具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。

除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。

本发明提供一种产氢气芽孢杆菌(Bacillus sp.)，其16s rRNA序列如SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1为：

AGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTACGAGG

进一步地，本发明还提供编号为JBW1-26a的上述产氢气芽孢杆菌(Bacillussp.)，已于2021年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO:22807。

芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，是细菌的一属，能形成芽孢(内生孢子)。它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。芽孢杆菌属细菌较大(4～10μm)，革兰氏阳性、是严格需氧或兼性厌氧的有荚膜的杆菌。该属细菌的重要特性是能够产生对不利条件具有特殊抵抗力的芽孢。芽孢杆菌属可分为以下亚群：多黏芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌(包括蜡样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)、短芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌。芽孢杆菌具有耐高温、快速复活和较强分泌酶等特点，在有氧和无氧条件下都能存活。

本发明还提供一种产氢气梭菌(Clostridium sp.)，其16s rRNA序列如SEQ IDNO:2所示。

SEQ ID NO:2为：

TGCAGTCGAGCGATGAAGCTCCTTCGGGAGCTGGATTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTCATAGAGGGGAATAGCCTTTCGAAAGGAAGATTAATACCGCATAAGATTGTAGTGCCGCATGGCATAGCAATTAAAGGAGTAATCCGCTATGAGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGTGATGACGGTCTTCGGATTGTAAAGCTCTGTCTTCAGGGACGATAATGACGGTACCTGAGAGGAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTACTGGGCGTAAAGGGAGCGTAGGTGGATATTTAAGTGGGATGTGAAATACTCGGGCTTAACCTGGGTGCTGCATTCCAAACTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGGAAAGTAGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTAGGAAGAATACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGACTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATACTAGGTGTAGGGGTTGTCATGACCTCTGTGCCGCCGCTAACGCATTAAGTATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTAGACTTGACATCTCCTGAATTACCCTTAATCGGGGAAGCCCTTCGGGGCAGGAAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCTACCATTTAGTTGAGCACTCTAGCGAGACTGCCCGGGTTAACCGGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCTGGTACAGAGAGATGCTAAACCGTGAGGTGGAGCCAAACTTTAAAACCAGTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGAAACTCGCCTACATGAAGCTGGAGTTGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTGGCAAATACCCAAAGTTCTGAGCTAACGCGCAAGCGAGGCAGCGACCTAA

进一步地，本发明还提供编号为JBW1-26b的上述产氢气梭菌(Clostridium sp.)已于2021年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO:22808。

梭菌属(Clostridium sp.)是一群革兰阳性菌，能产生芽孢，对外界抵抗力强。因芽孢直径大于菌体宽度,使菌体膨大呈梭形,因而得名。其广泛分布于自然界中，存在于土壤、人和动物肠道中。是能形成芽孢、厌氧生长的革兰氏染色阳性大杆菌。因芽孢常比菌体大，致使菌体呈梭状而得名。又称厌氧芽孢杆菌属。多数专性厌氧，少数微需氧，大多数梭菌不产生过氧化氢酶，对蛋白质分解和糖类发酵能力随菌种而异：溶组织梭菌分解蛋白，产气荚膜梭菌发酵糖类，产芽孢梭菌既分解蛋白又发酵糖类。

本发明还提供一种生产氢气的方法，其包括使用产氢气微生物进行发酵来生产氢气，其中所述产氢气微生物为上述产氢气芽孢杆菌(Bacillus sp.)或上述产氢气梭菌(Clostridium sp.)，或者包括产氢气芽孢杆菌(Bacillus sp.)和上述产氢气梭菌(Clostridium sp.)。

在一个优选的实施方式中，所述产氢气微生物包括产氢气芽孢杆菌(Bacillussp.)JBW1-26a和产氢气梭菌(Clostridium sp.)JBW1-26a。其中，产氢气芽孢杆菌(Bacillus sp.)JBW1-26a和产氢气梭菌(Clostridium sp.)JBW1-26b的比例可以是任意值。

在一个具体的实施方式中，产氢气芽孢杆菌(Bacillus sp.)JBW1-26a和产氢气梭菌(Clostridium sp.)JBW1-26b的比例为0.1-10:1，例如可以为0.1:1、0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1，优选为0.5-2:1。

