一种预防或治疗ii型糖尿病的微生物组合物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种预防或治疗ii型糖尿病的微生物组合物及其制备方法和应用 (Microbial composition for preventing or treating type II diabetes and preparation method and application thereof ) 是由 方曙光 盖忠辉 朱建国 王艳丽 于 2021-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种预防或治疗II型糖尿病的微生物组合物及其制备方法和应用,所述预防或治疗II型糖尿病的微生物组合物包括长双歧杆菌BL21菌株和鼠李糖乳杆菌LRa05菌株。该微生物组合物能够显著降低II型糖尿病患者的体重；显著降低II型糖尿病患者血清中ALT、AST等的水平；降低血清炎症因子TNF-ɑ、IL-1β等的水平；显著降低升高的空腹血糖水平和口服葡萄糖耐量试验中的曲线下面积；显著降低2.5h时的血浆DX-4000-FITC水平；显著降低血浆LPS水平。因此,该微生物组合物在制备预防、治疗、缓解II型糖尿病的药物、食品或保健品中,具有很大的应用前景。(The invention relates to a microbial composition for preventing or treating type II diabetes, and a preparation method and application thereof, wherein the microbial composition for preventing or treating type II diabetes comprises a bifidobacterium longum BL21 strain and a lactobacillus rhamnosus LRa05 strain. The microbial composition can remarkably reduce the weight of a type II diabetes patient; the level of ALT, AST and the like in the serum of a type II diabetes patient is obviously reduced; reducing the levels of serum inflammatory factors TNF-alpha, IL-1 beta and the like; significantly reducing elevated fasting glucose levels and area under the curve in an oral glucose tolerance test; the plasma DX-4000-FITC level at 2.5h is obviously reduced; significantly reduced plasma LPS levels. Therefore, the microbial composition has a great application prospect in preparing medicines, foods or health products for preventing, treating and relieving type II diabetes.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种微生物组合物及其制备方法和应用，尤其涉及一种预防或治疗II型糖尿病的微生物组合物及其制备方法和应用。
背景技术
II型糖尿病是最常见的糖尿病类型，约占所有糖尿病病例的90％。在II型糖尿病中，高血糖症是由于胰岛素分泌不足以及人体无法对胰岛素进行充分反应而导致的，定义为胰岛素抵抗。在胰岛素抵抗状态期间，胰岛素作用不良，因此最初会促使胰岛素分泌增加，以减少血糖水平的增加，但随着时间的推移，胰岛素分泌相对不足的状况可能会继续发展。
II型糖尿病发病通常比较缓慢，并且通常表现不像Ⅰ型糖尿病，不会出现急性代谢紊乱，这意味着难以确定真正的发病时间。因此通常需要很长时间才能发现，而且人群中有多达三分之一到二分之一的II型糖尿病病例可能未确诊，因为他们可能很多年都保持没有症状。当长时间无法识别时，可能会出现慢性高血糖症并发症。某些II型糖尿病患者首次被诊断出患有此病是因为他们出现高血糖症导致的并发症(如足部溃疡、视力变化、肾功能衰竭或感染)。
II型糖尿病在老年人中最为常见，但由于肥胖水平上升、缺乏运动和饮食不当，在儿童、青少年和年轻人中也越来越多。在全球范围内，II型糖尿病的患病率一直很高，并且在全球所有地区都呈上升趋势。人口老龄化、经济发展和日益城市化导致更多久坐不动的生活方式和更多与肥胖有关的不健康食品食用，从而会加剧这种上升趋势。
