一种新型冠状病毒南非突变株的重组亚单位疫苗及其应用
阅读说明：本技术 一种新型冠状病毒南非突变株的重组亚单位疫苗及其应用 (Novel recombinant subunit vaccine of coronavirus south Africa mutant strain and application thereof ) 是由 张海江 贠炳岭 刘永江 杨秀芬 高文双 温鸿研 刘洋 郭茜 王艳 伍树明 于 2021-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种含有新型冠状病毒南非突变株COVID-19疫苗的抗原表位的融合蛋白,所述融合蛋白由新型冠状病毒南非突变株COVID-19疫苗的RBD抗原表位片段S1亚基中的RBD片段和SD1片段和免疫球蛋白Fc片段构成。本发明经过研究发现在新型冠状病毒南非突变株COVID-19的RBD融合SD1,获得的效果具有优异的效果,尤其是中和数据方面具有突出的效果,因而可以推广作为针对新型冠状病毒南非突变株COVID-19的疫苗。(The invention discloses a fusion protein containing an epitope of a novel coronavirus south Africa mutant strain COVID-19 vaccine, which consists of an RBD fragment in an RBD epitope fragment S1 subunit, an SD1 fragment and an immunoglobulin Fc fragment of the novel coronavirus south Africa mutant strain COVID-19 vaccine. According to the invention, through research, the RBD fusion SD1 of the novel coronavirus south Africa mutant strain COVID-19 has excellent effects, especially has outstanding effects on neutralizing data, and therefore, the vaccine can be popularized as a vaccine aiming at the novel coronavirus south Africa mutant strain COVID-19.)
技术领域
本发明属于生物及医药技术领域，具体涉及新型冠状病毒的重组亚单位疫苗 及其应用，更具体涉及在通过基因工程手段人工合成的病毒基因在真核细胞中表 达出有免疫活性的重组亚单位蛋白，并且利用表达出的重组蛋白研制成疫苗的方 法。
背景技术
新型冠状病毒属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常 为多形性，直径60-140nm。新冠病毒SARS-CoV-2的结构蛋白包括S蛋白、N蛋 白、E蛋白、M蛋白。对于SARS-CoV-2而言，只有直接针对S蛋白的中和抗体才 能够中和病毒的毒力、阻止病毒对机体的感染，冠状病毒外套膜上的刺突蛋白 (Spike protein，S蛋白)是病毒感染过程中识别宿主细胞受体的一种关键蛋白，S 蛋白由S1和S2两个亚基组成，其中S1亚基中包含受体结合结构域(Receptor Binding Domain，RBD)介导吸附作用，S2亚基主要体现融合活性。
南非突变株是一种通俗的叫法，是指最早于2020年12月18日在南非被检测发 现的的新型冠状病毒的一个突变谱系(lineage)。该突变系随后以其极快的速度 蔓延全球，起初也被称之为501Y.V2，以区别于英国突变株的N501Y突变。他们 都属于B系谱突变。根据新冠谱系命名法南非突变株谱系被命名为(B.1.351)。 此后，该变体已成为本地主导。B.1.351除D614G外还包含多个刺突突变，包括 NTD中的一簇突变(例如242-244del和R246I)，RBD中的3个突变(K417N，E484K 和N501Y)和弗林蛋白酶裂解位点附近一个突变(A701V)。王鹏飞等在Nature 杂志发表研究论文(Antibody Resistance of SARS-Cov-2Variants B.1.351 and B.1.1.7,Nature,2021)，揭示了部分中和抗体和疫苗免疫血清对南非突变株的保 护效率。通过中和活性的对比，发现针对英国突变株B.1.1.7的中和活性基本未变， 但针对南非突变株B.1.351的中和活性则明显降低(12.4倍，Moderna；10.3倍，辉瑞)
