枯草芽孢杆菌株、菌剂、表面活性剂、其制备方法及应用
阅读说明：本技术 枯草芽孢杆菌株、菌剂、表面活性剂、其制备方法及应用 (Bacillus subtilis strain, microbial inoculum, surfactant, preparation method and application thereof ) 是由 翟怀建 任洪达 董景锋 潘竟军 王斌 邬国栋 王佳 张敬春 罗腾 孙锡泽 于 2021-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种枯草芽孢杆菌株、菌剂、表面活性剂、其制备方法及应用。枯草芽孢杆菌株的拉丁学名为Bacillus subtilis,保藏编号为CGMCC No.19809。在微生物降粘过程中,上述微生物能够分泌出降粘生物表面活性剂。该生物表面活性剂能够大幅降低稠油的粘度(比如可使黏度为4400mPa·s稠油降至185mPa·s,降黏率达到95.8％),这能够解决地下稠油难以流动储层压裂改造后产量低及地面稠油管输、处理困难等难题,具有良好的工业应用价值。(The invention provides a bacillus subtilis strain, a microbial inoculum, a surfactant, a preparation method and application thereof. The Latin chemical name of the Bacillus subtilis strain is Bacillus subtilis, and the preservation number is CGMCC No. 19809. During the viscosity reduction process of the microorganism, the microorganism can secrete the viscosity reduction biosurfactant. The biosurfactant can greatly reduce the viscosity of thick oil (for example, the viscosity of the thick oil is 4400mPa & s to 185mPa & s, and the viscosity reduction rate reaches 95.8%), can solve the problems of low yield, difficult pipeline transportation and treatment of ground thick oil and the like after fracturing modification of an underground thick oil reservoir which is difficult to flow, and has good industrial application value.)
技术领域
本发明涉及石油开采领域，具体而言，涉及一种枯草芽孢杆菌株、菌剂、表面活性剂、其制备方法及应用。
背景技术
稠油是一种多烃类混合物，其组成复杂，具有胶质和沥青质含量高，黏度高，密度大和流动性差等特点。稠油的高黏特点严重制约着稠油的开采，稠油降黏成为提高稠油井产量、提高经济效益的关键技术。目前，国内外常用稠油采油方法包括热采法、掺稀油降黏、催化降黏、化学降黏和微生物降黏法等。
微生物降黏法是指微生物利用石油中的碳源为唯一营养物质进行生长繁殖代谢，产生有机酸和表面活性剂并降解长链烃类物质，使稠油黏度大幅下降，促进石油在砂岩基质向井底流动，达到提高油井产量的目的。微生物产生的生物表面活性剂是微生物在代谢过程中分泌出的一类含有亲水基团(如氨基酸或多肽、二糖、寡糖或多糖等)和亲脂基团(如饱和或非饱和的脂肪醇或脂肪酸等)的两亲化合物，具有优异的稠油降黏、驱油性能。与其它技术相比，微生物降黏采油技术具有适用范围广、工艺简单、无污染、成本低等优点，具有良好的发展前景，而如何筛选及培养出能适应油藏地下环境的强降黏能力的微生物菌株已成为微生物降黏采油技术的核心技术。
现有文献提供了一种生产生物表面活性剂的双头菌菌株，该菌株分离自延长油田坪桥区块的油水样中，经16SrDNA序列鉴定属于双头菌属(Labrys sp.)，保藏编号CGMCCNo.16012。该菌株在以原油(或菜油)50g/L，(NH4)2SO4 10.0g/L，KCl 1.1g/L，NaCl 1.1g/L，MgSO4 0.5g/L，KH2PO4 3.4g/L，K2HPO4 4.4g/L，酵母粉0.5g/L的培养基中于30℃、160rpm恒温振荡培养5d后可使培养基的表面张力由初始的71.2mN/m降至32.1mN/m，其产生的表活剂属于糖脂类生物表面活性剂。该申请中的双头菌菌株可产生使培养基的表面张力由初始的71.2mN/m降至32.1mN/m的生物表面活性剂(下降54.92％)，但是该生物表面活性剂未表明对稠油的降黏作用及降黏效果。