目前，治疗糖尿病的降血糖药物主要有：双胍类药物、磺脲类药物、噻唑烷二酮类药物、格列奈类药物、α-糖苷酶抑制剂、二肽基肽酶-4抑制剂。但是，这些药物并不能从根本上治愈糖尿病，与此同时，各种治疗药物均有其不良反应：如低血糖事件和体重增加(如：胰岛素和胰岛素促分泌剂等)，胃肠道反应(如：双胍类药物、糖苷酶抑制剂和GLP-1受体激动剂等)，体重增加、水肿或不良心脏事件(如：噻唑烷二酮类药物TZDs)等等。另外，长期服用二甲双胍会引起刺激一些患者的胃肠道造成不适并且可能会影响患者对维生素B12的吸收，罗格列酮会引起肝功能损伤及水肿等。结果患者出现病情的耐受性，使得只有在服用大量剂量的降糖药才能有效地降低血糖的效果，然而长期使用胰岛素也会使患者产生对药物产生依赖性，依然是治标不治本，患者的血糖难以得到有效控制，容易出现反复。
因此，开发更多的能够有效预防或治疗II型糖尿病的治疗策略是很有必要的，使用药物治疗糖尿病并不排除用于抗击这种疾病的其他措施的重要性。最近的研究表明，肠道菌群失调造成内毒素入血所致的慢性炎症，是肥胖、糖尿病等代谢性疾病发展的重要因素之一。菌群紊乱失衡可引发全身慢性反应炎症，从而导致胰岛β细胞损伤和胰岛素抵抗下降，同时影响体内其他细胞对糖分的吸收用以转化能量，造成人体机能难以正常运转，最后引发一系列并发症。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种微生物组合物及其制备方法和应用，尤其提供一种预防或治疗II型糖尿病的微生物组合物及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种预防或治疗II型糖尿病的微生物组合物，所述预防或治疗II型糖尿病的微生物组合物包括双歧杆菌和乳杆菌；
所述双歧杆菌命名为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)BL21菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2015年1月27日，保藏编号为CGMCC 10452，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
所述乳杆菌命名为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRa05菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2020年7月20日，保藏编号为CGMCC 1.12734，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明创造性地开发了一种新的预防或治疗II型糖尿病的策略，即将长双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌组成微生物组合物，其中长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)是一种益生菌，因此，本发明所涉及的长双歧杆菌BL21对人体而言，相对健康，且不易产生不良反应；鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)也是益生菌的一种，因此，本发明所涉及的鼠李糖乳杆菌LRa05对人体而言，健康且无毒副作用。
研究表明，该微生物组合物能够显著降低II型糖尿病患者的体重；显著降低II型糖尿病患者血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)的水平；降低血清炎症因子TNF-ɑ、IL-1β、IL-6、IL-23、IP-10、OX-40的水平；显著降低升高的空腹血糖水平和口服葡萄糖耐量试验中的曲线下面积；显著降低2.5h时的血浆DX-4000-FITC水平；显著降低血浆LPS水平。因此，该微生物组合物在制备预防、治疗、缓解II型糖尿病的药物、食品或保健品中，具有很大的应用前景。
优选地，所述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)BL21菌株或鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRa05菌株在所述微生物组合物中的活菌数均不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g，例如1×106CFU/mL(CFU/g)、2×106CFU/mL(CFU/g)、3×106CFU/mL(CFU/g)、5×106CFU/mL(CFU/g)、7×106CFU/mL(CFU/g)、8×106CFU/mL(CFU/g)、1×107CFU/mL(CFU/g)、5×107CFU/mL(CFU/g)、1×108CFU/mL(CFU/g)等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)BL21菌株与鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRa05菌株的活菌数之比为1:(0.5-2)，例如1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.4、1:1.5、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的预防或治疗II型糖尿病的微生物组合物的制备方法，所述制备方法包括：