针对新型冠状病毒南非突变株COVID-19，已经有一些研究获得相关的疫苗， 目前已经上市的疫苗均针对HuB株新冠病毒开发，例如CN 111333704A的专利申请 中筛选和优化了可以用于制备新型冠状病毒南非突变株COVID-19疫苗的优势抗 原表位片段，并将该蛋白片段与人Fc片段融合，制备成新型的病毒疫苗。而2020 年5月22日《The Lancet》重磅刊发我国首个由于军事科学院军事医学研究院生 物工程研究所COVID-19疫苗I期临床试验结果，结果表明国内进入人体试验阶段 的新型冠状病毒疫苗目前试验结果反馈良好，单一剂量的新5型腺病毒载体 COVID-19(Ad5-nCoV)疫苗在14天内产生的特异抗体和T细胞，相关的疫苗已申请 专利。但现有的疫苗对南非突变株的保护力均不佳，所以，急需开发对南非株新 型冠状病毒有效的疫苗。
发明内容
本发明基于对新型冠状病毒南非突变株的分析研究，结合此前新型冠状病毒疫苗的分析，最终确定针对新型冠状病毒南非突变株有效的疫苗。首先基于此前的 RBDSD1序列和人Fc序列融合构建的疫苗，研究分析对于新型冠状病毒南非突变 株的适用性，研究意料发现将新型冠状病毒南非突变株的抗原表位片段是S1亚基中 的RBD片段和SD1片段与人免疫球蛋白Fc序列融合构建的疫苗具有预料不到的 技术效果。
本发明首先提供一种含有新型冠状病毒南非突变株COVID-19南非突变株 疫苗的抗原表位的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由新型冠状病毒南非突 变株COVID-19南非突变株抗原表位片段是S1亚基中的RBD片段和SD1片段与 人免疫球蛋白Fc序列融合构成，且所述RBD片段的氨基酸序列如SEQ ID NO： 2所示；所述SD1片段的氨基酸序列如SEQID NO：3所示，而所述免疫球蛋白 Fc片段选自于人、小鼠、兔子、牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、或豚 鼠的免疫球蛋白Fc片段；进一步地，所述免疫球蛋白Fc片段选自IgG、IgA、IgD、 IgE或IgM的Fc片段；其中优选地，所述免疫球蛋白Fc片段选自IgG1 Fc片段、 IgG2 Fc片段、IgG3 Fc片段、或IgG4 Fc片段；尤其优选地，所述免疫球蛋白Fc 片段是人IgG Fc片段，最优选地其是如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
最优选地，所述融合蛋白包含SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。
本发明相应提供根据所述的融合蛋白的编码核酸，优选地，其中RBD片段 的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示或其简并序列；所述SD1片段的编码核 苷酸序列如SEQ IDNO：4所示或其简并序列；所人免疫球蛋白Fc片段编码核 苷酸序列如SEQ ID NO：6所示或其简并序列。最优选地，融合蛋白的编码核酸 的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示或其简并序列。
本发明进一步提供含有如所述的编码核酸的重组载体、重组细胞。
本发明还提供一种新型冠状病毒南非突变株COVID-19南非突变株疫苗，其 特征在于，所述疫苗包含所述的融合蛋白。进一步还包括佐剂，例如氢氧化铝。 其中，所述融合蛋白通过化学合成，或基因重组方法获得。
本发明经过研究和探索，发现对于新型冠状病毒南非突变株COVID-19南非 突变株，在新型冠状病毒南非突变株COVID-19南非突变株的RBD的基础上融 合SD1，在免疫原性和稳定性方面，其效果显著优于仅融合RBD的效果。
附图说明
图1ProteinA亲和层析各缓冲体系洗脱峰还原电泳图。
图2HAc-NaAc缓冲体系SP洗脱非还原电泳图。
图3PB缓冲体系SP洗脱非还原电泳图。
图4实施例四的SDS-PAGE电泳检测图。
图5实施例五的分子排阻色谱法检测图谱及数据。
具体实施方式
本发明的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案，并不构成对 本发明的限制。同时，本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明 均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通 过正规商业渠道获得。
实施例一、载体构建
通过化学合成的方法，由北京六合华大基因科技有限公司合成新型冠状病毒 南非突变株COVID-19南非突变株疫苗的抗原表位的融合蛋白相关基因序列。其 中，
新型冠状病毒南非突变株COVID-19南非突变株RBD核苷酸序列如下(SEQ ID NO：1)：
其编码的RBD氨基酸序列如下(SEQ ID NO：2)：
其编码的SD1氨基酸序列如下(SEQ ID NO：3)：
SD1核苷酸序列如下(SEQ ID NO：4)：
其编码的hFc氨基酸序列如下(SEQ ID NO：5)：
hFc核苷酸酸序列如下(SEQ ID NO：6)：
RBDSD1-hFc氨基酸序列(SEQ ID NO：7)
RBDSD1-hFc核苷酸序列如下(SEQ ID NO：8)：
