阅读说明：本技术 低烟碱烟草植物及由其制备的烟草制品 (Low nicotine tobacco plants and tobacco products made therefrom ) 是由 A·亚当斯 M·德戈多伊·卢索 S·普拉莫德 许冬梅 于 2019-12-03 设计创作，主要内容包括：本申请提供了烟草近交植物dS1746、dS1746MS、dS1564和dS1564MS。本申请还提供了这类植物的部分和由这些部分制成的制品。本申请还包括所提供的植物的后代,包括杂交系。(The present application provides tobacco inbred plants dS1746, dS1746MS, dS1564 and dS1564 MS. Also provided are parts of such plants and articles made from these parts. Progeny of the provided plants, including hybrid lines, are also included.)

具体实施方式

实施例1：将纯合的nic1/nic2低生物碱基因座育种至TN 90背景中

品系dS1746是在两个基因座(nic1和nic2基因座)处携带纯合基因渗入的白肋烟栽培品种TN 90的回交衍生形式，所述基因渗入导致品系中生物碱含量的总体降低。为制备dS1746，选择从TN 90商业化种子批生长的单株植物，并与从LA Burley 21 USDA种质种子批生长的植物进行原始杂交，LA Burley是在nic1和nic2基因座纯合的烟草栽培品种。利用表1中所示的KASP试验，筛选多个F₁植物中nic1和nic2基因座的存在。选择单个F₁植物并在温室中与TN 90回交以产生BC₁F₁后代。筛选多个BC₁F₁后代，并鉴定nic1和nic2基因座杂合的个体植物。利用175K SNP Axiome阵列的全基因组SNP分布图用于选择具有杂合基因座和来自TN 90亲本的基因组材料的最高回收率的植物。将选择的杂合BC₁F₁植物与TN 90在温室中回交，产生BC₂F₁种子。使用该回交方法，在BC₂F₁和BC₃F₁代中鉴定具有nic1和nic2基因座的个体杂合植物。

为产生nic1和nic2基因座纯合的植物，筛选BC₃F₁后代植物的基因座，以鉴定杂合植物。对nic1和nic2基因座杂合的个体植物进行自花授粉以产生BC₃F₂种子。对多个BC₃F₂后代进行基因分型以鉴定nic1和nic2基因座纯合的个体。对nic1和nic2基因座纯合的个体植物进行自花授粉，产生BC₃F₃种子。使用这种自花授粉方法(近交)，在BC₃F₃和BC₃F₄代中选择植物，以产生品种dS1746，其nic1和nic2基因座是纯合的，并具有大于94％的源自优良栽培品种TN 90的基因组。

表1：用于nic1和nic2基因座基因分型和选择的KASP试验

实施例2：雄性不育品系的制备

为制备雄性不育(MS)品系，选择实施例1(如上所述)中制备的BC₃F₄的后代植物，其nic1和nic2基因座是纯合的，并作为父本与MS TN 90杂交。BC₃F₄×MS TN 90杂交的MS F₁后代植物是雄性不育的。对nic1和nic2基因座，筛选这些MS F₁后代植物(例如，BC₄F₁ MS)。类似地，BC₃F₁与TN 90杂交，得到可育的筛选所述基因座的BC₄F₁植物。鉴定为具有所述基因座的MS F₁后代植物是随后与也具有所述基因座的可育父本BC₃F₄杂交的母本。该杂交的后代(例如MS F₂后代)是雄性不育的，且nic1和nic2基因座纯合的那些通过基因分型被鉴定并被命名为dS1746MS。为了保持雄性不育品系，用可育的dS1746植物对dS1746MS植物授粉。

实施例3：dS1746的田间测试

在2017和2018季期间，在Blackstone田间研究场所和Rangcagua的Chilean苗圃中，以随机完全区块的规划，三至四个重复，生长dS1746品系的植物，以评价熟化叶的化学性质、产量和物理质量。Blackstone的每个重复区块是一行(One-row)的地块，每个地块有25株植物。Rancagua中的每个重复区块是2行(2-row)的地块，每个地块有100株植物。植物在成熟时被茎切割，晾制熟化并由之前的USDA烟草分级评价。使用地块的重量来确定每英亩产量。在熟化后，收集从晾制熟化品种的十二株不同试验植物的顶部数的第四片叶，以从每个地块制备五十克复合叶样品。通过气相色谱法分析复合样品的烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱的百分比。生物碱测量数据以四个重复的平均值显示(表2A)。

在每个重复的5个连续植物进行农艺学测量。不包括末端植物。测量即在收获之前进行且包括：植物高度、叶数(打顶后)、叶宽和叶长(自上而下第5片叶，就在第一次收获前)和50％开花的天数(表2B-2D)。然后，将每个重复的五个连续植物的测量值平均。

