一种酰基硫脲类化合物在制备抗肠道病毒药物中的应用
阅读说明：本技术 一种酰基硫脲类化合物在制备抗肠道病毒药物中的应用 (Application of acylthiourea compound in preparation of anti-enterovirus drugs ) 是由 周海兵 吴叔文 许智超 刘欣瑾 于 2021-08-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种酰基硫脲类化合物在制备抗肠道病毒药物中的应用,属于医药技术领域。本发明的酰基硫脲类化合物的结构如通式(I)、(II)、(III)所示,以取代的酰氯化合物、硫氰酸胺和胺类化合物为原料,反应得到通式(I)所示酰基硫脲类化合物；以通式(I)所示酰基硫脲类化合物与氯乙酰氯为原料,于溶剂中反应得到通式(II)所示酰基硫脲类化合物；以通式(I)所示酰基硫脲类化合物为原料,与卤代底物于溶剂中反应得到通式(III)所示酰基硫脲类化合物。本发明的酰基硫脲类化合物具有抗肠道病毒活性,可用于制备抗肠道病毒的药物。(The invention discloses an application of acyl thiourea compounds in preparation of anti-enterovirus drugs, and belongs to the technical field of medicines. The acyl thiourea compound has a structure shown in general formulas (I), (II) and (III), and is prepared by reacting substituted acyl chloride compounds, ammonium thiocyanate and amine compounds serving as raw materials to obtain the acyl thiourea compound shown in general formula (I); reacting acyl thiourea compound shown in general formula (I) and chloracetyl chloride in solvent to obtain acyl thiourea compound shown in general formula (II); acyl thiourea compounds shown in general formula (I) are used as raw materials to react with halogenated substrates in a solvent to obtain acyl thiourea compounds shown in general formula (III). The acyl thiourea compound has the activity of resisting the enterovirus and can be used for preparing medicines for resisting the enterovirus.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种酰基硫脲类化合物在制备抗肠道病毒药物中的应用。
背景技术
肠道病毒是小核糖核酸病毒科的无包膜单链RNA病毒，突变性较高。肠道病毒包含人肠道病毒(A、B、C、D)和非人肠道病毒。其中隶属于肠道病毒科的肠道病毒71型(EV-A71)、肠道病毒68型(EV-D68)、柯萨奇病毒A16型(CVA16)、脊髓灰质炎病毒在社会发展历史中对人类的生命财产健康安全造成了严重威胁。尽管目前脊髓灰质炎病毒已经被消灭，然而在我国普遍流行的肠道病毒71型以及北美地区流行的肠道病毒68型依旧是全世界婴幼儿生命健康安全的重大威胁。
手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是一种主要由肠道病毒71(Enterovirus71,肠道病毒)与柯萨奇病毒A16(CVA16)感染引起的常见婴幼儿传染疾病，病毒可通过粪-口途径传播或飞沫传播导致感染。其临床症状有发烧，咽喉痛，手、脚、舌、口腔黏膜出现水泡疹等。其中肠道病毒引发的手足口病更为严重，往往与神经系统疾病有着密不可分的关系，如引起脑膜炎、乙型脑炎、急性瘫痪，甚至能够导致死亡。此外，EV-D68也主要对婴幼儿神经系统造成损害。
以肠道病毒71型为例，肠道病毒中大约含有7400个核苷酸，这些核苷酸又组成了四种衣壳蛋白(VP1-VP4)和七种非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)，这些蛋白在病毒的吸附、侵入、脱壳和复制过程中起着重要的作用，当中每一个蛋白都可作为抗病毒药物的靶标。如病毒衣壳蛋白抑制剂pleconaril(普利康拉利)，3C蛋白酶抑制剂rupintrivir(芦平曲韦)，3D聚合酶抑制剂gemcitabine(吉西他滨)和PI4KB抑制剂enviroxime(恩韦肟)均已达到临床前或早期临床开发阶段，但由于抗病毒疗效有限或安全性问题，它们止步于临床研究阶段，无法真正应用于市场。因此合成一系列新型结构骨架的肠道病毒小分子抑制剂是十分有必要的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种酰基硫脲类化合物及其应用，所述的酰基硫脲类化合物具有抗肠道病毒活性，可以作为新的抗肠道病毒药物进行开发，具有广泛的应用前景。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下：
第一方面，提供一种下述通式(I)、(II)、(III)所示的酰基硫脲类化合物或其药理或生理上可接受的盐，
R1为烷基或者是带有不同取代基的苯环、芳香杂环结构，其中取代基可以是烷基取代基、卤素取代基、烷氧基取代基、杂烷基取代基，且包括上述取代基的单取代、多取代等各种自由组合方式；
R2为烷基或者是带有不同取代基的苯环、芳香杂环结构，其中取代基可以是烷基取代基、卤素取代基、烷氧基取代基、杂烷基取代基，且包括上述取代基的单取代、多取代等各种自由组合方式；
R3为单取代或者多取代的烷基取代基、卤素取代基、烷氧基取代基、杂烷基取代基；
R4为烷基取代基、烷氧基取代基、杂烷基取代基、酰基取代基，或者是带有不同取代基的苯环、芳香杂环结构，其中取代基可以是烷基取代基、卤素取代基、烷氧基取代基、杂烷基取代基，且包括上述取代基的单取代、多取代等各种自由组合方式；
X为硫原子或者氧原子；
Y为氮原子、硫原子或者氧原子。
优选地，所述的酰基硫脲类化合物选自下述表1中的化合物：
表1