由基因公司直接合成的方式将上述目的基因(即RBD、RBD-Fc和RBDSD1-Fc) 构建到pcDNA3.1表达载体，分别获得DNA质粒pcDNA3.1-RBD、pcDNA3.1-RBD-Fc、 pcDNA3.1-RBDSD1-Fc。
实施例二、细胞瞬转
①转染前一天按照2.0×106cells/mL密度接种，培养第二天细胞密度可至 4.0×106cells/mL左右；
②培养第二天细胞计数后，细胞活率＞95％，活细胞密度≥4.0×
106cells/mL，可直接使用；若细胞密度低于4.0×106cells/mL，可通过离心(800rpm，5min)收集细胞，将细胞以4.0×106cells/mL密度重悬于Transpro CD01培养基中；
③按照优化后的瞬转工艺，制备DNA和PEI混合液；
④将混合液加入到培养液中，进行培养；
⑤培养18h后，建议补加一次终浓度为2mM丙戊酸(VPA)和初始培养体积 5％+0.5％DN feed 2+DN feed B2，可进一步提高活细胞密度和蛋白表达量，瞬转 后培养过程若出现细胞结团现象，可以添加0.05-0.10g/L硫酸葡聚糖。
⑥培养至7天，或者活力低于60％，结束培养，收集细胞上清，用于蛋白纯 化。
实施例三、蛋白纯化
对实施例二获提蛋白通过下述先亲和层析，后离子交换进行纯化。
一、对于RBDSD1-Fc的纯化采取下述Protein A亲和层析方法
一)Protein A亲和层析方法的总体步骤如下
层析柱：AT ProteinA Diamond亲和层析介质，柱体积CV：10ml，流速： 4～6ml/min，限压：≤0.3MPa。
预处理：先用0.1M NaOH冲洗至少3个CV，后用纯化水冲洗至少10个CV。
平衡：先用清洗缓冲液(0.1M HAc-NaAc,pH3.0)淋洗2～3个CV，后用结合 缓冲液(0.02M PB,0.5M NaCl,pH7.0)充分平衡至少10个CV待用。
上样：取过滤后CHO悬浮细胞培养物用5M NaCl调整电导与结合缓冲液一致 后上样至平衡好的层析柱，收集上样流穿，并从中取样100μl用于电泳检测。
淋洗：上样完成后先用结合缓冲液淋洗至少4个CV至UV基线平，随后用淋洗 缓冲液(0.1M HAc-NaAc,pH5.0)，淋洗至少4个CV至UV基线平。
洗脱：用洗脱缓冲液(0.1M HAc-NaAc,pH3.8)进行洗脱，洗脱至UV基线平， 分管收集各洗脱组分，同时在各收集管内根据收集体积加入适量收集体积的中和 缓冲液(0.02MPB,pH8.0)并混匀。
二)ProteinA亲和层析工艺优化
1、Proteins亲和层析洗脱缓冲体系优化
根据前述Protein A亲和层析方法整体步骤进行实验，并且选用甘氨酸-盐 酸，醋酸-醋酸钠和柠檬酸缓冲体系进行纯化，收集纯化的样品进行SDS-PAGE电 泳检测。
取纯化过程中收集的各样品按100μl样品+25μl Loading dye(非还原型) 的比例配制各待电泳样品(沸水浴5min)，然后取适量上样进行电泳，电泳条 件为：胶浓度10％，先恒压100V跑15min，后改恒压200V跑至前沿刚好跑出， 接着考马斯亮蓝染色，沸水脱色，拍照记录电泳结果(电泳图如图1所示)。用 Labworks软件对Protein A亲和层析收集样品对应泳道进行电泳纯度分析，记录 分析结果。其表1所示，醋酸-醋酸钠体系纯化获得的蛋白纯度相对最高，平均 粒径也最小，粒径小表明蛋白聚集程度低，因此，醋酸-醋酸钠体系最佳。
表1 ProteinA亲和层析各缓冲体系洗脱主峰粒径和纯度分析表
二、对于RBDSD1-Fc的纯化采取下述SP阳离子交换层析
一)SP阳离子交换层析方法的总体步骤如下：
层析柱：Monomix HC60-SP阳离子交换层析柱，柱体积CV：10ml，流速：4～6ml/min，限压：≤0.3MPa。
预处理：先用1M NaOH冲洗至少3个CV，后用纯化水冲洗至少10个CV。
平衡：先用洗脱缓冲液(0.02M PB,1M NaCl,pH6.0)淋洗2～3个CV，后用结合缓冲液 (0.02M PB,pH6.0)充分平衡至少10个CV待用。
上样：ProteinA亲和层析洗脱收集中和后样品上样至平衡好的层析柱，收集上样流穿， 并从中分别取样100μl用于电泳检测。
淋洗：上样完成后先用结合缓冲液淋洗至6～8个CV至UV基线平，随后用3％B淋洗至 6～8个CV至UV基线平。
洗脱：先用10％B梯度洗脱，随后用100％B梯度洗脱，分管收集各洗脱组分。
二)SP阳离子交换层析工艺优化
1、SP阳离子交换层析缓冲体系优化
使用上述的SP阳离子交换层析方法进行蛋白纯化，缓冲体系分别选用醋酸- 醋酸钠和PB体系，纯化后收集纯化的样品，电泳分析样品纯度，发现两个体系 纯化收集的蛋白，在大约50～70Kd之间有明显的两条杂带(如图2所示)，但 是，随着收集管子的增加，PB体系纯化获得的样品，这两条杂带明显减少(如 图3所示)。因此，PB体系可以收集获得纯度更佳的蛋白样品。所以，SP阳离 子交换层析纯化时，优选用PB的缓冲体系。
实施例四、SDS-PAGE电泳检测
