一种肺爆震伤动物模型构建方法及其用途
阅读说明：本技术 一种肺爆震伤动物模型构建方法及其用途 (Method for constructing animal model with lung explosive injury and application thereof ) 是由 王鸿 高俊宏 骞爱荣 刘进仁 卢青 范小琳 李亮 张文娟 刘志永 于 2021-08-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医药技术领域,具体为一种肺爆震伤动物模型构建方法,该构建方法可真实反映爆炸有关的物理参数及其交互产生的复杂作用过程,并对肺损伤的范围、等级、严重程度实现量化评价；本发明通过该方法构建得到的肺爆震伤动物模型验证了白藜芦醇在治疗肺爆震伤中具有较佳的疗效,白藜芦醇具备来源广泛、安全、不易产生耐药性等优点,其能够降低肺爆震伤大鼠肺组织出血、肺泡隔破裂及炎性细胞浸润,并缓解肺组织水肿。(The invention relates to the technical field of medicines, in particular to a method for constructing an animal model of lung blast injury, which can truly reflect physical parameters related to explosion and a complex action process generated by interaction of the physical parameters and the complex action process and realize quantitative evaluation on the range, the grade and the severity of lung injury; the lung detonation injury animal model constructed by the method verifies that resveratrol has a good curative effect in treating lung detonation injury, and the resveratrol has the advantages of wide source, safety, difficulty in generating drug resistance and the like, can reduce the bleeding of lung tissues, alveolar septal rupture and inflammatory cell infiltration of rats in the lung detonation injury, and relieves the edema of the lung tissues.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体为一种肺爆震伤动物模型构建方法及其用途。
背景技术
肺爆震伤(Blast lung injury)是军事战争、恐怖主义袭击、工业爆炸事故中最常见的一种物理损伤形式。肺是对冲击波超压最为敏感靶器官之一，损伤表现主要为肺出血、水肿、破裂、大疱、塌陷和肺气肿，呈现“内轻外重、损伤复杂、死亡率高”等特点。病情恶化可导致急性肺损伤(acute lung injury，ALI)、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratorydistress syndrome，ARDS)和多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunctionsyndrome，MODS)，最终甚至死亡。目前尚未有效果显著的治疗BLI的药物，因此寻找一种安全、高效的治疗BLI的药物显得迫在眉睫。
爆炸冲击波对生物体的损伤过程，既是冲击波作用于生物组织的力学过程，也是生物组织以其独特而复杂的结构和材料特性响应冲击波作用的过程。模型是相关疾病研究的基础，肺爆震伤研究常见的有动物模型、假人模型、数字化仿真模型、等效性模型等，因其研究目的、对象和适用条件不同而各有其优缺点。动物是爆炸冲击伤研究中最常用的模型，主要依据是动物的损伤效应与人员的损伤效应具有相似性原则，其脏器结构、功能、解剖特点、损伤阈值等与人体接近。目前大多肺爆震伤模型主要是基于实验室生物激波管、简易爆炸装置等构建，虽然其试验参数可控、成本低、重复性好，但不能模拟出实际爆炸条件下冲击波的复杂性和破坏性，与实战环境所获得毁伤数据还存在较大的差距。