更进一步地，所述的酰基硫脲类化合物选自以下化合物：4-(叔丁基)-N-((2-氯苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-6)、4-(叔丁基)-N-((2-溴苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-7)、4-(叔丁基)-N-((2-甲基苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-8)、4-(叔丁基)-N-((2-甲氧基苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-9)、4-(叔丁基)-N-((4-氨基苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-16)、4-(叔丁基)-N-(吡啶-2-基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺(V-17)、4-(叔丁基)-N-(喹啉-2-氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺(V-18)、N-((4-丙酰氨基苯基)硫代氨基甲酰基)-4-叔丁基苯甲酰胺(V-19)、4-(叔丁基)-N-((4-新戊基酰胺)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-20)、4-(叔丁基)-N-((4-(乙基磺酰胺基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-21)、N-((4-苯甲酰氨基苯基)硫代氨基甲酰基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺(V-22)、N-(4-(3-(4-(叔丁基)苯甲酰基)硫脲基)苯基)-2-甲氧基苯甲酰胺(V-23)、N-(4-(3-(4-(叔丁基)苯甲酰基)硫脲基)苯基)-3-甲氧基苯甲酰胺(V-24)、N-(4-(3-(4-(叔丁基)苯甲酰基)硫脲基)苯基)-4-甲氧基苯甲酰胺(V-25)、4-(叔丁基)-N-((4-(4-甲基苯甲酰氨基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-26)、4-(叔丁基)-N-((4-(4-乙基苯甲酰氨基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-27)、4-(叔丁基)-N-((4-(4-氟苯甲酰氨基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-28)、4-(叔丁基)-N-((4-(4-氯苯甲酰氨基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-29)、4-(叔丁基)-N-((4-(4-溴苯甲酰氨基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-30)、4-(叔丁基)-N-((4-(4-叔丁基苯甲酰氨基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-31)、4-(叔丁基)-N-((4-(4-丙基苯甲酰氨基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-32)、4-(叔丁基)-N-((4-(4-丁基苯甲酰氨基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-33)、4-(叔丁基)-N-((4-(4-戊基苯甲酰氨基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-34)、碳酸(((4-(3-(4-(4-(叔丁基)苯甲酰基)硫脲基)苯氧基][羟基)磷酰基]氧基)甲基异丙基(V-41)、(4-(3-(4-(叔丁基)苯甲酰基)硫脲基)苯基)硼酸(V-43)、4-(叔丁基)-N-((4-苯氧基苯基)氨基甲硫酰基)苯甲酰胺(V-48)、4-(叔丁基)-N-(((4-(4-氟-3-甲基苯氧基)-2-甲基苯基)氨基甲硫酰基)苯甲酰胺(V-49)、N-((4-氨基-2-氯苯基)氨基甲硫酰基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺(V-50)、4-(叔丁基)-N-((4-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)苯基)氨基甲硫酰基)苯甲酰胺(V-55)、4-(叔丁基)-N-(((4-(苯基氨基)苯基)氨基甲硫酰基)苯甲酰胺(V-65)、4-(叔丁基)-N-(((4-((3-甲氧基苯基)氨基)苯基)氨基甲硫酰基)苯甲酰胺(V-68)。
第二方面，本发明提供上述任意一种酰基硫脲类化合物或其药理或生理上可接受的盐在制备抗肠道病毒药物中的应用。
第三方面，本发明提供一种抗肠道病毒的药物，包含上述酰基硫脲类化合物或其药理或生理上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明还提供上述酰基硫脲类化合物的制备方法，将上述酰基硫脲类化合物分为系列I酰基硫脲类化合物(通式(I))、系列II酰基硫脲类化合物(通式(II))、系列III酰基硫脲类化合物(通式(III))。
系列I酰基硫脲类化合物的制备，通过下述方法(1)或(2)：
方法(1)包括如下步骤：酰氯化合物与硫氰酸铵在溶剂中反应；所得反应液过滤，往滤液中加入胺类化合物反应得到系列I酰基硫脲类化合物。其中，所述的溶剂优选为乙腈，酰氯化合物与硫氰酸铵在溶剂中反应的条件优选为0-40℃反应1-4小时；加入胺类化合物后反应的条件优选为0-40℃下反应4-12h。
方法(2)包括如下步骤：酰氯化合物与氨水在溶剂一中反应；所得反应液过滤取固体，固体用溶剂二溶解后缓慢加入草酰氯反应；所得反应液浓缩旋干，用溶剂三溶解，随后加入胺类化合物反应得到系列I酰基脲类化合物。其中，所述的溶剂一优选为二氯甲烷，酰氯化合物与氨水在溶剂一中反应的条件优选为0-40℃反应2-4h；所述的溶剂二优选为二氯甲烷，加入草酰氯后反应的条件优选为60-80℃反应6-12h；所述的溶剂三优选为甲醇，加入胺类化合物反应的条件优选为0-40℃反应2-24h。
系列I酰基硫脲类化合物的合成路线
系列II酰基硫脲类化合物的制备，包括如下步骤：以系列I化合物与氯乙酰氯为原料，在缚酸剂存在的条件下于溶剂中反应得到系列II酰基硫脲类化合物。其中，所述的缚酸剂优选为三乙胺，所述的溶剂优选为二氯甲烷，所述的反应的条件优选为0-40℃反应2-24h。
系列II酰基硫脲类化合物的合成路线
系列III酰基硫脲类化合物的制备，包括如下步骤：以系列I化合物与卤代底物为原料，于溶剂中反应得到系列III酰基硫脲类化合物。所述的溶剂优选为DCM或DMF，所述的反应的条件优选为20-110℃反应2-24h。
系列II酰基硫脲类化合物的合成路线
其中R1、R2、R3、R4取代基种类均如前所述；X为硫原子或者氧原子；Y为硫原子，氮原子或者氧原子；Z为卤素原子。
本发明提供的酰基硫脲类化合物，可以有效抑制肠道病毒的活性，且上述肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、新型肠道病毒，其对细胞的毒性小，可用于制备抗肠道病毒的药物。
附图说明
图1是酰基硫脲类化合物在小鼠体内的药效评估结果图。
图2是酰基硫脲类化合物的安全性研究结果图。
具体实施方式