取经过proteinA和阳离子交换层析纯化后收集的样品样品按100μl样品 +25μlLoading dye(还原型)的比例配制电泳样品(沸水浴5min)，然后取 适量上样进行电泳，电泳条件为：胶浓度10％，先恒压100V跑15min，后改恒压 200V跑至前沿刚好跑出，接着考马斯亮蓝染色，沸水脱色，拍照记录电泳结果 (电泳图如图所示)。结果表明，蛋白经变性后，分子量在60～70Kd之间，两步 纯化后获得的蛋白纯度大于95％，符合要求(图4)。
实施例五、分子排阻色谱法检测
装柱前先将色谱柱浸泡48小时，使之充分溶胀，搅拌除去空气泡，徐徐倾入 玻璃或其他适宜材质的柱，一次性装填完毕，以免分层，使色谱柱面平整，新填 装的色谱柱要先用水连续冲洗4～6小时，以排出柱中的气泡。
进样可以采用自动进样阀，也可以直接将供试品加在床的表面，采用分子排 阻色谱法，亲水甲基丙烯酸树脂体积排阻色谱柱。流动相为20mmol/L Histidine 溶液(pH5.7～6.2)，0.5～1.35mol/L NaCl，0.02％聚山梨酯80，流速0.5mL/min 等度洗脱；上样量20μl；检测波长280nm。按面积归一化法计算纯度。结果表明， 纯度为95.972(图5)。
实施例六、小鼠免疫和中和抗体检测
将各重组蛋白分别与氢氧化铝佐剂混合，并免疫小鼠。采购20只6-8周雌性 BALB/c小鼠，随机分成2组(实验组和阴性对照组)，每组10只。每只小鼠肌肉免 疫10ug蛋白。每隔两周加强免疫一次，共加强免疫两次。从第一次免疫开始，每 隔两周采集小鼠血液，离心取上清，进行中和抗体滴度检测。
中和抗体滴度检测实验方法如下：
1.细胞准备：实验前一天，将约为1x104个细胞/孔的接种量把待感染细胞 接种于96孔细胞培养板中。
2.假病毒感染：取出冻存的假病毒置融化，待完全融化后，吸取所需量假 病毒加入细胞培养体系中感染目的细胞，病毒感染后6-8H后更换新鲜培养基继续 培养。
3.感染检测：细胞感染假病毒48-72H后,通过观察检测荧光素酶的活性判 定感染效率。
4.以抑制50％的感染时血清的最大稀释倍数作为中和抗体滴度。
实验结果如下表所示，可以发现同样的血清样品，用南非株假病毒检测的中 和抗体滴度远高于HuB株假病毒检测的中和抗体滴度，表明本疫苗对南非株有更 佳的保护作用。RBDSD1-Fc比RBD-Fc的中和活性更高。
实施例七、放置稳定性
将纯化的蛋白RBD-Fc和RBDSD1-Fc放入25℃温箱，放置60天，参照实施例六 免疫小白鼠，并用南非株假病毒检测中和抗体，发现25℃温箱放置60天的RBDSD1 -Fc蛋白仍然能诱导机体产生高滴度的中和抗体，而25℃温箱放置60天的RBD-Fc 蛋白诱导机体的中和抗体滴度相对较低(结果见下表)。
由上述结果表明SD1有稳定RBDSD1-Fc蛋白结构的作用。
序列表
<110>北京康乐卫士生物技术股份有限公司
<120>一种新型冠状病毒南非突变株的重组亚单位疫苗及其应用
<160>9
<170> PatentIn Version 3.1
<210>1
<211> 714
<212>DNA
<213>新型冠状病毒南非突变株COVID-19南非突变株RBD核苷酸序列
<400> 1
atgtttgtgt tcctggtgct gctgccactg gtgtccagcc agtgtagggt ccaaccaaca 60
gagagcattg tgaggtttcc aaacatcacc aacctgtgtc catttggaga ggtgttcaat 120
gccaccaggt ttgcctctgt ctatgcctgg aacaggaaga ggattagcaa ctgtgtggct 180
gactactctg tgctctacaa ctctgcctcc ttcagcacct tcaagtgtta tggagtgagc 240
ccaaccaaac tgaatgacct gtgtttcacc aatgtctatg ctgactcctt tgtgattagg 300
ggagatgagg tgagacagat tgcccctgga caaacaggca acattgctga ctacaactac 360
aaactgcctg atgacttcac aggctgtgtg attgcctgga acagcaacaa cctggacagc 420
aaggtgggag gcaactacaa ctacctctac agactgttca ggaagagcaa cctgaaacca 480
tttgagaggg acatcagcac agagatttac caggctggca gcacaccatg taatggagtg 540
aagggcttca actgttactt tccactccaa tcctatggct tccaaccaac ctatggagtg 600
ggctaccaac catacagggt ggtggtgctg tcctttgaac tgctccatgc ccctgccaca 660
gtgtgtggac caaagaagag caccaacctg gtgaagaaca agtgtgtgaa cttc 714
