一种氨乙基联苯类化合物及其制备方法和用途
阅读说明：本技术 一种氨乙基联苯类化合物及其制备方法和用途 (Aminoethylbiphenyl compound, and preparation method and application thereof ) 是由 牛生吏 李林 董婧 李应东 张德显 吕甜梦 于 2021-08-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种氨乙基联苯类化合物及其制备方法和用途,属于医药技术领域。首先通过乙醇水溶液提取假叶树根茎,获得粗提物,然后依次通过有机溶剂萃取、ODS色谱柱、HPLC色谱多级分离,获得氨乙基联苯类化合物。本发明所述的氨乙基联苯类化合物能明显抑制人急性原粒细胞白血病细胞株HL-60、人慢性髓细胞白血病细胞株K562、和人急性单核细胞白血病细胞株THP-1的增殖,并且对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、链球菌均具有一定的抗菌活性,有望作为活性成分用于制备治疗白血病或抗菌的药物。(The invention discloses an aminoethyl biphenyl compound, a preparation method and application thereof, and belongs to the technical field of medicines. Firstly, rhizomes of Ruscus aculeatus are extracted by ethanol aqueous solution to obtain crude extract, and then the crude extract is sequentially subjected to organic solvent extraction, ODS chromatographic column and HPLC chromatographic multi-stage separation to obtain the aminoethylbiphenyl compounds. The aminoethyl biphenyl compound can obviously inhibit the proliferation of human acute myeloblastic leukemia cell line HL-60, human chronic myeloblastic leukemia cell line K562 and human acute monocytic leukemia cell line THP-1, has certain antibacterial activity on escherichia coli, salmonella, staphylococcus aureus and streptococcus, and is expected to be used as an active ingredient for preparing medicines for treating leukemia or resisting bacteria.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种氨乙基联苯类化合物及其制备方法和用途。
背景技术
白血病(Leukemia)，亦称作血癌，是一种造血系统的恶性肿瘤。据推算全世界每年有新发白血病病例20万～25万，我国白血病的年发病率约为2.76/10万，占男性恶性肿瘤第六位，女性恶心肿瘤第八位。国家儿童肿瘤监测中心发布首期《国家儿童肿瘤监测年报2020》，年报显示，在所监测的肿瘤患儿出院人次中，白血病为患病比例最高的病种，占比57.21％。据统计，我国每年新增白血病患儿约1.5万人左右，儿童肿瘤的发病率在以每年2.8％的速度增长。据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的2020年最新全球癌症统计数据，全球癌症死亡病例996万例，其中白血病死亡人数超30万，而我国白血病死亡人数达到6万，白血病患者的五年生存率仅为25.4％。较高的发病率和死亡率意味着白血病治疗方法的研究刻不容缓。