通过以下详细说明可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
【实施例1】系列I酰基硫脲类化合物的制备
通过下式i、ii所示反应合成得到系列I酰基硫脲类化合物。
以4-(叔丁基)-N-((4-氨基苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺V-16的合成为例，步骤如下：取一50mL的单口瓶，加入硫氰酸铵(305.5mg，4.0mmol)、乙腈20mL，冰浴下加入4-叔丁基苯甲酰氯(0.8mL，4.0mmol)，冰浴下反应1h。过滤，取滤液，向滤液中加入对苯二胺(432.4mg，4.0mmol)，室温反应过夜。TLC确认反应完全后，浓缩后用流动相石油醚和乙酸乙酯(V/V＝6/1)过硅胶柱纯化，得到4-(叔丁基)-N-((4-氨基苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺V-16。
其他系列I酰基硫脲类化合物的制备方法同上。
【实施例2】系列I酰基脲类化合物的制备
通过下式iii、iv、v所示反应合成得到系列I酰基硫脲类化合物。
以化合物4-(叔丁基)-N-((2-氟苯基)氨基甲酰基)苯甲酰胺V-39的制备为例，步骤如下：4-叔丁基苯甲酰氯(0.4mL，2.0mmol)溶于二氯甲烷，冰浴下加入过量氨水，撤去冰浴，室温下反应3h。过滤所得固体经真空干燥后溶于二氯甲烷，冰浴下加入草酰氯(507.7mg，4.0mmol)，75℃下反应6h，浓缩旋干。旋干后粗产品溶于甲醇，随后加入2-氟苯胺(222.2mg，2.0mmol)，室温反应过夜。TLC确认反应完全后，浓缩后用流动相石油醚和乙酸乙酯(V/V＝10/1)过硅胶柱纯化，得到4-(叔丁基)-N-((2-氟苯基)氨基甲酰基)苯甲酰胺V-39。
其他系列I酰基脲类化合物的制备方法同上。
【实施例3】系列II酰基硫脲类化合物的制备
通过下式vi所示反应合成得到系列II酰基硫脲类化合物。
以化合物3-(4-(叔丁基)苯甲酰基)-1-(2-氟苯基)-2-硫代氧杂咪唑啉-4-酮V-45的制备为例，步骤如下：取化合物4-(叔丁基)-N-((2-氟苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺V-4(100mg，0.3mmol)溶于DCM，冰浴下依次加入三乙胺(61.4mg，0.6mmol)、氯乙酰氯(0.05mL，0.6mmol)，室温反应过夜。经TLC确认反应完全后，水淬灭，DCM萃取。浓缩后用流动相石油醚和乙酸乙酯(V/V＝6/1)过硅胶柱纯化，得到3-(4-(叔丁基)苯甲酰基)-1-(2-氟苯基)-2-硫代氧杂咪唑啉-4-酮V-45。
其他系列II酰基硫脲类化合物的制备方法同上。
【实施例4】系列III酰基硫脲类化合物的制备
通过下式vii所示反应合成得到系列III酰基硫脲类化合物。
以4-(叔丁基)-N-((4-(乙基磺酰胺基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺V-21的制备为例，步骤如下：称取实施例2制备的4-(叔丁基)-N-((4-氨基苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺V-16(150mg，0.46mmol)置于25mL单口瓶中，加入DCM使其溶解。冰浴下加入三乙胺(0.07mL，0.55mmol)、乙基磺酰氯(0.05mL，0.55mmol)，室温反应过夜。TLC确认反应完全后，浓缩经流动相石油醚和乙酸乙酯(V/V＝6/1)过硅胶柱纯化得到4-(叔丁基)-N-((4-(乙基磺酰胺基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺V-21。
其他系列III酰基硫脲类化合物的制备方法同上。
(1)N-((4-乙酰氨基苯基)硫代氨基甲酰基)苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(V-1)的制备
带R1的芳香甲酰氯衍生物为苯并噻吩-2-甲酰氯，R2取代的芳香杂环胺衍生物为4-氨基乙酰苯胺，参照实施例1中的方法制备目标化合物，产物为黄色固体，产率为30％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.30(s,1H),11.85(s,1H),10.07(s,1H),8.77(s,1H),8.10(d,J＝8.0Hz,1H),8.02(d,J＝7.8Hz,1H),7.72–7.43(m,6H),2.06(s,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ178.78,168.79,163.02,141.89,139.42,137.98,136.97,133.31,130.40,128.01,126.73,125.82,125.37,123.41,119.41,24.46.
(2)N-((4-乙酰氨基苯基)硫代氨基甲酰基)噻吩-2-甲酰胺(V-2)的制备
带R1的芳香甲酰氯衍生物为2-噻吩甲酰氯，R2取代的芳香杂环胺衍生物为4-氨基乙酰苯胺，参照实施例1中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为67％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.44(s,1H),11.63(s,1H),10.09(s,1H),8.40(d,J＝3.4Hz,1H),8.06(d,J＝4.8Hz,1H),7.97(s,1H),7.46(d,J＝7.1Hz,1H),7.33(d,J＝7.6Hz,2H),7.29–7.22(m,1H),2.06(s,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ179.10,168.93,162.52,140.10,138.71,137.15,135.81,133.18,129.32,129.21,119.32,117.33,115.29,24.51.
(3)N-((4-乙酰氨基苯基)硫代氨基甲酰基)-4-叔丁基苯甲酰胺(V-3)的制备
带R1的芳香甲酰氯衍生物为4-叔丁基甲酰氯，R2取代的芳香杂环胺衍生物为4-氨基乙酰苯胺，参照实施例1中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为59％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.70(s,1H),11.48(s,1H),10.10(s,1H),8.31–7.71(m,3H),7.57(d,J＝8.4Hz,2H),7.50–7.25(m,3H),2.07(s,3H),1.32(s,9H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ179.42,168.93,168.61,156.76,140.14,138.70,129.72,129.33,129.13,125.77,119.18,117.28,115.14,35.33,31.28,24.52.