本发明提供的生产氢气的方法，包括：

将所述产氢气微生物活化后接种到种子培养基中进行培养，得到种子液；

将所述种子液接种到含有底物的发酵培养基中进行发酵培养，得到氢气。

其中，在一个具体的实施方式中，所述种子培养基包含：蛋白胨5.0-12.0g/L，牛肉浸粉1-6g/L，氯化钠4-6g/L，pH值为7.0-7.5。

在一个具体的实施方式中，所述种子培养基包含：蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉3.0g/L，氯化钠5.0g/L，pH值为7.0-7.4。

值得提出的是，说明中仅给出种子培养基的最常用的培养基，在培养基中加入葡萄糖、淀粉、缓冲溶液、微量元素等有利于细菌生产的组份同样适用于本细菌的培养过程。

其中，发酵培养基是由底物与水组成。

多种底物可以适用于本发明的生产氢气的方法，除了通常发酵产氢所使用的淀粉、葡萄糖、蔗糖等成分，还可以选用秸秆、玉米芯、米糠、稻草等农副产品或农副产品二次加工产品作为底物。这些底物来源广泛，经济性更好，有利于实现产氢方法的商业化应用。

在一个具体的实施方式中，所述底物选自以下的一种或两种以上：小麦秸秆、燕麦麸皮、面糠、稻草秸秆、稻草壳、稻草液、米糠、脱脂米糠、米糠油、玉米秸秆、玉米芯、玉米皮、玉米面、玉米淀粉、玉米面渣、玉米籽、木头、甘蔗渣、白玉米面、白玉米籽、甜菜干、大豆分离蛋白粉、麸皮纤维粉、土豆淀粉、大米、灭菌大米、白糊精、灭菌白糊精、小麦粉、灭菌后小麦粉、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、低聚木糖、木质素、纤维素、半纤维素、纤维二糖、白砂糖、葡萄糖、丙三醇、白醋、灭菌白醋、白酒、乙醇溶液、泡打粉，或玉米芯、玉米皮、玉米秸秆、高梁秸秆、小麦秸秆、稻草秸秆、甘蔗渣、木薯渣或米糠经加工步骤获得的二次加工产品。

其中，加工步骤可以采用本领域常用的对玉米芯、玉米皮、玉米秸秆、高梁秸秆、小麦秸秆、稻草秸秆、甘蔗渣、木薯渣、米糠的加工方法。例如，加工步骤可以包括预处理、水解或酶解。

预处理可以包括蒸汽爆破。水解可以包括酸或碱调PH值、100-180℃高温水解。酶解可以包括添加纤维素酶、糖化酶、木制糖酶对玉米芯、玉米皮、玉米秸秆、高梁秸秆、小麦秸秆、稻草秸秆、甘蔗渣、木薯渣、米糠进行酶解。

在一个具体的实施方式中，加工步骤为蒸汽爆喷。

在一个具体的实施方式中，加工步骤为酸或碱调PH值、100-180℃高温水解。

在一个具体的实施方式中，加工步骤为酶解。

在一个具体的实施方式中，加工步骤为蒸汽爆喷，之后再酸或碱调PH值、100-180℃高温水解。

在一个具体的实施方式中，加工步骤为蒸汽爆喷，之后再酶解。

在一个具体的实施方式中，加工步骤为蒸汽爆喷，之后再酸或碱调PH值、100-180℃高温水解，最后酶解。

其中，各种底物可以涵盖领域内常用的尺寸、形状和加工方式。例如小麦秸秆可以包括小麦秸秆段和小麦秸秆段(水解)。其中小麦秸秆段是指将小麦切割成不同的长度，小麦秸秆段(水解)是指小麦秸秆水解后得到的产物。

在一个具体的实施方式中，小麦秸秆的尺寸为每段长度为0.5cm～1.5cm。

在一个具体的实施方式中，小麦秸秆段(水解)通过以下方式得到：指小麦秸秆段以8％的质量比浸入0.3％的稀硫酸溶液中，并放入不锈钢反应釜，加热反应釜温度至160度，维持50分钟后，降温取出，加Ca(OH)₂溶液调节PH值至7.0；