白藜芦醇(Resveratrol，RE))是一种由自然植物提取的芪类结构的非黄酮类多酚化合物，具有抗炎、抗氧化、调节免疫等多种的生物学效应，但到目前为止关于白藜芦醇用于肺爆震伤治疗的研究未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了肺爆震伤动物模型构建方法，更切近实战环境，可真实反映爆炸有关的物理参数及其交互产生的复杂作用过程，对肺损伤的范围、等级、严重程度实现量化评价，为肺爆震伤药物的筛选提供支撑。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种肺爆震伤动物模型构建方法，包括以下步骤：
布设炸药；
在距离爆炸中心点固定距离处布放经麻醉处理的实验动物，同时在与实验动物同一圆弧上布设压力传感器，并使所述压力传感器的敏感面与地面持平；
调试完成后远程引爆炸药，获得肺爆震伤动物模型，同时记录所述压力传感器的超压数据，获得动物肺损伤与超压的量效关系。
优选地，所述炸药的爆炸威力为280-320kg TNT当量。
优选地，所述固定距离是指距离爆炸中心点15-90m处。
本发明还提供一种上述方法构建的肺爆震伤动物模型在筛选治疗肺爆震伤的药物中的用途。
优选地，所述药物包括白藜芦醇。
优选地，所述白藜芦醇能够降低肺爆震伤大鼠肺组织出血、肺泡隔破裂及炎性细胞浸润，并缓解肺组织水肿。
优选地，所述白藜芦醇能够用于制备肺爆震伤大鼠炎性因子IL6、IL8与TNF-α、凋亡因子Caspase 3与Caspase 8及氧化应激产物MDA的表达抑制剂。
与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：
1、本发明通过实弹爆炸构建动物肺爆震伤模型，更切近实战环境，可真实反映爆炸有关的物理参数及其交互产生的复杂作用过程，对肺损伤的范围、等级、严重程度实现量化评价，为开展爆炸冲击肺损伤的分子机制、临床诊断、治疗、康复干预等研究及治疗肺爆震伤药物的筛选提供支撑。
2、应用本发明构建的模型对白藜芦醇的治疗效果评价结果证明：白芦藜醇可明显降低爆炸伤大鼠肺组织出血、肺泡隔破裂、炎性细胞浸润，通过抑制炎性因子(IL6、IL8)、凋亡因子(Caspase 3、Caspase 8)及氧化应激产物(MDA)表达，提升抗氧化酶(SOD)活性，对肺爆震伤具有保护作用。
3、白芦藜醇属于天然活性产物，以口服的方式给药，有利于药物的有效成分充分发挥治疗作用，具有不易产生耐药性、安全高效、不产生抗生素污染等优点，有利于肺爆震伤的治疗。
附图说明
图1是大鼠及压力传感器的布设位置图；
图2是距爆心不同距离大鼠肺解剖图；
图3是距爆心不同距离大鼠肺湿/干重比；与对照组相比，**P<0.01；***P<0.001；
图4是距爆心不同距离大鼠肺组织病理(HE，×100倍)；
图5是距爆心35m处爆炸模拟示意图；
图6是实施例2大鼠肺解剖图；
图7是实施例2大鼠肺组织病理(HE，×100倍)；
图8是白芦藜醇对大鼠肺爆震伤所致肺水肿的影响；
图9是白芦藜醇对爆炸冲击波暴露大鼠肺组织炎性因子的影响，其中，A、B、C分别表示IL6、IL8及TNF-ɑ；
图10是白芦藜醇对爆炸冲击波暴露大鼠肺组织氧化应激的影响，其中，A、B分别表示SOD、MDA；
图11是白芦藜醇对爆炸冲击波暴露大鼠肺组织凋亡的影响，其中，A、B分别表示Caspase 3、Caspase 8。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步详细说明，应予理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
肺爆震伤模型的构建
1、动物分组
将50只大鼠按顺序称重并编号1-50，利用Excel软件生成相对应随机数字，将随机数字按大小升序排列，按顺序将大鼠分为10组，每组5只，其中一组为对照组(图示中Ctrl组)，其余为试验组，试验组布放于距爆心不同距离处。
2、模型制作
该模型是借助于某战斗部静爆威力试验构建的。具体操作方法为：选择爆炸威力为300kg TNT当量(此处仅以300kg TNT当量为例，但并不代表只有在该爆炸威力下才能达到肺震伤效果)的炸药进行布设，再随机将试验组45只大鼠分别布放于距爆心15m、20m、25m、30m、35m、40m、50m、70m、90m处，每个位置点5只大鼠。试验前将大鼠吸入异氟烷进行麻醉，大鼠置于铁丝网鼠笼并固定于地面。每个位置布设压力传感器，通过线缆传输只终端计算机上，试验前启动电源开关并记录超压数据。试验后通过对大鼠的解剖、组织病理学检测等评价模型是否成功。大鼠及压力传感器的布设位置图如图1所示。
3、动物解剖方法
