大豆GmSPA3a/3b蛋白及其相关生物材料在调控植物开花和株高中的应用
阅读说明：本技术 大豆GmSPA3a/3b蛋白及其相关生物材料在调控植物开花和株高中的应用 (Application of soybean GmSPA3a/3b protein and related biological materials thereof in regulation and control of plant flowering and plant height ) 是由 赵涛 秦超 李宏宇 刘斌 刘军 于 2021-09-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了大豆GmSPA3a/3b蛋白及其相关生物材料在调控植物开花和株高中的应用。本发明所保护的一个技术方案是蛋白质相关生物材料在调控或缩短植物花期、调控或降低植物株高以及植物育种和改良中的应用。所述蛋白质的氨基酸序列可为序列表中序列1或序列2所示的蛋白。实验证明,GmSPA3a/3b蛋白活性丧失的转基因大豆Gmspa3a、Gmspa3b和Gmspa3ab突变体表现出花期提前且株高矮化的表型。通过敲除大豆Gmspa3a、Gmspa3b或GmSPA3a/3b基因,可降低大豆的光周期敏感性,培育不同开花时间和株高的多个品系以适应不同区域的种植,从而有效扩大优良大豆的播种面积,实现增产丰收。(The invention discloses application of soybean GmSPA3a/3b protein and related biological materials thereof in regulating and controlling flowering and plant height of plants. The invention provides a technical scheme for applying protein-related biological materials in regulation or shortening of the flowering phase of plants, regulation or reduction of the plant height of plants, plant breeding and improvement. The amino acid sequence of the protein can be a protein shown as a sequence 1 or a sequence 2 in a sequence table. Experiments prove that the transgenic soybeans Gmspa3a, Gmspa3b and Gmspa3ab mutant with the loss of the activity of the Gmsa 3a/3b protein show a phenotype of advanced flowering phase and dwarfing plant height. By knocking out soybean Gmspa3a, Gmspa3b or GmSPA3a/3b genes, the photoperiod sensitivity of soybeans can be reduced, and multiple strains with different flowering time and plant height are cultivated to adapt to planting in different areas, so that the sowing area of excellent soybeans is effectively enlarged, and yield and harvest are increased.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及大豆GmSPA3a/3b蛋白及其相关生物材料在调控植物开花和主茎节数中的应用。
背景技术
大豆(Glycine max)是世界上食用植物油和植物蛋白的重要来源。光照是影响大豆生长发育最为重要的环境因素之一。大豆作为典型的短日照植物，多数大豆品种对不同纬度的光周期适应性狭窄。
作物株型是指植株的形态布局、生态特性和生理特征等方面具有的总体体现。理想的作物株型可以提高作物的叶面积系数，增加群体光合效率、改善作物对肥料的需求关系，从而提高作物的产量。大豆作为典型的短日照植物，多数大豆品种对不同纬度的光周期适应性狭窄。高纬度地区通常需要矮秆生育期短的大豆品种，TL1作为低纬度地区的优良品种，在高纬度地区会出现严重倒伏结实率低的现象。
2010年，科学家已完成大豆基因组测序，为基因功能的研究提供了条件，克隆大豆中的优良基因更加便利，但目前大豆株型性的分子机制的尚未清楚。随着分子生物学的不断发展，利用高通量测序和转基因技术进行株型功能基因的研究，可以实现提高大豆产量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控植物花期和/或如何调控植物株高。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质相关的生物材料的下述任一种应用：
Q1、所述生物材料在调控植物花期或缩短植物花期中的应用。
Q2、所述生物材料在调控植物株高或降低植物株高中的应用。
Q3、所述生物材料在植物育种中的应用。
Q4、所述生物材料在植物品种改良中的应用。
上文所述蛋白质可为如下A1)、A2)、A3)、A4)、A5)、A6)、A7)、A8)、A9)或A10)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；
A2)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；
A3)氨基酸序列是序列表中序列5的蛋白质；
A4)氨基酸序列是序列表中序列6的蛋白质；
A5)氨基酸序列是序列表中序列7的蛋白质；
A6)氨基酸序列是序列表中序列8的蛋白质；
A7)氨基酸序列是序列表中序列9的蛋白质；
A8)氨基酸序列是序列表中序列10的蛋白质；
A9)将A1)、A2)、A3)、A4)、A5)、A6)、A7)或A8)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由A1)、A2)、A3)、A4)、A5)、A6)、A7)或A8)衍生的或与A1)、A2)、A3)、A4)、A5)、A6)、A7)或A8)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A10)在A1)、A2)、A3)、A4)、A5)、A6)、A7)、A8)或A9)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
上文所述生物材料可为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码上文所述蛋白质的核酸分子。
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒。
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体。
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系。
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织。
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。
B8)抑制或降低上文所述蛋白质的基因表达的核酸分子。
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
上述蛋白质中，序列表中序列1所示的大豆GmSPA3a蛋白由907个氨基酸残基组成。序列表中序列2所示的大豆GmSPA3b蛋白由906个氨基酸残基组成。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、85％、86％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。
上文所述应用中，B1)所述核酸分子为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)或b6)或b7)或b8)或b9)或b10)所示的DNA分子：
b1)编码序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
b2)编码序列是序列表中序列4所示的DNA分子；
b3)编码序列是在序列表序列3的第160-161位核苷酸之间插入了1个核苷酸T并保持序列3的其它序列不变得到的DNA分子；
b4)编码序列是缺失了序列表中序列3的第159-164位的5个核苷酸TTCGG并保持序列3的其它序列不变得到的DNA分子；
b5)编码序列是缺失了序列表中序列4的第420-421位的2个核苷酸CC并保持序列4的其它序列不变得到的DNA分子；
b6)编码序列是在序列表中序列4的第419-420位的2个核苷酸CC核苷酸之间插入了1核苷酸T，并保持序列4的其它序列不变得到的DNA分子；
b7)编码序列是缺失了序列表中序列3的第142-143位的2个核苷酸CC并保持序列3的其它序列不变得到的DNA分子；
b8)编码序列是缺失了序列表中序列4的第139-140位的2个核苷酸CC(发生了2个核苷酸的缺失)并保持序列4的其它序列不变得到的DNA分子；
b9)与b1)、b2)、b3)、b4)、b5)、b6)、b7)或b8)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子；
b10)在严格条件下与b1)、b2)、b3)、b4)、b5)、b6)、b7)、b8)或b9)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子。
上文B8)所述核酸分子可为表达靶向上文A1)或A2)所述蛋白编码基因的gRNA的DNA分子或靶向上文A1)或A2)所述蛋白编码基因的gRNA。
所述靶向上文A1)所述蛋白编码基因的gRNA的靶序列可对应于序列表序列3的第157-175位和/或序列3的第129-147位核苷酸。所述靶向上文A2)蛋白编码基因的gRNA的靶序列可如序列表序列4的第403-422位和/或序列4的第126-144位核苷酸。
术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。所述具有90％或90％以上同一性可为至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％的同一性。
上述生物材料中，B2)所述的含有核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达上述应用中所述蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动蛋白编码基因转录的启动子，还可包括终止蛋白编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上文所述蛋白质或调控上文所述蛋白质活性或含量的物质的下述任一种应用：
P1、上文所述蛋白质或调控上文所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物花期或缩短植物花期中的应用；
P2、上文所述蛋白质或调控上文所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物株高或降低植物株高中的应用；
P3、上文所述蛋白质或调控上文所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用；
P4、上文所述蛋白质或调控上文所述蛋白质活性或含量的物质在植物品种改良中的应用。