类似的，碎稻草是指切割为不同尺寸的稻草秸秆。碎稻草(高压灭菌)是指将碎稻草高压灭菌后得到的产物。稻草液是指稻草杆浸泡后得到的水溶液。

在一个具体的实施方式中，碎稻草是切割为0.5～1cm的稻草秸秆。

在一个具体的实施方式中，碎稻草(高压灭菌)通过以下方式得到：碎稻草放入高压灭菌锅内，加热高压灭菌锅压力至0.1～0.2Mpa下维持20分钟后，降温取出。

在一个具体的实施方式中，水稻壳(高压灭菌)通过以下方式得到：水稻壳放入高压灭菌锅内，加热高压灭菌锅压力至0.1～0.2Mpa下维持20分钟后，降温取出。

在一个具体的实施方式中，稻草液是指稻草杆浸泡水中4h后，将稻草过滤后的水溶液。

在一个具体的实施方式中，稻草(水洗后)通过以下方式得到：将浸泡过的稻草加水后浸泡清洗，再将水过滤掉，过滤掉的水滴入碘液观察是否变色，如变色重复加水浸泡清洗至过滤后的水加碘液不变色。

在一个具体的实施方式中，大米米糠(高压灭菌)通过以下方式得到：大米米糠放入高压灭菌锅内，加热高压灭菌锅压力至0.1～0.2Mpa下维持20分钟后，降温取出。

在一个具体的实施方式中，碎玉米杆是指切割为粒径为0.5～2cm的玉米秸秆。

在一个具体的实施方式中，碎玉米杆(水解)通过以下方式得到：碎玉米杆放入反应釜内，加热反应釜温度至120度后，维持30分钟后，降温取出。

玉米芯是指玉米棒脱粒后剩余截断成块。例如，具体截断的块的粒径为0.5～2cm。

在一个具体的实施方式中，玉米芯(高压灭菌)通过以下方式得到：玉米芯放入高压灭菌锅内，加热高压灭菌锅压力至0.1～0.2Mpa下维持20分钟后，降温取出。

玉米皮是指玉米苞叶。玉米皮(酶解处理)是指玉米皮酶解后得到的产物。

在一个具体的实施方式中，玉米皮(酶解处理)通过以下方式得到：将玉米皮按质量比6％放入0.5％的稀硫酸溶液，放入不锈钢反应釜，加热反应釜温度至140度下维持20分钟后，降温取出，用NaOH溶液调节PH值至5.0，加入糖化酶和木聚糖酶，50℃酶解40h。

白玉米面渣是指白玉米植物的玉米籽经研磨后得到的产物，白玉米籽是指白玉米植物的玉米籽。

在一个具体的实施方式中，白玉米面渣是直径小于0.5mm的颗粒。

木头(碎)是指杨树木头挤压成的木头碎屑。

在一个具体的实施方式中，木头(碎)是直径小于1mm的木头碎屑。

甘蔗渣(无糖水洗)是指甘蔗挤压甘蔗汁后多次水洗过滤至溶液无糖分得到的渣滓。

甘蔗渣(无糖高压灭菌)是将甘蔗渣(无糖水洗)进一步高压灭菌后得到的。

在一个具体的实施方式中，甘蔗渣(无糖高压灭菌)通过以下方式得到：指甘蔗挤压甘蔗汁后多次水洗过滤至溶液无糖分后，放入高压灭菌锅内，加热高压灭菌锅压力至0.1～0.2Mpa下维持30分钟后，降温取出。

甜菜干是指甜菜自然风干后得到的。

在一个具体的实施方式中，所述底物在发酵培养基中的含量为10～100g/L，例如可以为10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L。

在发酵培养中，发酵温度为25-45℃，发酵时间为60-120h。

产生的氢气可以外接气袋或倒置的水封玻璃瓶，待气袋鼓起或水封玻璃瓶中有气体时，采用气相色谱对氢气含量进行检测。

实施例

实施例1菌株的筛选

从四川省凉山州木里县的土壤中采样。

将采集的土壤样品稀释涂布于固体培养基平板上，30℃培养3～5天，获得多菌落的初筛菌株。其中，固体培养基为营养琼脂培养基，pH值(25℃)为7.3±0.1，其包括蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉3.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂15.0g/L。