另一篇现有文献提供了一种枯草芽孢杆菌，并将其应用在稠油中时，稠油的粘度下降率仅为50％。降粘率较低导致该方法在采油率的提升上的效果不高。
鉴于上述问题的存在，有必有研发一种能够大幅提高稠油降粘效果的微生物降粘法。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种枯草芽孢杆菌株、菌剂、表面活性剂、其制备方法及应用，以解决现有的微生物菌株在稠油降粘领域中的效果不明显或效果较差的问题。
为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种枯草芽孢杆菌株，枯草芽孢杆菌株的拉丁学名为Bacillus subtilis，保藏编号为CGMCC No.19809。
本申请的第二方面还提供了一种菌剂，该菌剂包括上述枯草芽孢杆菌株。
本申请的第三方面还提供了一种表面活性剂的制备方法，表面活性剂的制备方法包括：采用本申请提供的枯草芽孢杆菌株或本申请提供的菌剂进行液态发酵，得到表面活性剂。
进一步地，液态发酵过程的温度为40～65℃。
进一步地，液态发酵过程的温度为50～60℃。
进一步地，液态发酵过程中，溶氧量为4.0～8.5mg/L，采用的液态培养基包括葡萄糖8～12g/L，NH4Cl 0.5～1.5g/L，K2HPO4·12H2O 1.5～3.0g/L，KH2PO4 0.25～0.5g/L，NaCl5～10g/L，FeSO4·7H2O 0.010～0.015g/L，MnSO40.0025～0.005g/L，CuSO4·5H2O 0.0025～0.005g/L，pH 6.5～7.0。
进一步地，在发酵过程之后，表面活性剂的制备方法还包括：对发酵过程的产物进行第一次固液分离，得到第一清液；将第一清液的pH调至2～3，然后进行第二次固液分离，得到第二沉淀相；提纯第二沉淀相，得到表面活性剂。
本申请第四方面还提供了一种表面活性剂，该表面活性剂采用本申请提供的表面活性剂的制备方法制得。
本申请第五方面还提供了一种稠油降粘组合物，稠油降粘组合物包括上述表面活性剂。
本申请第六方面还提供了一种上述表面活性剂或上述稠油降粘组合物在石油开采领域中的应用。
应用本发明的技术方案，在微生物降粘过程中，上述微生物能够分泌出降粘生物表面活性剂。该生物表面活性剂能够大幅降低稠油的粘度(比如可使黏度为4400mPa·s稠油降至185mPa·s，降黏率达到95.8％)，这能够解决地下稠油难以流动储层压裂改造后产量低及地面稠油管输、处理困难等难题，具有良好的工业应用价值。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为对实施例中获得的微生物进行扫描电镜测试获得的电镜图；
图2为使用革兰氏染色鉴别细菌法进行鉴定的测试结果。
图3为根据16S rRNA基因测序结果进行系统进化分析获得的系统进化树。
本发明菌株的保藏信息
一种枯草芽孢杆菌株，该枯草芽孢杆菌株的拉丁学名为Bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰路1号院3号，保藏日期为2020年5月12日，保藏编号为CGMCC No.19809。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
正如背景技术所描述的，现有的微生物菌株在稠油降粘领域中的效果不明显或效果较差的问题。为了解决上述技术问题，本申请提供了一种枯草芽孢杆菌株，该枯草芽孢杆菌株的拉丁学名为Bacillus subtilis，保藏编号为CGMCC No.19809。
在微生物降粘过程中，上述微生物能够分泌出降粘生物表面活性剂。该生物表面活性剂能够大幅降低稠油的粘度(比如可使黏度为4400mPa·s稠油降至185mPa·s，降黏率达到95.8％)，这能够解决地下稠油难以流动储层压裂改造后产量低及地面稠油管输、处理困难等难题，具有良好的工业应用价值。
本申请的第二方面还提供了一种菌剂，菌剂包括本申请提供的枯草芽孢杆菌株。
由于上述枯草芽孢杆菌株分泌出的降粘生物表面活性剂能够大幅降低稠油的粘度，因而含有上述枯草芽孢杆菌株的菌剂也能够实现上述效果。
本申请的第三方面还提供了一种表面活性剂的制备方法，该表面活性剂的制备方法包括：采用本申请提供的枯草芽孢杆菌株或菌剂进行液态发酵，得到表面活性剂。
可以通过常规的发酵方法进行发酵使上述枯草芽孢杆菌株进行发酵，并分泌出所需的降粘表面活性剂。为了提高降粘表面活性剂的产率，优选地，液态发酵过程的温度为40～65℃，更优选为液态发酵过程的温度为50～60℃。相比于其它温度范围，将液态发酵在上述温度范围内进行有利于进一步提高枯草芽孢杆菌株的活性，从而能够分泌出更多的降粘表面活性剂。
