

35 40 45

Leu Pro Phe Arg Phe Val Leu Phe Ser Val Phe Trp Ser Asp Leu Leu

50 55 60

Val Thr Cys Ser Thr Glu Cys Arg Gly Glu Pro Gly Gly Arg Arg Pro

65 70 75 80

Gln Gly Gly Leu Lys Gly Gln Thr Gly Gln Pro Lys Gln Arg Lys Pro

85 90 95

His Arg Phe Arg Pro Gly Thr Val Ala Leu Arg Glu Ile Arg Arg Tyr

100 105 110

Gln Lys Ser Val Asp Phe Leu Ile Pro Phe Ala Pro Phe Val Arg Leu

115 120 125

Ile Lys Glu Val Thr Asp Phe Phe Cys Pro Glu Ile Ser Arg Trp Thr

130 135 140

Pro Gln Ala Leu Val Ala Ile Gln Glu Ala Ala Glu Tyr His Leu Val

145 150 155 160

Asp Val Phe Glu Arg Ala Asn His Cys Ala Ile His Ala Lys Arg Val

165 170 175

Thr Val Met Gln Lys Asp Ile Gln Leu Ala Arg Arg Ile Gly Gly Arg

180 185 190

Arg Leu Trp

195

<210> 60

<211> 106

<212> PRT

<213> 普通小麦

<400> 60

Met Ala Arg Thr Lys His Pro Ala Val Arg Lys Thr Lys Ala Pro Pro

1 5 10 15

Lys Lys Gln Leu Gly Pro Arg Pro Ala Gln Arg Arg Gln Glu Thr Asp

20 25 30

Gly Ala Gly Thr Ser Ala Thr Pro Arg Arg Ala Gly Arg Ala Ala Ala

35 40 45

Pro Gly Gly Ala Gln Gly Ala Asn Trp Ala Thr Gln Ala Glu Glu Thr

50 55 60

Thr Pro Val Gln Ala Arg His Gly Gly Thr Ala Gly Asp Gln Glu Val

65 70 75 80

Ser Glu Val Gly Arg Leu Ser His Pro Val Cys Thr Ile Cys Pro Ser

85 90 95

Asp Gln Gly Gly His Arg Leu Leu Leu Ser

100 105

<210> 61

<211> 2618

<212> DNA

<213> 普通小麦

<400> 61

atggcccgca ccaagcaccc ggccgtcagg aagaccaagg cgctgcccaa gaagcagctc 60

gggacgcgcc cctcggccgg gacgccgcgg cggcaggaga caggtgagcc cgcccctcct 120

tccttcctcc cccccatctc gagcgaacgc cgtcgcctcg tcgcgagaga tggacgcccc 180

acgcgtgatg ctaatgtgtt cttcctctcc ctttgcagat ggcgcgggca cgtcggcgac 240

tccggtgcgc gggccttcct gggtcacttc cttttgtttc gtcttgtttt ctgtttttgg 300

tctgacttgc tcgtctcctg ttcgacggaa tgcagaggcg agccgggcgg gcggcggccc 360

caggggcggc tgaaggtgcg cccttctttg tgcttttcgg ttttccgccg cgtgtttagg 420

gctatttccg tcttgtttgg ggcggggact tgtatcttct ccccccttcg ttgttgcgca 480

catttctcgg gaatgctacc aggagcagtt gcggttcttt ggcccttagg gagggctgca 540

ccggcaattt cttcgcttcc ttgctccaga ttttagttta tcttctacag tagcaagatg 600

atggatgggg acttgcgttt ttctttcccc ttccttgttc cgggcatttc tctggagcaa 660

tgtttatgca tttcccagta ttgtcctttg ccctcagagg ggaggggatc ggcagttttc 720

ttcgcttcat cggtccagat tttagtttat cttgtacagt agcaagatga tggatgtgac 780

acaaagttct cagtttgggg gttgcgctct tccgggtagt tgttaatttc gtctgtgact 840

gactcgtatc tattcttgtg ggagcagggg caactgggca acccaagcag aggaagccac 900