大鼠经腹腔注射水合氯醛(10％，0.3mL/100g)麻醉；沿剑突继续向上剪开皮肤自颌下，向两侧钝性剥开皮肤与皮下组织，暴露胸廓并沿正中剪开，用镊子夹住器官，整体取下肺组织，置于盛有生理盐水的培养皿中洗去血迹；分离左右肺，将左肺用滤纸洗净表面渗液，用电子天平称量肺湿重，随后放入烘箱内干燥；将右肺置于甲醛溶液中固定备用。
4、肺水肿检测
爆炸冲击波暴露24h后，将大鼠进行解剖。每组大鼠的完整左叶肺制成5份样本，用干净的滤纸将其表面的液体蘸干净，然后记录肺脏组织的重量，获得湿重；然后将其置于恒温干燥箱中，在80℃下保持48h称量干重，计算湿重/干重(W/D)比，评价肺水肿情况。
5、组织病理学检测
同时选择上述5只大鼠取出右侧肺脏，制作石蜡切片和组织病理学分析；其中，组织病理学制片的具体方法为：
①取材：取4％甲醛溶液固定的肺组织块约3～4mm，置于包埋盒中；
②脱水及透明：使用全自动脱水机进行脱水，脱水设置程序为：75％乙醇(1h)→85％乙醇(1h)→95％乙醇I(1h)→95％乙醇II(1h)→100％乙醇I(45min)→100％乙醇II(45min)→100％乙醇III(0.5h)；透明设置程序：二甲苯I(20min)→二甲苯II(20min)；
③包埋：使用石蜡包埋机将脱水后的标本用石蜡包埋，并对蜡块进行修整便于切片；
④切片：使用转式切片机，将标本切0.5μm的切片；
⑤摊片：左手用洁净毛笔轻轻挑起，右手拿眼科镊轻夹蜡片转移至摊片机(水温40～45℃)的水面漂浮；
⑥烘片：待切片完全展开后，用载玻片捞取一张较好的切片置于烘片机上烤干(65～70℃)，立即写上样本编号；
⑦染色：使用全自动染色机进行染色，设置程序：二甲苯I(5min)→二甲苯II(5min)→二甲苯III(5min)→100％乙醇(1min)→95％乙醇(1min)→85％乙醇(1min)→75％乙醇(1min)→水洗I(1min)→苏木素(6min)→水洗II(1min)→盐酸酒精分化(4s)→水洗III(1min)→氨水返蓝(1min)→水洗IV(1min)→伊红(1.5min)→水洗V(1min)→85％乙醇(20s)→90％乙醇(1min)→95％乙醇I(1min)→95％乙醇II(1min)→100％乙醇I(1min)→100％乙醇II(1min)→二甲苯I(1min)→二甲苯II(1min)；
(8)封片：使用自动封片机进行封面；
(9)镜检：使用显微镜进行组织病理学检查，详细观察标本出现的病理变化并做记录，并进行拍照。
6、结果
6.1试验后动物症状、体征
试验后距爆心15m、20m、25m处大鼠全部死亡；30m处当场死亡4只，试验4h后另一只死亡；35m处死亡1只，总体死亡率为42.0％(21/50)，其余大鼠全部存活，死亡大鼠口鼻有血性分泌物；40m、50m、70m处大鼠表现呼吸急促，精神萎靡，90m处大鼠未见明显异常。
6.2大鼠解剖
结果如图2所示。
解剖显示，所有大鼠肺脏主要以不同程度的出血为主，胸腔积血，距爆心25m和30m处大鼠全肺出血，也是其死亡的主要原因；35m处大鼠右肺中叶出血达深度达到肺组织全层；40m、50m和70m处大鼠仅组织表层斑片状装出血，随布放距离的延长，肺出血呈减轻状态；对照组大鼠未见异常。
6.3大鼠肺湿/干重比(W/D)
结果如图3所示。
与对照组大鼠肺组织W/D值(4.685±0.097)相比，距爆心35m(5.193±0.110)、40m(5.069±0.154)和50m(4.944±0.589)处大鼠W/D值显著增大，差异有统计学意义(F＝16.322，P<0.000)，且随距爆心距离的延长，W/D值呈下降趋势。说明距爆心的距离越近，肺水肿程度越严重。
6.4大鼠肺组织病理学
结果如图4所示。
显微镜下观察可见，大鼠肺组织可见肺泡腔弥漫性出血，可见大量炎细胞浸润；肺泡壁断裂、肺泡腔不同程度融合，肺间质见明显水肿。
6.5大鼠肺湿/干重比(W/D)与冲击波超压的相关性
对大鼠肺湿/干重比(W/D)与冲击波超压进行Pearson相关分析，结果显示W/D值与冲击波超压值呈正相关(r＝0.859，P＝0.029)，超压值越大，W/D值越大，提示爆炸冲击波超压所致肺水肿越严重。通过该量效关系，可以对肺损伤的范围、等级、严重程度实现量化评价，为开展爆炸冲击肺损伤的分子机制、临床诊断、治疗、康复干预等研究提供支撑。
实施例2
白藜芦醇缓解肺爆震伤效果评价
1、分组
选择40只品系为SD的SPF级雄性大鼠，体重(200±20)g，随机分为4组，分别为对照组(No treatment，NT)、白芦藜醇组(Resveratrol,RE)、模型组(Blast)、模型+白芦藜醇组(Blast+RE)，每组10只。
2、建模
参照实施例1中的建模方法，选择在距离爆心35m处布放试验组大鼠。为满足实验动物福利的要求，同时避免因应激对试验结果的影响，试验前将大鼠吸入异氟烷进行麻醉。将大鼠置于铁丝网鼠笼内并固定距爆心于35m半径的圆弧上。对照组大鼠远离爆炸环境3km以外区域。