上文所述蛋白质可来源于大豆。
所述植物可为下述任一种：
D1)双子叶植物，
D2)豆目植物，
D3)豆科植物，
D4)大豆属植物，
D5)大豆。
上述应用中，调控所述蛋白质活性或含量的物质可为敲除所述蛋白质的编码基因的物质和/或调控所述蛋白质的编码基因表达的物质。
上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
上述应用中，所述调控基因表达可为抑制或降低所述基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。
所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。
所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默,另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活,包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。
上述应用中，所述调控基因表达的物质可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过同源重组敲除所述基因的试剂，或通过CRISPR-Cas9敲除所述基因的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种缩短植物花期和/或降低植物株高的方法，包括通过抑制或降低植物基因组中上文所述的蛋白质的编码基因的表达来缩短植物花期和/或降低植物株高。
上述抑制或降低植物中上文所述蛋白编码基因的表达量可采用现有技术中的任何方式实现，以使基因产生缺失突变、插入突变或碱基变换突变，进而实现基因功能降低或丧失，具体可为化学诱变、物理诱变、RNAi、基因组定点编辑或同源重组等。
上述基因组定点编辑方法中，可采用锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)技术或成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas9 system)技术，以及其它能实现基因组定点编辑的技术。无论采取哪种方法，既可对上文所述蛋白的整个编码基因作为靶标，又可将调控上文所述蛋白编码基因表达的各个元件作为靶标，只要能实现基因功能丧失或降低即可。如可以将上文所述蛋白的编码基因的第1外显子作为靶标。
上文所述抑制或降低目的植物中上文所述蛋白质的活性或/和上文所述蛋白质的编码基因的表达量可为通过将所述目的植物中上文所述所述蛋白质的编码基因敲除实现的。
上述方法中所述蛋白质可为上文所述A1)中的蛋白。
上文所述方法还包括向所述植物中导入抑制或降低上文所述蛋白编码基因表达的物质。所述抑制或降低上文述所述蛋白编码基因表达的物质可为如下c1)-c4)任一种物质：
c1)抑制或降低上文所述蛋白编码基因表达的核酸分子；
c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物。
所述蛋白质可为上文所述A1)中的蛋白。
c1)所述的核酸分子可为表达靶向所述A1)蛋白编码基因的gRNA的DNA分子或靶向所述A1)蛋白编码基因的gRNA。
所述靶向上文A1)蛋白编码基因的gRNA的靶序列可对应于序列表序列3的第157-175位和/或129-147位所述靶。向上文A2)蛋白编码基因的gRNA的靶序列可如序列表序列4的第126-144位核苷酸和/或403-422位核苷酸。上文所述抑制或降低植物基因组中上文所述A1)编码基因的表达可为将植物基因组中的序列表中序列3所示的所述蛋白编码基因进行下述至少一种突变：
1)在序列3的第160-161位核苷酸之间插入了核苷酸T；
2)缺失了序列3的第159-164位的5个核苷酸TTCGG；
3)缺失了序列3的第142-143位的2个核苷酸。
上文所述抑制或降低植物基因组中上文所述A1)编码基因的表达也可为将植物基因组中的序列表中序列4所示的所述蛋白编码基因进行下述至少一种突变：
1)缺失了序列4的第418-419位的2个核苷酸CC；
2)在序列4的第419-420位插入了1个核苷酸T；
3)缺失了序列4的第139-144位的2个核苷酸CC。
上文所述的蛋白质可为上文所述A1)中的蛋白。
上文所述植物可为下述任一种：
D1)双子叶植物，
D2)豆目植物，
D3)豆科植物，
D4)大豆属植物，
D5)大豆。
大豆作为典型的短日照植物，多数大豆品种对不同纬度的光周期适应性狭窄。本发明中的实验证明，采用含有重组质粒GmSPA3a-gRNA1，GmSPA3b-gRNA2,GmSPA3a3b-gRNA3的重组农杆菌转化大豆品种TL1，能够对GmSPA3a/3b基因进行编辑，GmSPA3a/3b基因通过CRESPR/Cas9核酸内切酶编辑之后，可造成GmSPA3a/3b基因突变，当两条同源染色体的GmSPA3a/3b基因突变可以导致GmSPA3a/3b蛋白活性丧失，得到GmSPA3a/3b蛋白活性丧失的转基因大豆Gmspa3a、Gmspa3b和Gmspa3ab突变体。Gmspa3a、Gmspa3b和Gmspa3ab突变体表现出花期提前且株高矮化的表型，十分适合低纬度地区的优良品种向高纬度地区移栽种植，可为育种提供优质的资源。通过改变大豆GmSPAs基因的反应特性，将有可能降低大豆的光周期敏感性，培育不同开花时间和株高的多个品系以适应不同区域的种植，从而有效的扩大优良大豆的播种面积，实现增产、丰收之目的。本研究发现GmSPA3a/3b缺失后大豆花期提前且株高矮化，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为GmSPAs蛋白物种进化树。“★”代表GmSPA3a和GmSPA3b。
图2为Gmspa3a、Gmspa3b和Gmspa3ab突变类型的分子鉴定结果。A为GmSPA3a基因结构示意图和突变体Gmspa3a发生基因编辑的位置，B为GmSPA3b基因结构示意图和突变体Gmspa3b发生基因编辑的位置；C为Gmspa3ab发生基因编辑的位置示意图。
图3为大豆品种TL1、Gmspa3a、Gmspa3b和Gmspa3ab突变体植株表型统计图。
图4为大豆品种TL1、Gmspa3a、Gmspa3b和Gmspa3ab突变体植株开花相关基因表达量检测。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例中所用共培养培养基、加入激素的液体诱导培养基、固体诱导培养基、固体伸长培养基和生根培养基记载于如下文献中：Paz,M.M.,J.C.Martinez,A.B.Kalvig,T.M.Fonger and K.Wang(2006)."Improved cotyledonary node methodusing an alternative explant derived from mature seed for efficientAgrobacterium-mediated soybean transformation."Plant Cell Rep 25(3):206-213.
本发明实施例中的载体和实验材料的来源如下：
pU3-gRNA载体：高彩霞实验室惠赠，参考文献文献中：Shan,Q.,Y.Wang,J.Li,Y.Zhang,K.Chen,Z.Liang,K.Zhang,J.Liu,J.J.Xi,J.L.Qiu and C.Gao(2013).Targetedgenome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system.Nat Biotechnol31(8):686-688.公众可从发明人处获得，仅用于重复本发明。
大豆品种TL1：Tian-Long1，由中国农业科学院油料作物研究所单志慧研究员赠送，本实验室保存，用以TL1为背景进行转基因，以下简称大豆。参考文献：Xiangguang Lyuet al.,GmCRY1s modulate gibberellin metabolism to regulate soybean shadeavoidance in response to reduced blue light,Molecular Plant,Volume 14,Issue2,2021,.
本发明是实例中实验均设置三个重复，实验数据采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示与野生型大豆品种TL1相比具有显著性差异，P＜0.01(**)表示与野生型大豆品种TL1相比具有显著性差异。
实施例一、GmSPA3a/3b基因缺失突变体植株的获得
1、CRISPR-Cas9重组质粒GmSPA3a-gRNA1和GmSPA3a-gRNA2的构建
大豆基因组中GmSPAs基因包含一对同源基因GmSPA3a和GmSPA3b(下面简称GmSPA3a/3b)。大豆威廉82基因组中的GmSPA3a和GmSPA3b蛋白的氨基酸序列分别如序列表中序列1和序列2所示，GmSPA3a和GmSPA3b对应的CDS编码序列分别为序列表中序列3和序列4所示的核苷酸。
1.1、U6-gRNA的获得
根据大豆蛋白GmSPA3a/3b的基因组序列设计单向导RNA(single guide RNA)靶点序列，设计的1个靶向GmSPA3a的sgRNA名称为sgRNA1，将设计好的gRNA靶点序列进行大豆基因组序列比对，以排除非特异性靶位点。设计的1个靶向GmSPA3b的sgRNA名称为sgRNA2，将设计好的gRNA靶点序列进行大豆基因组序列比对，以排除非特异性靶位点。设计的2个同时靶向GmSPA3a和GmSPA3b的sgRNA名称分别为sgRNA3，将设计好的gRNA靶点序列进行大豆基因组序列比对，以排除非特异性靶位点。
sgRNA1靶点的核苷酸序列为5’-TTTTCGGGTGAGGCATCAC-3’，对应于序列表中序列3的第157-175位核苷酸；sgRNA2靶点的核苷酸序列为5’-GTCAGTGTAGCGCATTCTCA-3’，对应于序列表中序列4的第403-422位核苷酸；sgRNA3靶点的核苷酸序列为5’-AAGGGTTCATTGTCCTCAA-3’，分别对应于序列表中序列3的第129-147位核苷酸和序列表中序列4的第126-144位核苷酸。
1.1.1gRNA编码DNA片段的获得
配制下述PCR反应体系进行PCR扩增，总体积50μL：由25μL 2×Phanta MaxBuffer、1μL dNTP Mix、2μL引物F(3a-F1、3b-F1或3ab-F1)(序列见表1)水溶液(浓度为10μM)、2μL引物R(gRNA-R)(序列见表1)(浓度为10μM)、1μL Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase、1μL模板pU3-gRNA载体、18μL ddH2O组成。
表1 GmSPA3a/3b-gRNA1-gRNA2载体构建引物列表
体系中的3a-F1和gRNA-R引物的扩增产物为sgRNA1的编码DNA；3b-F1和gRNA-R引物的扩增产物为sgRNA2的编码DNA；3ab-F1和gRNA-R引物的扩增产物为sgRNA3的编码DNA。
反应程序为：95℃3min；95℃15s，57℃15s，72℃10s，35个循环；72℃5min；4℃保存。
PCR扩增结束后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Axygen公司)回收gRNA编码DNA片段，分别获得约141bp的sgRNA1的编码DNA(序列表中序列11的第306-443位),sgRNA2的编码DNA(序列表中序列12的第306-443位)和sgRNA3的编码DNA(序列表中序列13的第306-443位)。
1.1.2、U6启动子片段的获得
配制下述PCR反应体系进行PCR扩增：总50μL：由25μL 2×Phanta Max Buffer、1μLdNTP Mix、2μL引物U6-F(序列见表1)水溶液(浓度为10μM)、2μL引物U6-R(序列见表1)水溶液(浓度为10μM)、1μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、1μL威廉82(大豆)的基因组DNA、18μL ddH2O组成。