上述枯草芽孢杆菌株属于需氧型细菌，其发酵过程需要在一定的氧气含量下进行，且还需要培养基为其提供生长所需的营养物质。在一种优选的实施例中，液态发酵过程中，溶氧量为4.0～8.5mg/L，采用的液态培养基包括葡萄糖8～12g/L，NH4Cl 0.5～1.5g/L，K2HPO4·12H2O 1.5～3.0g/L，KH2PO4 0.25～0.5g/L，NaCl 5～10g/L，FeSO4·7H2O 0.010～0.015g/L，MnSO4 0.0025～0.005g/L，CuSO4·5H2O 0.0025～0.005g/L，pH 6.5～7.0。通过调节液态发酵过程中的溶氧量同时针对该菌株配制特定组成的培养基有利于进一步提高枯草芽孢杆菌株的生长繁殖速度，从而能够分泌出更多的降粘表面活性剂。
在表面活性剂的实际制备过程中，发酵过程结束后，为了去除产物体系中的菌种和其它杂质需要对发酵后的产物体系进行后处理。在一种优选的实施例中，在发酵过程之后，表面活性剂的制备方法还包括：对发酵过程的产物进行第一次固液分离，得到第一清液；将第一清液的pH调至2，然后进行第二次固液分离，得到第二沉淀相；提纯第二沉淀相，得到表面活性剂。
对发酵过程的产物进行第一次固液分离可以去除发酵体系中的微生物菌种。为了提高微生物菌种的去除率，优选地，上述第一次固液分离过程包括：将发酵过程的产物体系先在离心装置进行离心分离处理，然后在进行固液分离。更优选地上述分离过程在4℃，10000r/min的条件下进行离心。
第二次分离过程，先将第一清液的pH调至酸性，可以大幅降低降粘表面活性剂与水的溶解度，然后通过第二次固液分离降粘表面活性剂以沉淀的形式被分离出来。优选地，上述第二次固液分离过程为离心分离处理。更优选地，上述第二次固液分离过程在4℃，10000r/min的条件下进行离心。
通过提纯过程可以进一步去除降粘表面活性剂沉淀中的杂质，上述提纯过程包括：先采用pH为2.0的盐酸对第二次固液分离过程得到的第二固相产物洗涤3次，得到第一中间产物；然后采用pH为8的碳酸钠溶液溶解上述第一中间产物，然后进行冷冻干燥，得到表面活性剂粗产物；采用pH为8的碳酸钠溶液溶解上述表面活性剂粗产物，然后进行采用氯仿和甲醇的混合溶液(体积比为1:3)进行萃取，去除剩余的蛋白质及无机盐，最后再次进行真空冷冻干燥，得到纯化后的表面活性剂。
本申请的第四方面还提供了一种表面活性剂，该表面活性剂采用本申请提供的上述制备方法制得。
采用上述方法制得的生物表面活性剂能够大幅降低稠油的粘度，解决地下稠油难以流动储层压裂改造后产量低及地面稠油管输、处理困难等难题，具有良好的工业应用价值。
本申请的第五方面还提供了一种稠油降粘组合物，该稠油降粘组合物包括本申请提供的表面活性剂。
由于加入了本申请制得的具有优异降粘效果的表面活性剂，因而上述稠油降粘组合物也具有优异的稠油降粘性能。因而本申请提供的表面活性剂和稠油降粘组合物非常适合应用于石油开采领域中。
以下结合具体实施例对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
菌株筛选及鉴定
菌种来源为新疆稠油油样。
配制富集培养基：葡萄糖30g/L，NH4Cl 6g/L，K2HPO4·12H2O 6g/L，KH2PO4 3g/L，CaCl20.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4 0.002g/L，CuSO4·5H2O0.002g/L，pH 7.0。按1：50的体积比将采集获得的稠油样品加入到上述富集培养基中，在35℃、150rpm的恒温摇床上培养5d。
利用稀释涂平板的方法分离获得纯菌株。具体方法如下：
(1)稀释操作：将分别盛有900μL无菌水的7支1mL离心管灭菌，并按1到7的顺序进行编号。用移液枪吸取100μL菌液，注入1号离心管中。从1号离心管中吸取100μL稀释液，注入2号离心管中，重复第二步的混匀操作。以此类推，直到完成最后一支离心管的稀释。
(2)涂布操作：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s。取少量菌液(不超过100μL)滴加到培养基表面，用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面，涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。
以培养基中生长出菌落数、菌落种数来判断，优势菌种为培养基生长出的菌落中菌落数较多或菌落体积占比较大的菌落的菌种。根据稀释涂布结果，初步获得4株纯种微生物，其中1株具有优势性能，命名为XJ-021。
经扫描电镜观察上述菌株的形态外观，如图1所示，其形态为杆菌，大小为(0.5～0.6)μm×(2～3)μm，无荚膜，周生鞭毛，可运动，初步鉴定为杆菌属。使用革兰氏染色鉴别细菌法进行鉴定，如图2所示，该结果显示菌株XJ-21为革兰氏阳性杆菌。