(4)4-(叔丁基)-N-((2-氟苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-4)的制备
带R1的芳香甲酰氯衍生物为4-叔丁基甲酰氯，R2取代的芳香杂环胺衍生物为2-氟苯胺，参照实施例1中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为78％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.79(s,1H),9.24(s,1H),8.47–8.40(m,1H),7.86(d,J＝8.4Hz,2H),7.56(d,J＝8.4Hz,2H),7.27–7.16(m,3H),1.37(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ178.77,166.90,157.86,156.30,153.83,128.50,127.59,126.22,125.40,124.01,115.72,115.53,35.27,31.05.
(5)4-(叔丁基)-N-((3-氟苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-5)的制备
带R1的芳香甲酰氯衍生物为4-叔丁基甲酰氯，R2取代的芳香杂环胺衍生物为3-氟苯胺，参照实施例1中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为78％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.81(s,1H),9.18(s,1H),7.85(d,J＝8.5Hz,2H),7.78(d,J＝10.4Hz,1H),7.57(d,J＝8.5Hz,2H),7.45–7.33(m,2H),7.00(d,J＝7.2Hz,1H),1.38(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ178.33,167.03,163.77,161.32,157.96,139.13,130.01,128.45,127.55,126.27,119.38,113.67,113.46,111.32,111.06,35.29,31.05.
(6)4-(叔丁基)-N-((2-氯苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-6)的制备
带R1的芳香甲酰氯衍生物为4-叔丁基甲酰氯，R2取代的芳香杂环胺衍生物为2-氯苯胺，参照实施例1中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为72％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.82(s,1H),9.23(s,1H),8.44(d,J＝1.1Hz,1H),7.88(d,J＝8.4Hz,2H),7.57(d,J＝8.4Hz,2H),7.53–7.47(m,1H),7.37(t,J＝7.7Hz,1H),7.31–7.20(m,1H),1.38(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ178.89,166.71,157.88,135.13,129.68,128.50,128.03,127.67,127.61,126.90,126.27,126.23,35.28,31.06.
(7)4-(叔丁基)-N-((2-溴苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-7)的制备
带R1的芳香甲酰氯衍生物为4-叔丁基甲酰氯，R2取代的芳香杂环胺衍生物为2-溴苯胺，参照实施例1中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为66％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.68(s,1H),9.24(s,1H),8.29–8.25(m,1H),7.88(d,J＝8.6Hz,2H),7.70–7.66(m,1H),7.57(d,J＝8.6Hz,2H),7.45–7.37(m,1H),7.19(m,1H),1.38(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ179.22,166.66,157.89,136.55,132.96,128.51,128.24,127.63,127.56,127.22,126.23,118.71,35.29,31.07.
(8)4-(叔丁基)-N-((2-甲基苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-8)的制备
带R1的芳香甲酰氯衍生物为4-叔丁基甲酰氯，R2取代的芳香杂环胺衍生物为2-甲基苯胺，参照实施例1中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为70％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.34(s,1H),9.24(s,1H),7.90–7.85(m,2H),7.79(d,J＝7.7Hz,1H),7.61–7.55(m,2H),7.36–7.23(m,3H),2.40(s,3H),1.39(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ179.54,166.99,157.81,136.47,133.34,130.80,128.65,127.66,127.56,126.47,126.23,35.28,31.08,18.08.
(9)4-(叔丁基)-N-((2-甲氧基苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-9)的制备
带R1的芳香甲酰氯衍生物为4-叔丁基甲酰氯，R2取代的芳香杂环胺衍生物为2-甲氧基苯胺，参照实施例1中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为74％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.94(s,1H),9.15(s,1H),8.92–8.63(m,1H),7.87(d,J＝8.5Hz,2H),7.55(d,J＝8.5Hz,2H),7.26–7.22(m,1H),7.12–6.94(m,2H),3.97(s,3H),1.38(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ176.87,166.48,157.54,150.79,128.89,127.52,127.26,126.77,126.14,123.05,120.22,110.65,56.08,35.24,31.08.
(10)4-(叔丁基)-N-((2,6-二溴苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-10)的制备
带R1的芳香甲酰氯衍生物为4-叔丁基甲酰氯，R2取代的芳香杂环胺衍生物为2,6-二溴苯胺，参照实施例1中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为60％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.16(s,1H),9.39(s,1H),7.88(d,J＝8.4Hz,2H),7.65(d,J＝8.1Hz,2H),7.56(d,J＝8.4Hz,2H),7.13(t,J＝8.1Hz,1H),1.38(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ180.62,166.93,157.92,136.21,132.44,130.46,128.34,127.74,126.21,124.32,35.30,31.09.
(11)4-(叔丁基)-N-((2,4-二三氟甲基苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-11)的制备
带R1的芳香甲酰氯衍生物为4-叔丁基甲酰氯，R2取代的芳香杂环胺衍生物为2,4-二三氟甲基苯胺，参照实施例1中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为65％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.82(s,1H),9.36(s,1H),8.42(s,1H),7.88(d,J＝8.5Hz,3H),7.70(d,J＝8.2Hz,1H),7.58(d,J＝8.5Hz,2H),1.38(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ180.89,167.07,158.23,136.53,134.27,128.13,127.69,127.26,127.21,127.16,127.11,127.01,126.97,126.93,126.90,126.29,123.95,121.60,121.29,35.31,31.01.