将BL21菌株和LRa05菌株分别接种于培养基中进行培养，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用冻干保护剂重悬，得到重悬液；将重悬液冻干，得到BL21冻干菌剂和LRa05冻干菌剂；将BL21冻干菌剂和LRa05冻干菌剂混合，得到所述预防或治疗II型糖尿病的微生物组合物。
本发明所涉及的微生物组合物的制备工艺简单，适合工业化大规模生产，具有显著的实用性。
优选地，所述菌株的接种质量为培养基质量的2-4％，例如2％、2.5％、3％、3.5％、4％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述培养基的配方包括：蛋白胨5-15g/L、牛肉膏5-15g/L、葡萄糖15-25g/L、乙酸钠1-3g/L、酵母粉3-7g/L、柠檬酸氢二铵1-3g/L、K2PO4·3H2O1-4g/L、MgSO4·7H2O0.05-0.15g/L、MnSO4 0.04-0.06g/L、吐温80 0.5-1.5mL/L、半胱氨酸盐酸盐0.4-0.6g/L。
优选地，所述培养在36-38℃(例如36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃等)下培养12-24h(例如12h、14h、15h、17h、18h、20h、22h、24h等)，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述冻干保护剂的配方包括：脱脂奶粉80-120g/L(例如80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L等)、海藻糖80-120g/L(例如80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L等)、L-谷氨酸钠8-12g/L(例如8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L等)，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述冻干保护剂与菌体的质量比为(1-3):1，例如1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的预防或治疗II型糖尿病的微生物组合物在制备预防或治疗II型糖尿病的药物中的应用。
优选地，所述药物的剂型包括混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、乳剂、溶液剂、滴丸剂、注射剂、栓剂、灌肠剂、气雾剂、贴剂或滴剂中的任意一种。
优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
优选地，所述辅料包括载体、稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。
所述至少两种的组合例如稀释剂和赋形剂的组合、粘合剂和润湿剂的组合、乳化剂和助溶剂的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的预防或治疗II型糖尿病的微生物组合物在制备缓解II型糖尿病的保健食品中的应用。
第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的预防或治疗II型糖尿病的微生物组合物在制备缓解II型糖尿病的固体饮料中的应用。
第六方面，本发明还提供如第一方面所述的预防或治疗II型糖尿病的微生物组合物在制备以非诊断和/或治疗疾病为目的的降低丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、甘油三酯或胆固醇的水平的药物中的应用。
第七方面，本发明还提供如第一方面所述的预防或治疗II型糖尿病的微生物组合物在制备以非诊断和/或治疗疾病为目的的降低血清炎症因子TNF-ɑ、IL-1β、IL-6、IL-23、IP-10或OX-40的水平的药物中的应用。
第八方面，本发明还提供如第一方面所述的预防或治疗II型糖尿病的微生物组合物在制备以非诊断和/或治疗疾病为目的的降低血浆DX-4000-FITC水平的药物中的应用。