表2A：dS1746和对照植物中的生物碱水平。

表2B：dS1746和对照植物的叶测量。

表2C：开花时dS1746和对照植物的叶数。

	开花天数：	种植后61天
				平均叶数量	品种
重复4	20	dS1746
				20.8	LA BU21
	18.6	TN90 LC
			重复3	21	LA BU21
	21	TN90 LC
				19.25	dS1746
重复2	19.8	TN90 LC
				20.4	dS1746
	21.2	LA BU21
			重复1	19.2	dS1746
	20	LA BU21
				18.8	TN90 LC

表2D：dS1746和对照植物的株高。

	平均株高(cm)	品种
			重复4	153.2	dS1746
	150.8	LA BU21
				150	TN90 LC
重复3	153.4	LA BU21
				154.8	TN90
	151.2	dS1746
			重复2	149.4	TN90 LC
	151.8	dS1746
				153.8	LA BU21
重复1	150.6	dS1746
				152.4	LA BU21
	149.4	TN90 LC

实施例4：将纯合的nic1/nic2低生物碱基因座育种至K326背景中

品系dS1564是近交衍生形式的烤烟栽培品种K326，其携带两个基因渗入基因座(nic1和nic2基因座)，导致植物中生物碱含量的总体降低。为制备dS1564，选择从K326的商业化种子批生长的个体植物，并与从LAFC53的USDA种质种子批生长的植物进行初始杂交，LAFC53是对于nic1和nic2基因座纯合的烟草栽培品种。筛选存在nic1和nic2基因座的多个F₁植物。选择单个F₁植物并自花授粉以产生F₂后代植物。筛选多个F₂后代植物，并鉴定nic1和nic2基因座纯合的个体植物。利用175K SNP Axiome阵列的全基因组SNP分布图被用来选择具有纯合的nic1和nic2基因座和来自K326亲本的遗传物质的最高回收率的植物。将该选择的个体自花授粉以产生F₃后代。使用该近交方法，在F₄代中鉴定nic1和nic2基因座纯合的个体植物，以产生nic1和nic2基因座纯合的F₅种子(命名为品系dS1564)，且其具有大于42％的源自优良栽培品种K326的遗传物质。还开发了品系dS1564的雄性不育形式(命名为“dS1564MS”)。

实施例5：dS1564的田间测试

在2017和2018季期间，在Blackstone田间研究场所和Rangcagua的Chilean苗圃中，以随机完全区块规划，以三至四个重复，生长来自dS1564品系的植物，以评价熟化叶的化学性质、产量和物理质量。Blackstone中的每个重复的区块是一行的地块，每个地块有25株植物。Rancagua中的每个重复的区块是2行的地块，每个地块有100株植物。植物在成熟时被茎切割，熟化并由之前的USDA烟草分级评价。烤烟品种被预处理(primed)并用烤烟房进行熟化。架子完全且均匀地填充(每个架子大约45-50KG的绿色烟草)。使用地块的重量来确定每英亩产量。在熟化后，收集来自每个重复的每个地块的烤烟品种的第三次预处理的十二片随机叶片，以制备来自每个地块的五十克复合叶片样品。通过气相色谱法分析复合样品的烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱的百分比。生物碱测量数据以四个重复的平均值显示(表3A)。

每个重复的5个连续植物进行农艺学测量。不包括末端植物。测量即在收获之前进行，包括：植物高度、叶数(打顶后)、叶宽和叶长(自上而下第5片叶，就在第一次收获前)和开花至50％的天数(表3B-3D)。然后将每个重复的五个连续植物的测量值平均。

表3A：dS1564和对照植物中的生物碱水平。

表3B：dS1564和对照植物的叶测量。

表3B：开花时dS1564和对照植物的叶数。

表3D：dS1564和对照植物的株高。

	平均株高(cm)	品种
			重复4	150.4	K326
	151.6	dS1564
				148.2	LA FC53
重复3	148.2	LA FC53
				148.2	K326
	146.8	dS1564
			重复2	147.8	LA FC53
	148	dS1564
				148	K326
重复1	141.4	dS1564
				147.6	K326
	156.4	LA FC53

保藏信息

上文公开的和所附权利要求中列举的专有近交植物品系已经保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard,Manassas,VA 20110。dS1746和dS1564的保藏日期为2018年10月9日。dS1746MS和dS1564MS的保藏日期为2019年11月22日。在本申请提交日之前，从所保存的相同保藏中进行每个品种2500个种子的保藏。在专利颁发后，对保藏的所有限制将不可逆地去除，且保藏旨在满足37C.F.R.§1.801-1.809的所有要求。ATCC已经发布了下列保藏号：dS1746的ATCC保藏号PTA-125409，dS1746MS的ATCC保藏号PTA-126414，dS1564的ATCC保藏号PTA-125408，和dS1564MS的ATCC保藏号PTA-126413。这些保藏将在保藏机构保持30年的时间，或在最后一次请求后5年，或在专利的有效时期内，以较长者为准，并将在该期间根据需要替换。申请人不放弃任何侵犯本专利或植物品种保护法案(7 U.S.C.2321等)下授予的权利的行为。

PCT/RO/134表