(12)4-(叔丁基)-N-((2,4-二甲基苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-12)的制备
带R1的芳香甲酰氯衍生物为4-叔丁基甲酰氯，R2取代的芳香杂环胺衍生物为2,4-二甲基苯胺，参照实施例1中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为73％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.25(s,1H),9.28(s,1H),7.87(d,J＝8.5Hz,2H),7.58(t,J＝8.3Hz,3H),7.12(d,J＝11.6Hz,2H),2.36(d,J＝8.8Hz,6H),1.39(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ179.70,166.98,157.74,137.53,133.92,133.22,131.51,128.69,127.58,127.17,126.19,35.28,31.09,21.17,18.00.
(13)4-(叔丁基)-N-((2-溴-4-甲基苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-13)的制备
带R1的芳香甲酰氯衍生物为4-叔丁基甲酰氯，R2取代的芳香杂环胺衍生物为2-溴-4-甲基苯胺，参照实施例1中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为71％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.56(s,1H),9.21(s,1H),8.05(d,J＝8.2Hz,1H),7.87(d,J＝8.5Hz,2H),7.57(d,J＝8.5Hz,2H),7.50(s,1H),7.21(d,J＝8.3Hz,1H),2.38(s,3H),1.38(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ179.29,166.64,157.85,138.74,133.92,133.28,128.54,128.36,127.59,127.05,126.23,118.61,35.28,31.07,20.88.
(14)4-(叔丁基)-N-((3,4-二氟苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-14)的制备
带R1的芳香甲酰氯衍生物为4-叔丁基甲酰氯，R2取代的芳香杂环胺衍生物为3,4-二氟苯胺，参照实施例1中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为63％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.72(s,1H),9.18(s,1H),7.91–7.77(m,3H),7.57(d,J＝8.5Hz,2H),7.36–7.31(m,1H),7.26–7.12(m,1H),1.38(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ178.81,167.09,158.08,151.06,149.85,148.59,147.38,134.08,128.35,127.53,126.29,120.27,117.33,117.15,113.91,113.70,35.30,31.03.
(15)4-(叔丁基)-N-((2,4,6-三氯苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-15)的制备
带R1的芳香甲酰氯衍生物为4-叔丁基甲酰氯，R2取代的芳香杂环胺衍生物为2,4,6-三氯苯胺，参照实施例1中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为52％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.08(s,1H),9.44(s,1H),7.85(d,J＝8.2Hz,2H),7.55(d,J＝8.2Hz,2H),7.45(s,2H),1.38(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ180.96,167.03,158.07,135.09,134.65,132.48,128.64,128.20,127.70,126.23,35.31,31.06.
(16)4-(叔丁基)-N-((4-氨基苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-16)的制备
带R1的芳香甲酰氯衍生物为4-叔丁基甲酰氯，R2取代的芳香杂环胺衍生物为对苯二胺，参照实施例1中的方法制备目标化合物，产物为黄色固体，产率为40％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.41(s,1H),9.16(s,1H),7.84(d,J＝8.5Hz,2H),7.55(d,J＝8.5Hz,2H),7.44(d,J＝8.6Hz,2H),6.73(d,J＝8.7Hz,2H),3.81(s,2H),1.38(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ178.46,166.83,157.66,145.41,128.78,127.43,126.19,125.73,115.07,35.25,31.06.
(17)4-(叔丁基)-N-(吡啶-2-基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺(V-17)的制备
带R1的芳香甲酰氯衍生物为4-叔丁基甲酰氯，R2取代的芳香杂环胺衍生物为2-氨基吡啶，参照实施例1中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为69％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ13.20(s,1H),9.10(s,1H),8.84(d,J＝8.3Hz,1H),8.46(d,J＝3.9Hz,1H),7.95–7.69(m,3H),7.56(d,J＝8.4Hz,2H),7.20–7.16(m,1H),1.37(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ177.18,166.38,157.79,151.32,148.63,137.68,128.67,127.54,126.21,121.45,116.10,35.26,31.05.
(18)4-(叔丁基)-N-(喹啉-2-氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺(V-18)的制备
带R1的芳香甲酰氯衍生物为4-叔丁基甲酰氯，R2取代的芳香杂环胺衍生物为2-氨基喹啉，参照实施例1中的方法制备目标化合物，产物为黄色固体，产率为51％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ13.29(s,1H),9.18(s,1H),8.87(d,J＝8.9Hz,1H),8.24(d,J＝8.9Hz,1H),8.01(d,J＝8.4Hz,1H),7.89(d,J＝8.3Hz,2H),7.84(d,J＝8.1Hz,1H),7.72(t,J＝7.6Hz,1H),7.60–7.51(m,3H),1.38(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ178.11,166.48,157.87,150.59,146.97,137.66,130.05,128.62,128.45,127.56,126.99,126.26,116.13,35.28,31.06.
(19)N-((4-丙酰氨基苯基)硫代氨基甲酰基)-4-叔丁基苯甲酰胺(V-19)的制备
系列I酰基硫脲类化合物为V-16，R4取代的酰氯衍生物为丙酰氯，参照实施例4中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为44％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.65(s,1H),11.45(s,1H),10.00(s,1H),7.95(d,J＝8.3Hz,2H),7.70–7.50(m,6H),2.34(q,J＝7.5Hz,2H),1.32(s,9H),1.10(t,J＝7.5Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ179.37,172.45,168.53,156.75,138.00,133.24,129.75,129.08,125.77,125.16,119.47,35.32,31.28,29.99,10.12.
(20)4-(叔丁基)-N-((4-新戊基酰胺)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-20)的制备
系列I酰基硫脲类化合物为V-16，R4取代的酰氯衍生物为特戊酰氯，参照实施例4中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为28％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.62(s,1H),9.13(s,1H),7.85(d,J＝7.9Hz,2H),7.68(d,J＝8.3Hz,2H),7.62(d,J＝8.5Hz,2H),7.57(d,J＝7.8Hz,2H),7.44(s,1H),1.36(d,J＝14.9Hz,18H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ178.43,176.61,166.90,157.83,136.66,133.55,128.62,127.46,126.25,124.82,120.14,39.68,35.28,31.06,27.63.