accggttcag gccaggcacg gtggcactgc gggagatcag gaagtaccag aaatcggtcg 960

actttctcat cccgtttgca ccatttgttc gtctggtggg tacctctgtc atatcctctc 1020

gctctctcta ccaacgatct ggagtgcgga gtgtaaattg gaatcttttg ttcctgacaa 1080

atttgtagat caaggaggtc accgacttct tctgtcctga aatcagccgc tggactcccc 1140

aagcgctcgt tgcaattcaa gaggtcagtg ctcaaacctg gcatgtacta ttagatctga 1200

tggtttgatt agagtactac aatgcagatg aattcaagat ctgaaaacca tgaactgtgg 1260

ggtagatgca tgtatcatag tgtctgaatg ctctggtatt aattcagttt gatatattta 1320

tttagcagca tggtattgtt ttggtggctg gtaacccaaa actgaaacgt gattacgagc 1380

aaaatggtat caattgtctt ttctgtgtgt ttgtgcaaat ctggttgttt ggtcaagata 1440

tacagtcttg caacatgaat acatgatcct gcccacacac tcaaaactga actattggtt 1500

agatgccata tgtcttatgg aatttagggt gtaactgaga ggtgagcaag tggtagtgac 1560

gttcaatttt gattcaggat gaggatattg tgatccagaa aattgcatgt tatggttatg 1620

tgtccgaacg ccaaatgatt atgtctatat ccactacatg cttatgtgtc ccaaccccca 1680

aatgattatc tctgtttcca gtacaacaac aaaaagtact ttagaaccag tcaagtttat 1740

tgtgcattta tacgagattg ttgtttgcac aatagactta ctttagtcgc ctcttgccag 1800

aaatgccttc ttctgcacaa cgagcaaaaa taacataaag ttgactatac tcagtgtggc 1860

ctaagaaatg agttagtact tttagtcact ggcctgtgta tttgctttga attgacgcat 1920

aattcccttt tcctttccct ctgcaggctg cagagtatca cctcgtcgac gtatttgaaa 1980

gggcaaatca ctgtgccatc catgcaaagc gtgttaccgt cagtaagttc tcactgaatg 2040

aaaacttcct tccatttaca atattatgca gaaggaaaca tgccagttat gaaagagttt 2100

caattacagg atcacctttg ctttcatttg atgtgatatc tagttttgat gttgtttcaa 2160

ggttcaagaa ttctaacgat taatgatagg atccacaatt gttatatctc tgcagctcct 2220

cgtatctgtt gtcaacgaac aaacatgtca aacaattcat taaaaaaaac gaagatgtca 2280

aaccgggtta ctatagcagg aaattcaggg ttgattacct atttattcag ggttgattac 2340

ctatttattt cttatctgaa ggataaacat tatataaaat cagaatttta tttgtaggtt 2400

acattttttg tttccttata aaacttggaa actgttgaga atcatcatca tcatggctgt 2460

tgctattcta acaaataaaa cggatgctcc tgaataaatg gaactatata tgaagatgta 2520

tttactagca tgttcctgtt aacctgactt tttttgctgc tacagtgcaa aaggacatac 2580

agctcgcgag gcgtatcggc gggaggaggc tttggtga 2618

<210> 62

<211> 2676

<212> DNA

<213> 普通小麦

<400> 62

atggcccgta ccaagcaccc ggccgtcagg aagaccaagg cgccgcccaa gaagcagctc 60

gggccccgtc ccgcgcagcg gcggcaggag acaggtcagc ccgcccgccc gtcgctcctc 120

ccttccttcc cccccccgtc tcccgcctct cgaccgaacg ccgccgcctt gtttgttgcg 180

gtacagaggt gcccgtccgt gatgctaaca ggttcttcct ctcctttgca gatggcgcgg 240

gcacgtcggc gacaccggtg cgcgggtctt cccgggtcgc ttccttttgt ttcgtcttgt 300

