具体实施方式

本发明提供了一种胁迫条件下鱼饲喂条件的筛选方法，包括以下步骤：

将规格相同的鱼随机分成若干处理组，每组分别按不同的饲喂条件饲喂，在相同胁迫条件下分别培养30～50天；

培养结束后，每组分别随机取3～4尾鱼进行肝脏氧化能力、血清生化参数和肠道消化酶指标的测定，并计算IBR指数；

S_n+1＝S₁，式III；

S＝Z+|Min|， 式Ⅳ；

Y＝(X-m)/s， 式Ⅴ；

式Ⅰ和式II中的A_i为Si和S_i+1以及星状图半径相连形成的图形的面积；式Ⅰ和式III中的n为测得指标的个数；

式II和式III中的S_i和S_i+1分别代表星状图顺时针方向的不同指标的两个连续得分；其中S_i和S_i+1根据式Ⅳ计算得到；

式Ⅳ中的S为每个指标的得分，Z为每个指标根据式Ⅴ处理后的值，其中当指标的反应为受到活化时，Z＝Y；当指标的反应为受到抑制时，Z＝-Y；Min为每个指标的所有测定的Y值的最小值；

式Ⅴ中的X为每组中的每个指标的随机取样测定值的平均值，其中m是每一个指标所有处理组的总体平均值；s为每一个指标所有处理组的标准偏差；

根据计算结果判断，选择IBR指数最小的饲喂条件为耐胁迫的饲喂条件。

在本发明中，所述肝脏抗氧化能力指标优选包括总超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性和丙二醛含量；

所述血清生化参数指标优选包括葡萄糖水平、丙氨酸氨基转移活性、碱性磷酸酶活性、天门冬氨酸氨基转移酶活性、总胆固醇含量、甘油三酯含量和总蛋白含量；

所述肠道消化酶活性指标优选包括胰蛋白酶活性、脂肪酶活性和淀粉酶活性。

在本发明中，所述胁迫条件优选包括高温胁迫；所述高温胁迫的温度为 28～35℃，优选为29～31℃。

在本发明中，所述饲喂条件优选包括每天连续饲喂组，间隔一天饲喂组、间隔两天饲喂组和间隔四天饲喂组；本发明所述饲喂条件的选择为排除其他变量的干扰，优选确定一种变量进行筛选，确定其最优饲喂条件。

本发明利用鱼类普遍具有补偿生长现象的特点，设计合理的间歇性饲喂模式，并通过测定鲤鱼的生长性能指标、肝脏抗氧化能力指标、血清生化参数指标以及肠道消化酶指标，结合整合生物标志物(IBR)指数值，选择其中具有显著性差异的指标作为评价鲤鱼耐高温性能的技术指标，从而确定了高温胁迫下对鲤鱼最佳的饲喂方法。

本发明提供了一种高温胁迫下鲤科鱼类的饲喂方法，包括：在高温胁迫下，每隔两天饱食饲喂一次饲料；所述高温胁迫的温度为28～35℃。

在本发明中，所述高温胁迫的温度优选为29～31℃，所述鲤科鱼类优选包括鲤鱼；所述饱食饲喂的饲料与鲤科鱼类的重量比优选为(3～5):100；所述饲料包括通威集团有限公司的通威103池塘养鱼配合饲料；所述饱食饲喂的方法优选包括两次饲喂；所述饱食饲喂的时间优选包括：上午9点～上午11点和下午1 点～下午3点。

本发明提供的方法通过实施适宜的间歇性饥饿胁迫，激发鱼类的补偿生长潜能，其摄食速度和饵料利用效率均一定程度上得到提高，鱼体的生长速度加快，为夏季持续高温条件下饲喂鲤鱼提供了技术支持。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种胁迫条件下鱼饲喂条件的筛选方法和一种高温胁迫下鲤科鱼类的饲喂方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种高温胁迫下鲤科鱼类的饲喂方法的筛选过程，由以下步骤组成：