第九方面，本发明还提供如第一方面所述的预防或治疗II型糖尿病的微生物组合物在制备以非诊断和/或治疗疾病为目的的降低血浆LPS水平的药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明创造性地开发了一种新的预防或治疗II型糖尿病的策略，即将长双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌组成微生物组合物，研究表明，该微生物组合物能够显著降低II型糖尿病患者的体重；显著降低II型糖尿病患者血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)的水平；降低血清炎症因子TNF-ɑ、IL-1β、IL-6、IL-23、IP-10、OX-40的水平；显著降低升高的空腹血糖水平和口服葡萄糖耐量试验中的曲线下面积；显著降低2.5h时的血浆DX-4000-FITC水平；显著降低血浆LPS水平。因此，该微生物组合物在制备预防、治疗、缓解II型糖尿病的药物、食品或保健品中，具有很大的应用前景。
附图说明
图1是各组大鼠血清中ALT水平的测定结果统计图；
图2是各组大鼠血清中AST水平的测定结果统计图；
图3是各组大鼠血清中TC水平的测定结果统计图；
图4是各组大鼠血清中TG水平的测定结果统计图；
图5是各组大鼠血清中TNF-α水平的测定结果统计图；
图6是各组大鼠血清中IL-1β水平的测定结果统计图；
图7是各组大鼠血清中IL-6水平的测定结果统计图；
图8是各组大鼠血清中IL-23水平的测定结果统计图；
图9是各组大鼠血浆中FITC–葡聚糖浓度的结果统计图；
图10是各组大鼠血清中LPS水平的结果统计图；
上述各图中，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述内容中涉及的蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乙酸钠、酵母粉、柠檬酸氢二铵、K2PO4·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4、吐温80和半胱氨酸氨酸盐购自国药集团化学试剂有限公司；SPF级雄性3周龄SD大鼠、高脂及普通饲料购自上海斯莱克公司；STZ购自Sigma-Aldrich；血糖仪、血糖试纸购自台湾博仕珑；测定胰岛素、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IL-23检测用ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；测定内毒素LPS酶联免疫试剂盒购自武汉Uscn Life Science。
下述实施例中涉及的培养基配方如下：
MRS培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温80 1mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
下述内容所涉及的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)BL21菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2015年1月27日，保藏编号为CGMCC 10452，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
下述内容所涉及的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRa05菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2020年7月20日，保藏编号为CGMCC 1.12734，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述内容所涉及的冻干保护剂配方为：脱脂奶粉100g/L、海藻糖100g/L、L-谷氨酸钠10g/L，溶剂为无菌水。
制备例1
(1)长双歧杆菌BL21冻干粉的制备：
将长双歧杆菌BL21按照占培养基总质量3％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用冻干保护剂重悬(冻干保护剂与菌体的质量比为2:1)，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)BL21冻干粉。用水复溶后配制成5×109CFU/mL的菌液灌胃给II型糖尿病大鼠，连续12周。
(2)鼠李糖乳杆菌Ra05冻干粉的制备：
将鼠李糖乳杆菌Ra05按照占培养基总质量3％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用冻干保护剂重悬(冻干保护剂与菌体的质量比为2:1)，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRa05冻干粉。用水复溶后配制成5×109CFU/mL的菌液灌胃给II型糖尿病大鼠，连续12周。
(3)长双歧杆菌BL21和鼠李糖乳杆菌LRa05冻干粉混合物Ⅰ的制备：
取相同活菌数的长双歧杆菌BL21冻干粉和鼠李糖乳杆菌LRa05冻干粉混合均匀，用水复溶后配制成5×109CFU/mL的菌液灌胃给II型糖尿病大鼠，连续12周。
(4)长双歧杆菌BL21和鼠李糖乳杆菌LRa05冻干粉混合物Ⅱ的制备：