白血病分型和预后分层复杂，治疗方法主要有化学治疗﹑放射治疗﹑靶向治疗、免疫治疗、造血干细胞移植等。化疗为目前主要的治疗手段，但其有效率较低、选择性差、副作用大。另外，临床易复发和转移也是白血病治疗的难点。因此，研究疗效高、选择性好、靶点明确、对非靶器官无副作用的抗肿瘤药物是药学工作者的重大研究课题。
天然产物对于新药的发现与设计、合成具有重要意义，也是生物活性物质和创新药物的重要来源。根据文献报道，自从1940年以来，在全球上市销售的抗癌化疗药物中，42％是直接源自天然产物，如：紫杉醇(Taxol)、长春瑞滨(Vinorelbine)、青蒿素(Artemisinin)等，30％是天然产物的衍生物或其类似物。天然产物作为药物来源开发的优越性在于，生源合成的天然产物小分子具有更好的与酶和受体相结合的生物相容性，更适合成为治疗药物的先导化合物。因此，从传统中药和药用植物中寻找具有抗肿瘤活性的先导化合物，研究其作用机制，从而研制抗肿瘤治疗药物是当前研究的热点。
假叶树(Ruscus aculeatus)为百合科(Liliaceae)假叶树属(Ruscus)植物。原产于欧洲南部，目前国内外对假叶树的化学成分及药理作用的研究报道还相对较少。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种氨乙基联苯类化合物及其制备方法和其在抗肿瘤或抗菌方面的用途，为预防和/或治疗白血病或菌类感染提供一种新的药物。
本发明目的是通过以下方式实现：
一种氨乙基联苯类化合物及其衍生物，所述的氨乙基联苯类化合物的结构通式如式Ⅰ所示：
R1选自H、OH、甲基、乙基、丙基；R2选自H、甲基、乙基、丙基；R3选自H、甲基、乙基、丙基；
所述的衍生物为式Ⅰ所示化合物的药学上可接受的盐、前体化合物、水合物或溶剂化物。
进一步地，所述的氨乙基联苯类化合物的结构如下所示：
进一步地，所述的氨乙基联苯类化合物可通过化学合成或从植物中提取分离获得。
进一步地，所述的氨乙基联苯类化合物是从假叶树的根茎中提取分离得到。
本发明另一方面提供上述的氨乙基联苯类化合物的制备方法，主要包括如下步骤：
a)使用乙醇水溶液提取假叶树根茎，重复提取2次以上，合并所得提取液，减压浓缩，得提取物；
b)将步骤a)所得的提取物混悬于水中，用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇依次进行萃取，每次萃取过程中水相和有机相的体积比1:1～1:10，得到乙酸乙酯萃取液；
c)将步骤b)所得的乙酸乙酯萃取液上样到硅胶柱上，使用正己烷和丙酮体积比为100:0，100:3，100:5，100:7，100:10，100:15，100:20，100:25，100:30，100:40的混合溶液依次进行梯度洗脱，按洗脱顺序得到十个组分；
d)将步骤c)中得到的第七个组分上样到硅胶柱上，使用正己烷和丙酮体积比为100:0，100:3，100:5，100:10，100:15，100:20，100:30的混合溶液依次进行梯度洗脱，按洗脱顺序得到七个组分；
e)将步骤d)中所得的第五个组分上样至ODS色谱柱，使用乙腈-水按照30:70，40:60，50:50，60:40，70:30，80:20的体积比且均加入0.1％三氟乙酸形成的混合溶液为流动相依次进行梯度洗脱，按洗脱顺序得到六个组分；
f)将步骤(e)中所得的第五个组分经HPLC-DAD半制备型色谱分离制备，色谱柱为YMC ODS-A C18，检测波长为220nm，流动相为乙腈：水＝70:30，得到氨乙基联苯类化合物。
进一步地，步骤(a)中所述提取为加热回流提取或加热超声提取，温度范围为50～100℃。
进一步地，步骤(a)中所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为50％～99％，假叶树根茎与乙醇水溶液的重量体积比为1:5～1:20kg/L。
进一步地，步骤(b)中每次萃取过程中水相和有机相的体积比1:1～1:5。
进一步地，步骤(f)中所述流动相的流速为1-10mL/min。
本发明另一方面提供一种药物组合物，其包含上述的氨乙基联苯类化合物或氨乙基联苯类化合物衍生物。
一种包含上述氨乙基联苯类化合物或氨乙基联苯类化合物衍生物的药物制剂，所述药物制剂为片剂、滴剂、注射剂、颗粒剂、软膏剂、栓剂或胶囊剂。
上述的氨乙基联苯类化合物或氨乙基联苯类化合物衍生物、药物组合物在制备抗肿瘤药物或抗菌药物中的应用。
进一步地，所述肿瘤包括白血病细胞。
进一步地，所述菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、链球菌。