将初筛菌株分别接种于种子培养基中，25℃震荡培养60h。以营养肉汤为培养基，即：pH值(25℃)为7.3±0.1，其包括蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉3.0g/L，氯化钠5.0g/L。培养基溶解后经高压高温灭菌，待温度降至室温，获得种子培养基。然后将培养好的种子培养基、灭菌水、底物混合作为发酵培养基，密封，外接气袋或倒置的水封玻璃瓶，待气袋鼓起或水封玻璃瓶中有气体时，将气体打入气相色谱进行是否有氢气判定及氢气含量测定。

其中，所使用的发酵培养基底物为玉米淀粉，种子培养基、灭菌水、底物的质量比为10：85：5。

氢气测定的色谱条件如表1所示：

表1

将有氢气产出的发酵培养基作为液体样品稀释，再涂布于固体培养基平板上，再取菌落在种子培养基中进行培养，如此往复。

经过12轮固体培养基平板筛选，300多批次的菌液产氢气实验，得到两株菌株。其中一株菌株是在有氧气气氛下进行培养的，得到的菌株命名为产氢气芽孢杆菌(Bacillussp.)JBW1-26a。另一菌株是将培养基平板放入盛有厌氧产气袋的立式培养袋中进行的，得到的菌株命名产氢气梭菌(Clostridium sp.)JBW1-26b。

实施例2菌株的鉴定

芽孢杆菌(Bacillus sp.)JBW1-26a的鉴定

提取菌株的16s rRNA进行测序。

测定得到16s rRNA序列如SEQ ID NO:1所示：

AGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTACGAGG(SEQ ID NO:1)。

梭菌(Clostridium sp.)JBW1-26b的鉴定：

提取菌株的16s rRNA进行测序。

测定得到16s rRNA序列如SEQ ID NO:2所示：

TGCAGTCGAGCGATGAAGCTCCTTCGGGAGCTGGATTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTCATAGAGGGGAATAGCCTTTCGAAAGGAAGATTAATACCGCATAAGATTGTAGTGCCGCATGGCATAGCAATTAAAGGAGTAATCCGCTATGAGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGTGATGACGGTCTTCGGATTGTAAAGCTCTGTCTTCAGGGACGATAATGACGGTACCTGAGAGGAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTACTGGGCGTAAAGGGAGCGTAGGTGGATATTTAAGTGGGATGTGAAATACTCGGGCTTAACCTGGGTGCTGCATTCCAAACTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGGAAAGTAGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTAGGAAGAATACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGACTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATACTAGGTGTAGGGGTTGTCATGACCTCTGTGCCGCCGCTAACGCATTAAGTATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTAGACTTGACATCTCCTGAATTACCCTTAATCGGGGAAGCCCTTCGGGGCAGGAAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCTACCATTTAGTTGAGCACTCTAGCGAGACTGCCCGGGTTAACCGGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCTGGTACAGAGAGATGCTAAACCGTGAGGTGGAGCCAAACTTTAAAACCAGTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGAAACTCGCCTACATGAAGCTGGAGTTGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTGGCAAATACCCAAAGTTCTGAGCTAACGCGCAAGCGAGGCAGCGACCTAA(SEQ ID NO:2)

实施例3氢气的生产-不同菌株比例的影响

将已活化的产氢气芽孢杆菌(Bacillus sp.)JBW1-26a和产氢气梭菌(Clostridium sp.)JBW1-26b，分别接种于种子培养基进行培养。其中在有氧气气氛，温度37℃下培养10h，得到产氢气芽孢杆菌(Bacillus sp.)JBW1-26a种子液；在放入盛有厌氧产气袋的立式培养袋，温度37℃下培养10h，得到产氢气梭菌(Clostridium sp.)JBW1-26b的种子液。

以营养肉汤为培养基，即：pH值(25℃)为7.3±0.1，其包括蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉3.0g/L，氯化钠5.0g/L。培养基溶解后经高压高温灭菌，待温度降至室温，获得种子培养基。

将上述种子液按照表2的构成，以总种子液与种子培养基的体积比为10％(v/v)接种至含有种子培养基中，25℃震荡培养60h。然后将培养好的种子培养基、灭菌水、底物混合作为发酵培养基，密封，外接气袋或倒置的水封玻璃瓶，待气袋鼓起或水封玻璃瓶中有气体时，将气体打入气相色谱进行是否有氢气判定及氢气含量测定。