PCR扩增结束后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Axygen公司)回收约305bp的U6启动子片段(序列表中序列15的第1-305位核苷酸)。
反应程序为：95℃3min；95℃15s，57℃15s，72℃10s，35个循环；72℃5min；4℃保存。
1.1.3、U6-gRNA片段的获得
配制下述PCR反应体系进行PCR扩增，可实现U6启动子和gRNA编码DNA的连接。总50μL：由25μL 2×Phanta Max Buffer、1μL dNTP Mix、2μL引物U6-F水溶液(浓度为10μM)、2μL引物gRNA-R水溶液(浓度为10μM)、1μL模板(含有50ng步骤1.1.1中获得的gRNA编码DNA片段和50ng步骤1.1.2获得的U6启动子片段)和18μL ddH2O组成。
反应程序为：95℃3min；95℃15s，57℃15s，72℃30s，35个循环；72℃5min；4℃保存。
PCR扩增结束后，分别得到PCR产物U6-sgRNA1(序列表中序列11)、U6-sgRNA2(序列表中序列12)和U6-sgRNA3(序列表中序列13)。
1.2、CRISPR-Cas9重组载体的构建
1.2.1CRISPR-Cas9载体线性化
CRISPR-Cas9载体pCas9-AtU6-sgRNA为本实验室保存(相关文献:Li,C.et al.Adomestication-associated gene GmPRR3b regulates the circadian clock andflowering time in soybean.Mol Plant 13,745–759(2020).公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明)。
用限制性内切酶StuI和XbaⅠ双酶切pCas9-AtU6-sgRNA载体，回收约14000bp的线性pCas9-AtU6-sgRNA载体骨架。
同时使用限制性内切酶StuI和XbaⅠ分别双酶切步骤1.1获得的U6-sgRNA1,U6-sgRNA2和U6-sgRNA3。
1.2.2、连接产物的获得
(1)分别取1μL步骤1.2.1双酶切U6-sgRNA(U6-sgRNA1,U6-sgRNA2或U6-sgRNA3)后获得的片段和1μL 1.2.1获得的线性pCas9-AtU6-sgRNA载体骨架50ng，1μL T4 10xbuffer,1μL T4 DNA Ligase和5μL ddH2O得到连接体系。
(2)取(1)连接体系，16℃反应过夜，得到的连接产物为CRISPR-Cas9重组载体。
1.3CRISPR-Cas9重组载体质粒扩繁
将1.2得到的CRISPR-Cas9重组载体质粒分别转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(TRANS)，得到若干单克隆转化菌。
分别以获得的各个单克隆转化菌为模板，以引物5’-ACATTTAATACGCGATAGAAAAC-3’和5’-GTGCTCGGCAACGCGTTCTAGA-3’组成的引物对进行PCR扩增。如果PCR扩增产物的核苷酸序列为的528bp大小的DNA片段即含有序列表中序列15的第306-443位所示的sgRNA1的编码DNA分子：U6-sgRNA1，则对应的单克隆转化菌为阳性单克隆菌；U6-sgRNA2、U6-sgRNA3使用同样步骤进行验证，获得阳性单克隆菌。
将得到的阳性单克隆菌接种至LB液体培养基培养，然后从培养菌液中提取质粒，即得到CRISPR-Cas9重组质粒GmSPA3a-gRNA1，GmSPA3b-gRNA2和GmSPA3a3b-gRNA3。
2、T0代拟转基因大豆植株的获得
2.1将重组质粒GmSPA3a-gRNA1、GmSPA3b-gRNA2和GmSPA3a3b-gRNA3通过液氮冷冻法转化根癌农杆菌EH105(ZOMANBIO ZC142)的感受态细胞，得到重组农杆菌，分别命名为EH105/GmSPA3a-gRNA1、EH105/GmSPA3b-gRNA2和EH105/GmSPA3a3b-gRNA3。
2.2将重组农杆菌EH105/GmSPA3a-gRNA1，EH105/GmSPA3b-gRNA2和EH105/GmSPA3a3b-gRNA3转化大豆品种TL1(Tian-Long1，由中国农业科学院油料作物研究所单志慧研究员赠送，本实验室保存，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明。相关文献：Xiangguang Lyu et al.,GmCRY1s modulate gibberellin metabolism to regulatesoybean shade avoidance in response to reduced blue light,Molecular Plant,Volume 14,Issue 2,2021)，具体步骤如下：
(1)用浓盐酸和次氯酸钠反应出的氯气对大豆灭菌。
(2)将大豆对半切开，去掉一部分胚尖，在分生区部分划伤口，在无菌水中浸泡7-8h；之后弃无菌水，分别加入OD600nm为0.5-0.8的重组农杆菌EH105/GmSPA3a-gRNA1，EH105/GmSPA3b-gRNA2和EH105/GmSPA3a3b-gRNA3菌液，28℃、200rpm振荡30min；取出豆瓣在无菌条件下吹10min，然后平铺于共培养培养基，28℃暗培养3天。
(3)用无菌水和加入特美汀、头孢和万古霉素的液体诱导培养基各洗4-5次，将农杆菌洗净。
(4)将长出的胚芽切掉，只保留3-4mm，胚芽朝下，有伤口的一面朝上斜插入固体诱导培养基中，在温室中光照培养。
(5)10天后有的豆瓣开始出芽，有芽的从桩部将芽切掉并转到新的固体诱导培养基中，没长芽的扔掉，继续在温室中光照培养。
(6)10天后，将长芽的继代到新的固体诱导培养基中，没有长芽的豆瓣扔掉，温室培养10天。豆瓣在固体诱导培养基中共培养30天。
(7)将长好的愈伤组织与豆瓣分离，扔掉豆瓣，把愈伤组织上黑色表面刮掉，转到固体伸长培养基中，每20天更换一次新的固体伸长培养基，一般继代3-4次，合计60-80天。愈伤在伸长培养的同时也经过Kan(卡那霉素)抗生素筛选，在筛选的过程中会有苗长出来。
(8)当苗长到约4-5cm的时候从愈伤上切下来，移到生根培养基中。
(9)在生根培养基中培养20-30天左右，长得壮实有发达根系的苗子就可以开始放在背光处炼苗了，一般炼苗5天。
(10)将苗移入大田，加入适量水，绿肥和缓释肥，盖上一层薄膜放在光照下，使其适应强光，3天后去膜，最终获得T0代拟转基因大豆植株。
3、转基因大豆植株的突变类型的分子鉴定
3.1、分别以步骤2获得的T0代拟转基因大豆植株叶片的基因组DNA为模板，采用5’-TCCGCAGCCATTAACGACTT-3’和5’-ACAGATAAAGCCACGCACATT-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物1(用于鉴定是否含有Basta抗性基因,序列表中序列14所示的核苷酸,长度为989bp)；采用5’-CAGCTCGTCCAAACCTAC-3’和5’-CTGTGCCATCCATCTTCT-3’组成的引物对2进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物2(用于鉴定是否含有Cas9基因,序列表中序列15所示的核苷酸，长度为601bp)；采用5’-acatttaatacgcgatagaaaac-3’和5’-GTGCTCGGCAACGCGTTCTAGA-3’组成的引物对3进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物3(序列表中序列16的核苷酸序列，大小为566bp，用于鉴定是否含有U6-sgRNA片段)。
如果某T0代拟转基因大豆植株的PCR扩增产物均含有上述三种Basta抗性基因、Cas9基因和U6-sgRNA(U6-sgRNA1,U6-sgRNA2或U6-sgRNA3)的DNA片段，则该T0代拟转基因大豆植株被鉴定为T0代转基因大豆植株。
3.2分别以T0代转基因大豆植株叶片的基因组DNA为模板，采用5’-TGATTGATATTGGAGTCTGTG-3’和5’-GCTGATTCAATAAACGAGATA-3’组成的引物对转化重组农杆菌EH105/GmSPA3a-gRNA1的T0代苗进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物4，大小为619bp,序列见序列17；采用5’-AATGGTGATGGTGGAGGT-3’和5’-AATCTTCACTTCCCATACTCT-3’组成的引物对转化重组农杆菌EH105/GmSPA3b-gRNA2的T0代苗进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物5，大小为686bp，序列见序列18。以上两对引物分别对转化重组农杆菌EH105/GmSPA3a3b-gRNA3的T0代苗进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物4和5。
3.3、分别将PCR扩增产物4和5进行Sanger测序。测序结果分别与GmSPA3a/3b基因(序列表中序列3和序列4所示的核苷酸分子)目标序列进行比对，统计突变类型。
由于大豆是二倍体植株，当Cas9蛋白发挥作用开始剪切特定的基因时，GmSPA3a/3b基因纯合突变株指的是该植株的两条同源染色体的GmSPA3a/3b基因发生了相同的突变。GmSPA3a/3b基因双等位基因突变株指的是该植株的两条同源染色体的GmSPA3a/3b基因基因均发生了突变但突变形式不同。
经检测转化重组农杆菌EH105/GmSPA3a-gRNA1的T0代转基因大豆植株15株中，发生基因编辑的植株为5株；经检测转化重组农杆菌EH105/GmSPA3a-gRNA2的T0代转基因大豆植株16株中，发生基因编辑的植株为4株；经检测转化重组农杆菌EH105/GmSPA3a3b-gRNA3的T0代转基因大豆植株10株中，GmSPA3a和GmSPA3b同时发生基因编辑的植株为3株。
将T0代基因编辑的植株分别自交2代，得到T2代基因编辑的植株。之后按照上述方法检测T2代基因编辑的植株的突变类型。共获得4个单纯合突变体和1个双等位基因突变株。将4个单纯合突变体分别命名为Gmspa3a-1#、Gmspa3a-2#和Gmspa3b-1#、Gmspa3b-2#；将1个双等位基因突变株命名为Gmspa3ab-1#。
4个双纯合突变体和1个双等位基因突变株的检测结果见图2中A和B。
Gmspa3a-1#突变体中，与序列表序列3所示的大豆GmSPA3a编码基因相比，Gmspa3a-1#突变基因的核苷酸序列为在序列表序列3的第160-161位核苷酸之间插入了1个核苷酸T(发生了1个核苷酸的插入)并保持序列3的其它序列不变得到的DNA分子，突变引起了移码，造成GmSPA3a蛋白功能缺失。也就是，Gmspa3a-1#与野生型相比，对于GmSPA3a基因，两条同源染色体中GmSPA3a基因均突变为Gmspa3a-1#基因。Gmspa3a-1#蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列5所示。
Gmspa3a-2#突变体中，与序列表序列3所示的大豆GmSPA3a编码基因相比，Gmspa3a-2#突变基因的核苷酸序列为缺失了序列表中序列3的第159-164位的5个核苷酸TTCGG(发生了5个核苷酸的缺失)并保持序列3的其它序列不变得到的DNA分子，突变引起了移码，造成GmSPA3a蛋白功能缺失。也就是，Gmspa3a-2#与野生型相比，对于GmSPA3a基因，两条同源染色体中GmSPA3a基因均突变为Gmspa3a-2#基因。Gmspa3a-2#蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列6所示。