本发明所述的应用是指以具有式Ⅰ结构的化合物或其衍生物中的至少一种作为活性成分用于制备预防和/或治疗抗肿瘤药物或抗菌药物的药物。
本发明所述药物可以各种给药途径给予患者，包括但不限于口服、透皮、肌肉、皮下和静脉注射。
本发明所述药物的剂型不限，只要是能够使活性成分有效地到达作用部位的剂型均可以。
本发明所述药物可以单独使用，也可以以药物组合物的形式使用，所述的药物组合物是指在药物中，除了含有主要活性成分之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或药学上可接受的载体以及各种制剂所必要的辅料等。
本发明所述活性成分的有效施用剂量可随所用的药物组合物、药物制剂、给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。
术语“药学上可接受的盐”是指由所述化合物中带正电荷的部分(例如，胺基)与具有相反电性的带负电荷(例如，三氟醋酸、盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、1,5-萘二磺酸、亚细亚酸、草酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、庚二酸、己二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、氨基酸)形成的盐，或者由化合物中带负电荷的部分(例如，羟基)与正电荷(例如，钠、钾、钙、镁)形成的盐。所述的“药学上可接受的”是指适用于人而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。
术语“前体化合物”是指在体外无活性，但能够在生物体内进行代谢或化学反应转化为本发明的活性成分，从而发挥其药理作用的化合物。
与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：
(1)本发明所述的氨乙基联苯类化合物对人急性原粒细胞白血病细胞株HL-60、人慢性髓细胞白血病细胞株K562、人急性单核细胞白血病细胞株THP-1均具有较强的细胞毒性，能明显抑制人急性原粒细胞白血病细胞株HL-60、人慢性髓细胞白血病细胞株K562、和人急性单核细胞白血病细胞株THP-1的增殖，说明本发明所述的氨乙基联苯类化合物具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，可望作为活性成分用于制备预防和/或治疗白血病的药物，具有药用前景。
(2)本发明所述的氨乙基联苯类化合物具有显著的抗菌活性，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、链球菌均具有一定的抗菌活性，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强，说明其抗革兰氏阳性菌活性较强，抗革兰氏阴性菌活性较弱，可进一步测定其对金黄色葡萄球菌分离株的活性。后续研究中以此化合物为基本结构母核，进一步进行结构修饰来合成一系列氨乙基联苯类化合物，并探讨其抗菌活性构效关系。
(3)天然植物来源抗菌活性成分通常具有使病原体不易产生耐药性、高效低毒、低残留等优点，因此本发明的化合物aculebiphenyl A具有潜在的抗菌活性，有望作为从天然植物性资源中研发的生物碱类活性成分，用于制备预防和/或治疗细菌性感染等疾病的药物，市场开发潜力巨大。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
图1.本申请提取的aculebiphenyl A的高分辨质谱图。
图2.本申请提取的aculebiphenyl A的1H NMR谱图。
图3.本申请提取的aculebiphenyl A的13C NMR谱图。
图4.本申请提取的aculebiphenyl A的异核单量子相关谱图HSQC。
图5.本申请提取的aculebiphenyl A的异核多键相关谱图HMBC。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：从假叶树中提取氨乙基联苯类化合物
1.1实验材料
假叶树于2016年6月在河北省安国市场购买，植物经沈阳农业大学园艺学院的宁伟教授鉴定，植物样本保存于沈阳农业大学动物药学实验中心。
1.2试验方法
a)将2.5kg假叶树根茎用20L 95％乙醇80℃回流提取，重复提取3次，合并所得提取液，减压浓缩，得提取物61g；