<210>2
<211> 238
<212>DNA
<213>新型冠状病毒南非突变株COVID-19南非突变株RBD氨基酸序列
<400> 2
MFVFLVLLPL VSSQCRVQPT ESIVRFPNIT NLCPFGEVFN ATRFASVYAW NRKRISNCVA 60
DYSVLYNSAS FSTFKCYGVS PTKLNDLCFT NVYADSFVIR GDEVRQIAPG QTGKIADYNY 120
KLPDDFTGCV IAWNSNNLDS KVGGNYNYLY RLFRKSNLKP FERDISTEIY QAGSTPCNGV 180
EGFNCYFPLQ SYGFQPTNGV GYQPYRVVVL SFELLHAPAT VCGPKKSTNL VKNKCVNF 238
<210>3
<211> 50
<212>DNA
<213>人工序列SD1
<400>3
NFNGLTGTGV LTESNKKFLP FQQFGRDIAD TTDAVRDPQT LEILDITPCS 50
<210>4
<211> 150
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 4
aacttcaatg gactgacagg cacaggagtg ctgacagaga gcaacaagaa gttcctgcca 60
ttccaacagt ttggcaggga cattgctgac accacagatg ctgtgaggga cccacagacc 120
ttggagattc tggacatcac accatgttcc 150
<210>5
<211> 227
<212>DNA
<213>人工序列hFc
<400> 5
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 60
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK 120
GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS 180
DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK 227
<210>6
<211> 684
<212>DNA
<213>人工序列hFc
<400> 6
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660
ctctccctgt ctccgggtaa atga 684
<210>7
<211> 515
<212>DNA
<213>新型冠状病毒南非突变株COVID-19南非突变株RBD-SD1-hFc
<400>7
MFVFLVLLPL VSSQCRVQPT ESIVRFPNIT NLCPFGEVFN ATRFASVYAW NRKRISNCVA 60
DYSVLYNSAS FSTFKCYGVS PTKLNDLCFT NVYADSFVIR GDEVRQIAPG QTGKIADYNY 120
KLPDDFTGCV IAWNSNNLDS KVGGNYNYLY RLFRKSNLKP FERDISTEIY QAGSTPCNGV 180
EGFNCYFPLQ SYGFQPTNGV GYQPYRVVVL SFELLHAPAT VCGPKKSTNL VKNKCVNFNF 240
NGLTGTGVLT ESNKKFLPFQ QFGRDIADTT DAVRDPQTLE ILDITPCSDK THTCPPCPAP 300
ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR 360
EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP 420
PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV 480
DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK 515
<210>8
<211> 1503
<212>DNA
<213>人工序列RBDSD1-hFc
<400> 8
agggtccaac caacagagag cattgtgagg tttccaaaca tcaccaacct gtgtccattt 60
ggagaggtgt tcaatgccac caggtttgcc tctgtctatg cctggaacag gaagaggatt 120
agcaactgtg tggctgacta ctctgtgctc tacaactctg cctccttcag caccttcaag 180
tgttatggag tgagcccaac caaactgaat gacctgtgtt tcaccaatgt ctatgctgac 240
tcctttgtga ttaggggaga tgaggtgaga cagattgccc ctggacaaac aggcaacatt 300