Gmspa3b-1#突变体中，与序列表序列4所示的大豆GmSPA3b基因相比，Gmspa3b-1#突变基因的核苷酸序列为缺失了序列4的第420-421位的2个核苷酸CC(发生了2个核苷酸的缺失)并保持序列4的其它序列不变得到的DNA分子，突变引起了移码，造成GmSPA3b蛋白功能缺失。也就是，Gmspa3b-1#与野生型相比，对于GmSPA3b基因，两条同源染色体中GmSPA3b基因均突变为Gmspa3b-1#基因。突变后的Gmspa3b-1#蛋白质的氨基酸序列如序列7所示。
Gmspa3b-2#突变体中，与序列表序列4所示的大豆GmSPA3b基因相比，Gmspa3b-2#突变基因的核苷酸序列为在序列4的第419-420位的2个核苷酸CC核苷酸之间插入了1核苷酸T，并保持序列4的其它序列不变得到的DNA分子，突变引起了移码，造成GmSPA3b蛋白功能缺失。也就是，Gmspa3b-2#与野生型相比，对于GmSPA3b基因，两条同源染色体中GmSPA3b基因均突变为Gmspa3b-2#基因。突变后的Gmspa3b-2#蛋白质的氨基酸序列如序列8所示。
Gmspa3ab-1#突变体中，与序列表序列3所示的大豆GmSPA3a编码基因相比，Gmspa3a突变基因(Gmspa3ab-A)的核苷酸序列为缺失了序列3的第142-143位的2个核苷酸CC(发生了2个核苷酸的缺失)并保持序列3的其它序列不变得到的DNA分子，且同时与序列表序列4所示的大豆GmSPA3b基因相比，Gmspa3b突变基因(Gmspa3ab-B)的核苷酸序列为缺失了序列4的第139-140位的2个核苷酸CC(发生了2个核苷酸的缺失)并保持序列4的其它序列不变得到的DNA分子，两个基因的突变均引起了移码，造成GmSPA3a/3b蛋白功能缺失。
Gmspa3ab-A蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列9所示；Gmspa3ab-B蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列10所示。
收获5个突变体Gmspa3a-1#、Gmspa3a-2#、Gmspa3b-1#、Gmspa3b-2#和Gmspa3ab-1#植株所结的种子，进行下述实施例二中的表型观察。
实施例二、GmSPA3a/3b基因在调控大豆开花和株高中的应用
1.田间开花时间和株高表型观察
实验包括三个重复。采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示与野生型大豆品种TL1相比具有显著性差异，P＜0.01(**)表示与野生型大豆品种TL1相比具有显著性差异(请根据实际情况修改)。
分别将野生型大豆品种TL1、实施例一中得到的T2代GmSPA3a/3b基因缺失突变体植株Gmspa3a、Gmspa3b和Gmspa3ab的植株于北京(40°13’28”N，116°33’37”E)的种子各100粒，夏播于大田，观察并统计花期和株高表型。通过大田中表型观察，结果表明TL1在长日照下50天左右开花，而2个Gmspa3a突变体(图3中Gmspa3a-1#和Gmspa3a-2#)、2个Gmspa3b突变体(图3中Gmspa3b-1#和Gmspa3b-2#)和1个Gmspa3ab突变体(图3中Gmspa3ab-1#)的开花时间在42-47天。成熟后对其株高和主茎节数进行统计，结果表明TL1的株高在80-88cm；而Gmspa3a(图3中Gmspa3a-1#和Gmspa3a-2#)株高在47-53cm，Gmspa3b(图3中Gmspa3b-1#和Gmspa3b-2#)株高在55-68cm，Gmspa3ab(图3中Gmspa3ab-1#)株高在38-44cm(图3)。大豆TL1品种与5个GmSPA3a/3b基因缺失突变体Gmspa3a-1#、Gmspa3a-2#、Gmspa3b-1#、Gmspa3b-2#、Gmspa3ab-1#在花期和株高上存在极显著差异。由此可见，GmSPA3a/3b蛋白的功能丧失会导致大豆花期明显提前，株高显著降低。
2.大豆开花相关基因表达量检测
提取长日照条件下(12h光照/8h黑暗)培养21天，第二片三出复叶完全展开，(每4小时取样)的野生型大豆品种TL1、实施例一中得到的3个GmSPA3a/3b基因的缺失突变体T2代Gmspa3a-1#、Gmspa3b-1#和Gmspa3ab-1#植株的RNA，对大豆开花相关基因(包括GmFT2a、GmFT5a、GmFT4、E1、J和GmCCA1)进行荧光定量PCR检测。qPCR检测引物分别为：
GmFT2a-qF/R：
5’-GGATTGCCAGTTGCTGCTGT-3’/5’-GAGTGTGGGAGATTGCCAAT-3’；
GmFT5a-qF/R：
5’-AGCCCGAACCCTTCAGTAGGGA-3’/5’-GGTGATGACAGTGTCTCTGCCCA-3’；
GmFT4-qF/R：
5’-TTTGCATGACAAACACTAACCA-3’/5’-TCTTAGAGGAAAAGGAAAACCAGA-3’；
E1-qF/R：
5’-CACTCAAATTAAGCCCTTTCA-3’/5’-CTTATTGTTCATCTCCTCTT-3’；
J-qF/R：
5’-GTCTACCCTGTTCATTTGC-3’/5’-CAGGAACCCTAAAGTCGT-3’；
GmCCA1-qF/R：
5’-CGAAGATCCTGACAGCAAGA-3’/5’-TTCCTTGTCCAAGCCCTATG-3’；
GmActin-qF/R：
5’-CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3’/5’-GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3’；
以GmActin作为内参基因。荧光定量检测结果显示，相比较于野生型大豆品种TL1(图4中WT)，开花促进因子GmFT2a，GmFT5a和GmCCA1在Gmspa3a突变体(图4中Gmspa3a-1#)、Gmspa3b突变体(图4中Gmspa3b-1#)和Gmspa3ab突变体(图4中Gmspa3ab-1#)中明显上调而开花抑制因子GmFT4，E1和J的表达水平明显下调，表明GmSPA3ab影响大豆花期，可调节大豆成熟期，实现南种北引。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 大豆GmSPA3a/3b蛋白及其相关生物材料在调控植物开花和株高中的应用
<130> GNCSQ211050
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 907
<212> PRT
<213> 大豆（Glycine max）
<400> 1
Met Cys Cys Phe Thr Trp Pro Thr Cys Asn Ser Ser Trp Val Lys Met
1 5 10 15
Glu Gly Ser Ser Gly Ser Ala Phe His Asn Ser Gly Ser Ser Arg Ala
20 25 30
Leu Asn Ser Ser Gly Val Ser Asp Arg Asn Gln Arg Val His Cys Pro
35 40 45
Gln Arg Asn Pro Phe Ser Gly Glu Ala Ser Gln Asp Ser Gly Phe Arg
50 55 60
Lys Glu Arg Asp Arg Val Leu Leu Ala Gln Gly Gly Gln Pro Lys Asn
65 70 75 80
Leu Gly Gly Gly Phe Ser Gly Leu Cys Glu Asp Glu Val Glu Val Asp
85 90 95
Pro Phe Phe Cys Ala Val Glu Trp Gly Asp Ile Ser Leu Arg Gln Trp
100 105 110
Leu Asp Lys Pro Glu Arg Ser Val Asp Ala Phe Glu Cys Leu His Ile
115 120 125
Phe Arg Gln Ile Val Glu Ile Val Ser Val Ala His Ser Gln Gly Val
130 135 140
Val Val His Asn Val Arg Pro Ser Cys Phe Val Met Ser Ser Phe Asn
145 150 155 160
His Ile Ser Phe Ile Glu Ser Ala Ser Cys Ser Asp Thr Gly Ser Asp
165 170 175
Ser Leu Gly Asp Gly Met Asn Asn Gln Gly Gly Glu Val Lys Thr Pro
180 185 190
Thr Ser Leu Cys Pro His Asp Met His Gln Gln Ser Leu Gly Ser Glu
195 200 205
Asp Phe Met Pro Ile Lys Thr Ser Thr Thr Pro Ala Arg Ser Asp Ser
210 215 220
Ser Cys Met Leu Ser Ser Ala Val Tyr Ala Ala Arg Ala Ser Leu Ile
225 230 235 240
Glu Glu Thr Glu Glu Asn Lys Met Lys Asp Arg Arg Lys Asp Glu Glu
245 250 255
Val Glu Gly Lys Lys Gln Ser Phe Pro Met Lys Gln Ile Leu Leu Met
260 265 270
Glu Met Ser Trp Tyr Thr Ser Pro Glu Glu Gly Ala Gly Glu Ser Ser
275 280 285
Ser Cys Ala Ser Asp Val Tyr Arg Leu Gly Val Leu Leu Phe Glu Leu
290 295 300
Phe Cys Pro Leu Ser Ser Arg Glu Glu Lys Ser Arg Thr Met Ser Ser
305 310 315 320
Leu Arg His Arg Val Leu Pro Pro Gln Leu Leu Leu Lys Trp Pro Lys
325 330 335
Glu Ala Ser Phe Cys Leu Trp Leu Leu His Pro Asp Pro Lys Ser Arg
340 345 350
Pro Thr Leu Gly Glu Leu Leu Gln Ser Glu Phe Leu Asn Glu Gln Arg
355 360 365
Asp Asp Thr Glu Glu Arg Glu Ala Ala Ile Glu Leu Arg Gln Arg Ile
370 375 380
Glu Asp Gln Glu Leu Leu Leu Glu Phe Leu Leu Leu Leu Gln Gln Arg
385 390 395 400
Lys Gln Glu Val Ala Glu Lys Leu Gln His Thr Val Ser Phe Leu Cys
405 410 415
Ser Asp Ile Glu Glu Val Thr Lys Gln His Val Arg Phe Lys Glu Ile
420 425 430
Thr Gly Ala Glu Leu Gly Ser Asp Glu Arg Ser Ala Ser Ser Phe Pro
435 440 445
Ser Met Thr Phe Val Asp Ser Glu Asp Ser Ala Phe Leu Gly Thr Arg
450 455 460
Lys Arg Val Arg Leu Gly Met Asp Val Lys Asn Ile Glu Glu Cys Asp
465 470 475 480
Asp Asp Val Gly Asp Asp Gln Lys Ser Asn Gly Ser Phe Leu Ser Lys
485 490 495