tttctgtttt ttggtctgac ttgctcgtca cctgttcgac ggaatgcaga ggcgagccgg 360

gcgggcggcg gccccagggg gcgctgaagg tgcggccttc tttgcgcttt tcggttttcc 420

gccgcgtgtt tagggccatt tccgtcttgt ttgggggtgg gtggggcggg ggcttgattt 480

ttttcctcct cccttcgttg ttgcgcacat ttctcgggaa tgcttccagg agcggttgca 540

gttcttcttt ggccttaggg agggctggat cggcagtttc ttcgcttcct tgctccagat 600

tttagtttat cttgtagtag tacagtagca agatgatgga tggggacttg ttttttcttt 660

ccccttcctt gttccggaca tttctttgga gcaactttta tgcatttccc ggtattgtcc 720

tttgccctta gagtggagtg gatcggcagt tttcttcgct tccctggtcc agattttagt 780

ttatctttac agtagcaaga tgatgtatgt gacacaaagt tctcagtttg ggggttgcgc 840

tcttccaggt gtagttgtta tttttcgtct gtgactgact cgtatctatt cttgtgggag 900

caggggcaaa ctgggcaacc caagcagagg aagccacacc ggttcaggcc aggcacggtg 960

gcactgcggg agatcaggag gtaccagaag tcggtcgact ttctcatccc gtttgcacca 1020

tttgtccgtc tggtgggtac ctctgtctgt catatcctct cgctctctct accaacaatc 1080

tggagtgcgg ggtgtaaact ggaatctttt gttcctgaca aatttgcaga tcaaggaggt 1140

caccgacttc ttctgtcctg aaatcagccg ctggactccc caagcgctcg tcgcgattca 1200

agaggtcagt gctcaaacct ggcatgtact attagatctg atggtttgat tagagtacta 1260

caatgcagat gaattcaaga tctgaaaacc atgaactgtg gggtagatgc atgtatcgcc 1320

ttaattcata gtttctgaat gctctggtat taattcagtt tgatatattt atttagctgc 1380

atggtattgt tttggtggct ggtaattcaa aactgaaatg tgattacgag caaaatggta 1440

tcaattgtct tttctgtgca catctggttg tttggtcaag atatacagtc ttgcaacatg 1500

atcctgccca cacactcaaa actgaactat tggttagatt ccattttgct tatggaattt 1560

agggtgtaac tgagaggtga gcaggtggca gtgaccagag ctacgttcaa ttttgattca 1620

ggaagaggat cttgcgatcc agaaaattgc atgttatggt tatgtgtccg aaggccaaat 1680

gattatctct atatccagta catgcttatg tgtccgaacc cccaaatgat tatctctata 1740

tccagtacat gcttatgtgt ccgaaccatt caagttattg tgcatttatt caagattgtt 1800

gtttgcacaa tagacttact ttagtcgcct cttgccagaa atgcctcctt ctgcacaatg 1860

agcaaaaata acataaagtt gattatgctc agtgtggcct aattgtactt tcagttactg 1920

gcctgtgtat ttgctttgaa ttgacacata attccctttt cctttccctc tgcaggctgc 1980

agagtatcac ctcgtcgacg tatttgaaag ggcaaatcac tgtgccatcc atgcaaagcg 2040

tgttaccgtc agtaagttct cactgaatga aaacttcctt tcttttacaa tattatgcag 2100

aaggaaacat gccagttatg aaagagtttc aattacaaga tcacctttgc tttcatttga 2160

tgtggtatct agttttgatg ttgtttcaag gttcaagaat tctaatgatt aatgatagga 2220

tccacaattg ttatatctct gcagctcctc gtatctgacg aacaaacatg tcaaacaatt 2280

cattaaaaaa tgaagatgtc aaacaaacag tatatgcact gcatattgga tatcaaacct 2340