(21)4-(叔丁基)-N-((4-(乙基磺酰胺基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-21)的制备
以4-(叔丁基)-N-((4-(乙基磺酰胺基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺V-21的制备为例，步骤如下：称取实施例1制备的4-(叔丁基)-N-((4-氨基苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺V-16(150mg，0.46mmol)置于25mL单口瓶中，加入DCM使其溶解。冰浴下加入三乙胺(0.07mL，0.55mmol)、乙基磺酰氯(0.05mL，0.55mmol)，室温反应过夜。TLC确认反应完全后，浓缩经流动相比例为石油醚和乙酸乙酯(V/V＝6/1)过硅胶柱纯化得到白色固体V-21，产率为29％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.70(s,1H),9.20(s,1H),7.86(d,J＝8.5Hz,2H),7.71(d,J＝8.8Hz,2H),7.57(d,J＝8.5Hz,2H),7.36–7.27(m,2H),7.24(s,1H),3.19(q,J＝7.4Hz,2H),1.50–1.32(m,12H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ178.60,167.11,157.96,135.36,134.55,128.49,127.55,126.26,125.47,120.56,46.11,35.29,31.05,8.25.
(22)N-((4-苯甲酰氨基苯基)硫代氨基甲酰基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺(V-22)的制备
系列I酰基硫脲类化合物为V-16，R4取代的酰氯衍生物为苯甲酰氯，参照实施例4中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为36％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.65(s,1H),9.14(s,1H),8.12(s,1H),7.88(d,J＝7.4Hz,2H),7.84(d,J＝8.4Hz,2H),7.77–7.65(m,4H),7.55(t,J＝7.6Hz,3H),7.48(t,J＝7.4Hz,2H),1.38(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ178.38,166.95,165.83,157.84,136.56,134.75,133.85,131.96,128.81,128.62,127.50,127.13,126.24,124.84,120.49,35.28,31.06.
(23)N-(4-(3-(4-(叔丁基)苯甲酰基)硫脲基)苯基)-2-甲氧基苯甲酰胺(V-23)的制备
系列I酰基硫脲类化合物为V-16，R4取代的酰氯衍生物为2-甲氧基苯甲酰氯，参照实施例4中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为33％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.65(s,1H),9.92(s,1H),9.16(s,1H),8.32–8.28m,1H),7.85(d,J＝8.5Hz,2H),7.81–7.69(m,4H),7.62–7.47(m,3H),7.15(t,J＝7.2Hz,1H),7.05(d,J＝8.3Hz,1H),4.07(s,3H),1.38(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ178.33,166.91,163.23,157.81,157.22,137.02,133.50,133.41,132.55,128.65,127.48,126.25,124.80,121.73,121.58,120.59,111.58,56.30,35.28,31.06.
(24)N-(4-(3-(4-(叔丁基)苯甲酰基)硫脲基)苯基)-3-甲氧基苯甲酰胺(V-24)的制备
系列I酰基硫脲类化合物为V-16，R4取代的酰氯衍生物为3-甲氧基苯甲酰氯，参照实施例4中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为29％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.65(s,1H),9.13(s,1H),8.09(s,1H),7.84(d,J＝8.5Hz,2H),7.76–7.68(m,4H),7.56(d,J＝8.5Hz,2H),7.49–7.32(m,3H),7.13–7.00(m,1H),3.86(s,3H),1.38(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ178.36,166.92,165.62,159.96,157.85,136.53,136.24,133.86,129.79,128.61,127.48,126.24,124.82,120.43,118.81,118.16,112.51,55.51,35.28,31.05.
(25)N-(4-(3-(4-(叔丁基)苯甲酰基)硫脲基)苯基)-4-甲氧基苯甲酰胺(V-25)的制备
系列I酰基硫脲类化合物为V-16，R4取代的酰氯衍生物为4-甲氧基苯甲酰氯，参照实施例4中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为39％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.64(s,1H),9.13(s,1H),8.08(s,1H),7.85(t,J＝8.6Hz,4H),7.77–7.62(m,4H),7.56(d,J＝8.4Hz,2H),6.95(d,J＝8.7Hz,2H),3.86(s,3H),1.38(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ178.31,166.92,165.36,162.52,157.81,136.81,133.58,129.07,128.60,127.49,126.88,126.23,124.78,120.45,113.94,55.48,35.27,31.06.
(26)4-(叔丁基)-N-((4-(4-甲基苯甲酰氨基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-26)的制备
系列I酰基硫脲类化合物为V-16，R4取代的酰氯衍生物为4-甲基苯甲酰氯，参照实施例4中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为30％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.64(s,1H),9.14(s,1H),8.11(s,1H),7.84(d,J＝8.5Hz,2H),7.78(d,J＝8.1Hz,2H),7.74–7.65(m,4H),7.56(d,J＝8.5Hz,2H),7.26(d,J＝8.0Hz,2H),2.41(s,3H),1.38(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ178.28,166.90,165.79,157.80,142.45,136.72,133.67,131.86,129.90,129.41,128.62,127.49,127.18,126.22,124.74,120.46,35.27,31.06,21.51.
(27)4-(叔丁基)-N-((4-(4-乙基苯甲酰氨基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-27)的制备
系列I酰基硫脲类化合物为V-16，R4取代的酰氯衍生物为4-乙基苯甲酰氯，参照实施例4中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为38％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.64(s,1H),9.13(s,1H),8.10(s,1H),7.86–7.78(m,4H),7.75–7.66(m,4H),7.56(d,J＝8.4Hz,2H),7.29(d,J＝8.0Hz,2H),2.71(q,J＝7.6Hz,2H),1.38(s,9H),1.27(t,J＝7.6Hz,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ178.32,166.92,165.83,157.80,148.67,136.73,133.68,132.09,128.62,128.24,127.50,127.28,126.23,124.78,120.48,35.27,31.06,28.81,15.30.