gctgactaca actacaaact gcctgatgac ttcacaggct gtgtgattgc ctggaacagc 360
aacaacctgg acagcaaggt gggaggcaac tacaactacc tctacagact gttcaggaag 420
agcaacctga aaccatttga gagggacatc agcacagaga tttaccaggc tggcagcaca 480
ccatgtaatg gagtgaaggg cttcaactgt tactttccac tccaatccta tggcttccaa 540
ccaacctatg gagtgggcta ccaaccatac agggtggtgg tgctgtcctt tgaactgctc 600
catgcccctg ccacagtgtg tggaccaaag aagagcacca acctggtgaa gaacaagtgt 660
gtgaacttca acttcaatgg actgacaggc acaggagtgc tgacagagag caacaagaag 720
ttcctgccat tccaacagtt tggcagggac attgctgaca ccacagatgc tgtgagggac 780
ccacagacct tggagattct ggacatcaca ccatgttccg acaaaactca cacatgccca 840
ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 900
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 960
cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1020
aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1080
gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1140
ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1200
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1260
ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1320
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1380
agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1440
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1500
tga 1503
<210>9
<211> 1503
<212>DNA
<213>人工序列RBDSD1-hFc
<400> 9
ggtaccgcca ccatgtttgt gttcctggtg ctgctgccac tggtgtccag ccagtgtagg 60
gtccaaccaa cagagagcat tgtgaggttt ccaaacatca ccaacctgtg tccatttgga 120
gaggtgttca atgccaccag gtttgcctct gtctatgcct ggaacaggaa gaggattagc 180
aactgtgtgg ctgactactc tgtgctctac aactctgcct ccttcagcac cttcaagtgt 240
tatggagtga gcccaaccaa actgaatgac ctgtgtttca ccaatgtcta tgctgactcc 300
tttgtgatta ggggagatga ggtgagacag attgcccctg gacaaacagg caacattgct 360
gactacaact acaaactgcc tgatgacttc acaggctgtg tgattgcctg gaacagcaac 420
aacctggaca gcaaggtggg aggcaactac aactacctct acagactgtt caggaagagc 480
aacctgaaac catttgagag ggacatcagc acagagattt accaggctgg cagcacacca 540
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acctatggag tgggctacca accatacagg gtggtggtgc tgtcctttga actgctccat 660
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ctcgag 1566