ggttactaca gcaggaagtt cagggttgat tactttattt cttatctgaa ggataaacat 2400

tgtatcaaat cagaatttta tttgtaagtt gcattttttg tttactcata aaacttggaa 2460

actgttttac tgtgagaaat agatgcccac tagaatcatg atcatcatca tggctgttgc 2520

tattctaaca aataaaacgg atgctcctga acaaatggaa ctatgtatga agatgtatgg 2580

actagcatgt tcctgttaac ctgacttttt tttgctgcta cagtgcaaaa ggacatacag 2640

ctcgcgaggc gtatcggtgg gaggaggctt tggtga 2676

<210> 63

<211> 4399

<212> DNA

<213> 普通小麦

<400> 63

atggcccgca ccaagcaccc ggccgtcagg aagaccaagg cgccgcccaa gaagcagctc 60

gggccccgcc ccgcgcagcg gcggcaggag acaggtcagc ccttccctcc ttcctccccc 120

cgtctcccgc ctctcgagcg aacgccgtcg ccatttcgtc gcgagagatg gacggacgga 180

cgccccacgc atgacgctaa tgtgctcttc ctctcccttt gcagatggcg cgggcacgtc 240

ggcgacaccg tgcgcgggac cttcccgggt cgcttccttt tcgtttcgtc ttgttttctg 300

ttttttggtc tgacttgctc gtcacctgtt cgacggaatg cagaggcgag ccgggcgggc 360

ggcggcccca gggggggctc aaggtgcggc cttctttgcg cttttcggtt ttccgccgcg 420

tgtttagggc catttccgtc ttgtttgggg gtgcgcgggg cgggggcttg ttttttttcc 480

tccccccttc gttgttgcgc acattgctcg ggaatgctgc caggagcggt tgcggttctt 540

ctttgaccct tcgggagggc tggatcggca gtttcttcgc ttccttgctc cagattttag 600

ttcatcttgt accagtacag tagcaagatg atggatgggg gcttgttttt tctttctcct 660

tccttgttcc ggacatttct ctggagcgac ttttatgcat ttcccagtat tgtcctttgt 720

ccttagaggg tagtggatcg gcagttttct tcgcctcatt ggtccagatt ttagtttatc 780

ttgtacggta ccaagatgat ggatgtggca caaagttctc agtttggggg ttgcgctctt 840

ccgggcagtt gttattttgg tctgtgatga ctaactcgta tctattcttg tgggagcagg 900

ggcaaactgg gcaacccaag cagaggaaac cacaccggtt caggccaggc acggtggcac 960

tgcgggagat caggaggtat cagaagtcgg tcgactttct catcccgttt gcaccatttg 1020

tccgtctggt gggtacctct gtctgtcata tcctctcgct ctctctacaa acgatctgca 1080

gtgcagagtg taattggaat attttgttcc tgacaaattt gcagatcaag gaggtcaccg 1140

acttcttctg tcctgaaatc agccgctgga ctccccaagc gctcgtcgcg attcaagagg 1200

tcagtgctaa aacctggcat gtactattag atctgatggt ttgattagag tactacaatg 1260

cagatgaatt caatatccga aaaccatgaa ctgtggggta gatacatgta tcgccttaat 1320

tcatggtttc tgaatgctct gctattaatt cagtttgata tatttattta gcagcatggt 1380

attgttttgg tggctggtaa atcaaaactg aaatgtgatt acgagcaaaa cggtatcgat 1440

tgtcgatcct gtgtgttttt gtgcacatct ggttgtttgg tcaagatgtg tttgtgcaca 1500

tcttgcaaca tgatcctgcc cacacactca aaactgacta ttggttaggt tccatttgtc 1560

ttatggaatt tagggtgtaa ctgagaggtg agcaagtggt agtaacgttc aattttgatt 1620