取活菌数为1:2的长双歧杆菌BL21冻干粉和鼠李糖乳杆菌LRa05冻干粉混合均匀，用水复溶后配制成5×109CFU/mL的菌液灌胃给II型糖尿病大鼠，连续12周。
(5)长双歧杆菌BL21和鼠李糖乳杆菌LRa05冻干粉混合物Ⅲ的制备：
取活菌数为2:1的长双歧杆菌BL21冻干粉和鼠李糖乳杆菌LRa05冻干粉混合均匀，用水复溶后配制成5×109CFU/mL的菌液灌胃给II型糖尿病大鼠，连续12周。
(6)长双歧杆菌BL21和鼠李糖乳杆菌LRa05冻干粉混合物Ⅳ的制备：
取活菌数为1:4的长双歧杆菌BL21冻干粉和鼠李糖乳杆菌LRa05冻干粉混合均匀，用水复溶后配制成5×109CFU/mL的菌液灌胃给II型糖尿病大鼠，连续12周。
(7)长双歧杆菌BL21和鼠李糖乳杆菌LRa05冻干粉混合物Ⅴ的制备：
取活菌数为4:1的长双歧杆菌BL21冻干粉和鼠李糖乳杆菌LRa05冻干粉混合均匀，用水复溶后配制成5×109CFU/mL的菌液灌胃给II型糖尿病大鼠，连续12周。
实施例1
微生物组合物对II型糖尿病大鼠体重的影响：
(1)分组情况：
54只雄性SD大鼠(6周龄，体重在170g-190g之间)，每笼3-4只，饲养温度严格控制在22±2℃，光/暗循环12h，大鼠自由进食和饮水。适应性喂养2周后，将大鼠随机分为CTL组(n＝6)，常规饲喂普通饲料；高脂饮食组(n＝48)，饲喂高脂饲料(88％正常饲料，10％猪油，1.5％胆固醇，0.5％胆盐)，进一步分为II型糖尿病组(D2M组，n＝6)和干预1-7组(BL21+LRa05组，n＝6)。
(2)建立II型糖尿病大鼠模型：
第3周，所有大鼠禁食不禁水12h，除CTL组外，其余各组大鼠均按照100mg/kg体重注射新鲜配制的链脲佐菌素STZ(50mmol/L)。将一定量STZ溶于50mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中(pH 4.5)，CTL组注射0.85％的生理盐水。造模1周后(第4周)，造模成功的糖尿病大鼠其空腹血糖高于7.0mmol/L，餐后2h血糖高于11.0mmol/L。将建模成功的48只II型糖尿病大鼠分为八组：(1)II型糖尿病组(D2M组)共6只；(2)干预1组共6只，喂食制备例1制得的冻干粉混合物Ⅰ菌液；(3)干预2组共6只，喂食制备例1制得的冻干粉混合物Ⅱ菌液；(4)干预3组共6只，喂食制备例1制得的冻干粉混合物Ⅲ菌液；(5)干预4组共6只，喂食制备例1制得的冻干粉混合物Ⅳ菌液；(6)干预5组共6只，喂食制备例1制得的冻干粉混合物Ⅴ菌液；(7)干预6组共6只，喂食制备例1制得的BL21冻干粉菌液；(8)干预7组共6只，喂食制备例1制得的Ra05冻干粉菌液。
(3)实验过程：
实验共12周：第1-2周为大鼠适应期；第3-6周为造模期；第7-12周开始灌胃直至实验结束，干预组以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃；所有分组均为自由饮水和摄食。
第12周对CTL组、D2M组、干预1-3组的大鼠体重进行测量，结果如表1所示：D2M组大鼠体重显著高于CTL组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。干预组较D2M组大鼠体重显著降低(p＜0.05)。
表1
组别
体重(g)
CTL组
552±14
D2M组
649±39
干预1组
576±38
干预2组
583±42
干预3组
566±39.5
实施例2
微生物组合物对II型糖尿病大鼠空腹血糖及OGTT的影响：
分组情况、建立II型糖尿病大鼠模型和实验过程与实施例1一致。
空腹血糖在大鼠禁食不禁水12h后测定，餐后血糖在进食2h后进行测定。在进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)时，所有大鼠禁食过夜，并在葡萄糖给药前(时间＝0min)采集空腹血糖，作为基线值。然后，经口灌胃给予2g/kg葡萄糖溶液。在给予葡萄糖后15、30、60和120min采集血样。测定血糖水平，并计算葡萄糖曲线下面积(AUC)。
结果如表2和表3所示，由表2可知：与D2M组相比，干预组的葡萄糖水平均显著降低，且干预1-3组的葡萄糖水平降低程度更加显著(p<0.05)。由表3可知：与D2M组相比，干预组的曲线下总面积(TAUC)值显著降低，且干预1-3组的曲线下总面积降低程度更加显著(p<0.05)。
表2
组别
空腹血糖(mg/dL)
CTL组
121±10.5
D2M组
380±27
干预1组
190±19.8
干预2组
186±29.8
干预3组
192±16.8
干预4组
197±21
干预5组
205±28
干预6组
229±18.9
干预7组
238±28.5
表3
组别
曲线下面积
CTL组
2555±101.5
D2M组
3910±280.8
干预1组
2988±401.6
干预2组
2923±423.7
干预3组
2990±455.6
干预4组
3188±371.5
干预5组
3158±421.4
干预6组
3365±468.3
干预7组
3269±431.2
实施例3
微生物组合物对II型糖尿病大鼠血清生化指标的影响：