b)将步骤a)所得的提取物混悬于水中，用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇依次进行萃取，每个溶剂按照水相和有机相的体积比1:1，得到乙酸乙酯萃取液；
c)将步骤b)所得的乙酸乙酯萃取液通过硅胶柱分离，用正己烷和丙酮按照100:0，100:3，100:5，100:7，100:10，100:15，100:20，100:25，100:30，100:40的体积比形成的混合溶液依次进行梯度洗脱，按洗脱顺序得到十个组分，并分别减压浓缩各组分后经TLC薄层分析；
d)将步骤c)中得到的第七个组分(正己烷和丙酮体积比为100:20)通过硅胶柱分离，用正己烷和丙酮按照100:0，100:3，100:5，100:10，100:15，100:20，100:30的体积比形成的混合溶液依次梯度洗脱，按洗脱顺序得到七个组分，并分别减压浓缩各组分后经TLC薄层分析；
e)将步骤d)中所得的第五个组分(正己烷和丙酮体积比为100:15)经ODS色谱柱分离，用乙腈-水按照30:70，40:60，50:50，60:40，70:30，80:20的体积比且均加入0.1％三氟乙酸形成的混合溶液为流动相进行洗脱，按洗脱顺序得到六个组分，并分别减压浓缩各组分后经TLC薄层分析；
f)上述步骤(e)中所得的第五个组分(乙腈和水体积比为70:30)经HPLC-DAD半制备型色谱(YMC ODS-A C18)分离制备，220nm检测，流速为2mL/min，流动相为乙腈：水＝70:30，即得到本发明所述的氨乙基联苯类化合物。
所得的氨乙基联苯类化合物是白色针状晶体，通过高分辨质谱确定分子式为C16H19NO，其NMR数据如表1所示：
表1.本申请得到的氨乙基联苯类化合物的NMR数据
1.3实验结果
从假叶树中分离得到的化合物经核磁共振及高分辨质谱解析，确定其化学结构如下所示，为一未见报道的新化合物，命名为aculebiphenyl A。
实施例2：Aculebiphenyl A抑制人白血病细胞株增殖试验
2.1实验材料
aculebiphenyl A(从假叶树中提取分离得到)；人急性原粒细胞白血病细胞株HL-60、人慢性髓细胞白血病细胞株K562、人急性单核细胞白血病细胞株THP-1由沈阳药科大学华会明教授赠予；胎牛血清、青霉素、链霉素和RPMI1640购自美国Invitrogen公司；5-氟尿嘧啶购自于美国Sigma公司。
2.2试验方法
HL-60、K562、THP-1细胞培养于含有10％经加热灭活的胎牛血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素及1mmol/L L-谷氨酰胺RPMI1640培养液中，置37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中孵育，待细胞平铺面积比例达到70％-80％时使用。
0.4％台盼蓝溶液：称取台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水稀释到4％的储存浓度，用滤纸过滤，4℃保存。使用时，将该储存液用PBS稀释至0.4％工作浓度。
分别取HL-60、K562、THP-1细胞以3×104个/mL密度，每孔1mL接种于24孔板中后，随即加入不同浓度aculebiphenyl A药物和阳性对照药(5-氟尿嘧啶)，对照组加入等容积DMSO。孵育72小时后制备成单个细胞悬液，取50μL细胞悬液加入50μL的0.4％台盼蓝溶液，混匀，在3分钟内，于显微镜下观察，死细胞被染成蓝色，而活细胞拒染。用血球计数板分别计数各组活细胞和死细胞。利用下列公式计算得到细胞生长抑制率，抑制率＝[1–(加药孔细胞数/对照孔细胞数)]×100％。当细胞的生长抑制率达到50％时，化合物的浓度即为IC50值。
2.3实验结果
化合物aculebiphenyl A作用于三株人白血病细胞的IC50如表2所示。
表2.aculebiphenyl A抑制三株人白血病细胞生长的IC50值(μM)
由表2可见，本发明所述的氨乙基联苯类化合物aculebiphenyl A具有较强的细胞毒性，IC50均在50μM以下，能明显抑制人急性原粒细胞白血病细胞株HL-60、人慢性髓细胞白血病细胞株K562、和人急性单核细胞白血病细胞株THP-1的增殖，可见本发明所述的氨乙基联苯类化合物aculebiphenyl A能够浓度依赖性地抑制白血病细胞的增殖，具有潜在的抗肿瘤作用，有望作为活性成分用于制备预防和/或治疗白血病的药物。