Ser Ser Arg Leu Met Lys Asn Phe Lys Lys Leu Glu Ser Ala Tyr Phe
500 505 510
Leu Thr Arg Cys Arg Pro Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Leu Ala Val Arg
515 520 525
His Pro Pro Val Thr Ser Asp Gly Arg Gly Ser Val Val Val Thr Glu
530 535 540
Arg Ser Cys Ile Asn Asp Leu Lys Ser Lys Glu Gln Cys Arg Glu Gly
545 550 555 560
Ala Ser Ala Trp Ile Asn Pro Phe Leu Glu Gly Leu Cys Lys Tyr Leu
565 570 575
Ser Phe Ser Lys Leu Lys Val Lys Ala Asp Leu Lys Gln Gly Asp Leu
580 585 590
Leu His Ser Ser Asn Leu Val Cys Ser Leu Ser Phe Asp Arg Asp Gly
595 600 605
Glu Phe Phe Ala Thr Ala Gly Val Asn Lys Lys Ile Lys Val Phe Glu
610 615 620
Cys Asp Ser Ile Ile Asn Glu Asp Arg Asp Ile His Tyr Pro Val Val
625 630 635 640
Glu Met Ala Ser Arg Ser Lys Leu Ser Ser Ile Cys Trp Asn Thr Tyr
645 650 655
Ile Lys Ser Gln Ile Ala Ser Ser Asn Phe Glu Gly Val Val Gln Leu
660 665 670
Trp Asp Val Thr Arg Ser Gln Val Ile Ser Glu Met Arg Glu His Glu
675 680 685
Arg Arg Val Trp Ser Ile Asp Phe Ser Ser Ala Asp Pro Thr Met Leu
690 695 700
Ala Ser Gly Ser Asp Asp Gly Ser Val Lys Leu Trp Ser Ile Asn Gln
705 710 715 720
Gly Val Ser Val Gly Thr Ile Lys Thr Lys Ala Asn Val Cys Cys Val
725 730 735
Gln Phe Pro Leu Asp Ser Ala Arg Phe Leu Ala Phe Gly Ser Ala Asp
740 745 750
His Arg Ile Tyr Tyr Tyr Asp Leu Arg Asn Leu Lys Met Pro Leu Cys
755 760 765
Thr Leu Val Gly His Asn Lys Thr Val Ser Tyr Ile Lys Phe Val Asp
770 775 780
Thr Val Asn Leu Val Ser Ala Ser Thr Asp Asn Thr Leu Lys Leu Trp
785 790 795 800
Asp Leu Ser Thr Cys Ala Ser Arg Val Ile Asp Ser Pro Ile Gln Ser
805 810 815
Phe Thr Gly His Ala Asn Val Lys Asn Phe Val Gly Leu Ser Val Ser
820 825 830
Asp Gly Tyr Ile Ala Thr Gly Ser Glu Thr Asn Glu Val Phe Ile Tyr
835 840 845
His Lys Ala Phe Pro Met Pro Ala Leu Ser Phe Lys Phe Gln Asn Thr
850 855 860
Asp Pro Leu Ser Gly Asn Glu Val Asp Asp Ala Val Gln Phe Val Ser
865 870 875 880
Ser Val Cys Trp His Gly Gln Ser Ser Ser Thr Leu Leu Ala Ala Asn
885 890 895
Ser Thr Gly Asn Val Lys Ile Leu Glu Met Val
900 905
<210> 2
<211> 906
<212> PRT
<213> 大豆（Glycine max）
<400> 2
Met Cys Cys Cys Thr Trp Pro Thr Cys Asn Ser Ser Trp Met Lys Met
1 5 10 15
Glu Pro Ser Gly Ser Ala Phe Gln Asn Ser Gly Ser Ser Arg Ala Leu
20 25 30
Asn Ser Ser Gly Val Ser Asp Arg Asn Gln Arg Val His Cys Pro Gln
35 40 45
Arg Asn Pro Phe Leu Gly Glu Ala Ser Gln Asp Ser Gly Phe Arg Lys
50 55 60
Glu Arg Asp Arg Phe Leu Leu Ala Gln Gly Gly Gln Pro Lys Asn Leu
65 70 75 80
Gly Gly Gly Phe Ser Gly Leu Cys Glu Asp Glu Val Glu Val Asp Pro
85 90 95
Phe Phe Cys Ala Val Glu Trp Gly Asp Ile Ser Leu Arg Gln Trp Leu
100 105 110
Asp Lys Pro Glu Arg Ser Val Gly Ala Phe Glu Cys Leu His Ile Phe
115 120 125
Arg Gln Ile Val Glu Ile Val Ser Val Ala His Ser Gln Gly Val Val
130 135 140
Val His Asn Val Arg Pro Ser Cys Phe Val Met Ser Ser Phe Asn His
145 150 155 160
Ile Ser Phe Ile Glu Ser Ala Ser Cys Ser Asp Thr Gly Ser Asp Ser
165 170 175
Leu Gly Glu Gly Leu Asn Asn Gln Gly Gly Glu Val Lys Thr Pro Thr
180 185 190
Ser Leu Cys Pro His Asp Met Pro Gln Gln Ser Met Gly Ser Glu Asp
195 200 205
Phe Met Pro Val Lys Thr Leu Thr Thr Pro Ala Gln Ser Asp Ser Ser
210 215 220
Cys Met Leu Ser Ser Ala Val Tyr Ala Ala Arg Ala Ser Leu Ile Glu
225 230 235 240
Glu Thr Glu Glu Asn Lys Met Lys Asp Arg Arg Lys Asp Asp Glu Val
245 250 255
Glu Gly Lys Lys Gln Ser Phe Pro Met Lys Gln Ile Leu Leu Met Glu
260 265 270
Met Ser Trp Tyr Thr Ser Pro Glu Glu Gly Ala Gly Glu Ser Ser Ser
275 280 285
Cys Ala Ser Asp Val Tyr Arg Leu Gly Val Leu Leu Phe Glu Leu Phe
290 295 300
Cys Pro Leu Ser Ser Arg Glu Glu Lys Ser Arg Thr Met Ser Ser Leu
305 310 315 320
Arg His Arg Val Leu Pro Pro Gln Leu Leu Leu Lys Trp Pro Lys Glu
325 330 335
Ala Ser Phe Cys Leu Trp Leu Leu His Pro Asp Pro Ser Gly Arg Pro
340 345 350
Thr Leu Gly Arg Glu Leu Leu Gln Ser Asp Phe Leu Asn Glu Gln Arg
355 360 365
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370 375 380
Asp Asp Gln Glu Leu Leu Leu Glu Phe Leu Leu Leu Leu Gln Gln Arg
385 390 395 400
Lys Gln Glu Val Ala Glu Lys Leu Gln His Thr Val Ser Phe Leu Cys
405 410 415
Ser Asp Ile Glu Glu Val Thr Lys Gln His Val Arg Phe Lys Glu Ile
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Asp Asp Val Gly Asp Asp Gln Lys Ser Asn Gly Ser Phe Leu Ser Lys
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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545 550 555 560
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565 570 575
Ser Phe Ser Lys Leu Lys Val Lys Ala Asp Leu Lys Gln Gly Asp Leu
580 585 590
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595 600 605
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645 650 655
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675 680 685
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Gly Val Ser Val Gly Thr Ile Lys Thr Lys Ala Asn Val Cys Cys Val
725 730 735
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His Arg Ile Tyr Tyr Tyr Asp Leu Arg Asn Leu Lys Met Pro Leu Cys
755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
Asp Leu Ser Thr Cys Ala Ser Arg Val Ile Asp Ser Pro Ile Gln Ser
805 810 815
Phe Thr Gly His Ala Asn Val Lys Asn Phe Val Gly Leu Ser Val Ser
820 825 830
Asp Gly Tyr Ile Ala Thr Gly Ser Glu Thr Asn Glu Val Phe Ile Tyr
835 840 845
His Lys Ala Phe Ser Met Pro Ala Leu Ser Phe Lys Phe Gln Asn Thr
850 855 860