对XJ-021菌株进行16S rRNA基因序列分析，并根据16S rRNA基因测序结果进行系统进化分析，系统进化树见图3(其中的标尺0.01，表示基因组的遗传变异度为0.01)。分析结果显示菌株XJ-021与Bacillus subtilis NBRC101239的同源性最高。因而结合菌体形态观察和生理生化特征，鉴定为芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌。
降粘实施例
实施例1至5中将上述筛选出的菌种依次在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃下进行液态发酵制备表面活性剂，其中，溶氧量为7.5mg/L，液态培养基包括：葡萄糖12g/L，NH4Cl 1.5g/L，K2HPO4·12H2O 3.0g/L，KH2PO4 0.5g/L，NaCl 10g/L，FeSO4·7H2O 0.015g/L，MnSO4 0.005g/L，CuSO4·5H2O 0.005g/L，pH 6.5。
发酵36h后，取发酵液的上清液1L装入离心管中，在4℃下，以10000r/min速率离心20min，去除菌体，得到第一清液。
使用6mol/L HCl将上述第一清液的pH值调至2.0，在4℃下，静置10h，然后以10000r/min速率离心20min后收集沉淀，得到第二固相产物。
使用pH为2.0的HCl洗涤上述第二固相产物3次，再用pH为8的Na2CO3溶解，真空冷冻干燥即获得菌株产生的生物表面活性剂粗产物。
使用pH为8的Na2CO3溶液溶解上述粗产物，再使用体积比为3:1的氯仿和甲醇混合液进行萃取，去除剩余的蛋白质及无机盐离子，经真空冷冻干燥后得到的白色粉末即为纯化后的生物表面活性剂。实施例1至5中表面活性剂的产量依次为1.149g/L、1.207g/L、1.154g/L、1.173g/L、1.183g/L。因而实验结果表明55℃时达到最大产量，为1.296g/L。
乳化性能测试：取煤油和液体石蜡各5mL，分别加入5mL 1wt％的生物表面活性剂溶液，漩涡振荡器震荡1min，混匀后静置1h后，煤油乳化层高度为5.8cm，煤油乳化层高度为5.5cm。这表明生物表面活性剂乳化性能较好。
稠油降粘测试：取30mL 0.1wt％的生物表面活性剂溶液，加入70g脱水稠油，根据标准SY/T 0520-2008《原油粘度测定旋转粘度计平衡法》测定稠油粘度变化，稠油表观黏度由4400mPa·s降至185mPa·s，降黏率达到95.8％。
实施例6
与实施例1的区别为：液态发酵过程的温度为30℃。
表面活性剂的产量为1.008g/L。
实施例7
与实施例1的区别为：液态发酵过程的温度为75℃。
表面活性剂的产量为0.974g/L。
实施例8
与实施例1的区别为：溶氧量为4mg/L，液态培养基包括葡萄糖8g/L，NH4Cl 0.5g/L，K2HPO4·12H2O 1.5g/L，KH2PO4 0.25g/L，NaCl 5g/L，FeSO4·7H2O 0.010g/L，MnSO40.0025g/L，CuSO4·5H2O 0.0025g/L，pH 6.5。
表面活性剂的产量为1.074g/L。
实施例9
与实施例1的区别为：溶氧量为8.5mg/L，液态培养基包括葡萄糖12g/L，NH4Cl1.5g/L，K2HPO4·12H2O 3.0g/L，KH2PO4 0.5g/L，NaCl 10g/L，FeSO4·7H2O 0.015g/L，MnSO40.005g/L，CuSO4·5H2O 0.005g/L，pH 7.0。
表面活性剂的产量为1.032g/L。
实施例10
与实施例1的区别为：溶氧量为2mg/L，液态培养基包括葡萄糖13g/L，NH4Cl 2.0g/L，K2HPO4·12H2O 3.5g/L，KH2PO4 0.75g/L，NaCl 11g/L，FeSO4·7H2O 0.020g/L，MnSO40.007g/L，CuSO4·5H2O 0.007g/L，pH 7.5。
表面活性剂的产量为0.714g/L。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：
在微生物降粘过程中，上述微生物能够分泌出降粘生物表面活性剂。该生物表面活性剂能够大幅降低稠油的粘度(比如可使黏度为4400mPa·s稠油降至185mPa·s，降黏率达到95.8％)，这能够解决地下稠油难以流动储层压裂改造后产量低及地面稠油管输、处理困难等难题，具有良好的工业应用价值。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的术语在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施方式例如能够以除了在这里描述的那些以外的顺序实施。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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