实施例3：Aculebiphenyl A抗菌实验
3.1实验材料
供试菌种大肠杆菌ATCC25922、沙门氏菌C7731、金黄色葡萄球菌ATCC29213、链球菌ATCC49619均购自中国兽药监察所菌种保藏中心。阳性对照药硫酸庆大霉素购自大连美仑生物技术有限公司。
3.2菌液的制备
将保存的金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌菌种以划线方式分别接种到甘露醇氯化钠琼脂平板培养基、改良爱德华琼脂平板培养基、麦康凯琼脂平板培养基和SS琼脂平板培养基中，37℃培养24小时。分别挑取4种培养基上的典型单菌落于营养肉汤(NB)培养基中，37℃、150rpm振摇培养至OD600＝0.4-0.6，此时菌液的浓度约为1×108CFU/mL，使用时再用MHB培养基将菌液按1：1000稀释成约1×105CFU/mL的菌液。
3.3药液的配制及稀释
选取硫酸庆大霉素为对照抗生素，用磷酸盐缓冲液配制成浓度为1280μg/mL的储备液；化合物aculebiphenyl A用灭菌去离子水分别配制成浓度为32000μg/mL的储备液；所有储备液在使用前在无菌条件下用0.22μm的灭菌滤膜过滤除菌。采用倍比稀释的方法，在无菌操作条件下，取10支灭菌离心管，依次标号1-10。1号离心管中加1.6mL MHB培养基，2-9号离心管分别加1mL MHB。向1号离心管中加0.4mL药物储备液并混匀，用移液器从1号离心管吸取1mL液体加入2号离心管并混匀，再从2号离心管吸取1mL液体加入3号离心管并混匀……同法依次稀释到第10个离心管。按照此法硫酸庆大霉素将被依次稀释成256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL的梯度浓度；化合物aculebiphenyl A将被依次稀释成6400μg/mL、3200μg/mL、1600μg/mL、800μg/mL、400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL的梯度浓度。
3.4 MIC值的测定
在无菌操作条件下，将稀释好的化合物aculebiphenyl A和硫酸庆大霉素药液按浓度由大到小依次加入96孔板的1-10孔，每孔100μL。将细菌培养液用MHB培养基稀释成1×105CFU/mL，每排的1-10孔每孔均加100μL稀释后的菌液，此时1-10孔的药液浓度依次为3200μg/mL、1600μg/mL、800μg/mL、400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL，第11空加100μL MHB培养基作空白对照，第12孔加100μL稀释后的菌液作菌液对照。将每孔的菌液和药液混匀后加盖，37℃孵育18-24小时后观察。每种药物均做3个平行试验。金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌均按此法测定化合物aculebiphenyl A对其最小抑菌浓度。
3.5试验结果
化合物aculebiphenyl A作用于四株细菌株的MIC如表3所示。
表3.Aculebiphenyl A对金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的MIC(μg/mL)
如表3所示，本发明所述的氨乙基联苯类化合物aculebiphenyl A具有显著的抗菌活性，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、链球菌均具有一定的抗菌活性，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强，说明其抗革兰氏阳性菌活性较强，抗革兰氏阴性菌活性较弱，可进一步测定其对金黄色葡萄球菌分离株的活性。后续研究中以此化合物为基本结构母核，进一步进行结构修饰来合成一系列氨乙基联苯类化合物，并探讨其抗菌活性构效关系。天然植物来源抗菌活性成分通常具有使病原体不易产生耐药性、高效低毒、低残留等优点，因此本发明的化合物aculebiphenyl具有潜在的抗菌活性，有望作为从天然植物性资源中研发的生物碱类活性成分，用于制备预防和/或治疗细菌性感染等疾病的药物，市场开发潜力巨大。
最后需要在此指出的是：以上仅是本发明的部分优选实施例，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。