Asp Pro Leu Ser Gly Asn Glu Val Asp Asp Ala Ala Gln Phe Val Ser
865 870 875 880
Ser Val Cys Trp Arg Gly Gln Ser Ser Thr Leu Leu Ala Ala Asn Ser
885 890 895
Thr Gly Asn Val Lys Ile Leu Glu Met Val
900 905
<210> 3
<211> 2724
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
atgtgttgtt ttacttggcc tacatgcaat tctagctggg tgaagatgga gggttcttct 60
gggtctgctt ttcacaattc tggcagttct agggccttga atagttccgg agtctcagat 120
aggaatcaaa gggttcattg tcctcaaagg aacccctttt cgggtgaggc atcacaggat 180
tcggggttta gaaaggaaag ggatagggtt ctgttggctc aaggtggtca gcctaaaaat 240
ttgggtggcg ggttttcggg gttgtgtgag gatgaggtgg aggttgaccc ctttttctgt 300
gctgtagaat ggggtgatat tagcttgagg caatggttgg ataaacctga acgatcggtg 360
gatgcctttg aatgcttgca catatttagg caaatagtag agatcgttag tgtagcacat 420
tctcaaggag ttgtagttca caatgtgagg ccttcctgct tcgtcatgtc atctttcaac 480
catatctcgt ttattgaatc agcatcttgt tcagatactg gatcggattc tttaggagat 540
ggaatgaaca accaaggcgg tgaggttaaa actccaacat ctctctgtcc ccatgatatg 600
catcagcaga gtttgggaag tgaagatttt atgcccatca agacttcaac cacccctgct 660
cggtcagatt ctagttgcat gctgtcgagt gccgtgtatg cagctcgtgc atcattgata 720
gaagaaacag aagaaaataa aatgaaagat aggagaaagg atgaagaagt agaaggaaag 780
aagcaatcat ttccaatgaa acagatacta ctaatggaga tgagttggta cactagtcct 840
gaagagggtg ctggtgaatc tagttcttgt gcttcagacg tttatcgatt gggggttctc 900
ctttttgagc tattttgtcc gctcagctca agagaagaaa agagtagaac catgtctagc 960
cttagacaca gagttcttcc tccacagtta cttctaaagt ggcctaaaga agcttcattt 1020
tgcttatggt tactgcatcc tgaccctaag agtcgtccaa cacttgggga gttgttgcag 1080
agcgagttcc ttaatgaaca gagagatgat acggaagaac gtgaagcagc gatagagctg 1140
agacaaagga tagaggatca ggagttgttg ttagagttcc ttttgttact tcaacagaga 1200
aaacaggaag ttgctgagaa gttgcaacat actgtctctt ttctgtgttc agatattgaa 1260
gaagtgacca agcagcacgt tagatttaaa gagattactg gtgctgaact ggggagtgat 1320
gagcgttcag catcaagttt cccatccatg acatttgttg atagtgagga ttctgctttt 1380
ctagggacta gaaaacgagt cagactaggg atggatgtta aaaacattga ggaatgtgac 1440
gatgatgtag gggatgatca gaaaagtaac ggaagttttc tttcaaaaag ttcacgacta 1500
atgaagaact ttaagaaact tgagtcagct tactttttaa cacgatgtag accagcctat 1560
tcctctggga aactggcggt tagacatcca cctgtaacaa gtgatggtag agggtctgtt 1620
gtcgtgactg aaagaagttg catcaatgac ttgaaatcta aagagcagtg cagggagggt 1680
gcaagtgctt ggataaatcc ttttcttgag ggtttgtgca agtatttatc attcagtaag 1740
ctaaaggtta aggctgacct aaagcaagga gatcttttgc attcttccaa cctagtatgc 1800
tcactcagct ttgatcgtga tggagaattt ttcgctaccg cgggtgtgaa taagaaaatt 1860
aaagtgtttg aatgtgattc aataataaat gaggatcgtg atatccacta tccagttgtg 1920
gagatggcta gcaggtcaaa gttaagcagt atatgttgga atacatacat caaaagtcaa 1980
attgcttcaa gcaactttga aggtgttgta cagttatggg atgtgacaag aagtcaagta 2040
atctctgaaa tgagggagca cgagcggcgg gtgtggtcca ttgatttctc atcagcagac 2100
ccaacaatgt tggcaagtgg gagcgatgac ggttctgtca agctatggag tatcaatcag 2160
ggagttagtg ttggtaccat caaaaccaag gcaaatgttt gctgcgttca gttccccctg 2220
gattctgctc gtttccttgc ttttggttca gcagatcacc gaatatatta ctatgatctt 2280
cgcaacctta aaatgccact ttgtacttta gttggacata acaagactgt gagctacatc 2340
aagtttgtag acactgtgaa ccttgtctct gcttccacag ataacacttt gaagctttgg 2400
gatttgtcta catgtgcatc tcgagttata gactcaccga ttcaatcatt cactggtcac 2460
gcgaatgtta agaactttgt ggggttatca gtatctgatg gttacattgc cactggttca 2520
gagacaaatg aggtgttcat ataccacaag gccttcccca tgccagcatt gtcattcaag 2580
tttcagaaca cagaccctct ttctggcaac gaagtggacg atgctgtgca gttcgtgtcc 2640
tcagtctgtt ggcacggcca gtcatcgtcc accttgctcg ctgcaaattc cacagggaat 2700
gtcaaaattc tggagatggt ttaa 2724
<210> 4
<211> 2721
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
atgtgttgtt gtacttggcc tacatgcaac tctagctgga tgaagatgga gccttctggg 60
tctgcttttc agaattctgg cagttctagg gccttgaaca gttctggagt ctcagatagg 120
aaccaaaggg ttcattgtcc tcaaaggaac cccttcttgg gtgaggcatc ccaggattcg 180
gggttcagaa aggaaaggga taggtttctg ttggctcaag gtggtcagcc taagaacttg 240
ggcggtggtt tttcggggtt gtgtgaggac gaggtggagg ttgacccctt tttctgtgct 300
gtagaatggg gtgatattag cttgaggcaa tggttggata aacctgaacg atcggtgggt 360
gccttcgaat gcttgcacat atttaggcaa atagtagaga ttgtcagtgt agcgcattct 420
caaggagttg tagttcacaa tgtgaggcct tcctgctttg tcatgtcctc tttcaaccat 480
atctcattta ttgaatcagc atcttgttca gatactggat cggattcttt gggagaagga 540
ttaaacaacc aaggcggtga ggttaaaact ccaacatctc tctgtcccca tgatatgcct 600
cagcagagta tgggaagtga agattttatg cctgtcaaga ctttaaccac ccctgctcag 660
tcagattcta gttgcatgtt gtcgagtgcc gtgtatgcgg ctcgtgcatc attgatagaa 720
gaaacagaag aaaataaaat gaaagatagg agaaaggatg acgaagtaga aggaaagaag 780
caatcatttc caatgaaaca gatactacta atggagatga gttggtacac tagtcctgaa 840
gagggtgctg gtgaatctag ttcttgtgct tcagacgttt atcgattggg ggttctcctt 900
tttgagctat tttgtccgct cagctcaaga gaagaaaaga gtagaaccat gtctagcctt 960
agacacagag ttcttcctcc acagttactt ctaaagtggc ctaaagaagc ttctttttgt 1020
ttatggttac tgcatcctga ccctagtggt cgtccaacac tcggcaggga gttgttgcag 1080
agcgacttcc ttaatgaaca gagagatgat atggaagaac gtgaagcagc gatagagctg 1140
agacaaagga tagatgatca ggagttgctg ttagaattcc ttttattact tcaacagaga 1200
aaacaggaag ttgctgagaa gttgcaacat actgtctctt ttctgtgttc agatattgaa 1260
gaagtgacca agcagcacgt tagatttaaa gagattactg gtgctgaact ggggagtgat 1320
gagcattcag catcaagttt cccatccatg acagttgttg atagtgaggg ttctgctttt 1380
ctagggacta gaaaacgagt cagactaggg atggatgtta aaaacattga ggaatgtgtc 1440