在距离爆心35m半径的圆弧上布设压力传感器，通过线缆传输只终端计算机上，试验前启动电源开关记录超压数据。具体布设位置及方法参照图5所示。
3、方法
3.1剂量及给药方式
在构建BLI(肺爆震伤)模型的前1周以口服灌胃的方式进行给药，给药浓度为200mg/kg，给药体积按1mL/100g体重。
3.2操作方法
爆炸冲击波暴露24h后，将大鼠进行解剖。每组取出5只大鼠的完整左叶肺制成5份样本，用干净的滤纸将其表面的液体蘸干净，然后记录肺脏组织的重量，获得湿重；然后将其置于恒温干燥箱中，在80℃下保持48h称量干重，计算湿重/干重(W/D)比，评价肺水肿情况；
同时选择上述5只大鼠取出右侧肺脏，制作石蜡切片和组织病理学分析；其中，组织病理学制片的具体操作参照实施例1中的方法。
另取每组剩下的5只大鼠肺组织制备组织匀浆，采用酶联免疫吸附(ELISA)试验方法(具体步骤参照试剂盒说明书)，检测炎性因子、氧化应激及凋亡因子。组织匀浆制作方法为：用预冷的PBS(pH＝7.4)冲洗肺组织，去除残留血液，称重后将肺组织剪碎。将剪碎的肺组织与对应体积的PBS(按1:9的重量体积比)加入玻璃匀浆器中于冰上充分研磨，于冰上充分研磨，最后将匀浆液于5000×g离心10min，收集上清待测。
4结果
4.1大鼠一般情况
试验过程及观察期内大鼠无死亡，胸部外观均未见明显损伤，模型组大鼠呼吸浅快，其中2只鼻腔可见血性分泌物，模型组(8/10)、白芦藜醇+模型组(7/10)部分大鼠出现短暂呼吸暂停，试验后出现行动迟缓等表现，24h后恢复正常。
4.2大鼠肺组织病理学分析
大鼠肺组织解剖图如图6所示。
解剖可见，模型组大鼠肺组织有明显出血，白芦藜醇+模型组出血面显著减少。
大鼠肺组织病理图如图7所示。
组织病理学可见，模型组、白芦藜醇+模型组大鼠肺组织镜下可见出血、肺泡隔破裂和炎性细胞浸润；对照组和白芦藜醇组大鼠解剖和组织病理未见明显改变。结果表明：白芦藜醇对爆炸冲击波所致大鼠肺组织出血、水肿、炎细胞浸润等具有明显的改善作用。
4.3大鼠肺组织湿重/干重(W/D)比
结果如图8所示。
模型组、白芦藜醇+模型组大鼠肺湿/干重比(W/D)显著高于对照组，差异有统计学意义(***P<0.001)；白芦藜醇+模型组大鼠肺湿/干重比(W/D)显著低于模型组，差异有统计学意义(#P<0.05)。提示白芦藜醇可明显改善爆炸冲击波所致肺水肿。
4.4对爆炸冲击波暴露大鼠肺组织炎性因子的影响
结果如图9所示。
与对照组相比，模型组大鼠肺组织白细胞介素6(IL6)、白细胞介素8(IL8)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达显著升高，差异有统计学意义(***P<0.001)，白芦藜醇组无统计学差异(P>0.05)，提示肺爆震伤模型构建成功。
与模型组相比，白芦藜醇+模型组大鼠肺组织白细胞介素6(IL6)、白细胞介素8(IL8)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达显著降低，差异有统计学意义(###P<0.001)。结果表明：白芦藜醇对爆炸冲击波所致肺组织炎性反应具有保护作用。
4.5对爆炸冲击波暴露大鼠肺组织氧化应激的影响
如图10所示，与对照组相比，模型组大鼠肺组织总超氧化物歧化酶(T-SOD)表达显著降低，氧化应激产物丙二醛(MDA)表达升高，差异有统计学意义(*P<0.05，***P<0.001)，白芦藜醇组无统计学差异(P>0.05)，提示肺爆震伤可引起氧化应激反应。
与模型组相比，白芦藜醇+模型组大鼠肺组织SOD表达升高而MDA表达降低，差异有统计学意义(#P<0.05，###P<0.001)。结果表明：白芦藜醇对爆炸冲击波所致肺组织氧化应激反应具有保护作用。
4.6对爆炸冲击波暴露大鼠肺组织凋亡的影响
如图11所示，与对照组相比，模型组大鼠肺组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase 3)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(Caspase 8)表达显著升高，差异有统计学意义(***P<0.001)，白芦藜醇组无统计学差异(P>0.05)，提示爆炸冲击波致肺组织产生凋亡效应。
与模型组相比，白芦藜醇+模型组大鼠肺组织Caspase 3和Caspase 8表达显著降低，差异有统计学意义(###P<0.001)。结果表明：白芦藜醇对爆炸冲击波所致肺组织凋亡具有保护作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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