分组情况、建立II型糖尿病大鼠模型和实验过程与实施例1一致。
第12周实验结束时，小鼠禁食不禁水12h后，麻醉后摘取眼球取血，4℃低温下，4000×g离心10min后小心收集上层透明液体为血清，冻存于-80℃备用。
血清ALT、AST、TC、TG的测定：取出预留的血清，融化后采用生化自动生化分析仪按照机器和说明书对大鼠血清ALT、AST、TC、TG进行测定。结果分别如图1-4所示。
由图1可知，与CTL组比较，D2M组大鼠血清ALT水平明显升高，差异有统计学意义(p＜0.05)。与D2M组比较，干预1组大鼠血清ALT水平降低，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
由图2可知，与CTL组比较，D2M组大鼠血清AST水平明显升高，差异有统计学意义(p＜0.05)。与D2M组比较，干预1组大鼠血清AST水平降低，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
由图3可知，与CTL组比较，D2M组大鼠血清TC水平明显升高，差异有统计学意义(p＜0.05)。与D2M组比较，干预1组大鼠血清TC水平降低，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
由图4可知，与CTL组比较，D2M组大鼠血清TG水平明显升高，差异有统计学意义(p＜0.05)。与D2M组比较，干预1组大鼠血清TG水平降低，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
实施例4
微生物组合物对II型糖尿病大鼠血清炎症因子指标的影响：
分组情况、建立II型糖尿病大鼠模型和实验过程与实施例1一致。
血清中相关细胞因子的检测：TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-23含量的测定采用ELISA试剂盒，方法参照说明书。结果分别如图5-8所示。
由图5可知，与CTL组比较，D2M组大鼠血清TNF-α水平明显升高，差异有统计学意义(p＜0.05)。与D2M组比较，干预1组大鼠血清TNF-α水平降低，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
由图6可知，与CTL组比较，D2M组大鼠血清IL-1β水平明显升高，差异有统计学意义(p＜0.05)。与D2M组比较，干预1组大鼠血清IL-1β水平降低，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
由图7可知，与CTL组比较，D2M组大鼠血清IL-6水平明显升高，差异有统计学意义(p＜0.05)。与D2M组比较，干预1组大鼠血清IL-6水平降低，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
由图8可知，与CTL组比较，D2M组大鼠血清IL-23水平明显升高，差异有统计学意义(p＜0.05)。与D2M组比较，干预1组大鼠血清IL-23水平降低，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
实施例5
微生物组合物对II型糖尿病大鼠肠道通透性的影响：
分组情况、建立II型糖尿病大鼠模型和实验过程与实施例1一致。
体内肠道通透性试验过程：大鼠禁食过夜，采集血样作为实验的阴性对照，以测定大鼠血浆的背景。然后，通过经口灌胃给予大鼠FITC–葡聚糖(600mg/kg)(Sigma-Aldrich)，并在2.5和5h后采集血样。立即以6000rpm离心血样，分离血浆，并用等体积磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH＝7.4)稀释血浆。使用SynergyTMH4荧光酶标仪测定FITC–葡聚糖的血浆浓度，激发波长为485nm，发射波长为535nm，与连续稀释的FITC–葡聚糖的标准曲线进行比较。结果如图9所示。
由图9可知，与CTL组比较，D2M组大鼠血清FITC–葡聚糖水平明显升高，差异有统计学意义(p＜0.05)。与D2M组比较，干预1组大鼠血清FITC–葡聚糖水平降低，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
血浆脂多糖(LPS)测定：根据生产商说明，使用LPS检测试剂盒测定血浆LPS水平。将血浆与LAL试剂混合，并在37℃加热块中孵育10min，然后加入底物溶液，最终在37℃下孵育6min。之后，加入终止试剂。通过出现黄色推断血浆中LPS的存在。采用分光光度法定量测定样品的吸光度，结果如图10所示。
由图10可知，与CTL组比较，D2M组大鼠血清LPS水平明显升高，差异有统计学意义(p＜0.05)。与D2M组比较，干预1组大鼠血清LPS水平降低，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种预防或治疗II型糖尿病的微生物组合物及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。