gatgatgtag gggatgatca gaaaagtaac ggaagttttc tttcaaaaag ttcacggcta 1500
atgaagaact ttaagaaact tgagtcagca tactttttaa cacgatgtag accagcctat 1560
tcctctggga aactggcggt tagacatcca cctgtaacaa gtgatggtag agggtctgtt 1620
gtcatgactg aaagaagttg catcaatgac ttgaaatcta aagagcagtg cagggagggt 1680
gcgagtgctt ggataaatcc ttttcttgag ggtttgtgca agtatttatc attcagtaag 1740
ctaaaggtta aggctgacct aaagcaagga gatcttttgc attcttccaa cctagtatgc 1800
tcactcagct ttgatcgtga tggagagttt ttcgctactg ccggtgtgaa taagaaaatt 1860
aaagtgtttg aatgtgattc aataataaat gaggatcgtg atatccacta tccagttgtg 1920
gagatggcta gcaggtcaaa gttaagcagt atatgttgga atacatatat caaaagtcaa 1980
attgcttcaa gcaactttga aggtgttgta cagttatggg atgtaacaag aagtcaagta 2040
atctctgaaa tgagggagca tgagcggcgg gtgtggtcaa ttgatttctc atcagcagac 2100
ccaacaatgt tagcaagtgg gagcgatgac ggttctgtca agctatggag tatcaatcag 2160
ggagttagtg ttggtaccat caaaaccaag gcaaatgttt gctgcgttca gttccctctg 2220
gattctgctc gttttcttgc ttttggctca gcagatcacc gaatatatta ctatgatcta 2280
cgcaacctaa aaatgccgct ttgtacttta gttggacata acaagactgt gagctacatc 2340
aagtttgtag acactgtgaa ccttgtctct gcttccacag ataacacttt gaagctttgg 2400
gatttgtcta catgtgcatc tcgagttata gactcaccga ttcaatcatt cacgggtcat 2460
gcgaatgtta agaactttgt ggggttatca gtatctgatg gttacattgc cactggttca 2520
gagacaaatg aggtgttcat ataccacaaa gccttctcca tgccagcatt gtcattcaag 2580
tttcagaaca cagaccctct ttccggtaat gaagtggacg acgctgcgca gtttgtgtcc 2640
tcggtttgct ggcgcggcca gtcgtccacc ttgctcgctg caaattccac agggaatgtc 2700
aaaattctgg agatggttta a 2721
<210> 5
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
Met Cys Cys Phe Thr Trp Pro Thr Cys Asn Ser Ser Trp Val Lys Met
1 5 10 15
Glu Gly Ser Ser Gly Ser Ala Phe His Asn Ser Gly Ser Ser Arg Ala
20 25 30
Leu Asn Ser Ser Gly Val Ser Asp Arg Asn Gln Arg Val His Cys Pro
35 40 45
Gln Arg Asn Pro Phe Phe Gly
50 55
<210> 6
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
Met Cys Cys Phe Thr Trp Pro Thr Cys Asn Ser Ser Trp Val Lys Met
1 5 10 15
Glu Gly Ser Ser Gly Ser Ala Phe His Asn Ser Gly Ser Ser Arg Ala
20 25 30
Leu Asn Ser Ser Gly Val Ser Asp Arg Asn Gln Arg Val His Cys Pro
35 40 45
Gln Arg Asn Pro Leu
50
<210> 7
<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 7
Met Cys Cys Cys Thr Trp Pro Thr Cys Asn Ser Ser Trp Met Lys Met
1 5 10 15
Glu Pro Ser Gly Ser Ala Phe Gln Asn Ser Gly Ser Ser Arg Ala Leu
20 25 30
Asn Ser Ser Gly Val Ser Asp Arg Asn Gln Arg Val His Cys Pro Gln
35 40 45
Arg Asn Pro Phe Leu Gly Glu Ala Ser Gln Asp Ser Gly Phe Arg Lys
50 55 60
Glu Arg Asp Arg Phe Leu Leu Ala Gln Gly Gly Gln Pro Lys Asn Leu
65 70 75 80
Gly Gly Gly Phe Ser Gly Leu Cys Glu Asp Glu Val Glu Val Asp Pro
85 90 95
Phe Phe Cys Ala Val Glu Trp Gly Asp Ile Ser Leu Arg Gln Trp Leu
100 105 110
Asp Lys Pro Glu Arg Ser Val Gly Ala Phe Glu Cys Leu His Ile Phe
115 120 125
Arg Gln Ile Val Glu Ile Val Ser Val Ala His Ser Arg Ser Cys Ser
130 135 140
Ser Gln Cys Glu Ala Phe Leu Leu Cys His Val Leu Phe Gln Pro Tyr
145 150 155 160
Leu Ile Tyr
<210> 8
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 8
Met Cys Cys Cys Thr Trp Pro Thr Cys Asn Ser Ser Trp Met Lys Met
1 5 10 15
Glu Pro Ser Gly Ser Ala Phe Gln Asn Ser Gly Ser Ser Arg Ala Leu
20 25 30
Asn Ser Ser Gly Val Ser Asp Arg Asn Gln Arg Val His Cys Pro Gln
35 40 45
Arg Asn Pro Phe Leu Gly Glu Ala Ser Gln Asp Ser Gly Phe Arg Lys
50 55 60
Glu Arg Asp Arg Phe Leu Leu Ala Gln Gly Gly Gln Pro Lys Asn Leu
65 70 75 80
Gly Gly Gly Phe Ser Gly Leu Cys Glu Asp Glu Val Glu Val Asp Pro
85 90 95
Phe Phe Cys Ala Val Glu Trp Gly Asp Ile Ser Leu Arg Gln Trp Leu
100 105 110
Asp Lys Pro Glu Arg Ser Val Gly Ala Phe Glu Cys Leu His Ile Phe
115 120 125
Arg Gln Ile Val Glu Ile Val Ser Val Ala His Phe Ser Arg Ser Cys
130 135 140
Ser Ser Gln Cys Glu Ala Phe Leu Leu Cys His Val Leu Phe Gln Pro
145 150 155 160
Tyr Leu Ile Tyr
<210> 9
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 9
Met Cys Cys Phe Thr Trp Pro Thr Cys Asn Ser Ser Trp Val Lys Met
1 5 10 15
Glu Gly Ser Ser Gly Ser Ala Phe His Asn Ser Gly Ser Ser Arg Ala
20 25 30
Leu Asn Ser Ser Gly Val Ser Asp Arg Asn Gln Arg Val His Cys Ser
35 40 45
Lys Glu Pro Leu Phe Gly
50
<210> 10
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 10
Met Cys Cys Cys Thr Trp Pro Thr Cys Asn Ser Ser Trp Met Lys Met
1 5 10 15
Glu Pro Ser Gly Ser Ala Phe Gln Asn Ser Gly Ser Ser Arg Ala Leu
20 25 30
Asn Ser Ser Gly Val Ser Asp Arg Asn Gln Arg Val His Cys Ser Lys
35 40 45
Glu Pro Leu Leu Gly
50
<210> 11
<211> 443
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 11
tagatcggaa gcttaggcct aaaataaatg gtaaaatgtc aaatcaaaac taggctgcag 60
tatgcagagc agagtcatga tgatactact tactacaccg attcttgtgt gcagaaaaat 120
atgttaaaat aattgaatct ttctctagcc aaatttgaca acaatgtaca ccgttcatat 180
tgagagacga tgcttcttgt ttgctttcgg tggaagctgc atatactcaa cattactcct 240
tcagcgagtt ttccaactga gtcccacatt gcccagacct aacacggtat tcttgtttat 300
aatgaaatgt gccaccacat ggattgtttc gggtgaggca tcacgtttta gagctagaaa 360
tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc 420
ttttttttct agaacgcgtt gcc 443
<210> 12
<211> 443
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 12
tagatcggaa gcttaggcct aaaataaatg gtaaaatgtc aaatcaaaac taggctgcag 60
tatgcagagc agagtcatga tgatactact tactacaccg attcttgtgt gcagaaaaat 120
atgttaaaat aattgaatct ttctctagcc aaatttgaca acaatgtaca ccgttcatat 180