caggatgagg atattgtgat ccagaaaatt gcatgttatg gttatgtgtc caaacgccaa 1680

atgattatgt ctatatccag tactttagaa ccagtacaac aacaaaaagt actttagaac 1740

cagtcaagtt tattgtgcat ttatacaaga gtgttgtttg cacaatagac ttgctttagt 1800

cgtctcttgc cagaaatgcc ttcttctgca caacgagcaa aaataacata aagttgacta 1860

tactcagtgt ggcctaagaa atgagttgta ctttttagtc actggcctgt gtatttgctt 1920

tgaattgaca cataattccc ttttcctttc cctctgcagg ctgcagagta tcacctcgtc 1980

gacgtatttg aaagggcaaa tcactgtgcc atccatgcaa agcgtgttac cgtcagtaag 2040

ttctcactga atgaaaactc cctttctttt acaatattgc gcagaaggaa acatgccagt 2100

tatgaaagag tttcaattac aggatcacct ttgctttcat ttgatgtgat atctagtttt 2160

gatgttgttt caaggttcaa gaattctaat gataaatgat aggatccaca attgttatat 2220

ctctgcagct cctcgtatct gttgtccacg aacaaacata tcaaacaatt cattaaaaag 2280

atgaagaagt caaacaaaca gtatatgtgc actgcatatt agatatcaaa cctggttact 2340

atacgactga tctggcctga cccccgcgtc gcctctccct ggcggcacgg ggggaaccac 2400

tccggcgccg ccaccttccc tcctccctcc accccccacc tcgccgccgc ctgaggagtt 2460

cgccggcgaa gcccggtctg gctccaggga gggtggcggc ggggcatctc tctgcgaggc 2520

gtgagggcgc atctcgtgcg cgggcgcggc gagcttgggc gggatcgcgg gcgcggctct 2580

ggctcgggct ggtgaggctc cggcggtccg aggggtgtcg cggcgcggcg ggggtctcgc 2640

tccggcgcgg gcggtccgag ggcgcgcggg atctggcgct ccagcagggg cgccgtcaag 2700

gggagccggg cagggaagct cgtcaggcgg gctcgtcagg caggcgtgac gcggggcggc 2760

ggccgcgggc tggaagccat ggcgttttgg ccatggtgtc gtgtgcgctc gcttctcatt 2820

cgcagcttga ggtgctgctg ctgagggtgg tgcgcggtga agcttggtgg tcggcgttgg 2880

agagtgcaag gcgcaacagg aatggctcca atgatctcca cgcttctggg tggatcagat 2940

ctgcggccct ccataggggt gtgttccggg cgaaagcctt gacccgactt tgtcggtgcc 3000

gtcgacggcg gcgctttcgg gcgtcgtttc cctccttgga ggcgtcgttg tggaactcat 3060

cttcttctat gtggggctcg ggctctccgg gtgaaaacct aagctccaga ttttccggag 3120

cgggcgatgg cggcgtcttc gtcgtttccc tcttgggggc gttgcttggg agagttagct 3180

tgtgcttggt gcgtttggtt ttctcctacg tcgggtttgg tggatgccgg ggcagcggcc 3240

ccggacggct gatgaacgcc gaggcggcgg cctcggaaag tgatgcgcgg tgcggctcca 3300

tggggcgggg cggtggctcg gccttcactt gggtggcaat cttgggccac ttgggtggca 3360

ggcttgtcgg tccggtcgac gcgttccaga gggggcggtc tgactttgcg tcggggcggc 3420

ggccccggat gtggtgcgac gttcgtggtc tgcgagcggt tgccttgagc agcgtgggct 3480

gcgggcagct gggtcgcgcg gcgttgctgc tcgagcggag cggtggtacg tcggggcggc 3540

ggccccggaa ggtgatgccg gttgattgcg ctgggcgtga cggagcggtg gatgtcgggg 3600

cggcggcccc gagaaaatca ctgtggcgtc cagatttctg tggcaacgat gatggtggga 3660