(28)4-(叔丁基)-N-((4-(4-氟苯甲酰氨基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-28)的制备
系列I酰基硫脲类化合物为V-16，R4取代的酰氯衍生物为4-氟苯甲酰氯，参照实施例4中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为33％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.63(s,1H),9.14(s,1H),8.16(s,1H),7.94–7.79(m,4H),7.68(s,4H),7.56(d,J＝8.4Hz,2H),7.13(t,J＝8.5Hz,2H),1.38(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ178.37,166.95,157.86,136.43,133.92,130.88,129.65,129.56,128.58,127.49,126.24,124.81,120.66,115.90,115.69,35.27,31.05.
(29)4-(叔丁基)-N-((4-(4-氯苯甲酰氨基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-29)的制备
系列I酰基硫脲类化合物为V-16，R4取代的酰氯衍生物为4-氯苯甲酰氯，参照实施例4中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为29％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.64(s,1H),9.14(s,1H),8.21(s,1H),7.82(t,J＝8.7Hz,4H),7.68(s,4H),7.56(d,J＝8.5Hz,2H),7.41(d,J＝8.3Hz,2H),1.38(s,9H).13CNMR(100MHz,CDCl3)δ178.36,166.96,164.84,157.87,138.18,136.33,133.97,133.06,128.98,128.65,127.49,126.25,124.81,120.65,35.28,31.05.
(30)4-(叔丁基)-N-((4-(4-溴苯甲酰氨基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-30)的制备
系列I酰基硫脲类化合物为V-16，R4取代的酰氯衍生物为4-溴苯甲酰氯，参照实施例4中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为21％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.64(s,1H),9.14(s,1H),8.19(s,1H),7.84(d,J＝8.5Hz,2H),7.74(d,J＝8.5Hz,2H),7.69(s,4H),7.57(t,J＝8.6Hz,4H),1.38(s,9H).13CNMR(100MHz,CDCl3)δ178.35,166.95,164.93,157.87,136.31,133.99,133.53,131.96,128.80,128.57,127.49,126.67,126.25,124.81,120.64,35.28,31.06.
(31)4-(叔丁基)-N-((4-(4-叔丁基苯甲酰氨基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-31)的制备
系列I酰基硫脲类化合物为V-16，R4取代的酰氯衍生物为4-乙基苯甲酰氯，参照实施例4中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为36％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.65(s,1H),9.15(s,1H),8.11(s,1H),7.88–7.80(m,4H),7.78–7.66(m,4H),7.56(d,J＝8.4Hz,2H),7.50(d,J＝8.3Hz,2H),1.37(d,J＝7.4Hz,18H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ178.34,166.90,165.71,157.81,155.54,136.70,133.74,131.85,128.64,127.49,126.99,126.24,125.74,124.81,120.43,35.27,35.01,31.17,31.06.
(32)4-(叔丁基)-N-((4-(4-丙基苯甲酰氨基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-32)的制备
系列I酰基硫脲类化合物为V-16，R4取代的酰氯衍生物为4-丙基苯甲酰氯，参照实施例4中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为34％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.64(s,1H),9.13(s,1H),8.08(s,1H),7.85–7.81(m,4H),7.76–7.67(m,4H),7.56(d,J＝8.4Hz,2H),7.28(d,J＝8.0Hz,2H),2.75–2.54(m,2H),1.70–1.66(m,2H),1.38(s,9H),0.97(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ178.34,166.91,165.77,157.82,147.20,136.70,133.72,132.14,128.87,128.63,127.48,127.13,126.24,124.80120.41,37.90,35.27,31.06,24.30,13.77.
(33)4-(叔丁基)-N-((4-(4-丁基苯甲酰氨基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-33)的制备
系列I酰基硫脲类化合物为V-16，R4取代的酰氯衍生物为4-丁基苯甲酰氯，参照实施例4中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为30％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.65(s,1H),9.10(s,1H),7.98(s,1H),7.87–7.81(m,4H),7.73(s,4H),7.57(d,J＝8.5Hz,2H),7.35–7.26(m,2H),2.73–2.66(m,2H),2.72–1.58(m,5H),1.70–1.60(m,2H),1.45–1.34(m,11H),0.96(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ178.33,166.88,165.70,157.84,147.48,136.68,133.75,132.11,128.85,128.64,127.46,127.11,126.25,124.81,120.35,35.56,35.28,33.33,31.05,22.31,13.92.
(34)4-(叔丁基)-N-((4-(4-戊基苯甲酰氨基)苯基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-34)的制备
系列I酰基硫脲类化合物为V-16，R4取代的酰氯衍生物为4-戊基苯甲酰氯，参照实施例4中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为31％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.64(s,1H),9.11(s,1H),8.09(s,1H),7.86–7.78(m,4H),7.76–7.67(m,4H),7.56(d,J＝8.4Hz,2H),7.28(d,J＝8.1Hz,2H),2.72–2.60(m,2H),1.72–1.58(m,2H),1.45–1.27(m,13H),0.92(t,J＝6.8Hz,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ178.30,166.89,165.78,157.81,147.46,136.71,133.70,132.08,128.80,128.63,127.48,127.17,126.23,124.78,120.43,35.83,35.27,31.44,31.06,30.87,22.52,14.05.