tgagagacga tgcttcttgt ttgctttcgg tggaagctgc atatactcaa cattactcct 240
tcagcgagtt ttccaactga gtcccacatt gcccagacct aacacggtat tcttgtttat 300
aatgaaatgt gccaccacat ggattgaggg ttcattgtcc tcaagtttta gagctagaaa 360
tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc 420
ttttttttct agaacgcgtt gcc 443
<210> 13
<211> 443
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 13
tagatcggaa gcttaggcct aaaataaatg gtaaaatgtc aaatcaaaac taggctgcag 60
tatgcagagc agagtcatga tgatactact tactacaccg attcttgtgt gcagaaaaat 120
atgttaaaat aattgaatct ttctctagcc aaatttgaca acaatgtaca ccgttcatat 180
tgagagacga tgcttcttgt ttgctttcgg tggaagctgc atatactcaa cattactcct 240
tcagcgagtt ttccaactga gtcccacatt gcccagacct aacacggtat tcttgtttat 300
aatgaaatgt gccaccacat ggattgaggg ttcattgtcc tcaagtttta gagctagaaa 360
tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc 420
ttttttttct agaacgcgtt gcc 443
<210> 14
<211> 989
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 14
acagataaag ccacgcacat ttaggatatt ggccgagatt actgaatatt gagtaagatc 60
acggaatttc tgacaggagc atgtcttcaa ttcagcccaa atggcagttg aaatactcaa 120
accgccccat atgcaggagc ggatcattca ttgtttgttt ggttgccttt gccaacatgg 180
gagtccaaga ttctgcagtc aaatctcggt gacgggcagg accggacggg gcggtaccgg 240
caggctgaag tccagctgcc agaaacccac gtcatgccag ttcccgtgct tgaagccggc 300
cgcccgcagc atgccgcggg gggcatatcc gagcgcctcg tgcatgcgca cgctcgggtc 360
gttgggcagc ccgatgacag cgaccacgct cttgaagccc tgtgcctcca gggacttcag 420
caggtgggtg tagagcgtgg agcccagtcc cgtccgctgg tggcgggggg agacgtacac 480
ggtcgactcg gccgtccagt cgtaggcgtt gcgtgccttc caggggcccg cgtaggcgat 540
gccggcgacc tcgccgtcca cctcggcgac gagccaggga tagcgctccc gcagacggac 600
gaggtcgtcc gtccactcct gcggttcctg cggctcggta cggaagttga ccgtgcttgt 660
ctcgatgtag tggttgacga tggtgcagac cgccggcatg tccgcctcgg tggcacggcg 720
gatgtcggcc gggcgtcgtt ctgggctcat cgattcgatt tggtgtatcg agattggtta 780
tgaaattcag atgctagtgt aatgtattgg taatttggga agatataata ggaagcaagg 840
ctatttatcc atttctgaaa aggcgaaatg gcgtcaccgc gagcgtcacg cgcattccgt 900
tcttgctgta aagcgttgtt tggtacactt ttgactagcg aggcttggcg tgtcagcgta 960
tctattcaaa agtcgttaat ggctgcgga 989
<210> 15
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 15
cagctcgtcc aaacctacaa tcagctcttt gaggaaaacc caattaatgc ttcaggcgtc 60
gacgccaagg cgatcctgtc tgcacgcctt tcaaagtctc gccggcttga gaacttgatc 120
gctcaactcc cgggcgaaaa gaagaacggc ttgttcggga atctcattgc actttcgttg 180
gggctcacac caaacttcaa gagtaatttt gatctcgctg aggacgcaaa gctgcagctt 240
tccaaggaca cttatgacga tgacctggat aaccttttgg cccaaatcgg cgatcagtac 300
gcggacttgt tcctcgccgc gaagaatttg tcggacgcga tcctcctgag tgatattctc 360
cgcgtgaaca ccgagattac aaaggccccg ctctcggcga gtatgatcaa gcgctatgac 420
gagcaccatc aggatctgac ccttttgaag gctttggtcc ggcagcaact cccagagaag 480
tacaaggaaa tcttctttga tcaatccaag aacggctacg ctggttatat tgacggcggg 540
gcatcgcagg aggaattcta caagtttatc aagccaattc tggagaagat ggatggcaca 600
g 601
<210> 16
<211> 566
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 16
acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg 60
cggtgtcatc tatgttacta gatcggaagc ttaggcctaa aataaatggt aaaatgtcaa 120
atcaaaacta ggctgcagta tgcagagcag agtcatgatg atactactta ctacaccgat 180
tcttgtgtgc agaaaaatat gttaaaataa ttgaatcttt ctctagccaa atttgacaac 240
aatgtacacc gttcatattg agagacgatg cttcttgttt gctttcggtg gaagctgcat 300
atactcaaca ttactccttc agcgagtttt ccaactgagt cccacattgc ccagacctaa 360
cacggtattc ttgtttataa tgaaatgtgc caccacatgg attgtttcgg gtgaggcatc 420
acgtcagtgt agcgcattct cagagggttc attgtcctca agttttagag ctagaaatag 480
caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt 540
tttttctaga acgcgttgcc gagcac 566
<210> 17
<211> 619
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 17
tgattgatat tggagtctgt gctttttctt gagttaatga aatgagtttg agttataacg 60
gtgatggtgg aggtgcaagg gtgtgaggca agttggagga ggaccacagt ttttggatgt 120
gttgttttac ttggcctaca tgcaattcta gctgggtgaa gatggagggt tcttctgggt 180
ctgcttttca caattctggc agttctaggg ccttgaatag ttccggagtc tcagatagga 240
atcaaagggt tcattgtcct caaaggaacc ccttttcggg tgaggcatca caggattcgg 300
ggtttagaaa ggaaagggat agggttctgt tggctcaagg tggtcagcct aaaaatttgg 360
gtggcgggtt ttcggggttg tgtgaggatg aggtggaggt tgaccccttt ttctgtgctg 420
tagaatgggg tgatattagc ttgaggcaat ggttggataa acctgaacga tcggtggatg 480
cctttgaatg cttgcacata tttaggcaaa tagtagagat cgttagtgta gcacattctc 540
aaggagttgt agttcacaat gtgaggcctt cctgcttcgt catgtcatct ttcaaccata 600
tctcgtttat tgaatcagc 619
<210> 18
<211> 686
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 18
aatggtgatg gtggaggtgc tagagtgtga ggcaagttgg aggagggcca tagtttatgg 60
atgtgttgtt gtacttggcc tacatgcaac tctagctgga tgaagatgga gccttctggg 120
tctgcttttc agaattctgg cagttctagg gccttgaaca gttctggagt ctcagatagg 180
aaccaaaggg ttcattgtcc tcaaaggaac cccttcttgg gtgaggcatc ccaggattcg 240
gggttcagaa aggaaaggga taggtttctg ttggctcaag gtggtcagcc taagaacttg 300
ggcggtggtt tttcggggtt gtgtgaggac gaggtggagg ttgacccctt tttctgtgct 360
gtagaatggg gtgatattag cttgaggcaa tggttggata aacctgaacg atcggtgggt 420
gccttcgaat gcttgcacat atttaggcaa atagtagaga ttgtcagtgt agcgcattct 480
caaggagttg tagttcacaa tgtgaggcct tcctgctttg tcatgtcctc tttcaaccat 540
atctcattta ttgaatcagc atcttgttca gatactggat cggattcttt gggagaagga 600
ttaaacaacc aaggcggtga ggttaaaact ccaacatctc tctgtcccca tgatatgcct 660
cagcagagta tgggaagtga agattt 686