gcgatgtcgg cgacgcggca atggttgcga tagtcggctc ttctccggcg tgtccacgat 3720

attgcctcgg tttgtttgtt gctgtggagt cgaagctgcg gcggcgaggc cctgtggtat 3780

acgatgactg gttccaggtg tcctttcgtc gatcttccgt ggcgccagcc gtgcctggtt 3840

tcgttcttcc gagttctccg tcagaatcgg agctgcgttg tctgtccgca ggtcgacatg 3900

ttgtcgagaa gggtgggctt tgccctgtgt gtttcagtct atgcgagtgg gctcggccct 3960

tgttgttctg gtttttgccc ggttttccgt aattaactgg gcaattctct tctgcttaat 4020

taatagatga ggcaatcttt gcctcccttt caaaaaaaaa cctggttact atagcaggaa 4080

attcagggtt gattacttta tttcttatct gaaggataaa cattgtatca aatcagaatt 4140

ttatttgtaa gttacatttt tttttactta taaaacttgg aaactgtttt actgtgacaa 4200

atagatgcca ctagaatcat gatcacatcg tggctgttgc tattctaaca aataaatgct 4260

cctgaacaaa tgggaactat atatgaagat gtatggacca gcatgttcct gttaacctga 4320

cctttttcct ttttttgctg ctgcagtgca aaaggacata cagcttgcaa ggcgtatcgg 4380

cgggaggagg ctttggtga 4399

<210> 64

<211> 492

<212> DNA

<213> 普通小麦

<400> 64

atggcccgca ccaagcaccc ggccgtcagg aagaccaagg cgccgcccaa gaagcagctc 60

gggccccgcc ccgcgcagcg gcggcaggag acagatggcg cgggcacgtc ggcgacacca 120

ggcgagccgg gcgggcggcg gccccagggg gggctcaagg ggcaaactgg gcaacccaag 180

cagaggaaac cacaccggtt caggccaggc acggtggcac tgcgggagat caggaggtat 240

cagaagtcgg tcgactttct catcccgttt gcaccatttg tccgtctgat caaggaggtc 300

accgacttct tctgtcctga aatcagccgc tggactcccc aagcgctcgt cgcgattcaa 360

gaggctgcag agtatcacct cgtcgacgta tttgaaaggg caaatcactg tgccatccat 420

gcaaagcgtg ttaccgtcat gcaaaaggac atacagcttg caaggcgtat cggcgggagg 480

aggctttggt ga 492

<210> 65

<211> 163

<212> PRT

<213> 普通小麦

<400> 65

Met Ala Arg Thr Lys His Pro Ala Val Arg Lys Thr Lys Ala Pro Pro

1 5 10 15

Lys Lys Gln Leu Gly Pro Arg Pro Ala Gln Arg Arg Gln Glu Thr Asp

20 25 30

Gly Ala Gly Thr Ser Ala Thr Pro Gly Glu Pro Gly Gly Arg Arg Pro

35 40 45

Gln Gly Gly Leu Lys Gly Gln Thr Gly Gln Pro Lys Gln Arg Lys Pro

50 55 60

His Arg Phe Arg Pro Gly Thr Val Ala Leu Arg Glu Ile Arg Arg Tyr

65 70 75 80

Gln Lys Ser Val Asp Phe Leu Ile Pro Phe Ala Pro Phe Val Arg Leu

85 90 95

Ile Lys Glu Val Thr Asp Phe Phe Cys Pro Glu Ile Ser Arg Trp Thr

100 105 110

Pro Gln Ala Leu Val Ala Ile Gln Glu Ala Ala Glu Tyr His Leu Val

115 120 125

Asp Val Phe Glu Arg Ala Asn His Cys Ala Ile His Ala Lys Arg Val

130 135 140

Thr Val Met Gln Lys Asp Ile Gln Leu Ala Arg Arg Ile Gly Gly Arg

145 150 155 160

Arg Leu Trp

<210> 66

<211> 2619

<212> DNA

<213> 普通小麦

<400> 66