(35)4-(叔丁基)-N-((2-氟苯基)氨基甲酰基)苯甲酰胺(V-39)的制备
带R1的芳香甲酰氯衍生物为4-叔丁基甲酰氯，R2取代的芳香杂环胺衍生物为2-氟苯胺，参照实施例2中的方法制备目标化合物，产物为白色固体，产率为66％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.43(s,1H),10.45(s,1H),8.33(dd,J＝10.6,4.9Hz,1H),8.11(d,J＝8.4Hz,2H),7.55(d,J＝8.4Hz,2H),7.23-7.10(m,3H),1.40(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ168.58,157.26,154.33,152.40,151.89,129.08,128.16,126.09,125.98,125.78,124.57,124.49,124.19,124.15,121.91,115.29,115.10,35.19,31.13.
(36)3-(4-(叔丁基)苯甲酰基)-1-(2-氟苯基)-2-硫代氧杂咪唑啉-4-酮(V-45)的制备
系列I酰基硫脲类化合物为V-4，参照实施例3中的方法制备目标化合物，产物为淡黄色固体，产率为31％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.94(d,J＝8.5Hz,2H),7.61–7.51(m,1H),7.43–7.33(m,5H),4.04(q,J＝18.3Hz,2H),1.32(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ177.19,171.55,170.73,158.77,157.08,156.25,132.20,131.48,131.41,130.03,129.93,125.37,124.71,124.68,122.56,122.43,116.83,116.64,35.15,33.21,31.09.
【实施例5】酰基硫脲类化合物生物活性测试
(1)酰基硫脲类化合物细胞毒性测定：
黄色的噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的针状Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物可被20％(质量比体积)SDS溶解，用酶联免疫检测仪在595nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。
实验时，将RD细胞以每孔2×104的密度传至96孔板中，在37℃培养24小时后，吸走培养基，将含有各种浓度梯度化合物的细胞培养基(DMEM+5％血清)加到每个孔。24小时后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液，细胞板在37℃的CO2孵化器中培养4h。酶标仪测定595nm波长下的OD值。化合物的抑制率(％)＝[1-(E-N)/(P-N)]×100，其中“E”代表给药组的OD值，“P”代表未给药组的OD值，“N”代表空白组OD值。化合物的半数抑制浓度(CC50)作为该化合物细胞毒性的指标。
(2)酰基硫脲类化合物体外抗肠道病毒活性：
通过病毒蚀斑数减少分析来评估化合物的抗病毒活性。铺满RD细胞的6孔板按照70PFU/孔接入肠道病毒，40分钟后除去含病毒的培养基并加入含有特定浓度待测药物的培养基，培养基含有终浓度为2μg/mL TPCK-trypsin和0.5％agarose。在37℃、5％CO2条件下培养48-72小时后，用3％的福尔马林固定细胞，用0.5％结晶紫对细胞进行染色并计算病毒蚀斑数。EC50是指特定药物有效抑制病毒产生蚀斑数至对照孔的50％所需的浓度。
本实施例中所涉及的肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒以及肠道病毒EV-D68、EV-A-71、鼻病毒等。
本发明以恩韦肟对照，对合成的72个化合物进行细胞毒性和抗肠道病毒活性检查，并计算了化合物的选择性指数SI，结果见表2。
表2本发明合成的化合物V1-72抗肠道病毒EV71活性和细胞毒性的结果
表3本发明合成的化合物广谱抗肠道病毒活性结果
上述实验结果表明：合成的大多数酰基硫脲类化合物都具有很好抗肠道病毒活性，例如化合物V-6、V-8、V-9、V-16、V-19、V-20、V-22、V-23、V-26、V-27、V-28、V-29、V-30、V-31、V-32、V-33、V-34、V-49、V-50、V-65、V-66、V-67、V-68、V-69等，尤其是化合物V-16、V-20、V-22、V-23、V-26、V-27、V-28、V-29、V-30、V-31、V-32、V-3、V-65、V-66、V-67、V-68、V-69均显示了低纳摩尔水平的抗肠道病毒活性和高的选择性。
【实施例6】酰基硫脲类化合物动物活性测试
(1)酰基硫脲类化合物在小鼠体内的药效评估
首先，本发明所涉及的实验小鼠均为从湖北省疾控中心购买的两周大小的KM小鼠，所有相关的实验操作均符合动物福利指南。以化合物V-31为例，小鼠实验组分为空白组(不给药不攻毒组，NC)、阴性对照组(仅攻毒不给药组，Mock)、实验组(攻毒且给药组，V-31)三组，每组8只小鼠。阴性对照组小鼠攻毒(EV-A71)剂量为0.8×108pfu(致死剂量)，采用滴鼻感染方式；实验组小鼠在攻毒6小时前给药，给药浓度为0.6mg/kg，攻毒剂量为0.8×108pfu(致死剂量)，攻毒后再以0.6mg/kg的给药浓度连续口服给药4天。每天对三组小鼠的行为、体重进行监测并记录，持续10天。结果如图1所示，对照组在第六天以后均呈现死亡或濒临死亡状态，而化合物V-31在给药量为0.6mg/kg时对病毒感染的小鼠保护率高达80％，体现出了优秀的保护效果，适合作为临床候选药物做进一步开发。
(2)酰基硫脲类化合物的安全性研究
实验小鼠分为5组，空白组(不给药不攻毒组，Mock)，阴性对照组(仅攻毒不给药组，EV71)，实验组(攻毒且给药组，EV71+V-31 0.6mg/kg)，仅给药组(分为两个浓度，V-315mg/kg、V-31 10mg/kg)。其中攻毒剂量统一为0.8×108pfu；化合物给药方式为攻毒6小时前口服给药，攻毒后连续给药四天。每天对各组小鼠的行为、体重进行监测并记录，持续10天，结果见图2。从图2中可以看出，化合物V-31在单独给药量高达10mg/kg(超出实验室给药量15倍以上)时并未显示出明显的体重下降趋势，因此表明该化合物安全性较好，对小鼠没有明显的毒副作用，适合作为临床候选药物进一步开发。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。