其中，所使用的发酵培养基为底物5g玉米淀粉，种子培养基、灭菌水、底物的质量比为10：85：5。

表2

氢气的测定结果如表3显示，由此可见当芽孢杆菌JBW1-26a和梭菌JBW1-26b联合使用时的效果优于两种菌单独使用时，尤其是当芽孢杆菌JBW1-26a和梭菌JBW1-26b以1:1混合使用使用时的产氢气效果最佳。

表3

实施例4氢气的生产-不同底物的产氢情况

将已活化的产氢气芽孢杆菌(Bacillus sp.)JBW1-26a和产氢气梭菌(Clostridium sp.)JBW1-26b，分别接种于种子培养基进行培养。其中在有氧气气氛，温度37℃下培养10h，得到产氢气芽孢杆菌(Bacillus sp.)JBW1-26a种子液；在放入盛有厌氧产气袋的立式培养袋，温度37℃下培养10h，得到产氢气梭菌(Clostridium sp.)JBW1-26b的种子液。

以营养肉汤为培养基，即：pH值(25℃)为7.3±0.1，其包括蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉3.0g/L，氯化钠5.0g/L。培养基溶解后经高压高温灭菌，待温度降至室温，获得种子培养基。

将产氢气芽孢杆菌(Bacillus sp.)JBW1-26a的种子液和产氢气梭菌(Clostridium sp.)JBW1-26b的种子液按照1:1的体积比例，以总种子液与发酵培养基的体积比为10％(v/v)接种至接种于种子培养基中，25℃震荡培养60h。然后将培养好的种子培养基、灭菌水、底物混合，密封，外接气袋或倒置的水封玻璃瓶，待气袋鼓起或水封玻璃瓶中有气体时，将气体打入气相色谱进行是否有氢气判定及氢气含量测定。

其中，所使用的发酵培养基各底物的种类如表4所示，种子培养基、灭菌水、底物的质量比为10：85：5

氢气的测定结果如表4所示。

其中，表4中所使用的底物如下：

小麦秸秆段切割是指将小麦杆切割成每段长度为0.5cm～1.5cm；

小麦秸秆段(水解)是指小麦秸秆段以8％的质量比浸入0.3％的稀硫酸溶液中，并放入不锈钢反应釜，加热反应釜温度至160度，维持50分钟后，降温取出，加Ca(OH)₂溶液调节PH值至7.0；

碎稻草是指切割为0.5～1cm的稻草秸秆；

碎稻草(高压灭菌)通过以下方式获得：碎稻草放入高压灭菌锅内，加热高压灭菌锅压力至0.1～0.2Mpa下维持20分钟后，降温取出；

水稻壳(高压灭菌)通过以下方式获得：水稻壳放入高压灭菌锅内，加热高压灭菌锅压力至0.1～0.2Mpa下维持20分钟后，降温取出；

稻草液是指稻草杆浸泡水中4h后，将稻草过滤后的水溶液。

稻草(水洗后)通过以下方式获得：将浸泡过的稻草加水后浸泡清洗，再将水过滤掉，过滤掉的水滴入碘液观察是否变色，如变色重复加水浸泡清洗至过滤后的水加碘液不变色。

大米米糠(高压灭菌)通过以下方式获得：大米米糠放入高压灭菌锅内，加热高压灭菌锅压力至0.1～0.2Mpa下维持20分钟后，降温取出。

碎玉米杆是指切割为粒径为0.5～2cm的玉米秸秆；

碎玉米杆(水解)通过以下方式获得：碎玉米杆放入反应釜内，加热反应釜温度至120度后，维持30分钟后，降温取出。

玉米芯是指玉米棒脱粒后剩余截断成块，尺寸为直径0.5cm～1.5cm的不规则小块。

玉米芯(高压灭菌)通过以下方式获得：指玉米芯放入高压灭菌锅内，加热高压灭菌锅压力至0.1～0.2Mpa下维持20分钟后，降温取出。

玉米皮是指玉米苞叶。

玉米皮(酶解处理)通过以下方式获得，玉米皮按质量比6％放入0.5％的稀硫酸溶液，放入不锈钢反应釜，加热反应釜温度至140度下维持20分钟后，降温取出，用NaOH溶液调节PH值至5.0，加入糖化酶和木聚糖酶，50℃酶解40h。