(1)暂养鲤鱼：选取规格体重约25.30±1.27g的鲤鱼120尾，随机分为四组，分别为以每天连续饲喂商业饵料为对照组(T0)，间隔一天饲喂商业饵料 (T1)、间隔两天饲喂商业饵料(T2)和间隔四天饲喂商业饵料(T3)，所述商业饵料为通威集团有限公司的通威103池塘养鱼配合饲料，每组30尾，每组做三个平行，每个平行10尾鲤鱼，转移到12只单个体积为60cm×60cm×60cm (水体为120L)的塑料循环水水族箱，采用循环水养殖系统进行饲养；两天的暂养期间，每只箱的循环水量为1.0L/min，自然光照，水温为25.00±1.00℃，溶解氧≥5.5mg L^-1，pH为7.5±0.2；温度条件由电热加温棒加热循环水及双制式空调调节室温共同控制；

(2)试验处理：高温胁迫试验期间，水温有电热加热棒升到30℃，其他水质条件不变，试验周期为40天；采用两次饱食投喂方式，所述饱食饲喂的饲料与鲤鱼的重量比为4:100；所述饱食饲喂的时间为上午8点和下午2点，投喂后半小时收集残饵；

(3)采集样本：试验结束后，样本采集前24小时停止饲喂并对每个水箱中的鲤鱼进行计数和称量；在取样时，鲤鱼用渔用麻醉剂进行麻醉，用含75wt.％酒精的卫生棉条对鱼的皮肤进行消毒；每组各个平行随机取3尾鲤鱼进行取样操作；用2mL注射器刺穿尾静脉采集鲤鱼血样，存储在1.5mL离心管中，并在 4℃条件下以7000rpm离心10分钟，收集血清并将其储存在-80℃冰箱中下直至生化分析试验；从鱼腹腔解剖取肝脏和，液氮速冻，-80℃冰箱保存，分析抗氧化能力参数；取鲤鱼中肠，取出约2cm的肠段放入液氮中，然后置于-80℃冰箱下进行后续的消化酶活性分析；

(4)样本处理：把鲤鱼肝脏和肠道组织在4℃条件下解冻，样本用0.9wt.％无菌生理盐水(组织重量，g):v(生理盐水体积，mL)以10％的比例匀浆；在 4℃，3500rpm的条件下离心10分钟，取上清液用于测定鲤鱼肝脏和肠道的理化指标；

(5)技术指标：鲤鱼的理化指标包括生长性能指标、肝脏抗氧化能力指标、血清生化参数指标以及肠道消化酶指标；生长性能指标为增重率(WG)、特定增重率(SGR)、饵料系数(FCR)和摄食率(FR)；抗氧化能力指标为总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-PX)活性和丙二醛(MDA)含量；血清生化参数指标为葡萄糖(Glu) 水平、丙氨酸氨基转移(ALT)活性、碱性磷酸酶(ALP)活性、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性、总胆固醇(TC)含量、甘油三酯(TG)含量和总蛋白 (TP)含量；肠道消化酶活性指标为胰蛋白酶(TRY)活性、脂肪酶(LPS)活性和淀粉酶(AMS)活性；

生长性能指标计算公式如下：

增重率WG(％)＝(末体重–初体重)/初体重×100％

特定生长率SGR(％·day^-1)＝[ln(末体重)–ln(初体重)]/天数×100％

饵料系数FCR(％)＝总摄食量/(末体重–初体重)×100％

摄食率FR(％)＝总摄食量/(天数×(末体重+初体重)/2)×100％

抗氧化能力指标(T-SOD活性、CAT活性、GSH-PX活性和MDA含量)、血清生化参数(Glu含量、ALT活性、ALP活性、AST活性、TC含量、TG含量和TP含量)和肠道消化酶活性指标(TRY活性、LPS活性和AMS活性)按南京建成生物工程研究所测定试剂盒说明书进行测定；