白玉米面渣是指白玉米植物的玉米籽经研磨后直径小于0.5mm的颗粒。

白玉米籽是指白玉米植物的玉米籽。

木头(碎)是指杨树木头挤压成直径小于1mm的木头碎屑。

甘蔗渣(无糖水洗)通过以下方式获得：甘蔗挤压甘蔗汁后多次水洗过滤至溶液无糖分。

甘蔗渣(无糖高压灭菌)通过以下方式获得：甘蔗挤压甘蔗汁后多次水洗过滤至溶液无糖分后，放入高压灭菌锅内，加热高压灭菌锅压力至0.1～0.2Mpa下维持30分钟后，降温取出。

甜菜干是指甜菜自然风干后得到。

表4

其中，产生氢气的总量＝产气体积×产生氢气浓度。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京北方华科科技有限公司

<120> 产氢气菌及其用于生产氢气的方法

<130> TPE01616

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1454

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成的

<400> 1

agtcgagcga atggattaag agcttgctct tatgaagtta gcggcggacg ggtgagtaac 60

acgtgggtaa cctgcccata agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat 120

aacattttga accgcatggt tcgaaattga aaggcggctt cggctgtcac ttatggatgg 180

acccgcgtcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc 240

gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 300

cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga 360

tgaaggcttt cgggtcgtaa aactctgttg ttagggaaga acaagtgcta gttgaataag 420

ctggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 480

taatacgtag gtggcaagcg ttatccggaa ttattgggcg taaagcgcgc gcaggtggtt 540

tcttaagtct gatgtgaaag cccacggctc aaccgtggag ggtcattgga aactgggaga 600

cttgagtgca gaagaggaaa gtggaattcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatatg 660

gaggaacacc agtggcgaag gcgactttct ggtctgtaac tgacactgag gcgcgaaagc 720

gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag 780

tgttagaggg tttccgccct ttagtgctga agttaacgca ttaagcactc cgcctgggga 840

gtacggccgc aaggctgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca 900

tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaacc 960

ctagagatag ggcttctcct tcgggagcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1020

tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc 1080

atcattaagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1140

acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacggtaca 1200

aagagctgca agaccgcgag gtggagctaa tctcataaaa ccgttctcag ttcggattgt 1260

aggctgcaac tcgcctacat gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg 1320

gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc 1380

cgaagtcggt ggggtaacct tttggagcca gccgcctaag gtgggacaga tgattggggt 1440

gaagtcgtac gagg 1454

<210> 2

<211> 1383

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成的

<400> 2

tgcagtcgag cgatgaagct ccttcgggag ctggattagc ggcggacggg tgagtaacac 60

gtgggtaacc tgcctcatag aggggaatag cctttcgaaa ggaagattaa taccgcataa 120

gattgtagtg ccgcatggca tagcaattaa aggagtaatc cgctatgaga tggacccgcg 180

tcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga 240

gagggtgatc ggccacattg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt 300

ggggaatatt gcacaatggg ggaaaccctg atgcagcaac gccgcgtgag tgatgacggt 360

cttcggattg taaagctctg tcttcaggga cgataatgac ggtacctgag aggaagccac 420

ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggatttac 480

tgggcgtaaa gggagcgtag gtggatattt aagtgggatg tgaaatactc gggcttaacc 540

tgggtgctgc attccaaact ggatatctag agtgcaggag aggaaagtag aattcctagt 600

gtagcggtga aatgcgtaga gattaggaag aataccagtg gcgaaggcga ctttctggac 660

tgtaactgac actgaggctc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt 720

ccacgccgta aacgatgaat actaggtgta ggggttgtca tgacctctgt gccgccgcta 780

acgcattaag tattccgcct ggggagtacg gtcgcaagat taaaactcaa aggaattgac 840

gggggcccgc acaagcagcg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac 900

ctagacttga catctcctga attaccctta atcggggaag cccttcgggg caggaagaca 960

ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1020

cgcaaccctt attgttagtt gctaccattt agttgagcac tctagcgaga ctgcccgggt 1080

taaccgggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgtc tagggctaca 1140

cacgtgctac aatggctggt acagagagat gctaaaccgt gaggtggagc caaactttaa 1200

aaccagtctc agttcggatt gtaggctgaa actcgcctac atgaagctgg agttgctagt 1260

aatcgcgaat cagaatgtcg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1320

caccatgaga gttggcaaat acccaaagtt ctgagctaac gcgcaagcga ggcagcgacc 1380

taa 1383