生长性能计算结果见表1；肝脏抗氧化能力指标见结果表2；血清生化参数指标结果见表3；肠道消化酶活性指标见结果表4；

表1高温胁迫下不同饲喂方法对鲤鱼生长性能的影响

注：Duncan’s法多重比较，数据上标不同字母表示各组间存在显著性差异 (P<0.05)；

表2高温胁迫下不同饲喂方法对鲤鱼肝脏抗氧化能力的影响

注：Duncan’s法多重比较，数据上标不同字母表示各组间存在显著性差异 (P<0.05)；

表3高温胁迫下不同饲喂方法对鲤鱼血清生化参数的影响

注：Duncan’s法多重比较，数据上标不同字母表示各组间存在显著性差异 (P<0.05)；

表4高温胁迫下不同饲喂方法对鲤鱼肠道消化酶活性的影响

注：Duncan’s法多重比较，数据上标不同字母表示各组间存在显著性差异 (P<0.05)；

(6)整合生物标志物响应分析(Integreted Biomarker Responses，IBR)：将肝脏氧化能力指标、血清生化参数指标以及肠道消化酶指标作为生物标志物组合起来进行综合分析，计算IBR指数；

IBR指数的计算步骤采用以下方法：计算每个处理组，三次重复样的平均值 X；

数据标准化：对X进行处理，可以得到Y，Y＝(X-m)/s，其中m是每一个生物指标所有处理组的总体平均值；s为每一个生物指标所有处理组的标准偏差；当生物指标的反应为受到活化时，Z＝Y；当生物指标的反应为受到抑制时，Z＝-Y；找出每一个生物指标的所有处理组的Y值最小值，记为Min；将Min绝对值处理后，与Z相加，得到得分S，S＝Z+|Min|，S≥0；

在星状图中标出各生物指标处理后的数据，作为每个处理组的一个生物指标的得分S；S_i和S_i+1分别代表星状图顺时针方向的两个连续得分，n为半径的数目，即测得生物指标的个数；A_i为Si和S_i+1以及星状图半径相连形成的图形的面积：

S_n+1＝S₁，式III；

注：S_i和S_i+1都为0时，β无法计算，A_i设为0；

(7)数据处理：通过IBM SPSS 25.0统计软件进行数据分析，鲤鱼的理化指标数据用平均值±标准误(Mean±SE)来表示；用单因素方差分析(One-way ANOVA)分析和Duncan’s法多重比较对所得数据进行分析处理；技术指标差异显著的判断规则是P<0.05表示显著性差异。

由表1可知，在间隔两天饲喂组(T2)中增重率、特定增重率和饵料系数显著高于其他组(P<0.05)，在对照组(T0)和间隔一天组(T1)中摄食率显著高于其他组(P<0.05)；

由表2可知，在间隔两天饲喂组(T2)中有高的T-SOD活性；各组间CAT 活性无显著性差异(P>0.05)；在间隔两天组(T2)中有低的GSH-PX活性；在对照组(T0)中MDA含量最低；

由表3可知，在间隔两天饲喂组(T2)中有最高的GLU含量(P<0.05)；在间隔一天饲喂组(T1)中有最高的ALT活性；在对照组中(T0)中有最低的 ALP活性和AST活性；TC含量在各组间无显著性差异(P>0.05)；在对照组 (T0)中有高的TG和TP含量；

由表4可知，在间隔两天饲喂组(T2)中有最高的TRY活性；在对照组(T0) 中有最低的LPS活性；在间隔一天组(T1)中有最高的AMS活性；

由图1可知，在间隔两天饲喂组(T2)中有最低的IBR指数值，即T2组具有最低的环境胁迫压力指数。

综上所述，在高温胁迫下，在间隔两天饲喂组(T2)中鲤鱼有最佳的生长性能和消化酶活性；本发明通过实施间歇性饥饿胁迫，激发鱼类的补偿生长潜能，其摄食速度和饵料利用效率均一定程度上得到提高，鱼体的生长速度加快，进一步加深在夏季持续高温条件下对于鲤鱼饲喂策略的科学认识。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。